Summary
Tensione di integrina svolge i ruoli importanti in varie funzioni cellulari. Con un sensore di tensione integrativa, integrina tensione è calibrato con sensibilità picoNewton (pN) e ripreso a risoluzione di submicron.
Abstract
Molecolare tensione trasmessa dal ligando integrinico obbligazioni è il segnale meccanico fondamentale nella via dell'integrina che gioca un ruolo importante in molte funzioni cellulari e comportamenti. Per calibrare e integrina tensione della battuta con forza elevata sensibilità e risoluzione spaziale, abbiamo sviluppato un sensore di tensione integrativa (ITS), un sensore di tensione fluorescente basati sul DNA. L'ITS viene attivato per essere flourescente se sostenere una tensione molecolare, così convertire forza segnale fluorescente a livello molecolare. La soglia di tensione per l'attivazione di ITS è accordabile nell'intervallo di pN 10 – 60 che ben copre la gamma dinamica della tensione delle integrine in cellule. Su un substrato innestato con un ITS, la tensione di integrin di cellule aderenti è visualizzata tramite fluorescenza ed imaged a risoluzione di submicron. L'ITS è anche compatibile con formazione immagine strutturale delle cellule in cellule vive e cellule fissate. L'ITS è applicato con successo per lo studio della contrazione delle piastrine e migrazione cellulare. Questa carta in dettaglio la procedura per la sintesi e l'applicazione dell'ITS nello studio della forza cellulare integrina-trasmessa.
Introduction
Le cellule si basano sulle integrine di aderire ed esercitano forze cellulare alla matrice extracellulare. Trasmissione di adesione e forza di integrina-mediata delle cellule sono cruciali per cella diffusione1,2, migrazione3,4e sopravvivenza5,6,7. A lungo termine, integrina biomeccanico segnalazione influenza anche cellula proliferazione8,9,10 e differenziazione11,12. I ricercatori hanno sviluppato diversi metodi per misurare e cellulare di integrina-trasmessa mappa forze all'interfaccia cellula-matrice. Questi metodi sono basati su substrato elastico13, matrice di micropost14, o atomico forza microscopia (AFM)15,16. Elastico substrato e micropost metodi si basano sulla deformazione di substrati per segnalare lo stress cellulare e hanno limitazioni in termini di risoluzione spaziale e forzare la sensibilità. AFM ha forza elevata sensibilità, ma non può rilevare la forza in più punti contemporaneamente, rendendo difficile la mappa cellulare forza trasmessa da integrine.
Negli ultimi anni, diverse tecniche sono state sviluppate per studiare la forza cellulare a livello molecolare. Un insieme di sensori di tensione molecolare basato su polietilene glicole17,18, ragno seta peptide19e DNA20,21,22,23 sono stati sviluppati per visualizzare e monitorare la tensione trasmessa dalle proteine molecolari. Tra queste tecniche, DNA fu adottato come il materiale di sintesi nella tensione gauge tether (TGT), un linker rupturable che modula il limite superiore delle tensioni delle integrine in cellule vive22,24. Più tardi, tecnica di trasferimento di risonanza di fluorescenza e di DNA sono stati combinati per creare tornante sensori basati sul DNA fluorescente tensione prima gruppo23 di Chen e gruppo20 di Salaita. Il sensore di tensione basati sul DNA tornante segnala integrina tensione in tempo reale e ha applicato con successo per lo studio di una serie di funzioni cellulari21. In seguito, laboratorio di Wang combinato un TGT con la coppia di fluorophore-quencher per tensione di integrin di relazione. Questo sensore è denominato un ITS25,26. L'ITS è basato sul DNA a doppia elica (dsDNA) e ha una gamma dinamica più ampia (pN 10-60) per la calibrazione di tensionamento di integrina. A differenza dei sensori basati sul DNA di tornante, l'ITS non segnala forza cellulare in tempo reale ma registra tutti gli eventi di integrina storico come l'impronta della forza cellulare; Questo processo di accumulazione di segnale migliora la sensibilità per forza cellulare imaging, rendendo così possibile alla forza cellulare immagine anche con un microscopio a fluorescenza di fascia bassa. La sintesi dell'ITS è relativamente più conveniente in quanto è creato da ibridare due DNAs singola elica (ssDNA).
