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Bioengineering

इमेजिंग Integrin तनाव और सेलुलर बल Submicron संकल्प पर एक एकीकृत तनाव सेंसर के साथ

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59476
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Summary

Integrin तनाव विभिंन सेल कार्यों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । एक एकीकृत तनाव संवेदक के साथ, integrin तनाव picoNewton (पीएन) संवेदनशीलता के साथ calibrated है और submicron संकल्प पर imaged ।

Abstract

Integrin-ligand बांड द्वारा प्रेषित आणविक तनाव integrin मार्ग है कि कई सेल कार्यों और व्यवहार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता में मौलिक यांत्रिक संकेत है । जांच करने के लिए और उच्च बल संवेदनशीलता और स्थानिक संकल्प के साथ छवि integrin तनाव, हम एक एकीकृत तनाव संवेदक (इसके), एक डीएनए आधारित फ्लोरोसेंट तनाव सेंसर विकसित की है । इसकी फ्लोरेस्क को सक्रिय किया जाता है यदि एक आणविक तनाव को बनाए रखने, इस प्रकार आणविक स्तर पर प्रतिदीप्त संकेत करने के लिए बल परिवर्तित । इसके सक्रियकरण के लिए तनाव सीमा 10 – 60 पीएन की श्रेणी में स्वरित्र है जो अच्छी तरह से कोशिकाओं में integrin तनाव की गतिशील रेंज को शामिल किया गया है । एक सब्सट्रेट के साथ grafted पर, आसंन कोशिकाओं के integrin तनाव प्रतिदीप्ति और सब्सट्रेट संकल्प पर imaged द्वारा कल्पना की है । इसके अलावा दोनों जीवित कोशिकाओं और स्थिर कोशिकाओं में कोशिका संरचनात्मक इमेजिंग के साथ संगत है । इसकी सफलतापूर्वक प्लेटलेट संकुचन और कोशिका प्रवास के अध्ययन के लिए लागू किया गया है । इस कागज के संश्लेषण और integrin-संचारित सेलुलर बल के अध्ययन में अपने आवेदन के लिए प्रक्रिया का विवरण ।

Introduction

कोशिकाओं का पालन करने के लिए integrins पर निर्भर करते हैं और कोशिकीय मैट्रिक्स के लिए सेलुलर बलों डालती. Integrin-मध्यस्थता सेल आसंजन और सेना संचरण1,2, प्रवास3,4, और जीवन रक्षा5,6,7फैल सेल के लिए महत्वपूर्ण हैं । लंबी अवधि में, integrin biomechanical संकेतन भी प्रभावित करता है सेल प्रसार8,9,10 और विभेदन11,12। शोधकर्ताओं ने कोशिका-मैट्रिक्स इंटरफेस पर integrin-संचारित सेलुलर बलों को मापने और मैप करने के लिए विभिन्न तरीके विकसित किए हैं । इन पद्धतियों के आधार पर कर रहे है लोचदार बुनियाद13, सरणी micropost14, या परमाणु फोर्स micropost (afm)15,16। लोचदार बुनियाद और micropost तरीकों सेलुलर तनाव की रिपोर्ट के लिए बुनियाद के विरूपण पर भरोसा करते हैं और स्थानिक संकल्प और बल संवेदनशीलता के मामले में सीमाएं हैं. AFM उच्च शक्ति की संवेदनशीलता है, लेकिन यह एक साथ कई स्थानों पर बल का पता लगाने के लिए, यह मुश्किल सेलुलर integrins द्वारा प्रेषित बल मैप करने के लिए कर सकते हैं ।

हाल के वर्षों में, आणविक स्तर पर सेलुलर बल का अध्ययन करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया था । पॉलीथीन ग्लाइकोल17,18, स्पाइडर सिल्क पेप्टाइड19, और डीएनए20,21,22,23 पर आधारित आणविक तनाव सेंसर का एक संग्रह विकसित किया गया कल्पना और आणविक प्रोटीन द्वारा प्रेषित तनाव की निगरानी । इन तकनीकों में, डीएनए पहले तनाव गेज तार में संश्लेषण सामग्री के रूप में अपनाया गया था (TGT), एक rupturable linker कि जीवित कोशिकाओं में integrin तनाव की ऊपरी सीमा modulates22,24. बाद में, डीएनए और प्रतिदीप्ति अनुनाद अंतरण तकनीक को संयुक्त रूप से हेयरपिन डीएनए आधारित फ्लोरोसेंट तनाव सेंसर बनाया गया, जो चेन के समूह23 और सबिता के समूह20द्वारा पहले किया गया था । हेयरपिन डीएनए आधारित तनाव सेंसर रीयल-टाइम में इंटीरिइन टेंशन की रिपोर्ट करता है और इसे सेलुलर फंक्शन्स21की एक सीरीज के अध्ययन में सफलतापूर्वक लागू किया गया है । इसके बाद, वांग की प्रयोगशाला ने एक TGT को फ्लूओफोर-क्वान्चर जोड़ी के साथ एकीकृत करके तनाव की रिपोर्ट की । इस सेंसर का नाम है एक इसके25,26। इसकी डबल-फंसे डीएनए (dsDNA) पर आधारित है और integrin तनाव अंशांकन के लिए एक व्यापक गतिशील रेंज (10-60 pN) है । हेयरपिन डीएनए-आधारित सेंसरों के विपरीत, यह वास्तविक समय में सेलुलर बल की रिपोर्ट नहीं करता है, लेकिन सेलुलर बल के पदचिह्न के रूप में सभी ऐतिहासिक integrin घटनाओं रिकॉर्ड; यह संकेत संचय प्रक्रिया सेलुलर फोर्स इमेजिंग के लिए संवेदनशीलता को बेहतर बनाता है, यह एक कम अंत प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ भी छवि सेलुलर बल के लिए व्यवहार्य बना रही है । इसका संश्लेषण अपेक्षाकृत अधिक सुविधाजनक होता है क्योंकि यह दो एकल-असहाय DNAs (ssDNA) को संकरित करके बनाया जाता है ।

