Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Интегрин напряженности и клеточных силы на субмикронном резолюции с датчиком интегративной напряженности

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59476
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Summary

Интегрин напряженности играет важную роль в различных функций клеток. С датчиком интегративной напряженности Интегрин напряженности калибруется с чувствительностью picoNewton (pN) и образы на субмикронном резолюции.

Abstract

Молекулярные напряженности, переданные Интегрин лиганд облигаций — основных механических сигнал в Интегрин путь, который играет важную роль во многих функций клеток и поведения. Для калибровки и изображения Интегрин напряженности с высокой силой чувствительность и пространственным разрешением, мы разработали интегративной напряжение датчик (СТС), на основе ДНК флуоресцентные напряженности. ЕЕ активируется для флуоресцировать если поддержания молекулярной напряжение, таким образом преобразование силы в флуоресцентного сигнала на молекулярном уровне. Порог напряжения для ее активации перестраиваемой в диапазоне pN 10-60, который также охватывает весь динамический диапазон Интегрин напряженности в клетках. На подложке, привитый с СТС Интегрин напряженности адэрентных клеток визуализированное флуоресценции и отражаться на субмикронном резолюции. ЕЕ также совместим с структурных изображений клеток в живых клеток и фиксированные клетки. ЕЕ успешно применяется для изучения миграции клеток и тромбоцитов сужением. Этот документ подробно описывает процедуры для синтеза и применения ее в исследовании Интегрин передаются сотовый силы.

Introduction

Клетки полагаются на интегринов присоединиться и оказывают сотовой силы внеклеточного матрикса. При посредничестве Интегрин клеток адгезии и силы передачи имеют решающее значение для ячейки, распространение1,2,3,миграции4и выживания5,6,7. В долгосрочной перспективе Интегрин биомеханических сигнализации также влияет на клетки распространения8,9,10 и дифференциации11,12. Исследователи разработали различные методы для измерения и карта Интегрин передаются сотовый сил в интерфейсе ячейки матрицы. Эти методы основаны на упругие субстрат13, массив micropost14, или атомных сил микроскопии (АСМ)15,16. Эластичные субстрат и micropost методы полагаются на деформации субстратов сообщать клеточного стресса и имеют ограничения с точки зрения пространственного разрешения и заставить чувствительность. AFM имеет чувствительность высокой силы, но он не может обнаружить силы в нескольких местах одновременно, что затрудняет карта сотовой силы передано интегринов.

В последние годы были разработаны несколько методик для изучения клеточных силы на молекулярном уровне. Коллекция молекулярных напряжение датчиков на основе полиэтиленгликоля17,18, паук Шелковый пептид19и ДНК-20,-21,-22,-23 были разработаны для визуализации и мониторинга напряжения, передано низкомолекулярных белков. Среди этих методов ДНК был впервые принят как синтез материала в напряжение датчика троса (TGT), rupturable компоновщик, который модулирует верхний предел Интегрин напряженности в живые клетки22,24. Позже ДНК и флуоресценции техника передачи резонанса были объединены для создания шпильки на основе ДНК флуоресцентные напряжение датчиков сначала Чэня группы23 и Salaita в группы20. Шпилька напряженности на основе ДНК датчик сообщает Интегрин напряженность в режиме реального времени и успешно применяется для изучения ряда клеточных функций21. Потом Ван лаборатории комбинированный TGT с парой Флюорофор утоления доклад Интегрин напряженность. Этот датчик с именем его25,26. Основан на двойной спирали ДНК (dsDNA) и имеет более широкий динамический диапазон (pN 10-60) для калибровки Интегрин напряженности. В отличие от шпильки на основе ДНК датчики ее не сообщают сотовой силы в режиме реального времени, но записывает все события исторического Интегрин как след клеточных сил; Этот процесс накопления сигнала улучшает чувствительность для сотовых силу визуализации, что делает его возможным сотовой силам изображения даже с low-end флуоресцентным микроскопом. Синтез его относительно более удобным, как она создается гибридизировать двух одноцепочечной ДНК (ssDNA).