L'ITS è un dsDNA 18-base-accoppiato coniugato con biotina, un fluoroforo e un quencher (buco nero Quencher 2 [BHQ2])27un ciclico arginylglycylaspartic acido (RGD) peptide28 come un ligando di peptide integrina (Figura 1). Il filo inferiore è coniugato con il fluoroforo (Cy3 è usato in questo manoscritto, mentre altri coloranti, come serie di Cy5 o Alexa, inoltre sono stati dimostrati fattibile nel nostro laboratorio) e il tag di biotina, con cui l'ITS è immobilizzato su un substrato di legame biotina-avidina. Il filo superiore è coniugato con il peptide RGD e il Quencher di buco nero, che disseta Cy3 con circa 98% dissetante efficienza26,27. Con il protocollo presentato in questa carta, la densità di rivestimento dell'ITS su un substrato è circa 1.100/µm2. Questa è la densità che abbiamo precedentemente tarati per 18 bp biotinilati dsDNA rivestito sul substrato neutrAvidin-funzionalizzate seguendo lo stesso protocollo29del rivestimento. Quando le cellule aderiscono al substrato rivestito con l'ITS, integrina associa l'ITS attraverso RGD e trasmette tensione per l'ITS. L'ITS ha una tolleranza di tensione specifico (Ttol) che è definita come la soglia di tensione che separa meccanicamente il dsDNA dell'ITS entro 2 s22. SUA rottura da integrina tensione conduce alla separazione del quencher dal colorante che successivamente emette fluorescenza. Di conseguenza, la tensione di integrina invisibile viene convertita in un segnale di fluorescenza e la forza di cellulare possa essere mappata da formazione immagine di fluorescenza.
Per illustrare l'applicazione dell'ITS, utilizziamo pesce del keratocyte qui, un modello ampiamente usato cella per cella migrazione Studio30,31,32, CHO-K1 cellulare, una linea cellulare immobili comunemente utilizzati e dei fibroblasti NIH 3T3. Coimaging delle strutture di tensione e cella di integrina è anche condotto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di uso (IACUC, 8-16-8333-I) della Iowa State University e istituzionali Animal Care.
1. sintesi del sensore tensione integrativa
- Personalizzare e ordinare ssDNAs (Vedi la Tabella materiali).
Nota: Le sequenze di ssDNA sono come segue. Il filo superiore è /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. I fili inferiori sono come segue.
12 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio/
23 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT/ CCC
33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
pN 54 ITS: /5Biosg/iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC
Qui, /5ThioMC6-D / rappresenta un modificatore del tiolo C6 S-S (disolfuro) all'estremità 5'. /3BHQ_2/ rappresenta un buco nero Quencher 2 all'estremità 3'. 3Bio /, / 5Biosg/e /iBiodT/ sono biotinylation all'estremità 3' estremità 5' e sulla timina del DNA interno, rispettivamente. /iCy3/ rappresenta un Cy3 inserita nel backbone del interna di ssDNA. Questi codici sono utilizzati dal fornitore commerciale specifico usato qui e potrebbero essere diversi in altre società di DNA. - Peptide RGD coniugato ad SH-ssDNA-quencher.
Nota: I reagenti impiegati sono tampone fosfato salino (PBS), Sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloesano-1-carbossilato (sulfo-SMCC), peptide RGD e tris-(2-carboxyethyl) cloridrato di fosfina, noto anche come TCEP-HCl.- DEPROTECT il modificatore del tiolo sul DNA strand superiore utilizzando TCEP soluzione.
Nota: Tiolo-modificato DNAs ordinato da una fonte commerciale vengono spediti in forma ossidata, con gli atomi di zolfo protetti da un ponte disolfuro che deve essere ridotta prima coniugazione RGD-DNA. TCEP è un reagente di riduzione inodore usato per la deprotezione del tiolo.- Sciogliere 14,3 mg di TCEP-HCl in 300 µ l di acqua. Regolare il pH della soluzione TCEP a ~7.2–7.4 con una soluzione di NaOH 1 M (circa 150 µ l), utilizzando documenti di test del pH. Aggiungere acqua pura per rendere un volume finale di 0.5 mL. La concentrazione finale di TCEP è 100 mM.