इसकी एक 18-बेस-युग्मित dsdna biotin के साथ संयुग्मित, एक fluorophore, एक शामक (ब्लैक होल शामक 2 [BHQ2])27, और एक चक्रीय arginylglycylaspartic एसिड (rgd) के रूप में28 पेप्टाइड एक integrin पेप्टाइड लिगामेंट (चित्रा 1). लोअर strand फ्लोरोफोर (Cy3 इस पांडुलिपि में प्रयोग किया जाता है के साथ संयुग्मित है, जबकि अंय रंगों, जैसे Cy5 या Alexa श्रृंखला के रूप में, यह भी हमारे प्रयोगशाला में संभव सिद्ध किया गया है) और बायोटिन टैग, जिसके साथ अपने बायोटिन-avidin बांड द्वारा एक सब्सट्रेट पर immobilized है । ऊपरी किनारा rgd पेप्टाइड और ब्लैक होल quencher, जो लगभग ९८% शमन क्षमता के साथ Cy3 quencher के साथ संयुग्मित है26,27। इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ, एक सब्सट्रेट पर इसकी कोटिंग घनत्व 1100/μm2के आसपास है । यह घनत्व हम पहले 18 बीपी biotinylated dsDNA के लिए calibrated है neutrAvidin-functionalized सब्सट्रेट पर लेपित उसी कोटिंग प्रोटोकॉल29का पालन करके । जब कोशिकाओं को अपने साथ लेपित सब्सट्रेट का पालन, integrin अपने RGD के माध्यम से बांधता है और इसके लिए तनाव पहुंचाता । इसकी एक विशिष्ट तनाव सहिष्णुता (टीटोल) जो तनाव सीमा के रूप में परिभाषित किया गया है कि यंत्रवत् 2 एस22के भीतर के dsdna अलग है । Integrin तनाव द्वारा इसका टूटना डाई कि बाद में प्रतिदीप्ति उत्सर्जित से शामक के जुदाई की ओर जाता है । परिणामस्वरूप, अदृश्य समांतक तनाव प्रतिदीप्ति संकेत में परिवर्तित हो जाता है और सेलुलर बल प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा प्रतिचित्रित किया जा सकता है ।

इसके लिए आवेदन प्रदर्शित करने के लिए, हम मछली keratocyte यहां का उपयोग करें, सेल प्रवास के अध्ययन के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया सेल मॉडल30,31,३२, चो-K1 सेल, एक आमतौर पर इस्तेमाल किया अचल सेल लाइन, और nih 3t3 फाइलब्लास्ट । Integrin तनाव और कोशिका संरचनाओं के कोइन्एजिंग भी आयोजित किया जाता है ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी तरीकों को आयोवा राज्य विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC, 8-16-8333-I) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. एकीकृत तनाव सेंसर का संश्लेषण