ЕЕ это 18-base паре dsDNA, конъюгированных с биотин, Флюорофор, утоления (черная дыра утоления 2 [BHQ2])27и циклических Аргинилглициласпарагиновая кислота (РГД) пептида28 как Интегрин пептидных лигандов (рис. 1). Нижняя нить проспряганное с Флюорофор (Cy3 используется в этой рукописи, в то время как другие красители, например Cy5 или Alexa серии, также оказались в нашей лаборатории) и биотин тега, с которым ее это иммобилизованные на подложке биотин авидин Бонд. Верхние пряди проспряганное с пептидной РСЗ и утоления черная дыра, которая утоляет Cy3 с приблизительно 98% тушения эффективности26,27. С протоколом, представленных в настоящем документе плотность покрытия ее на подложке составляет около 1100/мкм2. Это плотность, которую мы ранее калиброванные для 18 bp биотинилированным dsDNA покрытием на подложке neutrAvidin функционализированных следуя то же покрытие протокол29. Когда клетки присоединиться к подложке, с покрытием с ее, Интегрин привязывает ее через РСЗ и передает напряженность для ее. ЕЕ имеет конкретные напряженности терпимости (ТолT), который определяется как порог напряжения, который механически отделяет dsDNA ее в течение 2 s22. ЕГО разрыв Интегрин напряженности приводит к разделение утоления от красителя, который впоследствии испускает флуоресценции. В результате невидимый Интегрин напряжения преобразуется в сигнал флуоресценции и клеточных силы могут быть сопоставлены с флуоресцентным изображений.

Чтобы продемонстрировать применение ее, мы используем рыбы Кератоцит здесь, широко используемых ячеечная модель для клеток миграции исследование30,,3132, Чо-K1 ячеек, часто используемых аэробны клеточной линии и низ 3T3 фибробластов. Также проводится coimaging Интегрин напряженности и клеток структур.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC, 8-16-8333-я) из университета штата Айова.