Nota: Si consiglia di rendere TCEP soluzione fresca ogni volta per deprotezione del tiolo del DNA. Evitare lo stoccaggio soluzione TCEP per lungo tempo. - Aggiungere 100 µ l di soluzione di 0,5 M Etilendiamminotetraacetico acido (EDTA) e 400 µ l di acqua alla soluzione TCEP.
- Aggiungere 10 µ l della soluzione TCEP + EDTA a 20 µ l di 1 mM del tiolo-DNA-BHQ2 in PBS. Lasciare reagire per 30 min a temperatura ambiente.
Nota: Il legame disolfuro di 5' modificatore del tiolo coniugazione C6 S-S a questo ssDNA sarà essere clivato da TCEP, lasciando il gruppo tioalcool pronta per reazione con maleimide nei passaggi successivi. Il TCEP non interferisce con la seguente reazione tiolo-maleimide; così, non è necessario di passivare TCEP dopo questo passaggio.
- Sciogliere 14,3 mg di TCEP-HCl in 300 µ l di acqua. Regolare il pH della soluzione TCEP a ~7.2–7.4 con una soluzione di NaOH 1 M (circa 150 µ l), utilizzando documenti di test del pH. Aggiungere acqua pura per rendere un volume finale di 0.5 mL. La concentrazione finale di TCEP è 100 mM.
- Coniugato RGD-NH2 con sulfo-SMCC.
- Sciogliere 5 mg di RGD-NH2 in 100 µ l di PBS per ottenere 11 mM RGD-NH2.
- Aggiungere 200 µ l di acqua pura al tubo con 2 mg di sulfo-SMCC (predosate dal fornitore). Smash il sulfo-SMCC solido con un puntale e pipettare vigorosamente allo stesso tempo per facilitare la dissoluzione del SMCC in acqua. La concentrazione di sulfo-SMCC sarà 23 mM.
Nota: Poiché l'estere NHS in sulfo-SMCC è soggetto a idrolisi e ha una durata di pochi minuti, questo passaggio dissoluzione dovrebbe essere completato entro 1 min per evitare un'eccessiva perdita dell'estere NHS a causa di idrolisi. Utilizzare acqua pura per sciogliere sulfo-SMCC perché la relativa solubilità in PBS o altri buffer è povero. - Aggiungere 40 µ l di soluzione di sulfo-SMCC alla soluzione di2 RGD-NH 100 µ l e incubare per 20 minuti.
Nota: L'estere NHS in sulfo-SMCC reagirà con il gruppo amminico in RGD-NH2, formando un legame dell'ammide che collega RGD e sulfo-SMCC.
- Coniugato RGD-SMCC con il SH-ssDNA-quencher.
- Mescolare le soluzioni elaborate in punti 1.2.1 e 1.2.2 e incubare la miscela per 1 h a temperatura ambiente. Spostare la soluzione su un set di frigorifero a 4 ° C e lasciar reagire ulteriormente durante la notte. Il tiolo coniugato sul DNA strand superiore reagirà con maleimide su sulfo-SMCC, formando un gruppo tioetere che collega RGD con il filo superiore del DNA.
- Eseguire la precipitazione dell'etanolo per purificare RGD-ssDNA-quencher da non reagito sulfo-SMCC, RGD e TCEP.
- Chill 10 mL di etanolo al 100% in una provetta conica da 15 mL in un congelatore a-20 ° C per almeno 30 min.
- Mescolare una soluzione di NaCl di M 3, una soluzione di DNA e refrigerato etanolo a un rapporto volumetrico di 01:10:25. Tenere il liquido misto in un congelatore di-20 ° C per 30 minuti o fino a quando il DNA è precipitato.
- Centrifugare il liquido a 10.000 x g per 30 min. eliminare il supernatante.
- Aggiungere PBS al pellet di DNA. Misurare la concentrazione di DNA usando uno spettrometro.
- (Opzionale) Eseguire l'elettroforesi del DNA per ottenere una maggiore purezza di RGD-ssDNA.
Nota: Con il protocollo di cui sopra, circa il 70 – 90% del ssDNA saranno coniugati con RGD. Se si desidera maggior purezza, elettroforesi del DNA può essere eseguita anche per separare il DNA coniugato dal DNA non coniugato.- Assemblare un sistema di elettroforesi verticale.