  1. अनुकूलित और आदेश ssDNAs ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    नोट: ssDNA अनुक्रम निंनानुसार हैं । ऊपरी कतरा/5Thiomc6-d/ggg AGG ACG सीएजी सीजीजी जीसीसी/3BHQ_2/। निचली किस्में इस प्रकार हैं ।
    12 पीएन अपनी:/5Cy3/GGC CCG CTG CGT CCG सीसीसी/3Bio/
    23 पीएन अपनी:/5Cy3/GGC CCG CTG CGT CC/Ibiodt/CCC
    ३३ पीएन इसके:/5Cy3/GGC CCG CTG तटरक्षक/iBiodT/CCG सीसीसी
    ४३ पीएन अपने:/5Cy3/ggc CCG C/iBiodT/G CGT CCG सीसीसी
    ५४ पीएन इसके:/5Biosg//iCy3/GGC CCG CTG CGT CCG सीसीसी
    यहां,/5ThioMC6-D/5 ' अंत में एक thiol संशोधक C6 एस-एस (डाइसल्फाइड) का प्रतिनिधित्व करता है । /3BHQ_2/3 ' अंत में एक काला छेद Quencher 2 का प्रतिनिधित्व करता है । /3Bio/,/5Biosg/, और/Ibiodt/biotinylation रहे है 3 ' अंत, 5 ' अंत में, और आंतरिक डीएनए की थाइमीन पर क्रमशः । /iCy3/ssDNA के आंतरिक बैकबोन में प्रविष्ट Cy3 का प्रतिनिधित्व करता है । इन कोड विशिष्ट वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ता द्वारा उपयोग किया जाता है यहां इस्तेमाल किया और अंय डीएनए कंपनियों में अलग हो सकता है ।
  2. श्री-ssDNA-quencher को संयुग्मी RGD पेप्टाइड ।
    नोट: इस्तेमाल किया अभिकर्मकों फॉस्फेट-buffered खारा (pbs) हैं, सल्फोससिनिमिडियल 4-(एन-मेलिइमीमेथायल) साइक्लोहेक्सेन-1-कार्बोक्सिलेट (सल्फो-एसएमसीसी), आरजीडी पेप्टाइड और ट्रिस-(2-कार्बोक्सियेथिल) फास्फीन हाइड्रोक्लोराइड, जिसे tcep-एचसीएल के नाम से भी जाना जाता है ।
    1. टीसीईपी समाधान का उपयोग करते हुए ऊपरी किनारा डीएनए पर thiol संशोधक को deprotect ।
      नोट: thiol संशोधित dnas एक वाणिज्यिक स्रोत से आदेश दिया ऑक्सीकरण रूप में भेज रहे हैं, एक डाइसल्फ़ाइड बांड की जरूरत है कि rgd-डीएनए संयुग्मन से पहले कम किया जाना चाहिए द्वारा संरक्षित सल्फर परमाणुओं के साथ । TCEP एक गंजेहीन कमी अभिकर्मक थीओल deprotection के लिए प्रयोग किया जाता है ।
      1. ३०० μL पानी में TCEP-एचसीएल के १४.३ मिलीग्राम भंग । PH परीक्षण पेपरों का उपयोग करके TCEP सॉल्यूशन के pH को 1 M NaOH सॉल्यूशन (लगभग १५० μL) के साथ ~ 7.2 – 7.4 पर समायोजित करें । ०.५ मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा बनाने के लिए शुद्ध पानी जोड़ें । अंतिम TCEP एकाग्रता १०० मिमी है ।
        नोट: डीएनए thiol deprotection के लिए हर बार TCEP समाधान ताजा बनाने के लिए सिफारिश की है । एक लंबे समय के लिए TCEP समाधान मोजा से बचें ।
      2. टीसीईपी समाधान में १०० μL ०.५ मीटर एथीलेन्डिमनेटेटएसिटिक अम्ल (ईटीए) विलयन और ४०० μL जल को डालिए ।
      3. पीबीएस में 1 मिमी थिओल-डीएनए-BHQ2 के 20 μL के लिए TCEP + EDTA समाधान के 10 μL जोड़ें । कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए समाधान प्रतिक्रिया दें ।
        नोट: इस ssdna पर 5 ' thiol संशोधक 6 एस-एस संयुग्मन के डाइसल्फ़ाइड बांड tcep द्वारा cleaved किया जाएगा, thiol समूह अगले कदम में maleimide के साथ प्रतिक्रिया के लिए तैयार छोड़. TCEP निंनलिखित thiol-maleimide प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है; इस तरह इस स्टेप के बाद टीसीईपी को पासीवेट करना जरूरी नहीं है ।
    2. संयुग्मी आरजीडी-सल्फो-एसएमसीसी के साथ एनएच2 ।
      1. 11mm RGD-रारा2प्राप्त करने के लिए pbs के १०० μl में rgd के 5 मिलीग्राम-एनएच2 भंग ।
      2. सल्फो के 2 मिलीग्राम-SMCC (आपूर्तिकर्ता द्वारा premeasured) के साथ ट्यूब के लिए शुद्ध पानी की २०० μL जोड़ें । पानी में smcc भंग करने की सुविधा के लिए एक ही समय में एक पिपेट टिप और सख्ती पिपेट साथ sulfo-smcc ठोस तोड़ । सल्फो-एसएमसीसी की एकाग्रता 23 एमएम होगी ।
        नोट: क्योंकि sulfo-smcc में एनएचएस एस्टर हाइड्रोलिसिस के अधीन है और कुछ मिनट की एक जीवन भर है, इस भंग कदम 1 मिनट के भीतर पूरा किया जाना चाहिए हाइड्रोलिसिस के कारण एनएचएस एस्टर के अत्यधिक नुकसान से बचने के लिए । सल्फो-एसएमसीसी को भंग करने के लिए शुद्ध जल का उपयोग करें क्योंकि पीबीएस या अन्य बफ़र्स में इसकी घुलनशीलता खराब है ।
      3. १०० μL RGD-एनएच2 समाधान के लिए सल्फो-smcc समाधान के ४० μl जोड़ें और इसे 20 मिनट के लिए सेते ।
        नोट: sulfo-SMCC में एनएचएस एस्टर RGD में amine समूह के साथ प्रतिक्रिया-एनएच2होगा, एक ऐमाइड बांड कि rgd और SULFO-smcc लिंक बनाने ।