1. синтез интегративной напряжение датчика

  1. Настройка и заказать ssDNAs (см. Таблицу материалов).
    Примечание: SsDNA последовательности являются следующие. Верхние пряди — /5ThioMC6-D/GGG общ ACG CAG КЭУ GCC/3BHQ_2 /. Нижней нити.
    12 pN его: / 5Cy3/GGC CCG КТГ CGT CCT CCC /3Bio/
    23 pN его: / 5Cy3/GGC CCG КТГ CGT CC /iBiodT/ CCC
    33 pN его: / 5Cy3/GGC CCG КТГ CG/iBiodT/CCT CCC
    43 pN его: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
    54 pN СТС: /5Biosg / / iCy3/GGC CCG КТГ CGT CCT CCC
    Здесь, /5ThioMC6-D представляет собой тиоловых модификатор C6 S-S (дисульфид) в конце 5'. /3BHQ_2/ представляет утоления 2 черная дыра в конце 3'. / 3Bio /, / 5Biosg/и /iBiodT/ являются biotinylation в конце 3', 5' конца и тимин внутренней ДНК, соответственно. /iCy3/ представляет Cy3, вставляется в внутренней магистрали ssDNA. Эти коды используются конкретные коммерческий поставщик, используемый здесь и может отличаться в других компаниях ДНК.
  2. Сопряженное РСЗ пептида в SH-ssDNA утоления.
    Примечание: Используемые реагенты, фосфат амортизированное saline (PBS), sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) циклогексан-1-карбоксилатных (сульфогруппу ККАП), РГД пептида и трис - гидрохлорида фосфина (2-carboxyethyl), также известный как TCEP-HCl.
    1. Deprotect модификатор тиоловых на верхней нити ДНК с помощью решения TCEP.
      Примечание: Изменение тиоловых ННО, приказал из коммерческого источника поставляются в окисленной формы, с атомами серы защищается дисульфидными облигаций, что потребности сокращается до спряжение РГД-ДНК. TCEP является сокращение запаха реагент, который используется для тиоловых deprotection.
      1. Растворите 14,3 мг TCEP-HCl в 300 мкл воды. Отрегулируйте пэ-аш TCEP решение ~7.2–7.4 с 1 М растворе NaOH (около 150 мкл), с помощью рН тест документов. Добавьте чистой воды, чтобы сделать окончательный объем 0,5 мл. Конечная концентрация TCEP-100 мм.
        Примечание: Рекомендуется сделать TCEP решение свежий каждый раз для ДНК тиоловых deprotection. Избегайте чулок TCEP решение для длительного времени.
      2. Добавьте 100 мкл 0,5 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) решения и 400 мкл воды в TCEP решение.
      3. Добавьте 10 мкл раствора TCEP + ЭДТА в 20 мкл 1 мм тиоловых ДНК-BHQ2 в PBS. Пусть решение реагируют на 30 минут при комнатной температуре.
        Примечание: Дисульфидными облигаций 5' тиоловых модификатора спряжение C6 S-S в этом ssDNA будет расщепляется по TCEP, оставляя тиоловых групп готовы к реакции с maleimide в следующих шагах. TCEP не вмешиваться в следующей реакции тиоловых maleimide; Таким образом нет необходимости для пассивации TCEP после этого шага.
    2. Сопряженное РГД-NH2 с сульфогруппу ККАП.
      1. Растворяют 5 мг РГД-NH2 в 100 мкл PBS для получения 11 мм РГД-NH2.
      2. Добавьте 200 мкл чистой воды в трубе с 2 мг сульфогруппу-ККАП (premeasured поставщиком). Smash сульфогруппу ККАП твердых с кончиком пипетки и энергично Пипетка в то же время для содействия, растворяя ККАП в воде. Концентрация сульфогруппу ККПА будет 23 мм.
        Примечание: Потому что Эстер NHS в сульфогруппу ККАП подвергается гидролизу и имеет время жизни в нескольких минут, это растворения шаг должен быть завершен в течение 1 мин, чтобы избежать чрезмерных потерь Эстер NHS вследствие гидролиза. Использование чистой воды растворить сульфогруппу ККАП, потому что его растворимости в PBS или другие буферы бедных.
      3. Добавьте 40 мкл раствора сульфогруппу ККАП в 100 мкл РГД-NH2 решение и проинкубируйте втечение 20 мин.
        Примечание: Эстер NHS в сульфогруппу ККАП будет реагировать с аминовая группа в РГД-NH2, образуя амидной форме облигаций этой связи РСЗ и сульфогруппу ККАП.
    3. Сопряженное с SH-ssDNA утоления РГД ККАП.
      1. Смешать решения, подготовленные в пунктах 1.2.1 и 1.2.2 и инкубировать смесь для 1 ч при комнатной температуре. Переместить решение набор холодильник на 4 ° C и пусть он далее реагировать на ночь. Тиоловых спрягаются по верхней нити ДНК будет реагировать с maleimide на сульфогруппу ККАП, образуя тиоэфиры группа, которая связывает РСЗ с верхней нити ДНК.
    4. Выполняйте этанола осадков для очистки РГД ssDNA утоления от непрореагировавшего сульфогруппу ККАП, РСЗ и TCEP.
      1. Холод 10 мл 100% этанола в 15 мл конические пробки в морозильной камере-20 ° C по меньшей мере 30 мин.
      2. Смешайте раствор NaCl 3 M, решение ДНК и охлажденные этанола в том соотношении 1:10:25. Держите смешанной жидкости в морозильной камере-20 ° C за 30 минут или до тех пор, пока осаждается ДНК.
      3. Центрифуга жидкости на 10000 x g 30 мин отбросить супернатант.
      4. Добавьте PBS в Пелле ДНК. Измерение концентрации ДНК с помощью спектрометра.
    5. (Необязательно) Провести Электрофорез ДНК для получения более высокой чистоты РГД ssDNA.
      Примечание: Выше протокол, около 70%-90% ssDNA будет проспряганное с РГД. Если высшей чистоты, электрофорез ДНК также может выполняться для разделения конъюгированных ДНК от неконъюгированной ДНК.
      1. Соберите систему вертикального электрофореза.
      2. Приготовляют раствор 10% геля полиакриламида, смешивая 50 мл чистой воды, 20 мл гель акриламида 40%, 8 мл 10 x буфер tris Борат ЭДТА (КЭ) и 800 мкл 10% Персульфат аммония (APS).
      3. 80 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED), для решения гелем. Залейте раствор в стекло камеры системы электрофореза. Вставьте один Ну гребень для создания хорошо поверх геля. Ждать 10 минут, пока гель высокоструктурированные.
      4. Mix решение ДНК с 100% глицерина в том соотношении 1:1. Снимите гребень и загрузите решение ДНК гель хорошо.
      5. Побегите гель при напряжении 200 V. наблюдать два ДНК полос в которых отстает, один является конъюгированных ДНК.
      6. Отрежьте полосу гель с конъюгированные ДНК и нарезать на мелкие кусочки.
      7. Соберите кубики гель в две 1,5 мл пробирок с фильтрами. 500 мкл PBS, к каждой трубе.
      8. Поставьте гель PBS-пропитанной в темном месте при комнатной температуре за 1 день. ДНК будет диффундировать из геля штук в PBS.
      9. Собирайте решения ДНК центрифугированием трубы на 1000 x g на 2 мин.
      10. Выполните еще один раунд осадков (шаг 1.2.4) этанола для сбора ДНК.
  3. Синтезировать ее к Гибридизировать РГД ssDNA утоления и краска ssDNA биотин.
    1. Смесь растворов стренги верхняя и нижняя нить ННО на молярное соотношение 1.1:1. Держите смесь на 4 ° C на ночь, чтобы произвести ее ДНК гибридизации.
      Примечание: Молярное соотношение 1.1:1 для гибридизации ДНК используется вместо 1:1. Чрезмерная РГД ssDNA утоления используется для обеспечения что все краски ssDNA биотин будет гибридизировать с РГД ssDNA утоления. РГД ssDNA утоления без гибридизации будут смыты во время поверхностного покрытия, которое не влияет на ее качество поверхности покрытия.
    2. Алиготе и хранить ее решения при-20 ° C для долгосрочного хранения.
      Примечание: Буфер хранения PBS и концентрация хранения как правило должно быть выше 10 мкм. Для регулярного использования ее раствор можно хранить при 4 ° C на несколько недель без ухудшения качества заметно.