- Preparare una soluzione di gel di poliacrilammide del 10% con 50 mL di acqua pura, 20 mL di gel dell'acrilamide 40%, 8 mL di tris-borato-EDTA (TBE) tampone 10x e 800 µ l di 10% ammonio persolfato (APS).
- Aggiungere 80 µ l di tetrametiletilendiammina (TEMED) alla soluzione di gel. Versare la soluzione nella camera di vetro del sistema elettroforesi. Inserire un pettine di singolo-pozzo per creare un pozzo sulla superficie del gel. Attendere 10 minuti fino a quando il gel è reticolato.
- Miscelare la soluzione di DNA con glicerolo 100% con un rapporto di volume di 1:1. Togliere il pettine e caricare la soluzione di DNA al gel bene.
- Esegua il gel ad una tensione di 200 V. osservare due fasce del DNA in cui il lagging uno è il DNA coniugato.
- Tagliare la banda di gel con il DNA coniugato e tagliatela a dadini piccoli pezzetti.
- Raccogliere il gel a dadini in due provette da centrifuga da 1,5 mL con filtri. Aggiungere 500 µ l di PBS in ogni provetta.
- Mettere il gel PBS-imbevuto in un luogo buio a temperatura ambiente per 1 giorni. DNA si diffonderà fuori i pezzi di gel in PBS.
- Raccogliere la soluzione di DNA mediante centrifugazione le provette a 1.000 x g per 2 min.
- Eseguire un altro ciclo di precipitazione dell'etanolo (punto 1.2.4) per raccogliere il DNA.
- DEPROTECT il modificatore del tiolo sul DNA strand superiore utilizzando TCEP soluzione.
- Sintetizzare l'ITS di ibridare RGD-ssDNA-quencher e colorante-ssDNA-biotina.
- Mescolare le soluzioni del filo superiore e il filo inferiore DNAs con un rapporto molare di 1.1:1. Mantenere la miscela a 4 ° C durante la notte per produrre il suo tramite l'ibridazione del DNA.
Nota: Un rapporto molare di 1.1:1 per l'ibridazione del DNA viene utilizzato invece di 1:1. Eccessiva RGD-ssDNA-quencher viene utilizzato per garantire che tutte le tinture-ssDNA-biotina sarà ibridare con RGD-ssDNA-quencher. RGD-ssDNA-quencher senza ibridazione saranno lavate durante il rivestimento superficiale, che non influirà sulla qualità del rivestimento superficiale di ITS. - Aliquotare e conservare la soluzione ITS a-20 ° C per la conservazione a lungo termine.
Nota: Il buffer di memoria è PBS e la concentrazione di deposito generalmente deve essere superiore a 10 µM. Per un uso regolare, la soluzione può essere conservata a 4 ° C per un paio di settimane senza deterioramento della qualità evidente.
- Mescolare le soluzioni del filo superiore e il filo inferiore DNAs con un rapporto molare di 1.1:1. Mantenere la miscela a 4 ° C durante la notte per produrre il suo tramite l'ibridazione del DNA.
2. preparazione delle superfici da immobilizzare l'ITS su piastre di Petri con fondo di vetro
Nota: I reagenti impiegati sono biotinilati albumina di siero bovino (BSA-biotina), la proteina avidina e ITS. Chill tutti i reagenti e tampone PBS a circa 0 ° C sul ghiaccio con un secchio di ghiaccio.
- Caricare 200 µ l di 0,1 mg/mL BSA-biotina in PBS sul pozzetto di una piastra Petri con fondo di vetro (29 mm di diametro, con ben 14 mm). Incubare per 30 min a 4 ° C in frigorifero. BSA-biotina è fisicamente adsorbita sulla superficie del vetro.
- Aspirare la soluzione dal bene utilizzando una pipetta e aggiungere 200 µ l di PBS torna al pozzo per lavare la superficie. Ripetere questo x 3 per completare il lavaggio.
- Incubare 200 µ l di proteina di avidina 50 µ g/mL nel pozzo per 30 min a 4 ° C. Lavare 3 volte con PBS. Dopo questo passaggio, la proteina avidina si lega a BSA-biotina e diventa immobilizzata sulla superficie del vetro.
- Incubare 200 µ l di 0,1 µM ITS nel pozzo per 30 min a 4 ° C. Lavare il piatto con 3 volte con PBS. Lasciare PBS nel pozzo fino la placcatura di cella. Dopo questo passaggio, l'ITS con l'etichetta di biotina si lega alla proteina avidina e diventa immobilizzato sulla superficie.
Nota: Una precauzione critica per la sua qualità di rivestimento e omogeneità durante l'immobilizzazione di ITS è di non lasciare mai la superficie della piastra di Petri asciugare. Mantenendo tutti i reagenti e PBS a 4 ° C o 0 ° C sul ghiaccio con un secchiello per il ghiaccio aiuta a ridurre il tasso di evaporazione dell'acqua durante le fasi di lavaggio, quando PBS è tirato fuori dal pozzo.
3. cellula placcatura sulle sue superfici
- Cultura pesci keratocytes.
Nota: Qui, ciprino dorato (Carassius auratus) viene utilizzato come un esempio, ma potrebbero funzionare anche altre specie di pesci.- Strappare un pezzo di pesce scala da un pesce con una pinzetta piatto-punta. Spingere delicatamente la scala il pozzo di una capsula di Petri con fondo di vetro, con il lato interno della scala contattando il vetro. Attendere circa 30 s per la scala di pesce di aderire bene alla superficie del vetro del piatto.
- Aggiungere 1 mL di Iscove per volta medio (IMDM) completa medio di Dulbecco per coprire completamente la scala di pesce. Tenere la piastra di Petri in una scatola buia e umida per 6 – 48 h a temperatura ambiente.
Nota: Terreno completo IMDM contiene 79% IMDM + 20% siero bovino fetale (FBS) + 1% di penicillina. Non è necessaria alcuna alimentazione supplementare di ossigeno o CO2 . Alcuni rotoli di carta velina, inumiditi con acqua e possono essere lasciati nella casella a mantenere alta umidità nella casella. Pesce keratocytes migrerà fuori la scala di pesce come un foglio delle cellule dopo poche ore. Questo può essere osservato con un microscopio di coltura del tessuto. Le cellule sono generalmente praticabile a 48 h.
- Staccare e le cellule di cheratociti su ITS superfici della lastra.
- Togliere il mezzo di Petri in cui la scala di pesce è stata coltivata. Lavare il bene 1x con cella disconnessione soluzione e aggiungere soluzione distaccante per coprire la scala di pesce ed incubare per 3 min.
Nota: La ricetta per la cella disconnessione EDTA soluzione è la seguente: 100 mL di 10 x Hanks' bilanciato sale soluzione (HBSS) + 10 mL di 1 M HEPES (pH 7,6) + 10 mL di bicarbonato di sodio 7,5% + 2,4 mL di 500 mM EDTA + 1 L di H2O. Il pH è regolato a 7,4. - Aspirare tutti i cellulare disconnessione soluzione e aggiungere il terreno completo IMDM. Disperdere i cheratociti pipettando delicato. Regolare la densità della soluzione di cella al livello desiderato (1 x 104– 1 x 105/ml). Piastra le cellule sulla superficie ITS (preparato secondo la sezione 2). Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 min prima di formazione immagine.
Nota: Conta cellulare può essere fatto con un emocitometro dopo lo scollegamento delle cellule con disconnessione soluzione. La cella placcatura densità è relativamente bassa, affinché i keratocytes hanno un sacco di superficie per la migrazione.
- Togliere il mezzo di Petri in cui la scala di pesce è stata coltivata. Lavare il bene 1x con cella disconnessione soluzione e aggiungere soluzione distaccante per coprire la scala di pesce ed incubare per 3 min.
- Cellule di CHO-K1 piastra e cellule NIH 3T3 sulle sue superfici.
Nota: Il supporto per le cellule di CHO-K1 è del 89% Ham F12 + 10% FBS + 1%, penicillina. Il mezzo per cellule NIH 3T3 è medio dell'Aquila di 89% Dulbecco modificato (DMEM) + 10% siero bovino di vitello (CBS) + 1% di penicillina. Le condizioni di coltura sono 37 ° C e 5% CO2.- Cellule di CHO-K1 cultura o cellule NIH 3T3 alla confluenza di 80 – 100% in una capsula di Petri (o matraccio di cultura).
- Riscaldare la cellula lo scollegamento soluzione e terreno di coltura a 37 ° C.
- Rimuovere tutti i terreno di coltura di Petri con una pipetta. Lavare le cellule 1 x cella disconnessione soluzione. Coprire le cellule con disconnessione soluzione e incubare a 37 ° C per 10 min.
- Disperdere le cellule pipettando. Raccogliere la soluzione di cella ed e centrifugare a 300 x g per 3 min.
- Aspirare il supernatante e aggiungere terreno completo o medium senza siero.
- Regolare la densità della soluzione di cella al livello desiderato (1 x 105 – 1 x 106/ml). Piastra le cellule sulle superfici ITS (preparate secondo la sezione 2). Incubare le cellule a 37 ° C per 1 – 2 h prima di imaging, o 30 min prima della registrazione dei video.
4. formazione immagine, registrazione video e in tempo reale delle integrine tensione mapping
-
Quasi-Real-Time imaging di tensione delle integrine in cellule vive
- Incubare keratocytes sulle sue superfici (preparati conformemente al punto 2) per 30 min a temperatura ambiente, o incubare le cellule CHO-K1 o cellule NIH 3T3 per 1 h sulle sue superfici in un incubatore a 37 ° C.
- Montare la piastra di Petri su una fase di microscopio di fluorescenza. Eseguire imaging cellulare forza con un tempo di esposizione di 1 s. L'ingrandimento è 40 x o x 100.
- Fare un video di sue immagini con un intervallo di fotogrammi di 20 s per keratocytes, o 1 – 2 min per cellule CHO-K1 o cellule NIH 3T3.
- È possibile utilizzare MATLAB o un altro strumento di analisi di immagine per sottrarre un fotogramma precedente del video ITS da un fotogramma corrente per calcolare il segnale ITS appena prodotto nell'ultimo intervallo di fotogrammi. Il segnale ITS recentemente prodotto rappresenta la tensione di integrina generata nell'ultimo intervallo di fotogrammi, quindi segnalazione la forza cellulare in maniera quasi-real-time.
-
Coimaging di tensione di integrina e struttura cellulare in cellule immunostained
- Dopo passaggio 3.2.2 o 3.3.6, eseguire immunostaining per contrassegnare le proteine strutturali di destinazione.
Nota: Utilizzare coloranti diversi per evitare il crosstalk fluorescenza tra integrina tensione imaging e formazione immagine strutturale delle cellule. In questo manoscritto, Cy5 fluoroforo è stato usato per falloidina e Alexa 488 è stato utilizzato per la colorazione del vinculin. Concentrazione di anticorpi primari e secondari è 2,5 µ g/mL. La concentrazione per la falloidina è di 1,5 unità / µ l. - Eseguire multifluorescent canale imaging per acquisire una mappa tensione integrina e la formazione immagine strutturale delle cellule.
- Dopo passaggio 3.2.2 o 3.3.6, eseguire immunostaining per contrassegnare le proteine strutturali di destinazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Con l'ITS, la mappa di tensione integrina dei keratocytes di pesce è stata catturata. Dimostra che un keratocyte migra e genera tensione integrina alle due tracce di forza (Figura 2A). La risoluzione della mappa forza è stata calibrata per essere 0,4 µm (Figura 2B). Integrina alta tensione si concentra sul margine posteriore (Figura 3A). L'ITS Mostra anche diversi modelli specifici di cellule diverse. Una cella immobili, NIH-3T3, costituisce un modello per la tensione dell'integrina specifico (Figura 3B) abbastanza differente da quello del del keratocyte migrazione veloce.
Con immunostaining, adesioni focali e la tensione di integrin di pesce keratocytes erano coimaged (Figura 4A). La relazione tra tensione di integrina e struttura cellulare nei keratocytes è stata studiata in dettaglio da Wang et al.25. Fibre di tensione e lo stress di integrine in cellule CHO-K1 erano anche coimaged (Figura 4B). Questi esperimenti indicano che l'ITS consente la coimaging di forza di adesione delle cellule e strutture cellulari contemporaneamente sotto Impostazioni immagini simili, facilitando così lo studio dell'interazione di struttura/forza di cella.
Figura 1: schemi della sua. L'ITS è un dsDNA decorato con un ligando RGD, un quencher di fluorescenza, un colorante e un tag di biotina. La tintura (cerchio verde-riempito) è spenta mediante il quencher. Sotto tensione di integrina, il dsDNA è rotto e Cy3 è liberato dalla tempra ed emettono fluorescenza che possa essere rilevata da microscopia fluorescente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: mappa di tensionamento di Integrin di un pesce keratocyte e la risoluzione di submicron dell'ITS. (A) durante la migrazione veloce, un keratocyte costantemente genera una mappa di tensionamento di integrin in due tracce di forza. (B) la distanza tra i due brani di forza è in genere 40 µm. La risoluzione spaziale della mappa cellulare forza ripresa da ITS è di circa 0,4 µm. Il profilo lineare dell'intensità fluorescente Cy3 della zona segnata da una breve linea rossa nel pannello sinistro inferiore viene calcolato per la calibrazione della risoluzione nell'imaging cellulare forza. Il risultato è mostrato nel pannello destro inferiore e dotato di una curva gaussiana. La barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: mappa di tensionamento di integrin in tempo reale di un pesce keratocyte e NIH-3T3. (A) A pesci keratocyte e la mappa di tensionamento di integrina. (Parte superiore sinistra) Un pesce motili keratocyte. (Basso a sinistra) Mappa di tensione integrina della del keratocyte segnalato da ITS. (Alto a destra) Integrina in tempo reale tensione è stata ottenuta per sottrazione di telaio. Essa mostra che la tensione di integrina appena generato è colocalized con il bordo posteriore delle cellule. (In basso a destra) Mappa di tensione delle integrine (verde) e tensione in tempo reale delle integrine (magenta) sono presentati in una figura unita. La barra della scala = 10 µm. (B) un NIH-3T3 del fibroblasto e la mappa di tensionamento di integrina. (Parte superiore sinistra) Dei fibroblasti 3T3-NIH. (Basso a sinistra) Mappa di tensione integrina di fibroblasti 3T3-NIH. Integrina tensione generata in un motivo a strisce. (Alto a destra) Tensione di integrin in tempo reale mostra che appena generato integrina tensione forma principalmente alla regione periferica delle cellule. (In basso a destra) Mappa di tensione delle integrine (verde) e tensione in tempo reale delle integrine (magenta) sono presentati in una figura unita. La barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Coimaging della struttura di tensionamento e cella di integrina. (A) Coimaging di tensione di integrina, vinculina e F-actina in del keratocyte. Il keratocyte è stato risolto e immunostained per segnalare vinculina e F-actina. (B) Coimaging di tensione di integrina, vinculina e F-actina in una cella di CHO-K1. La barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'ITS è un altamente accessibile ma potente tecnica per cellulare mappatura in termini sia di sintesi e di applicazione della forza. Tutti i materiali pronti, l'ITS può essere sintetizzato entro 1 giorno. Durante gli esperimenti, sono necessari solo tre passaggi di rivestimento superficiale prima della placcatura di cella. Recentemente, abbiamo ulteriormente semplificato la procedura di rivestimento per un passo collegando direttamente il suo di albumina di siero bovino, che consente di adsorbimento fisico diretto dell'ITS a vetro o polistirolo superfici33. Il suo porta l'intensità di fluorescenza del segnale cellulare forza ad un livello paragonabile di cellulare imaging strutturale. La sintesi conveniente e preparazione del campione, modesti requisiti per microscopia e alta sensibilità per forza cellulare rendono l'ITS una tecnica robusta e affidabile per lo studio della meccanica delle cellule. In questa carta, abbiamo presentato una procedura completa per la sua sintesi e applicazione.
Coniugando RGD ligando con ssDNA è la procedura più critica nella sintesi ITS. Come accennato nella sezione protocollo, l'estere NHS il sulfo-SMCC non è stabile in acqua. Quanto più ci vuole per sciogliere sulfo-SMCC in acqua, la quantità più di sulfo-SMCC perde estere NHS all'idrolisi e diventa "cilecca", che coniuga con DNA attraverso la reazione di maleimide-tiolo, ma non riesce a coniugare con RGD-NH2. Di conseguenza, una grande porzione di molecole di DNA sarà occupata dal sulfo-SMCC morto e non è possibile collegare con RGD, portando a una bassa resa di ssDNA-RGD. Per questo motivo, sciogliendo il sulfo-SMCC in acqua dovrebbe essere completato rapidamente, in genere entro 1 min. Si raccomanda inoltre di controllare il rendimento di ssDNA-RGD con elettroforesi. Se il rendimento è supera al 80%, non è generalmente necessaria purificazione. In caso contrario, la purificazione del DNA dal gel di poliacrilammide è raccomandato. Il tasso di recupero del DNA dal gel di poliacrilammide è circa 60% – 80%.
Per sintetizzare una quantità ragionevole di RGD-ssDNA-BHQ2, l'importo iniziale di tiolo-ssDNA-BHQ2 dovrebbe essere almeno 20 nmol (1 mM x 20 µ l). Si noti che modificazioni del DNA riducono significativamente la quantità di ssDNA ordinato da aziende di DNA. Ad esempio, se viene ordinato 1.000 nmol di ssDNA con due modifiche, il rendimento garantito può essere solo 20 nmol. Se questo è il caso, ordinare almeno 1.000 nmol di ssDNA per la coniugazione di RGD-ssDNA. I ricercatori inoltre possono progettare le proprie sequenze per i suoi costrutti. Normalmente, manteniamo il contenuto di GC in ITS superiori al 70% per migliorare la stabilità termica di dsDNA. Analisi di sequenza del DNA può essere eseguita per ridurre al minimo la probabilità di formazione di auto-tornante, auto-ibridazione, stabile struttura secondaria, ecc. Lo strumento di analisi è disponibile online. Nel manoscritto, il filo superiore del DNA è lo stesso per ITSs con differenti Ttol. Variamo la posizione di biotina al filo inferiore del DNA per raggiungere un diverso Ttol. Tuttavia, variando la posizione di RGD sullo strand superiore può essere anche applicato per sintonizzare il Ttol dell'ITS. Il calcolo di Ttol per una geometria diversa dsDNA è fornito da Wang e Ha22 e Mosayebi et al.34, soprattutto per il dsDNA la decompressione modalità35,36 e la modalità di taglio 37,38.
Anche se le sue superfici registrano tutte le tensioni di integrina che hanno avuto luogo nel passato, registrando un video della mappa cellulare forza consecutivamente, i ricercatori in grado di calcolare la tensione di integrina prodotta nell'ultimo intervallo di fotogrammi sottraendo il fotogramma precedente da un fotogramma corrente per generare la 'quasi-real-time forza cellulare mappa'. L'intervallo di fotogrammi nel video ITS varia a seconda dei tipi di cella, ma è di solito 20 s per cellule migranti veloce e 1 – 2 min per celle fisse. Il metodo di sottrazione telaio riporta la tensione di integrina quasi-real-time pur mantenendo l'elevata sensibilità per l'integrina imaging di tensione a causa dell'effetto di accumulo di segnale. Photobleaching tra due immagini consecutive è minima e, pertanto, non ha alcuna influenza osservabile per il metodo di sottrazione di frame.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal fondo di avvio fornito da Iowa State University e dal National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA-biotin | Sigma-Aldrich | A8549 | |
| Neutravidin | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
| Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 434301 | |
| upper strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section |
| lower strand DNA | Integrated DNA Technologies | N/A | Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section. |
| sulfo-SMCC | Thermo Fisher Scientific | A39268 | |
| Cyclic peptide RGD with an amine group | Peptides International | PCI-3696-PI | |
| IMDM | ATCC | 62996227 | |
| FBS | ATCC | 302020 | |
| Penicillin | gibco | 15140122 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706 | |
| 200 uL petri dish | Cellvis | D29-14-1.5-N | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | N/A | spectrometer |
| SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit | Hoefer | SE410-15-1.5 | Device for electroporesis |
| CHO-K1 cell line | ATCC | CCL-61 | |
| NIH/3T3 cell line | ATCC | CRL-1658 | |
| Anti-Vinculin Antibody | EMD Millipore | 90227 | Primary antibody for vinculin immunostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | Secondary antibody for vinculin immunostaining |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | |
| Eclipse Ti | Nikon | N/A | microscope |
References
- Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R.
- Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
- Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
- Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
- Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
- Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
- Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
- Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
- Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
- Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
- Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
- Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 235-244 (2017).
- Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
- Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
- Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
- Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
- Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
- Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
- Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
- Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
- Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
- Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
- Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
- Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
- Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
- Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
- Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
- Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
- Mueller, J., et al.
- Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
- Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
- Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
- Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E.
- de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
- Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).