    3. संयुग्मी RGD-SMCC के साथ एसएच ssDNA-quencher ।
      1. कदम 1.2.1 और 1.2.2 में तैयार समाधान मिश्रण और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मिश्रण सेबेट । समाधान को एक फ्रिज में ले जाएं 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और इसे आगे रातोंरात प्रतिक्रिया दें । Thiol ऊपरी किनारा डीएनए पर संयुग्मित, sulfo-SMCC पर maleimide के साथ प्रतिक्रिया करेंगे, एक thioether समूह है कि ऊपरी कतरा डीएनए के साथ RGD लिंक बनाने ।
    4. बिना प्रतिक्रिया वाले सल्फो-SMCC, RGD, और TCEP से RGD-ssDNA-quencher शुद्ध करने के लिए इथेनॉल वर्षा करते हैं ।
      1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नली में १००% एथेनॉल की 10 मिलीलीटर की एक-20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 30 मिनट के लिए ठंडा ।
      2. एक 3 एम NaCl समाधान, एक डीएनए समाधान, और 1:10:25 की मात्रा अनुपात में ठंडा इथेनॉल मिलाएं । एक-20 ° c फ्रीजर में मिश्रित तरल 30 मिनट के लिए या जब तक डीएनए precipitated है रखो ।
      3. अपकेंद्रित्र 30 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी पर तरल supernatant त्यागने ।
      4. डीएनए गोली के लिए PBS जोड़ें । एक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर डीएनए एकाग्रता को मापने.
    5. वैकल्पिक एक उच्च rgd-ssdna शुद्धता हासिल करने के लिए डीएनए वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन.
      नोट: उपरोक्त प्रोटोकॉल के साथ, के बारे में 70%-ssDNA के 90% RGD के साथ संयुग्मित किया जाएगा । यदि उच्च शुद्धता वांछित है, डीएनए वैद्युतकणसंचलन भी असंयुग्मित डीएनए से संयुग्मित डीएनए अलग किया जा सकता है ।
      1. एक ऊर्ध्वाधर वैद्युतकणसंचलन प्रणाली इकट्ठा ।
      2. ५० मिलीलीटर शुद्ध पानी, ४०% एक्रिलामाइड जेल के 20 मिलीलीटर, 10x tris-बोरेट-EDTA (TBE) बफर के 8 मिलीलीटर और 10% अमोनियम पेरासल्फेट (एपीएस) के ८०० μL को मिलाकर 10% पॉलीएक्रिलामाइड जेल समाधान तैयार करें ।
      3. जेल के समाधान के लिए टेट्रामेथिलेथिलीनेडिऐमीन (TEMED) के ८० μL जोड़ें । इस घोल को इलेक्ट्रोफोरेसिस सिस्टम के ग्लास चैंबर में डालें । जेल के शीर्ष पर एक अच्छी तरह से बनाने के लिए एक एक अच्छी तरह से कंघी डालें । जेल crosslinked है जब तक 10 मिनट के लिए रुको ।
      4. 1:1 के एक मात्रा अनुपात में १००% ग्लिसिनॉल के साथ डीएनए समाधान मिलाएं । कंघी निकालें और जेल के लिए डीएनए समाधान अच्छी तरह से लोड ।
      5. २०० के एक वोल्टेज पर जेल भागो V. दो डीएनए बैंड है जिसमें पीछे एक संयुग्मित डीएनए है निरीक्षण ।
      6. संयुग्मी डीएनए के साथ जेल बैंड काट और यह छोटे टुकड़ों में पासा ।
      7. फिल्टर के साथ दो १.५ मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों में diced जेल ले लीजिए । प्रत्येक ट्यूब के लिए PBS के ५०० μL जोड़ें ।
      8. 1 दिन के लिए कमरे के तापमान पर एक अंधेरी जगह में PBS-लथपथ जेल रखो । डीएनए PBS में जेल के टुकड़ों से बाहर फैलाना होगा ।
      9. 2 मिनट के लिए १,००० x g पर ट्यूबों को अपकेंद्रण द्वारा डीएनए समाधान इकट्ठा ।
      10. डीएनए इकट्ठा करने के लिए इथेनॉल वर्षण का एक और दौर (चरण 1.2.4) प्रदर्शन ।
  3. इसकी संकरंयकरण RGD-ssDNA-quencher और डाई-ssDNA-बायोटिन द्वारा संश्लेषी ।
    1. ऊपरी किनारा और निचला किनारा dnas के समाधान 1.1:1 के एक मोलर अनुपात में मिलाएं । डीएनए संकरण द्वारा इसके उत्पादन के लिए रात के 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण रखें ।
      नोट: डीएनए संकरण के लिए एक मोलर अनुपात 1.1:1 के बजाय 1:1 के प्रयोग किया जाता है । अत्यधिक आरजीडी-ssdna-क्वान्चर का प्रयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि सभी डाई-ssDNA-बायोटिन RGD-ssDNA-क्वान्चर के साथ संकरज हो जाएगा । संकरण रहित RGD-ssDNA-क्वान्चर सतह कोटिंग के दौरान धुल जाएगा, जो इसकी सतह कोटिंग गुणवत्ता को प्रभावित नहीं करेगा ।
    2. Aliquot और लंबी अवधि के भंडारण के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर अपने समाधान की दुकान ।
      नोट: भंडारण बफर PBS है और भंडारण एकाग्रता आम तौर पर 10 μM से ऊपर होना चाहिए । नियमित उपयोग के लिए, इसका समाधान एक कुछ हफ्तों के लिए 4 ° c पर ध्यान देने योग्य गुणवत्ता गिरावट के बिना संग्रहित किया जा सकता है ।

2. ग्लास तली पेट्री व्यंजन पर अपने को immobilizing द्वारा अपनी सतहों की तैयारी

नोट: प्रयुक्त अभिकर्मक biotinylated गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए-बायोटिन), avidin प्रोटीन, और इसके । एक बर्फ बाल्टी के साथ बर्फ पर लगभग 0 डिग्री सेल्सियस के लिए सभी अभिकर्मकों और PBS बफर चिल ।

  1. लोड २०० μL की ०.१ मिलीग्राम/एमएल बीएसए-PBS में biotin एक गिलास तली पेट्री डिश के कुएं पर (व्यास में 29 मिमी, एक 14 मिमी के साथ अच्छी तरह से). इसे फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते । बीएसए-बायोटिन कांच की सतह पर शारीरिक रूप से अधिशोषित होता है ।
  2. अच्छी तरह से एक पिपेट का उपयोग कर से समाधान चूसना और PBS के २०० μL जोड़ने के लिए अच्छी तरह से सतह धोने के लिए वापस । धोने को पूरा करने के लिए इस 3x दोहराएं ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से ५० μg/एमएल avidin प्रोटीन के २०० μL को क्यूबेट । यह PBS के साथ 3x धो लो । इस स्टेप के बाद एविडिन प्रोटीन को बीएसए-बायोटिन के साथ बांधता है और कांच की सतह पर बिखर जाता है ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से ०.१ μM की २०० μL 3 x के साथ पकवान PBS के साथ धो लें । सेल चढ़ाना जब तक अच्छी तरह से में PBS छोड़ दें । इस कदम के बाद, अपने बायोटिन टैग के साथ avidin प्रोटीन को बांधता है और सतह पर immobilized हो जाता है ।
    नोट: एक एहतियात इसके स्थिरीकरण के दौरान अपनी कोटिंग गुणवत्ता और एकरूपता के लिए महत्वपूर्ण पेट्री डिश सतह सूख कभी नहीं है । एक बर्फ बाल्टी के साथ बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस या आसपास 0 डिग्री सेल्सियस पर सभी अभिकर्मक और PBS रखते हुए धोने के कदम के दौरान पानी के वाष्पीकरण की दर को कम करने में मदद करता है, जब PBS अच्छी तरह से बाहर खींचा है ।

3. सेल अपनी सतहों पर चढ़ाना

  1. संस्कृति मछली keratocytes ।
    नोट: यहां, सुनहरी (कैर्सियसऑरेटस) एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है, लेकिन अंय मछली प्रजातियों में भी काम कर सकते हैं ।
    1. एक मछली से एक फ्लैट टिप tweezer के साथ मछली पैमाने के एक टुकड़े बांधना । धीरे से एक गिलास तली पेट्री डिश के कुएं पर पैमाने पर प्रेस, गिलास से संपर्क पैमाने के भीतर की ओर से । मछली पैमाने के लिए ~ 30 एस प्रतीक्षा डिश के कांच की सतह के लिए अच्छी तरह से पालन करने के लिए ।
    2. पूरी तरह से मछली पैमाने पर कवर करने के लिए पूरा माध्यम Iscove संशोधित Dulbecco के माध्यम (IMDM) के 1 मिलीलीटर जोड़ें । पेट्री डिश को कमरे के तापमान पर 6 – 48 ज के लिए एक गहरे और नम बॉक्स में रखें ।
      नोट: IMDM पूर्ण मध्यम ७९% IMDM + 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) + 1% पेनिसिलिन शामिल हैं । ऑक्सीजन या सीओ2 की कोई अतिरिक्त आपूर्ति की जरूरत है । कुछ टिशू पेपर रोल पानी से लथपथ बक्से में उच्च आर्द्रता बनाए रखने के लिए बॉक्स में छोड़ा जा सकता है । मछली keratocytes कुछ घंटों के बाद कोशिकाओं के एक पत्रक के रूप में मछली पैमाने से बाहर की ओर पलायन होगा । यह एक ऊतक संस्कृति माइक्रोस्कोप के साथ मनाया जा सकता है । कोशिकाओं को ४८ घंटे में आम तौर पर व्यवहार्य हैं ।
  2. अलग और प्लेट अपनी सतहों पर keratocytes कोशिकाओं ।
    1. पेट्री डिश से मीडियम को निकालें जिसमें फिश स्केल संस्कारी था । अच्छी तरह से 1 एक्स के साथ बंद करो, और मछली स्केल और 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट को कवर करने के लिए अलग समाधान जोड़ें ।
      नोट: सेल के लिए नुस्खा EDTA समाधान निंनानुसार है: १०० एमएल 10x हैंक्स ' संतुलित नमक समाधान (HBSS) + 10 मिलीलीटर की 1 मीटर HEPES (पीएच ७.६) + 10 मिलीलीटर की ७.५% सोडियम बाइकार्बोनेट + २.४ मिलीलीटर की ५०० मिमी EDTA + 1 एल की एच2ओ । पीएच ७.४ को समायोजित किया है ।
    2. बाहर चूसना सभी सेल अलग समाधान और IMDM पूरा माध्यम जोड़ें । कोमल pipetting द्वारा keratocytes तितर बितर । सेल समाधान घनत्व समायोजित करने के लिए इच्छित स्तर (1 x 104– 1 x 105/ इसकी सतह पर कोशिकाओं को प्लेट (धारा 2 के अनुसार तैयार) । इमेजिंग से पहले 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कोशिकाओं सेते ।
      नोट: सेल गणना एक hemocytometer के साथ अलग समाधान के साथ कोशिकाओं detaching के बाद किया जा सकता है । सेल चढ़ाना घनत्व अपेक्षाकृत कम है कि keratocytes सतह क्षेत्र के बहुत से स्थानांतरित करने के लिए है ।
  3. प्लेट चो-K1 कोशिकाओं और अपनी सतहों पर NIH 3T3 कोशिकाओं ।
    नोट: चो-K1 कोशिकाओं के लिए मध्यम ८९% है हैम F12 + 10% FBS + 1% पेनिसिलिन है । NIH 3T3 कोशिकाओं के लिए मध्यम ८९% है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) + 10% बछड़ा गोजातीय सीरम (सीबीएस) + 1% पेनिसिलिन है । संस्कृति की स्थिति ३७ ° c और 5% CO2है ।
    1. संस्कृति चो-K1 कोशिकाओं या NIH 3T3 कोशिकाओं को 80%-100% एक पेट्री डिश में संगम (या संस्कृति flask) ।
    2. हल और संस्कृति मध्यम ३७ ° c करने के लिए कक्ष को गर्म करें ।
    3. पेट्री डिश में सभी कल्चर मीडियम को पिपेट के साथ निकालें । कक्ष को अलग करने के समाधान के साथ 1x कक्षों को धोएं । कोशिकाओं को अलग समाधान के साथ कवर और यह 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेते ।
    4. Pipetting द्वारा कोशिकाओं को तितर-बितर । सेल समाधान ले लीजिए और यह 3 मिनट के लिए ३०० x g पर अपकेंद्रित्र ।
    5. बाहर supernatant चूसना और पूरा मध्यम या सीरम मुक्त माध्यम जोड़ें ।
    6. सेल समाधान घनत्व समायोजित करने के लिए इच्छित स्तर (1 x 105 – 1 x 106/ अपनी सतहों पर कोशिकाओं को प्लेट (धारा 2 के अनुसार तैयार) । 1-2 के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं को इमेजिंग से पहले, या वीडियो रिकॉर्डिंग से पहले 30 मिनट सेक्यूबेट ।

4. इमेजिंग, वीडियो रिकॉर्डिंग, और वास्तविक समय integrin तनाव मानचित्रण

  1. -अर्ध वास्तविक समय लाइव कोशिकाओं में integrin तनाव का इमेजिंग
    1. अपने सतहों पर keratocytes सेते (2 खंड के अनुसार तैयार) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए, या चो-K1 कोशिकाओं या NIH 3T3 कोशिकाओं को 1 ज के लिए अपनी सतहों पर एक इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    2. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप स्टेज पर पेट्री डिश को माउंट करे । 1 एस के एक जोखिम समय के साथ सेलुलर फोर्स इमेजिंग प्रदर्शन । आवर्धन 40x या 100x है ।
    3. Keratocytes के लिए 20 s, या चो-K1 कोशिकाओं या NIH 3T3 कोशिकाओं के लिए 1-2 मिनट के एक फ्रेम अंतराल के साथ अपनी छवियों का एक वीडियो ले लो ।
    4. नवीनतम फ़्रेम अंतराल में नए उत्पादित सिग्नल की गणना करने के लिए किसी वर्तमान फ़्रेम से अपने वीडियो के पिछले फ़्रेम को घटाने के लिए MATLAB या किसी अंय छवि विश्लेषण उपकरण का उपयोग करें । नव उत्पादित अपने संकेत नवीनतम फ्रेम अंतराल में उत्पंन integrin तनाव का प्रतिनिधित्व करता है, जिससे एक अर्ध में सेलुलर बल रिपोर्टिंग वास्तविक समय तरीके से ।
  2. इंयूनोसना कोशिकाओं में समांतक तनाव और कोशिकीय संरचना का इंकोएजिंग
    1. कदम 3.2.2 या 3.3.6 कदम के बाद, लक्ष्य संरचनात्मक प्रोटीन चिह्नित करने के लिए immunostaining प्रदर्शन करते हैं ।
      नोट: integrin तनाव इमेजिंग और सेल संरचनात्मक इमेजिंग के बीच प्रतिदीप्ति दिश से बचने के लिए विभिन्न रंगों का उपयोग करें । इस पांडुलिपि में, Cy5 फ्लोरोफोर phalloidin और Alexa ४८८ के लिए इस्तेमाल किया गया था विंक्युलइन धुंधला के लिए इस्तेमाल किया । प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी दोनों की सांद्रता २.५ μg/mL है । Phalloidin के लिए एकाग्रता १.५ इकाइयों/
    2. दोनों एक integrin तनाव नक्शा और सेल संरचनात्मक इमेजिंग प्राप्त करने के लिए multiफ्लोरोसेंट चैनल इमेजिंग प्रदर्शन.

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Representative Results

इसके साथ, मछली keratocytes के integrin तनाव नक्शा कब्जा कर लिया गया था । यह दर्शाता है कि स्वच्छपटणु दो बल पथों (चित्र 2a) पर समाकनन तनाव उत्पन्न करता है । बल मानचित्र के विभेदन को ०.४ μm (चित्र 2b) के रूप में अंशांकित किया गया । उच्च integrin तनाव पीछे मार्जिन पर ध्यान केंद्रित (चित्र 3a) । इसके अलावा विभिन्न कोशिकाओं के विभिन्न विशिष्ट पैटर्न से पता चलता है. एक अचल कोशिका, nih-3t3, एक विशिष्ट integrin तनाव पैटर्न रूपों (चित्रा 3 बी) तेजी से पलायन keratocyte से काफी अलग है ।

Immunostaining, फोकल आसंजन और मछली keratocytes के integrin तनाव कोइंयूज्ड थे (चित्र 4a) । Keratocytes में integrin तनाव और कोशिका संरचना के बीच संबंध विस्तार से वांग एट अल.25द्वारा अध्ययन किया गया था । Integrin तनाव और चो-K1 कोशिकाओं में तनाव फाइबर भी कोइ (चित्रा 4b) थे । इन प्रयोगों से संकेत मिलता है कि इसकी कोशिका आसंजन बल और कोशिका संरचनाओं के एक साथ इसी तरह इमेजिंग सेटिंग्स के तहत, जिससे कोशिका संरचना के अध्ययन को सुविधाजनक बनाने/

Figure 1
चित्रा 1: इसकी Schematics । इसकी एक dsdna एक rgd ligand, एक प्रतिदीप्ति quencher, एक डाई, और एक बायोटिन टैग के साथ सजाया है । डाई (हरा-भरा सर्कल) क्वान्चर से ठंडा हो जाता है । Integrin तनाव के तहत, dsDNA उठी और Cy3 शमन से मुक्त है और प्रतिदीप्ति कि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया जा सकता है उत्सर्जन करता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक मछली keratocyte और इसके सबमाइक्रोन संकल्प के Integrin तनाव नक्शा । (क) द्रुत प्रवास के दौरान, स्वच्छपटणु दो बल पथों में लगातार एक समाकनन तनाव मानचित्र उत्पन्न करता है । (ख) दो बल पथों के बीच की दूरी सामान्यतया ४० μm है । कोशिकीय बल मानचित्र का स्थानिक विभेदन इसके लगभग ०.४ μm है । निचले बाएँ पैनल में एक छोटी लाल रेखा से चिह्नित क्षेत्र की Cy3 फ्लोरोसेंट तीव्रता के रेखीय प्रोफ़ाइल सेलुलर फोर्स इमेजिंग में संकल्प के अंशांकन के लिए गणना की है. परिणाम कम सही पैनल में दिखाया गया है और एक गाउसीय वक्र के साथ सज्जित । स्केल बार = 10 μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक मछली keratocyte और NIH-3T3 के वास्तविक समय integrin तनाव नक्शा । (क) एक मछली keratocyte और उसके integrin तनाव नक्शा । (ऊपरी बाएं) एक मोस् टाइल फिश केराटोसाइट । (निचला बायां) Integrin तनाव का नक्शा keratocyte द्वारा सूचित इसकी । (ऊपरी दाईं ओर) रीयल-टाइम integrin तनाव फ्रेम घटाव द्वारा प्राप्त किया गया था । यह पता चलता है कि नव निर्मित integrin तनाव सेल रियर एज के साथ colocalized है । (निचला दायां) Integrin तनाव नक्शा (हरा) और वास्तविक समय Integrin तनाव (magenta) एक विलय आंकड़ा में प्रस्तुत कर रहे हैं । स्केल बार = 10 μm । (ख) एक एनआईएच-3T3 फाइकोब्लास्ट और इसके इंटीराइन टेंशन मैप । (ऊपरी बाएं) एक NIH-3T3 फाइकोब्लास्ट । (निचला बायां) Integrin तनाव NIH-3T3 फाइकोब्लास्ट का नक्शा । Integrin तनाव एक धारी पैटर्न में उत्पंन किया गया । (ऊपरी दाईं ओर) रीयल-टाइम integrin तनाव से पता चलता है कि नव जनित integrin तनाव मुख्य रूप से सेल परिधीय क्षेत्र में रूपों । (निचला दायां) Integrin तनाव नक्शा (हरा) और वास्तविक समय Integrin तनाव (magenta) एक विलय आंकड़ा में प्रस्तुत कर रहे हैं । स्केल बार = 10 μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: integrin तनाव और कोशिका संरचना के कोआएजिंग. (क) केराटोसाइट में इंटीइन टेंशन, विन्क्युलेनिन और एफ-एसीटिन केराटोसाइट को विंक्यूटिन और एफ-एक्टीन रिपोर्ट करने के लिए तय किया गया था और इम्यूनोदाग दिया गया था । (ख) एक चो-K1 सेल में इंटीइन टेंशन, विनक्यूइन और एफ-एसीटिन का कोइन्जिंग । स्केल बार = 10 μm । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

अपने दोनों संश्लेषण और आवेदन के संदर्भ में सेलुलर फोर्स मानचित्रण के लिए एक उच्च सुलभ अभी तक शक्तिशाली तकनीक है. सभी के लिए तैयार सामग्री के साथ, इसके 1 दिन के भीतर संश्लेषित किया जा सकता है । प्रयोगों के दौरान, सतह कोटिंग के केवल तीन चरणों सेल चढ़ाना से पहले की जरूरत है । हाल ही में, हमने कोटिंग प्रक्रिया को सीधे तौर पर गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन से जोड़ने के द्वारा एक कदम को सरलीकृत किया है, जो इसके कांच या पॉलीस्टाइरीन सतहों३३के प्रत्यक्ष भौतिक अधिशोषण को सक्षम करता है । इसके सेलुलर संरचनात्मक इमेजिंग के एक तुलनीय स्तर के लिए सेलुलर बल संकेत की फ्लोरोसेंट तीव्रता लाता है । सुविधाजनक संश्लेषण और नमूना तैयारी, microscopy के लिए मामूली आवश्यकताओं, और सेलुलर बल के लिए उच्च संवेदनशीलता सेल यांत्रिकी के अध्ययन के लिए अपनी एक मजबूत और विश्वसनीय तकनीक बना. इस कागज में, हम इसके संश्लेषण और आवेदन के लिए एक व्यापक प्रक्रिया प्रस्तुत की ।

SsDNA के साथ संसंयोजन RGD लिग्वर संश्लेषण में सबसे महत्वपूर्ण प्रक्रिया है । जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग में उल्लेख किया गया है, सल्फो-एसएमसीसी पर एन एच एस एस्टर जल में स्थिर नहीं है । अब यह sulfo-smcc पानी में भंग करने के लिए लेता है, sulfo की अधिक राशि-smcc हाइड्रोलिसिस के लिए एनएचएस एस्टर खो देता है और "dud" हो जाता है, जो maleimide-thiol प्रतिक्रिया के माध्यम से डीएनए के साथ conjugates लेकिन rgd-एनएच2के साथ संयुग्मी में विफल रहता है । नतीजतन, डीएनए अणुओं का एक बड़ा हिस्सा मृत sulfo-SMCC द्वारा कब्जा कर लिया जाएगा और RGD के साथ लिंक नहीं कर सकता, ssDNA-RGD की कम उपज के लिए अग्रणी । इस कारण से, पानी में sulfo-SMCC भंग जल्दी से पूरा किया जाना चाहिए, आम तौर पर 1 मिनट के भीतर । यह भी electrophoresis के साथ ssDNA-RGD की उपज की जांच करने के लिए सिफारिश की है । यदि उपज ८०% से अधिक है, शुद्धि आम तौर पर अनावश्यक है । अंयथा, polyacrylamide जेल द्वारा डीएनए शुद्धि की सिफारिश की है । Polyacrylamide जेल द्वारा डीएनए की वसूली दर के बारे में 60% – 80% है ।

RGD की एक उचित राशि-ssDNA-BHQ2synthesize करने के लिए, Thiol-ssdna की प्रारंभिक राशि-bhq2 कम से 20 Nmol (1 मिमी x 20 μl) होना चाहिए । ध्यान दें कि डीएनए संशोधनों से डीएनए कंपनियों से ऑर्डर की गई ssDNA की मात्रा काफी कम हो जाती है । उदाहरण के लिए, यदि दो संशोधनों के साथ ssDNA के १,००० nmol का आदेश दिया जाता है, तो गारंटीकृत उपज केवल 20 nmol हो सकती है । यदि यही स्थिति है तो आरजीडी-ssDNA संयुग्मन के लिए ssDNA के कम से १,००० nmol का आदेश करें । शोधकर्ताओं ने भी अपने स्वयं के दृश्यों के लिए डिजाइन कर सकते है अपने constructs । आम तौर पर, हम अपने उच्च से अधिक ७०% में GC सामग्री रखने के लिए dsDNA थर्मल स्थिरता में सुधार होगा । डीएनए अनुक्रम विश्लेषण स्वयं-हेयरपिन, स्व-संकरण, स्थिर द्वितीयक संरचना आदि के गठन की संभावना को कम करने के लिए किया जा सकता है । विश्लेषण उपकरण ऑनलाइन उपलब्ध है । पांडुलिपि में, ऊपरी किनारा डीएनए अलग टीटोलके साथ itss के लिए एक ही है । हम कम कतरा डीएनए पर बायोटिन स्थान भिंन टीटोलप्राप्त करने के लिए बदलती हैं । हालांकि, ऊपरी कतरा पर RGD के स्थान बदलती भी अपने की टीटॉल की धुन के लिए आवेदन किया जा सकता है । एक अलग dsdna ज्यामिति के लिए टीटॉल की गणना वांग और हा22 और मोज़ाबाई एट अल.३४द्वारा प्रदान की जाती है, विशेष रूप से unzipping मोड३५,३६ और कतरनी मोड में dsdna के लिए ३७,३८।

हालांकि इसकी सतहों सभी integrin तनाव है कि अतीत में जगह ले ली है रिकॉर्ड, सेलुलर सेना के नक्शे के एक वीडियो रिकॉर्डिंग द्वारा लगातार, शोधकर्ताओं ने पिछले फ्रेम घटाकर द्वारा नवीनतम फ्रेम अंतराल में उत्पादित integrin तनाव की गणना कर सकते है एक मौजूदा फ्रेम से ' अर्ध वास्तविक समय सेलुलर बल ' नक्शा उत्पंन करने के लिए । इसके वीडियो में फ़्रेम अंतराल कक्ष प्रकारों के आधार पर बदलता रहता है, लेकिन यह आमतौर पर 20 तेज़ी से माइग्रेट होने वाले कक्षों और स्टेशनरी कक्षों के लिए 1 – 2 मिनट के लिए होता है । फ्रेम घटाव विधि अर्ध वास्तविक समय integrin तनाव के लिए उच्च संवेदनशीलता संकेत संचय प्रभाव के कारण इमेजिंग बनाए रखने के दौरान तनाव की रिपोर्ट । प्रकाश विरंजन लगातार दो छवियों के बीच कम है, और इसलिए, फ्रेम घटाव विधि के लिए कोई नमूनीय प्रभाव है.

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम स्टार्टअप कोष द्वारा समर्थित किया गया था आयोवा राज्य विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की और राष्ट्रीय सामांय चिकित्सा विज्ञान संस्थान (R35GM128747) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA-biotin Sigma-Aldrich A8549
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Streptavidin Thermo Fisher Scientific 434301
upper strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group Peptides International PCI-3696-PI
IMDM ATCC ‎62996227
FBS ATCC 302020
Penicillin gibco 15140122
TCEP Sigma-Aldrich C4706
200 uL petri dish Cellvis D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000 Thermo Scientific N/A spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit Hoefer SE410-15-1.5 Device for electroporesis
CHO-K1 cell line ATCC CCL-61
NIH/3T3 cell line ATCC CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody EMD Millipore 90227 Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175 Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287
Eclipse Ti Nikon N/A microscope

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References

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Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor. J. Vis. Exp. (146), e59476, doi:10.3791/59476 (2019).

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