2. Подготовка поверхностей, фиксирующий ее на прозрачным дном Петри

Примечание: Реагентов, используемых являются биотинилированным бычьим сывороточным альбумином (БСА биотин), белок авидин и ее. Холод все реагенты и PBS буфера до 0 ° C на льду с ведро льда.

  1. Загрузка 200 мкл 0,1 мг/мл BSA-биотина в PBS на хорошо прозрачным дном Петри (29 мм в диаметре, с хорошо 14 мм). Инкубируйте 30 мин при температуре 4 ° C в холодильник. BSA-биотин физически адсорбироваться на поверхности стекла.
  2. Высасывать решения из хорошо с помощью пипетки и 200 мкл PBS обратно к колодцу, чтобы вымыть поверхность. Повторите этот 3 x для завершения стирки.
  3. Инкубировать 200 мкл 50 мкг/мл авидин протеина в колодец для 30 мин при 4 ° C. Промойте его 3 x с PBS. После этого шага белок авидин связывает BSA-биотин и становится лишенных подвижности на поверхности стекла.
  4. Инкубировать 200 мкл 0,1 мкм его в колодце за 30 мин при 4 ° C. Вымойте блюдо с 3 x с PBS. Оставьте PBS в скважине до ячейки покрытия. После этого шага с тегом биотина связывается с белками авидином и становится лишенных подвижности на поверхности.
    Примечание: Одна предосторожность решающее значение для его покрытия качество и однородность во время его иммобилизации-никогда не позволить Петри поверхности высохнуть. Сохраняя все реагенты и PBS на 4 ° C или около 0 ° C на льду с ведро льда помогает уменьшить скорость испарения воды во время стирки шаги, когда PBS вытягивается из колодца.

3. ячейки покрытия на его поверхности

  1. Культура рыбы кератиноцитах.
    Примечание: Здесь, Золотая рыбка (караси auratus) используется в качестве примера, но может также работать другие виды рыб.
    1. Срывать кусок рыбы масштаба из рыбы с плоским наконечник пинцет. Аккуратно нажмите масштаб на хорошо Петри прозрачным дном, с внутренней стороны шкалы, обратившись стекла. Ждать ~ 30 s для рыбы масштаба присоединиться также к поверхности стекла блюдо.
    2. Добавьте 1 мл Iscove изменение Дульбекко средний (IMDM) полного среднего для полного покрытия шкале рыбы. Держите чашку Петри в темных и влажных ящик для 6 – 48 ч при комнатной температуре.
      Примечание: IMDM полный носитель содержит 79% IMDM + 20% плода бычьим сывороточным (ФБС) + 1% пенициллин. Заказ не дополнительной подачи кислорода или CO2 . Несколько рулонов бумаги ткани, пропитанной водой можно оставить в поле для поддержания высокой влажности в поле. Кератиноцитах рыбы будут мигрировать из шкале рыбы как лист клеток после нескольких часов. Это можно наблюдать с помощью микроскопа культуры ткани. Клетки обычно жизнеспособной на 48 ч.
  2. Отсоединение и тарелка кератиноцитах клетки на ее поверхности.
    1. Удалите носитель из Петри блюдо, в котором выращиваются шкале рыбы. Мыть хорошо 1 x с ячейкой, отсоединение решение и добавить отсоединение решение для покрытия шкале рыбы и Инкубируйте 3 мин.
      Примечание: Рецепт для ячейки, отсоединение ЭДТА решения является следующим: 100 мл 10 x Hanks сбалансированный соли раствора (HBSS) + 1 М HEPES (рН 7,6) 10 мл + 10 мл 7,5% бикарбоната натрия + 2,4 мл ЭДТА 500 мм + 1 L H2O. PH корректируется до 7,4.
    2. Высосать все ячейки, отсоединение решение и добавить полный среднего IMDM. Разогнать кератиноцитах, нежный закупорить. Регулировка плотности раствора клеток на желаемый уровень (1 х 104– 1 x 105/мл). Пластина клетки на его поверхности (подготовлен согласно разделу 2). Инкубируйте клетки при комнатной температуре за 30 мин до изображений.
      Примечание: Подсчет клеток может быть сделано с Горяева после отсоединения клетки с отсоединение решение. Ячейка, покрытие плотность является относительно низким, так, что кератиноцитах имеют много площади поверхности для миграции.
  3. Пластина Чо-K1 клетки и клетки 3T3 низ на его поверхности.
    Примечание: Средство для Чо-K1 клетки — F12 Хэм 89% + 10% FBS + 1% пенициллин. Средство для них 3T3 клеток — 89% Дульбекко модифицированных орла среднего (DMEM) + 10% теленка бычьим сывороточным (CBS) + 1% пенициллин. В условиях культуры являются 37 ° C и 5% CO2.
    1. Культура Чо-K1 ячейки или низ 3T3 до 80 – 100% слияния в чашку Петри (или колбу культуры).
    2. Теплый клеток, отсоединение решение и культуры среднего до 37 ° C.
    3. Удалите все культуры среднего в Петри с пипеткой. Вымыть клетки 1 x с ячейкой, отсоединение решение. Обложка клетки с отсоединение решения и инкубировать при 37 ° C за 10 мин.
    4. Разогнать клетки, закупорить. Собирать решения клеток и центрифуги на 300 x g на 3 мин.
    5. Высосать супернатант и добавьте полного среднего или сыворотки свободной среде.
    6. Регулировка плотности раствора клеток на желаемый уровень (1 х 105 – 1 x 10-6/мл). Пластина на его поверхности (подготовлен согласно разделу 2) ячейки. Инкубируйте клетки при 37 ° C для 1-2 ч до визуализации, или 30 мин до записи видео.

4. изображения, запись видео и в реальном времени Интегрин напряженности сопоставления

  1. Близком изображений Интегрин напряженности в живых клеток
    1. Инкубировать кератиноцитах на его поверхности (подготовлен согласно разделу 2) за 30 мин при комнатной температуре, или инкубировать Чо-K1 ячейки или низ 3T3 за 1 час на его поверхности в инкубаторе при 37 ° C.
    2. Смонтируйте на Петри блюдо на сцене флуоресцентным микроскопом. Выполнение визуализации клеточных силы с Выдержка 1 s. Масштаб — 40 x или 100 x.
    3. Возьмите видео его изображения с интервалом в кадр 20 s для кератиноцитах, или 1 – 2 мин на Чо-K1 клетки или клетки 3T3 низ.
    4. Используйте MATLAB или другое средство анализа изображений для вычитания предыдущего кадра видео его из текущего кадра для вычисления его сигнал, вновь произведенных в последний интервал кадра. Недавно выдоваемого сигнала ее представляет Интегрин напряжение генерируется в последний интервал кадра, тем самым отчетности сотовой силы в близком виде.
  2. Coimaging Интегрин напряженности и клеточной структуры в immunostained клетках
    1. После этапе 3.2.2 или 3.3.6 выполняют иммуноокрашивания для обозначения структурных белков-мишеней.
      Примечание: Используйте различные красители, чтобы избежать флуоресценции перекрестных помех между Интегрин напряженности изображений и ячеек структурных изображений. В этой рукописи Cy5 Флюорофор был использован для Фаллоидин и Alexa 488 был использован для vinculin окраски. Концентрация как начального, так и вторичные антитела является 2,5 мкг/мл. Концентрация для Фаллоидин составляет 1.5 единицы/мкл.
    2. Выполните multifluorescent канал изображений приобрести Интегрин напряженности карта и структурных визуализации ячейки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С ее был захвачен Интегрин напряженности карта рыбы кератиноцитах. Он показывает, что Кератоцит переносит и генерирует Интегрин напряжение на две силы треков (рисунок 2A). Разрешение карты силы был калиброванные быть 0,4 мкм (рис. 2B). Интегрин высокого напряжения концентрируется на задний край (рис. 3A). ЕЕ также показывает различные конкретные модели различных клеток. Аэробны ячейки, низ 3T3, образует конкретных Интегрин напряженности шаблон (рис. 3B) отличается от быстрый перенос Кератоцит.

С иммуноокрашивания фокуса спаек и напряженности Интегрин рыбы, которую кератиноцитах были coimaged (рис. 4A). Связь между Интегрин напряженности и клеточной структуры в кератиноцитах был детально Wang et al.25. Интегрин напряжение и стресс волокон в клетках Чо-K1 также были coimaged (рис. 4В). Эти эксперименты показывают, что ее позволяет coimaging сил адгезии клеток и клеточных структур одновременно параметры аналогичных изображений, способствуя тем самым изучение структуры/силы взаимодействия клеток.

Figure 1
Рисунок 1: схема из своей. ЕЕ это dsDNA, украшенные РГД-лиганд, утоления флуоресценции, краска и биотин тег. Краска (зеленый заполненный круг) угасает, утоления. В разделе Интегрин напряженности разрушившие dsDNA и Cy3 освобождается от закалки и испускает которые могут быть обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии флуоресцирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Интегрин напряженности карта Кератоцит рыбы и субмикронные резолюции ее. (A) во время быстрой миграции, Кератоцит последовательно создает сопоставление Интегрин напряженности в двух направлениях силы. (B) расстояние между ними силы треков обычно составляет 40 мкм. Пространственное разрешение карты сотовой силы, отображаемого на ее составляет около 0,4 мкм. Линейный профиль интенсивности флуоресценции Cy3 области отмечен короткий красной линией на нижней левой панели рассчитывается для калибровки резолюции в сотовой силы изображений. Результат показан в нижней правой панели и оборудованием с гауссовой кривой. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: напряжение карта реального времени Интегрин рыбы Кератоцит и низ 3T3. (A) A рыбы Кератоцит и его карта Интегрин напряженности. (Вверху слева) Кератоцит подвижных рыб. (Внизу слева) Интегрин напряженности карта Кератоцит, сообщил ее. (Вверху справа) Реальном времени Интегрин напряженности был получен путем вычитания кадра. Это показывает, что созданный Интегрин напряженности является colocalized с заднего края ячейки. (Внизу справа) Интегрин напряженности карта (зеленый) и реального времени Интегрин напряженности (пурпурный) представлены в одной Объединенные фигурой. Шкалы бар = 10 мкм. (B) низ 3T3 фибробластов и его карта Интегрин напряженности. (Вверху слева) НИЗ 3T3 фибробластов. (Внизу слева) Интегрин напряженности карта низ 3T3 фибробластов. Интегрин напряженность была сгенерирована узоров. (Вверху справа) Напряженность в реальном времени Интегрин показывает, что напряженность вновь сгенерированный Интегрин главным образом формирует на периферийной области ячейки. (Внизу справа) Интегрин напряженности карта (зеленый) и реального времени Интегрин напряженности (пурпурный) представлены в одной Объединенные фигурой. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Coimaging Интегрин напряженности и ячеек структуры. (A) Coimaging Интегрин напряженности, vinculin и F-актина в Кератоцит. Было зафиксировано Кератоцит и immunostained vinculin и F-миозина. (B) Coimaging Интегрин напряженности, vinculin и F-актина в ячейке Чо-K1. Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ЕЕ является весьма доступным, но мощный метод для сотовых силу сопоставление с точки зрения синтез и применение. Со всеми материалами готова ее может быть синтезирован в течение 1 дня. Во время экспериментов необходимы только три шага поверхности покрытия до ячейки покрытия. Недавно мы дополнительно упростить процедуры покрытия, один шаг, напрямую связывая ее с бычьим сывороточным альбумином, что позволяет прямой физической адсорбции ее стекла или полистирол поверхности33. ЕЕ приносит интенсивности флуоресценции сотовой силы сигнала до сопоставимого уровня клеточных структурных изображений. Удобное синтеза и пробоподготовки, скромные требования для микроскопии и высокая чувствительность для сотовых силы делают ее прочная и надежная техника для изучения клеток механики. В этой статье мы представили всеобъемлющую процедуру для его синтеза и применения.

Спряжение РСЗ лиганда с ssDNA является наиболее важных процедура в ее синтез. Как уже упоминалось в разделе протокол, Эстер NHS на сульфогруппу ККАП не стабилен в воде. Чем дольше он принимает распустить сульфогруппу ККАП в воде, больше количество сульфогруппу ККАП теряет Эстер NHS для гидролиза и становится «безнадежный», который спрягает с ДНК через maleimide тиоловых реакции, но не сопряженные с РГД-NH2. В результате большая часть молекул ДНК будет оккупирован мертвых сульфогруппу ККАП и нельзя связать с РСЗ, приводит к низкой доходности ssDNA РГД. По этой причине растворяя сульфогруппу ККАП в воде должен быть завершен быстро, обычно в течение 1 мин. Также рекомендуется проверить доходность ssDNA РГД с электрофорезом. Если доходность выше 80%, обычно ненужные очистки. В противном случае рекомендуется очищение дна с геля полиакриламида. Восстановление ДНК на геле полиакриламида составляет около 60%-80%.

Синтезировать достаточное количество РГД ssDNA-BHQ2, начальное количество тиоловых ssDNA-BHQ2 должно быть по меньшей мере 20 нмоль (1 мм x 20 мкл). Обратите внимание, что изменения ДНК значительно уменьшить количество ssDNA приказал от ДНК компаний. Например если приказал 1000 нмоль ssDNA с двумя изменениями, гарантированная доходность можно только 20 нмоль. Если это так, заказывайте по крайней мере 1000 нмоль ssDNA для сопряжения РГД ssDNA. Исследователи также можно разработать свои собственные последовательности для своей конструкции. Как правило мы держать содержание GC в ее более чем на 70% для повышения термостабильности dsDNA. Анализ последовательности ДНК может выполняться для сведения к минимуму вероятности формирования самостоятельной заколка, самостоятельной гибридизации, стабильной вторичной структуры и т.д. Средство анализа доступен онлайн. В рукописи Верхняя нить ДНК одинаков для ITSs с различными TТол. Мы изменять расположение биотина в нижней нити ДНК для достижения различных TТол. Однако различные местоположения РГД на верхней нити может применяться для настройки TТол о ее. РасчетТол Tдля различных dsDNA геометрии обеспечивается Ван и Ha22 и Mosayebi et al.34, особенно для dsDNA в режиме сдвига и распаковки режиме35,36 37,38.

Хотя его поверхности записывать все Интегрин напряженности, которые имели место в прошлом, путем записи видео карты сотовой силы последовательно, исследователи можно вычислить Интегрин напряженности, производится в последний интервал кадра путем вычитания предыдущего кадра от текущего кадра для создания «близком сотовой силы карты». Интервал кадра в ее видео варьируется в зависимости от типов клеток, но обычно это 20 s для быстрой миграции клеток и 1 – 2 мин для стационарных клеток. Метод вычитания кадра сообщает близком Интегрин напряжение сохраняя при этом высокую чувствительность для воображения Интегрин напряженность из-за эффекта накопления сигнала. Фотообесцвечивание минимальна между двух последовательных изображений и, следовательно, не наблюдаемый влияние метода вычитания кадра.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Фондом запуска, Университет штата Айова и от национального института Генеральной медицинских наук (R35GM128747).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA-biotin Sigma-Aldrich A8549
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Streptavidin Thermo Fisher Scientific 434301
upper strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group Peptides International PCI-3696-PI
IMDM ATCC ‎62996227
FBS ATCC 302020
Penicillin gibco 15140122
TCEP Sigma-Aldrich C4706
200 uL petri dish Cellvis D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000 Thermo Scientific N/A spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit Hoefer SE410-15-1.5 Device for electroporesis
CHO-K1 cell line ATCC CCL-61
NIH/3T3 cell line ATCC CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody EMD Millipore 90227 Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175 Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287
Eclipse Ti Nikon N/A microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
  2. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  3. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
  4. Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
  5. Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
  6. Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
  7. Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
  8. Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
  9. Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
  10. Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
  11. Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
  12. Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
  13. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
  14. Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 235-244 (2017).
  15. Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  16. Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
  17. Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
  18. Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
  19. Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  20. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
  21. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  22. Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
  23. Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
  24. Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
  25. Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
  26. Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
  27. Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
  28. Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
  29. Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  30. Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
  31. Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
  32. Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
  33. Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
  34. Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
  35. Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
  36. Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
  37. de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
  38. Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).

Tags

Ретракция выпуск 146 клеток механики mechanobiology Интегрин Интегрин напряженности сотовой силы сопоставления Интегрин напряжение датчика
Интегрин напряженности и клеточных силы на субмикронном резолюции с датчиком интегративной напряженности
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X.… More

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor. J. Vis. Exp. (146), e59476, doi:10.3791/59476 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter