Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Imaging Integrin spændinger og cellulære kraft på Submicron opløsning med en integrativ spænding Sensor

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59476
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Summary

Integrin spænding spiller vigtige roller i forskellige cellefunktioner. Med en integrativ spænding sensor, er integrin spændinger kalibreret med picoNewton (pN) følsomhed og afbildet på submicron beslutning.

Abstract

Molekylær spænding fremsendes integrin-ligand obligationer er grundlæggende mekaniske signalet i integrin pathway, som spiller vigtige roller i mange cellefunktioner og adfærd. For at kalibrere og billed integrin spændinger med høj kraft følsomhed og rumlige opløsning, udviklede vi en integrativ spænding sensor (ITS), en DNA-baseret fluorescerende spænding sensor. ITS er aktiveret for at fluorescerer hvis opretholde en molekylær spændinger, således konvertering kraft til fluorescerende signal på det molekylære niveau. Spænding tærsklen for ITS aktivering er afstemmelige i rækken af 10 – 60 pN, der dækker godt dynamikområde integrin spændinger i celler. På et substrat podet med en ITS, er integrin spændingen i vedhængende celler visualiseret ved fluorescens og afbildet på submicron opløsning. ITS er også kompatibel med celle strukturel billeddannelse i levende celler og faste celler. ITS har været anvendt med succes til studiet af trombocyt sammentrækning og celle migration. Dette papir beskriver proceduren for syntese og anvendelse af ITS i studiet af integrin overførte cellulære kraft.

Introduction

Celler stole på integriner at overholde og udøve cellulære styrker til ekstracellulære matrix. Integra-medieret celle vedhæftning og kraft transmission er afgørende for celle spredning1,2, migration3,4og overlevelse5,6,7. På lang sigt påvirkninger integrin biomekaniske signalering også celle spredning8,9,10 og differentiering11,12. Forskere har udviklet forskellige metoder til at måle og kort integrin overførte cellulære styrker på grænsefladen celle-matrix. Disse metoder er baseret på elastisk undergrundens13, array af micropost14, eller atomic force mikroskopi (AFM)15,16. Elastisk undergrundens og micropost metoder er afhængige af deformation af substrater til at rapportere den cellulært stress og har begrænsninger med hensyn til rumlige opløsning og tvinge følsomhed. AFM har høj kraft følsomhed, men det kan ikke afsløre kraft på flere steder samtidig, hvilket gør det vanskeligt at kortlægge cellulære kraft fremsendes integriner.

I de seneste år, blev flere teknikker udviklet for at studere cellulær kraft på molekylært niveau. En samling af molekylære spænding sensorer baseret på polyethylen glycol17,18, spider silke peptid19og DNA20,21,22,23 blev udviklet til visualisere og overvåge spændingen fremsendes molekylære proteiner. Blandt disse teknikker, blev DNA først vedtaget som syntese materiale i spændingen måle tether (TGT), en rupturable linker, der modulerer den øvre grænse for integrin spændinger i levende celler22,24. Senere, DNA og fluorescens resonans overførsel teknik blev kombineret til at oprette hårnål DNA-baserede fluorescerende spænding sensorer først af Chens gruppe23 og Salaitas gruppe20. Hårnål DNA-baserede spænding sensor rapporter integrin spændinger i real-tid og har været anvendt med succes til undersøgelse af en række cellulære funktioner21. Bagefter, kombineret Wang's lab en TGT med fluorophore-quencher parret til betænkningen integrin spændinger. Denne sensor er opkaldt en ITS25,26. ITS er baseret på dobbelt-strenget DNA (dsDNA) og har et bredere dynamikområde (10-60 pN) til integrin spænding kalibrering. I modsætning til hårnål DNA-baserede sensorer, ITS rapporterer ikke cellulære kraft i realtid men registrerer alle historiske integrin begivenheder som fodaftryk af cellulære kraft; Dette signal ophobning proces forbedrer følsomheden for cellulære kraft imaging, der gør det muligt at billedet cellulære kraft selv med en low-end fluorescens mikroskop. Syntesen af ITS er relativt mere bekvemt, da det er skabt af hybridizing to enkeltstrenget DNAs (ssDNA).

ITS er en 18-base-parret dsDNA konjugeret med biotin, en fluorophore, en quencher (sort hul Quencher 2 [BHQ2])27og en cyklisk arginylglycylaspartic syre (M.H.T.) peptid28 som en integrin peptid ligand (figur 1). Den nederste linje er konjugeret med fluorophore (Cy3 er anvendt i dette manuskript, mens andre farvestoffer, såsom Cy5 eller Alexa serien, også har bevist, muligt i vores lab) og biotin tag, hvormed ITS er immobiliseret på et underlag af biotin-begærlighed bond. Den øvre strand er konjugeret med M.H.T. peptid og sort hul Quencher, der slukker Cy3 med ca 98% quenching effektivitet26,27. Med protokollen præsenteret i dette papir, er belægning tætheden af ITS på et substrat omkring 1.100/µm2. Dette er massefylden vi tidligere kalibreret for 18 bp biotinylated dsDNA belagt på neutrAvidin-functionalized underlaget ved at følge den samme belægning protokol29. Når celler overholder substrat belagt med ITS, integrin binder ITS gennem M.H.T. og transmitterer spænding til ITS. ITS har en specifik spænding tolerance (Ttol), der defineres som den spænding tærskelværdi, der mekanisk adskiller dsDNA ITS inden for 2 s22. SIT ruptur af integrin spændinger fører til adskillelsen af quencher fra farvestoffet, der efterfølgende udsender fluorescens. Som et resultat, den usynlige integrin spænding er konverteret til et fluorescens signal og den cellulære kraft kan kortlægges af fluorescens billeddannelse.

For at demonstrere anvendelsen af ITS, bruger vi fisk keratocyte her, udbredte celle model for celle migration undersøgelse30,31,32, CHO-K1 celle, almindeligt anvendte nonmotile cellelinje og NIH 3T3 fibroblast. Coimaging af integrin spændinger og celle strukturer er også gennemført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC, 8-16-8333-jeg) i Iowa State University.

1. Sammenfatning af Integrativ spænding sensor

  1. Tilpasse og Bestil ssDNAs (Se Tabel af materialer).
    Bemærk: SsDNA sekvenserne er som følger. Den øverste del er /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. De lavere dele er som følger.
    12 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG KBRT FTT CCC /3Bio/
    23 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG KBRT CC /iBiodT/ CCC
    33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/FTT CCC
    43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG Christensen/iBiodT KBRT FTT CCC
    54 pN ITS: /5Biosg / / iCy3/GGC CCG CTG KBRT FTT CCC
    Her, /5ThioMC6-D / repræsenterer en thiol modifier C6 Sørensen (disulfid) på 5'-enden. /3BHQ_2/ repræsenterer et sort hul Quencher 2 på 3'-enden. / 3Bio /, / 5Biosg/og /iBiodT/ er biotinylation for enden 3', 5' ende, og på thymin interne DNA, henholdsvis. /iCy3/ repræsenterer en Cy3, der er indsat i den interne rygraden i ssDNA. Disse koder anvendes af de specifikke kommercielle leverandør bruges her og kan være anderledes i andre selskaber, DNA.
  2. Konjugerede M.H.T. peptid til SH-ssDNA-quencher.
    Bemærk: De reagenser er fosfatbufferet saltopløsning (PBS), sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyklohexan-1-carboxylat (sulfo-Investeringsfondene), M.H.T. peptid og tris-(2-carboxyethyl) phosphine hydrochlorid, også kendt som TCEP-HCl pr.
    1. Deprotect thiol modifier på den øvre strand DNA ved hjælp af TCEP løsning.
      Bemærk: Thiol modificerede DNAs bestilt fra en kommerciel kilde er afsendt i oxideret form, med svovl atomer beskyttet af en disulfid obligation, der skal reduceres før M.H.T.-DNA konjugering. TCEP er en lugtfri reduktion reagens anvendes til thiol deprotection.
      1. 14.3 mg TCEP-HCL i 300 µL vand opløses. PH-værdien af TCEP løsningen til ~7.2–7.4 med 1 M NaOH opløsning (ca. 150 µL), ved hjælp af pH test papirer. Tilsæt rent vand for at gøre en endelige mængden af 0,5 mL. Den endelige TCEP koncentration er 100 mM.
        Bemærk: Det anbefales at gøre TCEP løsning frisk hver gang for DNA thiol deprotection. Undgå strømpe TCEP løsning i lang tid.
      2. Tilføje 100 µL af 0,5 M ethylendiamintetra syre (EDTA) løsning og 400 µL vand til TCEP løsning.
      3. Tilsæt 10 µL TCEP + EDTA-oploesning til 20 µL af 1 mM thiol-DNA-BHQ2 i PBS. Lad løsningen reagere i 30 min. ved stuetemperatur.
        Bemærk: Disulfid obligation af 5' thiol modifier C6 S-S konjugation på denne ssDNA vil være kløvet af TCEP, forlader gruppen thiol klar til reaktion med maleimide i de næste skridt. TCEP forstyrrer ikke den følgende thiol-maleimide reaktion; Det er således ikke nødvendigt at passivering TCEP efter dette trin.
    2. Konjugerede M.H.T.-NH2 med sulfo-Investeringsfondene.
      1. 5 mg M.H.T.-NH2 i 100 µL af PBS til at opnå 11 mM M.H.T.-NH2opløses.
      2. Tilføje 200 µL af rent vand til rør med 2 mg af sulfo-Investeringsfondene (afmålt af leverandøren). Smadre sulfo-Investeringsfondene solid med en pipette spids og kraftigt afpipetteres på samme tid at fremme opløse Investeringsfondene i vandet. Koncentrationen af sulfo-Investeringsfondene vil være 23 mM.
        Bemærk: Fordi NHS ester i sulfo-Investeringsfondene er underlagt hydrolyse og har en levetid på et par minutter, denne opløsende skridt bør fuldføres inden for 1 min til at undgå uforholdsmæssigt store tab af NHS ester på grund af hydrolyse. Bruge rent vand til at opløse sulfo-Investeringsfondene, fordi dets Opløselighed i PBS eller andre buffere er dårlig.
      3. Tilføje 40 µL af sulfo-Investeringsfondene løsning til 100 µL M.H.T.-NH2 løsning og Inkuber det i 20 min.
        Bemærk: NHS ester i sulfo-Investeringsfondene vil reagere med Amin gruppe i M.H.T.-NH2, danner et AMID bond der forbinder M.H.T. og sulfo-Investeringsfondene.
    3. Konjugat M.H.T.-Investeringsfondene med SH-ssDNA-quencher.
      1. Opløsninger villig i 1.2.1 og 1.2.2 blandes og inkuberes blandingen i 1 time ved stuetemperatur. Flytte løsningen til et køleskab ved 4 ° C og lad det yderligere reagere natten over. Thiol konjugeret på den øvre strand DNA vil reagere med maleimide på sulfo-Investeringsfondene, danner en thioether gruppe, der forbinder M.H.T. med den øvre strand DNA.
    4. Udføre ethanol nedbør til at rense M.H.T.-ssDNA-quencher fra ureageret sulfo-Investeringsfondene, M.H.T. og TCEP.
      1. Chill 10 mL 100% ethanol i en 15 mL konisk slange i en-20 ° C fryser i mindst 30 min.
      2. Bland en 3 M NaCl opløsning, DNA løsning og kølet ethanol på en volumen-forholdet 1:10:25. Holde blandet væsken i en-20 ° C fryser i 30 min, eller indtil DNA er fældet.
      3. Centrifuge væske på 10.000 x g i 30 min. supernatanten.
      4. Tilføje PBS til DNA pellet. Måle DNA koncentrationen ved hjælp af et spektrometer.
    5. (Valgfrit) Udføre DNA elektroforese for at få en højere M.H.T.-ssDNA renhed.
      Bemærk: Med ovenstående protokollen, omkring 70% – 90% af ssDNA vil være konjugeret med M.H.T.. Hvis højere renhed ønskes, kan DNA elektroforese også udføres for at adskille konjugeret DNA fra ukonjugeret DNA.
      1. Samle en lodret elektroforese system.
      2. Forberede en 10% polyacrylamid gelopløsning ved at blande 50 mL rent vand, 20 mL 40% acrylamid gel, 8 mL 10 x tris-Borat-EDTA (TBE) buffer og 800 µL af 10% ammonium persulfat (APS).
      3. Tilføje 80 µL af tetramethylethylenediamine (TEMED) til gelopløsning. Hæld opløsningen i glas kammer af elektroforese system. Indsæt en enkelt-godt kam for at oprette en brønd på toppen af gelen. Vent i 10 min til gelen er crosslinked.
      4. Blandes DNA løsning med 100% glycerol på volumen forholdet 1:1. Fjern kammen og indlæse DNA løsning til gel godt.
      5. Kør gelen ved en spænding på 200 V. observere to DNA bands, hvor halter, en er konjugeret DNA.
      6. Afbrød gel bandet med den konjugerede DNA og skær det i små stykker.
      7. Indsamle de hakkede gel i to 1,5 mL centrifugeglas med filtre. Tilføje 500 µL af PBS til hver tube.
      8. Sætte PBS-gennemblødt gelen i et mørkt sted ved stuetemperatur i 1 dag. DNA bliver diffust ud af gel stykker til PBS.
      9. Indsamle DNA løsning ved centrifugering rør ved 1.000 x g i 2 min.
      10. Udføre en anden runde af ethanol nedbør (trin 1.2.4) at indsamle DNA.
  3. Syntetisere ITS af hybridizing M.H.T.-ssDNA-quencher og dye-ssDNA-biotin.
    1. Bland løsningerne af den øvre strand og den lavere strand DNAs på en kindtand forholdet mellem 1.1:1. Holde blandingen ved 4 ° C natten over til at producere ITS ved DNA hybridisering.
      Bemærk: En kindtand forholdet mellem 1.1:1 for DNA hybridisering bruges i stedet for 1:1. Overdreven M.H.T.-ssDNA-quencher bruges til at sikre, at alle dye-ssDNA-biotin vil krydse sig med M.H.T.-ssDNA-quencher. M.H.T.-ssDNA-quencher uden hybridisering vil blive vasket under overfladebehandling, som ikke vil påvirke ITS overfladebehandling kvalitet.
    2. Alikvot og butik ITS løsning ved-20 ° C til langtidsopbevaring.
      Bemærk: Opbevaring buffer er PBS og opbevaring koncentration skal generelt være over 10 µM. Til regelmæssig brug, kan dens løsning opbevares ved 4 ° C for et par uger uden mærkbar kvalitetsforringelse.

2. forberedelse af sin overflader af immobilisere ITS på glas-bund petriskåle

Bemærk: De reagenser, der anvendes er biotinylated bovint serumalbumin (BSA-biotin), begærlighed protein og ITS. Chill alle reagenser og PBS buffer til omkring 0 ° C på isen med en isspand.

  1. Indlæse 200 µL af 0,1 mg/mL BSA-biotin i PBS på godt af en glas-bund petriskål (29 mm i diameter, med en 14 mm godt). Der inkuberes i 30 min. ved 4 ° C i et køleskab. BSA-biotin er fysisk adsorberet på glasoverfladen.
  2. Suge løsning fra de godt bruge en pipette og tilføje 200 µL af PBS tilbage til godt at vaske overfladen. Gentag denne 3 x for at fuldføre vask.
  3. Inkuber 200 µL af 50 µg/mL begærlighed protein i godt i 30 min. ved 4 ° C. Vask det 3 x med PBS. Efter dette trin, begærlighed protein binder sig til BSA-biotin og bliver immobiliseret på glasoverfladen.
  4. Inkuber 200 µL af 0,1 µM ITS i godt i 30 min. ved 4 ° C. Vask skål med 3 x med PBS. Forlade PBS i brønden indtil cellen plating. Efter dette trin, ITS med biotin tag binder til begærlighed protein og bliver immobiliseret på overfladen.
    Bemærk: Ét sikkerhedsforanstaltning kritisk for belægning kvalitet og ensartethed i ITS immobilisering er aldrig lade petriskål overfladen tørre op. At holde alle reagenser og PBS på 4 ° C eller omkring 0 ° C på isen med en isspand hjælper med at reducere vand fordampning sats under vask trin, når PBS er draget fra brønden.

3. celle plating på sin overflader

  1. Kultur fisk keratocytes.
    Bemærk: Her, guldfisk (Carassius auratus) bruges som eksempel, men andre fiskearter kan også arbejde.
    1. Plukke et stykke fisk skala fra en fisk med en flad-spids pincet. Tryk forsigtigt skalaen på godt af en glas-bund petriskål, med den indvendige side af skalaen at kontakte glasset. Vente på ~ 30 s for fisk skala til at overholde godt glasoverfladen af fadet.
    2. Tilsæt 1 mL af Iscoves modificerede Dulbecco's medium (IMDM) komplet medium for at fuldt ud dække fisk skalaen. Holde petriskålen i et mørkt og fugtigt boks 6-48 timer ved stuetemperatur.
      Bemærk: IMDM komplet medium indeholder 79% IMDM + 20% føtal bovint serum (FBS) + 1% penicillin. Der kræves ingen ekstra levering af ilt og CO2 . Et par silkepapir ruller vædet med vand kan stå i boksen for at opretholde høj luftfugtighed i boksen. Fisk keratocytes vil migrere ud af fisk skala som et ark af celler efter et par timer. Dette kan ses med et mikroskop for vævskultur. Cellerne er generelt levedygtige på 48 timer.
  2. Frigør og plade keratocytes celler på ITS overflader.
    1. Fjern mediet fra petriskålen fisk skala blev kulturperler. Vask godt 1 x med celle afmontering løsning, og tilføje fjernelse løsning til at dække fisk skala og Inkuber i 3 min.
      Bemærk: Opskriften på cellen afmontering EDTA-oploesning er som følger: 100 mL 10 x Hanks' Balanced Salt løsning (HBSS) + 10 mL 1 M HEPES (pH 7,6) + 10 mL af 7,5% natriumbikarbonat + 2,4 mL 500 mM EDTA + 1 L H2O. PH-værdien justeres til 7,4.
    2. Suge ud alle celle afmontering løsning og tilføje IMDM komplet medium. Sprede keratocytes af blid pipettering. Justere celle løsning tæthed til det ønskede niveau (1 x 104– 1 x 105/mL). Plade celler på ITS overfladen (tilberedt efter afsnit 2). Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 30 min før billeddannelse.
      Bemærk: Celle optælling kan være gjort med en hemocytometer efter afmontering af celler med afmontering løsning. Cellen plating tæthed er relativt lavt, således at keratocytes har masser af areal til at migrere.
  3. Plade CHO-K1 celler og NIH 3T3 celler på sin overflader.
    Bemærk: Medium for CHO-K1 celler er 89% skinke F12 + 10% FBS + 1% penicillin. Medium til NIH 3T3 celler er 89% Dulbecco modificerede Eagle medium (DMEM) + 10% kalv bovint serum (CBS) + 1% penicillin. Dyrkningsbetingelserne er 37 ° C og 5% CO2.
    1. Kultur CHO-K1 celler eller NIH 3T3 celler til 80%-100% sammenløbet i en petriskål (eller kultur kolbe).
    2. Varme cellen afmontering løsning og næringssubstratet til 37 ° C.
    3. Fjerne alle næringssubstratet i petriskål med en pipette. Vaske cellerne 1 x med celle afmontering løsning. Dække celler med afmontering løsning og der inkuberes ved 37 ° C i 10 min.
    4. Sprede cellerne af pipettering. Indsamle celle løsning og centrifugeres ved 300 x g i 3 min.
    5. Suge supernatanten og tilføje komplet medium eller serumfrit medium.
    6. Justere celle løsning tæthed til det ønskede niveau (1 x 105 – 1 x 106/mL). Plade celler på ITS overflader (tilberedt efter afsnit 2). Inkuber celler ved 37 ° C i 1-2 h før billedbehandling, eller 30 min før videooptagelse.

4. imaging, video optagelse og real-time integrin spænding kortlægning

  1. Quasi-real-time imaging integrin spændinger i levende celler
    1. Inkubér keratocytes på sin overflader (tilberedt efter afsnit 2) i 30 min. ved stuetemperatur, eller Inkuber CHO-K1 celler eller NIH 3T3 celler i 1 time på sin overflader i en inkubator ved 37 ° C.
    2. Montere petriskålen på et fluorescens mikroskop scenen. Udføre cellulære kraft imaging med en eksponeringstid af 1 s. Forstørrelsen er 40 x eller 100 x.
    3. Tag en video af sine billeder med en frame interval 20 s for keratocytes eller 1-2 min for CHO-K1 celler eller NIH 3T3 celler.
    4. Bruge MATLAB eller et andet billede analyseværktøj til at trække en foregående ramme af ITS video fra en nuværende ramme til at beregne ITS signalet nyligt produceret i det seneste frame interval. Den nyligt producerede ITS signal repræsenterer integrin spænding genereret i det nyeste frame interval, dermed rapportering den cellulære kraft på en quasi-real-time måde.
  2. Coimaging af integrin spændinger og cellulære struktur i immunostained celler
    1. Efter trin 3.2.2 eller trin 3.3.6, udføre immunfarvning for at markere målet strukturelle proteiner.
      Bemærk: Brug forskellige farvestoffer til at undgå fluorescens krydstale mellem integrin spænding imaging og celle strukturel billeddannelse. I dette manuskript, Cy5 fluorophore blev brugt til phalloidin og Alexa 488 blev brugt til vinculin farvning. Koncentrationen af både primære og sekundære antistof er 2,5 µg/mL. Koncentration af phalloidin er 1,5 enheder/µL.
    2. Udføre multifluorescent kanal imaging for at erhverve en integrin spænding kort og celle strukturel billeddannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med ITS, blev integrin spænding kort af fisk keratocytes fanget. Det viser, at en keratocyte vandrer og genererer integrin spænding på to kraft spor (figur 2A). Opløsning af kraft kort var kalibreret til at være 0,4 µm (figur 2B). Høj integrin spænding koncentrerer sig på den bageste margin (figur 3A). ITS viser også forskellige specifikke mønstre af forskellige celler. En nonmotile celle, NIH-3T3, danner en specifik integrin spænding mønster (figur 3B) helt forskellig fra den hurtige overfører keratocyte.

Med immunfarvning coimaged fokale sammenvoksninger og integrin spænding af fisk keratocytes var (figur 4A). Forholdet mellem integrin spændinger og cellestruktur i keratocytes blev studeret i detaljer af Wang et al.25. Integrin spændinger og stress fibre i CHO-K1 celler blev også coimaged (figur 4B). Disse eksperimenter tyder på, at ITS muliggør coimaging af celle vedhæftning kraft og cellestrukturer samtidigt under lignende imaging indstillinger for dermed at lette undersøgelsen af celle struktur/kraft samspillet.

Figure 1
Figur 1: skemaer af den sin. ITS er en dsDNA dekoreret med en M.H.T. ligand, en fluorescens quencher, et farvestof samt et biotin tag. Farvestof (grøn-fyldt cirkel) er slukket af quencher. Under integrin spænding, dsDNA er bristet og Cy3 er befriet fra dæmper og udsender fluorescens, der kan registreres af fluorescerende mikroskopi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Integrin spænding kort af en fisk keratocyte og submicron opløsningen af ITS. (A) under hurtig overførsel, en keratocyte konsekvent genererer en integrin spænding kort i to kraft spor. (B) afstanden mellem to kraft ruter er typisk 40 µm. Den rumlige opløsning af cellulære kraft kort afbildet af ITS er omkring 0,4 µm. Den lineære profil af Cy3 fluorescerende intensiteten af området markeret ved en kort rød linje i den nederste venstre panel beregnes for kalibrering af opløsningen i cellulære kraft billeddannelse. Resultatet er vist i nederste højre panel og monteret med en Gaussisk kurve. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Real-time integrin spænding kort af en fisk keratocyte og NIH-3T3. (A) A fisk keratocyte og dens integrin spænding kort. (Øverst til venstre) En motile fisk keratocyte. (Nederst til venstre) Integrin spænding kort over keratocyte rapporteret af ITS. (Øverst til højre) Real-time integrin spænding er opnået ved frame subtraktion. Det viser, at den nyligt oprettede integrin spænding er colocalized med celle bagkant. (Nederst til højre) Integrin spænding kort (grøn) og real-time integrin spænding (magenta) er præsenteret i en flettet figur. Skalalinjen = 10 µm. (B) en NIH-3T3 fibroblast og dens integrin spænding kort. (Øverst til venstre) En NIH-3T3 fibroblast. (Nederst til venstre) Integrin spænding kort over NIH-3T3 fibroblast. Integrin spænding blev genereret i et stribemønster. (Øverst til højre) Real-time integrin spændinger viser, at nyligt genererede integrin spænding hovedsagelig danner på celle randområde. (Nederst til højre) Integrin spænding kort (grøn) og real-time integrin spænding (magenta) er præsenteret i en flettet figur. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Coimaging af integrin spændinger og celle struktur. (A) Coimaging af integrin spænding, vinculin og F-actin i en keratocyte. Keratocyte var fast og immunostained til vinculin og F-actin. (B) Coimaging af integrin spænding, vinculin og F-actin i en CHO-K1 celle. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ITS er en meget tilgængelig endnu kraftfulde teknik for cellulær tvinge kortlægning både syntese og anvendelse. Med alle materialer klar, kan ITS syntetiseres i 1 dag. Under eksperimenter, er kun tre trin af overfladebehandling nødvendig før celle plating. For nylig, vi yderligere forenklet proceduren belægning til et trin af direkte forbinder ITS til bovin serum albumin, som giver mulighed for direkte fysisk adsorption af ITS til glas eller polystyren overflader33. ITS bringer fluorescerende intensiteten af cellulære kraft signal til en sammenlignelig cellulære strukturelle billeddannelse. Praktisk syntese og prøveforberedelse, beskedne krav til mikroskopi og høj følsomhed for cellulære kraft gør ITS en robust og driftsikker teknik til undersøgelse af celle mekanik. I dette papir præsenterede vi en omfattende procedure for sin syntese og anvendelse.

De tråddannende M.H.T. er ligand med ssDNA den mest kritiske procedure i ITS syntese. Som nævnt i afsnittet protokol, er NHS ester på sulfo-Investeringsfondene ikke stabilt i vand. Jo længere det tager for at opløse sulfo-Investeringsfondene i vand, de mere mængden af sulfo-Investeringsfondene mister NHS ester til hydrolyse og bliver "dud", som konjugater med DNA gennem maleimide-thiol reaktion, men undlader at konjugat med M.H.T.-NH2. Som følge heraf en stor del af DNA-molekyler vil blive besat af den døde sulfo-Investeringsfondene og kan ikke sammenkædes med M.H.T., fører til et lavt udbytte af ssDNA-M.H.T.. Af denne grund, bør opløse sulfo-Investeringsfondene i vand færdiggøres hurtigt, normalt inden for 1 min. Det anbefales også at kontrollere udbytteforholdet mellem ssDNA-M.H.T. med elektroforese. Hvis udbyttet er højere end 80%, rensning er generelt unødvendige. Ellers anbefales DNA oprensning af polyacrylamid gel. Genfindingsprocenten for DNA af polyacrylamid gel er omkring 60%-80%.

For at syntetisere et rimeligt beløb af M.H.T.-ssDNA-BHQ2, bør startbeløbet thiol-ssDNA-BHQ2 være mindst 20 nmol (1 mM x 20 µL). Bemærk at DNA ændringer betydeligt reducere mængden af ssDNA bestilt fra DNA virksomheder. For eksempel hvis 1.000 nmol af ssDNA med to ændringer er bestilt, kan det garanterede afkast kun være 20 nmol. Hvis dette er tilfældet, skal du bestille mindst 1000 nmol af ssDNA for M.H.T.-ssDNA konjugering. Forskere kan også designe deres egen sekvenser til sin konstruktioner. Normalt, holder vi GC indhold i ITS højere end 70% at forbedre dsDNA termisk stabilitet. DNA Sekvensanalyse kan udføres for at minimere sandsynligheden for danner self-hårnål, selvstændig hybridisering, stabil sekundær struktur. Den analyseværktøj er tilgængelig online. I manuskriptet er den øvre strand DNA den samme for ITSs med forskellige Ttol. Vi varierer biotin placering ved den nedre strand DNA for at opnå en anden Ttol. Dog kan varierende placeringen af M.H.T. på den øvre strand også anvendes til at tune Ttol af ITS. Beregning af Ttol for en anderledes dsDNA geometri er fastsat af Wang og Ha22 og Mosayebi et al.34, især for dsDNA i unzipping tilstand35,36 og shear mode 37,38.

Selv om dens overflader optage alle integrin spændinger, der er sket i fortiden, ved at optage en video af cellulære kraft kort efter hinanden, kan forskere beregne den integrin spænding produceret i det seneste frame interval ved at fratrække den forrige ramme fra en nuværende ramme til at generere quasi-real-time cellular kraft-kort. Frame interval i ITS video varierer afhængigt af celletyper men er normalt 20 s for hurtig overflytning celler og 1-2 min for stationære celler. Metoden frame subtraktion rapporter quasi-real-time integrin spændinger samtidig bevare den høje følsomhed for integrin spænding billeddannelse af signal ophobning virkningen. Photobleaching er minimal mellem to på hinanden følgende billeder, og har derfor ingen observerbare indflydelse til metoden frame subtraktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af fondens opstart fra Iowa State University og af National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA-biotin Sigma-Aldrich A8549
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Streptavidin Thermo Fisher Scientific 434301
upper strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group Peptides International PCI-3696-PI
IMDM ATCC ‎62996227
FBS ATCC 302020
Penicillin gibco 15140122
TCEP Sigma-Aldrich C4706
200 uL petri dish Cellvis D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000 Thermo Scientific N/A spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit Hoefer SE410-15-1.5 Device for electroporesis
CHO-K1 cell line ATCC CCL-61
NIH/3T3 cell line ATCC CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody EMD Millipore 90227 Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175 Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287
Eclipse Ti Nikon N/A microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
  2. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  3. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
  4. Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
  5. Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
  6. Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
  7. Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
  8. Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
  9. Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
  10. Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
  11. Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
  12. Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
  13. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
  14. Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 235-244 (2017).
  15. Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  16. Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
  17. Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
  18. Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
  19. Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  20. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
  21. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  22. Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
  23. Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
  24. Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
  25. Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
  26. Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
  27. Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
  28. Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
  29. Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  30. Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
  31. Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
  32. Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
  33. Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
  34. Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
  35. Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
  36. Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
  37. de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
  38. Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).

Tags

Retraktion spørgsmålet 146 celle mekanik mechanobiology Integra integrin spænding cellulære kraft kortlægning integrin spænding sensor
Imaging Integrin spændinger og cellulære kraft på Submicron opløsning med en integrativ spænding Sensor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X.… More

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor. J. Vis. Exp. (146), e59476, doi:10.3791/59476 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter