Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הדמיה אינטגרין מתח וכוח הסלולר ברזולוציה כחיוניים עם חיישן המתח אינטגרטיבית

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59476
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Summary

אינטגרין המתח ממלא תפקידים חשובים פונקציות שונות של התא. עם חיישן המתח אינטגרטיבית, המתח אינטגרין מכויל עם רגישות picoNewton (pN), עם תמונה ברזולוציה כחיוניים.

Abstract

מתח מולקולרית המועברת על ידי אינטגרין-ליגנד חוב זה האות מכני בסיסי במסלול אינטגרין שמשחק תפקידים משמעותיים בתוך התא פונקציות רבות התנהגויות. כדי לכייל תמונה אינטגרין מתח עם רגישות גבוהה כוח והרזולוציה המרחבית, פיתחנו חיישן המתח אינטגרטיבית (ITS), חיישן המתח פלורסנט מבוסס DNA. ITS מופעל כדי לזרוח אם הסדירה מתח מולקולרית, ובכך המרת כוח לאות פלורסנט ברמה המולקולרית. סף המתח להפעלה ITS הוא tunable בטווח של 10 – 60 pN שמכסה היטב את הטווח הדינמי של אינטגרין המתח בתאים. על מצע הושתל עם ITS, המתח אינטגרין של תאים חסיד דמיינו ידי קרינה פלואורסצנטית, עם תמונה ברזולוציה כחיוניים. ITS הוא גם תואם תא המבניות תאים חיים והן תאים קבוע. ITS יושם בהצלחה לחקר נדידת תאים להתכווצות של טסיות. מאמר זה מפרט את ההליך עבור סינתזה של יישום ITS במחקר של אינטגרין מסר כוח הסלולר.

Introduction

תאים להסתמך על אינטגרינים כדי לדבוק ולהפעיל כוחות הסלולר מטריצה חוץ-תאית. שידור אדהזיה וכוח בתיווך אינטגרין תא מכריעים עבור תא הפצת1,2,3,ההעברה4והישרדות5,6,7. בטווח הארוך, איתות biomechanical אינטגרין גם השפעות תא התפשטות8,9,10 ובידול11,12. חוקרים פיתחו שיטות שונות למדידת וכוחות מפה מסר אינטגרין סלולרי-הממשק תא-מטריקס. שיטות אלה מבוססות על תשתית גמישה13, מערך micropost14, או אטומי בכוח מיקרוסקופ (AFM)15,16. תשתית גמישה ושיטות micropost להסתמך על להרכב של סובסטרטים הדו ח הלחץ הסלולר, יש מגבלות מבחינת רזולוציה מרחבית, להכריח את הרגישות. AFM יש רגישות גבוהה כוח, אבל הוא אינו יכול לזהות כוח בנקודות מרובים בו זמנית, ולכן קשה למפות כוח הסלולר המועברת על ידי אינטגרינים.

בשנים האחרונות פותחו מספר טכניקות ללמוד הסלולר כוח ברמה המולקולרית. אוסף של חיישנים המתח מולקולרי המבוסס על17,פוליאתילן גליקול18, עכביש משי פפטיד19, ו DNA20,21,22,23 פותחו כדי דמיינו ונטר במתח המועברת על ידי חלבונים מולקולרית. בין שיטות אלה, DNA אומצה לראשונה כמו החומר סינתזה במתח להעריך את הקשר (TGT), rupturable מקשר זאת שמחליש את הגבול העליון של אינטגרין מתחים בתוך תאים חיים22,24. מאוחר יותר, טכניקת העברת DNA ו קרינה פלואורסצנטית תהודה היו המשולבות ליצירת סיכת ראש מבוסס DNA המתח פלורסנט חיישנים לראשונה על ידי קבוצה של חן23 של Salaita קבוצה20. החיישן מבוסס DNA המתח מכבנה מדווח אינטגרין המתח בזמן אמת, יושם בהצלחה במחקר של סדרת פונקציות הסלולר21. לאחר מכן, המעבדה של וואנג בשילוב ש- TGT עם הזוג fluorophore-כ'חטיף דו ח אינטגרין מתח. חיישן זה נקרא25,ITS26. ITS מבוסס על שני גדילי ה-DNA (dsDNA) ויש לו טווח דינמי רחב יותר (10-60 pN) לצורך כיול מתח אינטגרין. בניגוד סיכת ראש מבוסס DNA חיישנים, ITS אינו מדווח כוח הסלולר בזמן אמת אבל יקליט כל האירועים ההיסטוריים אינטגרין טביעת רגלו של כוח הסלולר; תהליך הצטברות אות זה משפר את הרגישות לכוח הסלולר הדמיה, שהופך אותו ריאלי לכוח הסלולר התמונה אפילו עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות זולים. הסינתזה של ITS נוח יחסית יותר כמו זה נוצר על ידי hybridizing חד גדילי שני DNAs (ssDNA).

ITS הוא dsDNA 18-בסיס-לזווג מצומדת עם ביוטין, fluorophore, כ'חטיף (חור שחור כ'חטיף 2 [BHQ2])27arginylglycylaspartic מחזורית חומצה (RGD) פפטיד28 כמו ליגנד פפטיד integrin (איור 1). נמוך יותר סטרנד הוא מצומדת עם fluorophore (Cy3 משמש כתב יד זה, בעוד צבעים אחרים, כגון סדרת Cy5 או אלקסה, גם הוכחו ריאלי במעבדה שלנו) ואת התג ביוטין, שבה ITS ותשמרו על מצע מאת ביוטין-אבידין בונד. סטרנד העליונה היא מצומדת עם פפטיד את RGD, את כ'חטיף חור שחור, אשר המרווה Cy3 עם 98% שכבתה יעילות26,27. פרוטוקול שהוצגו במאמר זה, יש צפיפות ציפוי ITS על מצע בסביבות 1100/מיקרומטר2. זוהי צפיפות שלנו בעבר מכויל עבור 18 dsDNA biotinylated bp מצופה על המצע neutrAvidin functionalized על-ידי ביצוע זהה ציפוי פרוטוקול29. כאשר תאים לדבוק המצע מצופה של ITS, integrin נקשר את ITS דרך RGD ומעביר מתח ITS. ITS יש סובלנות מתח מסוים (Ttol) אשר מוגדר סף המתח שמפריד את dsDNA של ITS בתוך 2 s22מכנית. שלו להיקרע על-ידי מתח אינטגרין מוביל את ההפרדה של כ'חטיף לצבוע את זה לאחר מכן פולט קרינה פלואורסצנטית. כתוצאה מכך, המתח הבלתי נראה אינטגרין המרת אות פלורסצנטיות, הכוח הסלולר יכולים למפות על-ידי קרינה פלואורסצנטית הדמיה.

כדי להדגים את היישום של ITS, אנו משתמשים דגים keratocyte כאן, מודל תא בשימוש נרחב עבור תא העברה המחקר30,31,32, צ'ו-K1 תא, שורת התאים nonmotile נפוץ וכן NIH 3T3 פיברובלסט. Coimaging של אינטגרין המתח ותא מבנים גם מתנהל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC, 8-16-8333-אני) של איווה סטייט.

1. סינתזה של החיישן המתח אינטגרטיבית

  1. אישית, להזמין ssDNAs (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: רצפי ssDNA הם כדלקמן. סטרנד העליון הוא AGG ACG חטיבתי CGG GCC /5ThioMC6-D/GGG/3BHQ_2 /. הגדילים התחתון הם כדלקמן.
    12 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG מס רווחי הון CCT CCC /3Bio/
    23 pN ITS: / 5Cy3//iBiodT/ GGC CCG CTG מס רווחי הון CC CCC
    33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
    43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CCT מס רווחי הון קכ ק
    54 pN ITS: /5Biosg / / iCy3/GGC CCG CTG מס רווחי הון CCT CCC
    הנה, /5ThioMC6-D / מייצג צירוף תיול C6 S-S (דיסולפידי) בקצה 5'. /3BHQ_2/ מייצג את 2 כ'חטיף חור שחור בקצה 3'. / 3Bio / / 5Biosg /, /iBiodT/ הן biotinylation בקצה 3', בקצה 5', ועל תימין את ה-DNA פנימי, בהתאמה. /iCy3/ מייצג של Cy3 מוכנס לתוך עמוד השדרה פנימי של ssDNA. קודים אלה נמצאים בשימוש על ידי הספק מסחריים ספציפיים המשמש כאן, עשויים להיות שונים מחברות אחרות, ה-DNA.
  2. פפטיד RGD תרכיב את SH-ssDNA-כ'חטיף.
    הערה: ריאגנטים המשמש הן באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) ציקלוהקסאן-1-carboxylate (sulfo-SMCC) RGD פפטיד, טריס - הידרוכלוריד פוספין (2-carboxyethyl), הידוע גם בשם TCEP-HCl.
    1. Deprotect בביטוי המגביל תיול על ה-DNA גדיל עליון באמצעות פתרון TCEP.
      הערה: DNAs תיול-לאחרונה הורה ממקור מסחרי נשלחים בצורה מחמצנים, עם האטומים גופרית מוגן על-ידי קשר דיסולפידי שלא צריך להיות מופחת לפני RGD-DNA ההטיה. TCEP הוא ריאגנט להפחתת ריח המשמש את deprotection תיול.
      1. להמיס 14.3 מ ג של TCEP-HCl ב- 300 µL של מים. להתאים את ה-pH של הפתרון TCEP ~7.2–7.4 עם פתרון NaOH 1 מ' (כ-150 µL), באמצעות טופס המבחן pH. להוסיף מים טהורים כדי ליצור אמצעי אחסון הסופי של 0.5 מ. ריכוז TCEP הסופי הוא 100 מ מ.
        הערה: מומלץ לבצע TCEP פתרון טרי כל הזמן DNA תיול deprotection. הימנע גרב TCEP פתרון במשך זמן רב.
      2. להוסיף הפתרון TCEP 100 µL של 0.5 M ethylenediaminetetraacetic תמיסה חומצית (EDTA) ו- 400 µL של מים.
      3. להוסיף 10 µL של הפתרון TCEP + EDTA µL 20 של 1 מ מ תיול-DNA-BHQ2 ב- PBS. תן את הפתרון להגיב למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
        הערה: ביקע את קשר דיסולפידי של 5' צירוף תיול ההטיה C6 S-S-ssDNA זו על-ידי TCEP, עוזב את הקבוצה תיול מוכן התגובה עם maleimide בשלבים הבאים. TCEP לא מפריע התגובה הבאה תיול-maleimide; לפיכך, אין צורך passivate TCEP לאחר שלב זה.
    2. תרכיב RGD-NH2 עם sulfo-SMCC.
      1. להמיס 5 מ"ג של RGD-NH2 µL 100 ל- PBS לקבל 11 מ"מ RGD-NH2.
      2. להוסיף 200 µL של מים טהורים ברכבת התחתית עם 2 מ ג של sulfo-SMCC (premeasured על ידי הספק). לרסק את המוצק sulfo-SMCC עם טיפ פיפטה, נמרצות פיפטה במקביל כדי להקל על המסת את SMCC במים. הריכוז של sulfo-SMCC יהיה 23 מ"מ.
        הערה: כי אסתר NHS ב sulfo-SMCC כפוף הידרוליזה ויש לו חיים שלמים של כמה דקות, שלב המסת זה צריך להסתיים בתוך 1 דקות כדי למנוע אובדן מוגזם של אסתר NHS עקב הידרוליזה. להשתמש במים טהורים כדי להמיס sulfo-SMCC כי מסיסות שלה PBS או מאגרים אחרים הוא עני.
      3. להוסיף 40 µL של sulfo-SMCC פתרון הפתרון2 100 µL RGD-NH, דגירה זה במשך 20 דקות.
        הערה: אסתר NHS ב sulfo-SMCC יגיב עם הקבוצה אמין RGD-NH2, ויוצרים של בונד אמיד המקשר RGD ו- sulfo-SMCC.
    3. נזווג RGD-SMCC עם SH-ssDNA-כ'חטיף.
      1. לערבב את הפתרונות שהוכנו בשלבים 1.2.1 ו- 1.2.2, דגירה התערובת לשעה בטמפרטורת החדר. לעבור את הפתרון ערכה מקרר ב 4 ° C ולתת לו עוד יותר להגיב למשך הלילה. תיול מצומדת על ה-DNA של גדיל עליון יגיב עם maleimide על sulfo-SMCC, להרכיב קבוצה thioether המקשרת RGD עם סטרנד העליון הדנ א.
    4. לבצע אתנול משקעים לטהר את RGD-ssDNA-כ'חטיף sulfo unreacted-SMCC, RGD, TCEP.
      1. מקררים 10 מ"ל אתנול 100% 15 מ"ל צינור חרוטי במקפיא-20 ° C במשך לפחות 30 דקות.
      2. לערבב פתרון NaCl 3 מ', פתרון ה-DNA וכן אתנול מצוננים ביחס נפח של 1: 10:25. לשמור על הנוזל מעורב במקפיא-20 ° C למשך 30 דקות או עד ה-DNA הוא חולל.
      3. צנטריפוגה הנוזל ב 10,000 x g עבור 30 דקות לבטל את תגובת שיקוע.
      4. להוסיף PBS בגדר ה-DNA. מודדים את ריכוז הדנ א באמצעות ספקטרומטר.
    5. (אופציונלי) לבצע אלקטרופורזה דנ א כדי לזכות טוהר RGD-ssDNA גבוהה יותר.
      הערה: עם פרוטוקול לעיל, כ 70% – 90% של ssDNA להיות מצומדת עם RGD. אם טוהר גבוה רצוי, ניתן לבצע DNA אלקטרופורזה גם להפריד מצומדת DNA unconjugated DNA.
      1. להרכיב מערכת אלקטרופורזה אנכי.
      2. להכין פתרון 10% ג'ל לזיהוי על ידי ערבוב 50 מ של מים זכים, 20 מ"ל של אקרילאמיד 40% ג'ל, 8 מ של 10 x טריס-בוראט-EDTA (TBE) מאגר 800 µL של 10% קירור (APS).
      3. מוסיפים 80 µL של tetramethylethylenediamine (TEMED) הפתרון ג'ל. שופכים את הפתרון לתוך תא זכוכית של מערכת אלקטרופורזה. הכנס מסרק יחיד-טוב כדי ליצור באר על גבי הג'ל. חכה 10 דקות עד הג'ל הוא תפור.
      4. מערבבים את פתרון ה-DNA עם 100% גליצרול ביחס נפח של 1:1. הסר את המסרק, העמס את פתרון ה-DNA הג'ל.
      5. הפעל את הג'ל על מתח של 200 (פ') להתבונן שני DNA להקות שבהן פיגר אחריו אחד הוא ה-DNA מצומדת.
      6. לחתוך את הלהקה ג'ל עם ה-DNA מצומדת ולגזור אותו לחתיכות קטנות.
      7. לאסוף את הג'ל קוביות שני צינורות צנטריפוגה 1.5 mL עם מסננים. להוסיף 500 µL ל- PBS כל שפופרת.
      8. לשים את הג'ל ספוג PBS במקום חשוך בטמפרטורת החדר עבור יום אחד. דנ א מפוזר מתוך החלקים ג'ל לתוך מגניב.
      9. לאסוף את פתרון ה-DNA על ידי צריך שתוציאו הצינורות ב x 1000 g למשך 2 דקות.
      10. לבצע סיבוב נוסף של אתנול משקעים (שלב 1.2.4) לאסוף את ה-DNA.
  3. לסנתז את ITS מאת hybridizing RGD-ssDNA-כ'חטיף, צבען-ssDNA-ביוטין.
    1. מערבבים את הפתרונות של סטרנד העליון, נמוך יותר סטרנד DNAs ביחס טוחנת של 1.1:1. לשמור את התערובת ב 4 ° C בלילה כדי לייצר את ITS על ידי הכלאה הדנ א.
      הערה: יחס טוחנת של 1.1:1 של ה-DNA הכלאה משמש במקום 1:1. מוגזם RGD-ssDNA-כ'חטיף משמש כדי להבטיח כי כל צבע-ssDNA-ביוטין hybridize עם RGD-ssDNA-כ'חטיף. RGD-ssDNA-כ'חטיף ללא הכלאה יהיה שטף במהלך ציפוי פני השטח, אשר לא ישפיע על איכות ציפוי פני השטח ITS.
    2. Aliquot, חנות הפתרון ITS ב-20 ° C לאחסון לטווח ארוך.
      הערה: מאגר אחסון PBS, ריכוז האחסון בדרך כלל צריך להיות מעל 10 מיקרומטר. לשימוש רגיל, ניתן לאחסן את הפתרון שלה לכמה שבועות ללא התדרדרות באיכות מורגש ב 4 ° C.

2. הכנת משטחים שלה על ידי שיתק את ITS על צלחות פטרי עם תחתית זכוכית

הערה: ריאגנטים בשימוש הם biotinylated אלבומין שור (BSA-ביוטין), חלבון אבידין, ITS. מקררים כל ריאגנטים ומאגר PBS עד סביב 0 ° C על הקרח עם דלי קרח.

  1. לטעון µL 200 של 0.1 מ"ג/מ"ל BSA-ביוטין ב- PBS אל הבאר של צלחת פטרי עם תחתית זכוכית (29 מ"מ קוטר, עם 14 מ מ טוב). דגירה זה במשך 30 דקות ב 4 ° C במקרר. BSA-ביוטין הוא פיזית הספוחה על משטח זכוכית.
  2. למצוץ את הפתרון טוב באמצעות פיפטה ולהוסיף µL 200 ל- PBS בחזרה לבאר, כדי לשטוף את פני השטח. חזור על זה 3 x כדי להשלים את הכביסה.
  3. דגירה 200 µL של µg/mL 50 אבידין חלבון בבאר למשך 30 דקות ב 4 º C. לשטוף אותה 3 x עם PBS. לאחר שלב זה, החלבון אבידין נקשר BSA-ביוטין, הופך להיות מרותק למיטה על משטח זכוכית.
  4. דגירה µL 200 של 0.1 מיקרומטר ITS בבאר למשך 30 דקות ב 4 º C. לשטוף את הצלחת עם 3 x עם PBS. יוצאים PBS בבאר עד ציפוי התא. לאחר שלב זה, ITS עם התגית ביוטין נקשר החלבון אבידין, הופך להיות מרותק למיטה על פני השטח.
    הערה: קריטי עבור ציפוי איכות ומדיניות הומוגניות במהלך הנייח ITS אחד זהירות הוא לתת לעולם השטח פטרי יתייבש. שמירה על כל ריאגנטים, PBS ב 4 ° C או סביב 0 ° C על הקרח עם דלי קרח מסייע להקטין את קצב אידוי המים במהלך השלבים כביסה, כאשר PBS נשאבים מן הבאר.

3. תאי ציפוי על גבי משטחים שלה

  1. תרבות דגים keratocytes.
    הערה: כאן, דג זהב (אם לדייק קרסיוס) משמש כדוגמה, אבל מיני דגים אחרים תיתכן גם עבודה.
    1. לתלוש חתיכת דג בקנה מידה של דג עם פינצטה שטוח-טיפ. לחץ בעדינות את קנה המידה אל הבאר של תת פטרי, עם הצד הפנימי של הסקאלה פנייה אל הזכוכית. לחכות ~ 30 s עבור ציר דגים לדבוק היטב משטח זכוכית של המנה.
    2. להוסיף 1 מיליליטר של Iscove ששינה בינוני שלם בינוני (IMDM) של Dulbecco כדי כיסוי מלא ציר דגים. שמור הפטרי בקופסה חשוכים ולחים עבור 6-48 שעות בטמפרטורת החדר.
      הערה: בינוני מלא IMDM מכיל 79% IMDM + 20% סרום שור עוברית (FBS) + 1% פניצילין. אין אספקה נוספת של חמצן או CO2 נדרש. כמה לחמניות נייר טישו ספוג במים יכול להשאיר בתיבה כדי לשמור על לחות גבוהה בתיבה. דגים keratocytes נודדים מתוך ציר דגים כמו סדין של תאים אחרי כמה שעות. זה יכול להיות שנצפו עם מיקרוסקופ תרביות רקמה. התאים הם בדרך כלל קיימא ב 48 שעות.
  2. ניתוק, צלחת התאים keratocytes על משטחים ITS.
    1. הסר את המדיום הפטרי בה ציר דגים היה תרבותי. לשטוף היטב 1 x עם תא ניתוק פתרון, וכן להוסיף פתרון התולש מכסה את קנה המידה של דגים, תקופת דגירה של 3 דקות.
      הערה: המתכון עבור התא ניתוק EDTA הפתרון הוא כדלקמן: 100 מ של 10 x מאוזנת מלח פתרון (HBSS הנקס) + 10 מ"ל של מ' 1 HEPES (pH 7.6) + 10 מ"ל של 7.5% סודה לשתייה + 2.4 מ של EDTA 500 מ מ + 1 L H2O. ה-pH מכוון 7.4.
    2. למצוץ כל תא ניתוק פתרון ולהוסיף בינוני מלא IMDM. לפזר את keratocytes על ידי pipetting עדין. התאם את צפיפות פתרון תא לרמה הרצויה (1 x 104– 1 x 105/mL). צלחת את התאים על פני השטח ITS (להכין לפי סעיף 2). דגירה התאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני הדמיה.
      הערה: תא סופר יכול להיעשות עם hemocytometer לאחר ניתוק התאים עם ניתוק פתרון. התא יופיצ צפיפות היא נמוכה יחסית keratocytes יש שפע של פני השטח כדי להעביר.
  3. צלחת צ'ו-K1 תאים ותאים NIH 3T3 על משטחים שלה.
    הערה: המדיום עבור תאים צ'ו-K1 היא של 89% חזיר F12 + 10% FBS + 1% פניצילין. המדיום עבור תאים 3T3 NIH הוא המדיום הנשר של 89% Dulbecco ששונתה (DMEM) + 10% עגל שור סרום (CBS) + 1% פניצילין. תרבות התנאים CO 37 ° C ו-5%2.
    1. תרבות צ'ו-K1 תאים או NIH 3T3 לתאים 80%-100% הנהרות פטרי (או תרבות את הבקבוק).
    2. לחמם את התא ניתוק פתרון ותרבות בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס.
    3. הסר כל תרבות בינוני בצלוחית הפטרי עם פיפטה. לשטוף את התאים 1 x עם תא ניתוק פתרון. מכסה את התאים עם ניתוק פתרון, דגירה זה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. לפזר את התאים על ידי pipetting. לאסוף את הפתרון תא, centrifuge זה ב 300 x גרם במשך 3 דקות.
    5. למצוץ תגובת שיקוע והוסף בינוני מלא או בינונית ללא סרום.
    6. התאם את צפיפות פתרון תא לרמה הרצויה (1 x 105 – עונה 1 פרק 106/mL). צלחת את התאים על משטחים ITS (להכין לפי סעיף 2). דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שעות לפני הדמיה, או 30 דקות לפני הקלטת וידאו.

4. הדמיה, הקלטת וידאו, ומיפוי המתח של אינטגרין בזמן אמת

  1. Quasi-real-time הדמיה של אינטגרין במתח תאים חיים
    1. דגירה keratocytes על משטחים שלה (להכין לפי סעיף 2) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, או דגירה צ'ו-K1 תאים או תאים 3T3 NIH לשעה על משטחים שלה בתוך אינקובטור ב 37 º C.
    2. הר הפטרי על הבמה מיקרוסקופ זריחה. לבצע הדמיה כוח הסלולר עם מועד החשיפה של 1 s. ההגדלה היא 40 x או 100 x.
    3. קח וידאו של תמונות שלה עם מרווח מסגרת זמן של 20 s עבור keratocytes או 1-2 דקות עבור תאים צ'ו-K1 או NIH 3T3 תאים.
    4. השתמש MATLAB או כלי אחר של ניתוח תמונה כדי לחסר מסגרת הקודם של הוידאו ITS מן המסגרת הנוכחית כדי לחשב את האות ITS החדש מיוצר במרווח המסגרת האחרונה. האות ITS לאחרונה המיוצר מייצגת את המתח אינטגרין שנוצר מרווח מסגרת העדכנית ביותר, ובכך דיווח מהמשטרה הסלולר באופן quasi-real-time.
  2. Coimaging של אינטגרין המתח ואת המבנה התאי בתאים immunostained
    1. לאחר שלב 3.2.2 או שלב 3.3.6, לבצע immunostaining כדי לסמן את היעד חלבונים מבניים.
      הערה: השתמש צבעים שונים כדי להימנע crosstalk זריחה בין אינטגרין הדמיה מתח התא המבניות. כתב יד זה, שימש Cy5 fluorophore phalloidin, 488 אלקסה שימשו vinculin מכתים. ריכוז נוגדן ראשי ומשני הוא 2.5 µg/mL. הריכוז של phalloidin הוא יחידות 1.5/µL.
    2. לבצע ערוץ multifluorescent הדמיה לרכוש אינטגרין המתח מפה והן תא המבניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עם ITS, נתפס על מפת המתח אינטגרין דגים keratocytes. זה מראה keratocyte נודד אינטגרין מתח על שני מסלולים לכוח (איור 2 א). הרזולוציה של המפה כוח היה מכויל כדי להיות 0.4 מיקרומטר (איור 2B). מתח גבוה אינטגרין מתרכזת בקצה תחום אחורי (איור 3 א). ITS מראה גם דפוסים ספציפיים שונים של תאים שונים. תא nonmotile, NIH-3T3, טפסים אינטגרין מסוימים המתח דפוס (איור 3B) שונה לגמרי מזו של keratocyte העברה מהירה.

עם immunostaining, מוקד הדבקויות והמתח אינטגרין של דגים keratocytes היו coimaged (איור 4A). היחס בין המתח אינטגרין מבנה תא keratocytes נחקר בפירוט על ידי וואנג et al.25. סיבי וסטרס אינטגרין בתאים צ'ו-K1 היו גם coimaged (איור 4B). ניסויים אלה מציינים ITS מאפשר את coimaging של כוח הידבקות תאים ומבנים התא בו זמנית. תחת הגדרות הדמיה דומה, ובכך להקל את חקר התא מבנה/כפה הגומלין.

Figure 1
איור 1: תרשים של שלה. ITS הוא dsDNA המעוטר של ליגנד RGD, כ'חטיף זריחה, צבע, תג ביוטין. לצבוע (עיגול מלא ירוק) הוא מתרצה מאת כ'חטיף. תחת מתח אינטגרין, נקרע את dsDNA ו- Cy3 הוא שוחרר מן שכבתה פולט קרינה פלואורסצנטית שניתן לאתר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: אינטגרין המתח מפת keratocyte דגים הרזולוציה כחיוניים של ITS. (א) במהלך ההעברה מהיר, keratocyte באופן עקבי יוצר מפת המתח של אינטגרין במסלולים כוח שני. (B) המרחק בין שתי רצועות כוח היא בדרך כלל 40 מיקרומטר. הרזולוציה המרחבית של המפה כוח הסלולר עם תמונה מאת ITS הוא סביב 0.4 מיקרומטר. הפרופיל ליניארי של עוצמת פלורסנט Cy3 של האזור המסומן בקו אדום קצר בחלונית השמאלית התחתונה מחושבת עבור הכיול של הרזולוציה בתחום הסלולר כוח ההדמיה. התוצאה המוצגת בחלונית הימנית התחתונה, מצוידים עם עיקול לפי עקומת גאוס. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: מפת המתח אינטגרין בזמן אמת של דגים keratocyte ו- NIH-3T3- (א) א דגים keratocyte ומפת המתח שלו אינטגרין. (שמאל למעלה) Keratocyte תאי דגים. (השמאלית התחתונה) אינטגרין המתח מפת keratocyte שדווחו על-ידי ITS. (מימין) אינטגרין בזמן אמת המתח היה מתקבל על ידי חיסור מסגרת. זה מראה כי המתח אינטגרין החדש שנוצר הוא colocalized עם הקצה האחורי של התא. (הימנית התחתונה) אינטגרין המתח מפה (ירוק), המתח אינטגרין בזמן אמת (מגנטה) מוצגים באיור ממוזג אחד. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) ה-NIH 3T3 פיברובלסט ומפת המתח שלו אינטגרין. (שמאל למעלה) פיברובלסט NIH-3T3. (השמאלית התחתונה) אינטגרין המתח מפת פיברובלסט NIH-3T3. אינטגרין המתח נוצר בתבנית הפסים. (מימין) אינטגרין בזמן אמת המתח מראה אינטגרין החדש שנוצר מתח טפסים בעיקר על אזור פריפריאלי תא. (הימנית התחתונה) אינטגרין המתח מפה (ירוק), המתח אינטגרין בזמן אמת (מגנטה) מוצגים באיור ממוזג אחד. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: Coimaging של מתח אינטגרין ומבנה התא. (א) Coimaging של אינטגרין מתח, vinculin ו- F-אקטין ב keratocyte. Keratocyte היה קבוע, immunostained לדווח vinculin ו- F-אקטין. Coimaging (B) של אינטגרין מתח, vinculin ו- F-אקטין בתא צ'ו-K1. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ITS היא ונגישות גבוהה טכניקה חזקה עבור הסלולר לאלץ את מיפוי במונחים של סינתזה והן ביישום. עם כל החומרים מוכנים, ITS יכול להיות מסונתז בתוך יום אחד. במהלך הניסויים, נחוצים רק שלושה צעדים של ציפוי פני השטח לפני ציפוי התא. לאחרונה, אנחנו מפושט ההליך ציפוי צעד אחד נוסף על-ידי קישור ישירות את ITS אלבומין שור, שמאפשר ספיחה פיסיקלית ישירה של ITS זכוכית או משטחים פוליסטירן33. ITS מביא את עוצמת אות כוח הסלולר לרמה המקבילה של הסלולר המבניות פלורסנט. סינתזה נוח הכנת הדוגמא, דרישות צנועות מיקרוסקופ, ורגישות גבוהה עבור כוח הסלולר הופכים ITS טכניקה עמיד ואמין עבור חקר התא מכניקה. בנייר זה, הצגנו הליך מקיף של סינתזה וביישום שלה.

ליגנד עם ssDNA conjugating RGD הוא ההליך הקריטי ביותר בסינתזה ITS. כפי שהוזכר בסעיף פרוטוקול, אסתר NHS-sulfo-SMCC אינה יציבה במים. ככל שיידרש כדי להמיס sulfo-SMCC במים, כמות sulfo-SMCC יותר. מפסיד NHS אסתר הידרוליזה, הופך להיות "נכשל", אשר conjugates עם ה-DNA דרך התגובה maleimide-תיול. אבל נכשל נזווג עם RGD-NH2. כתוצאה מכך, חלק גדול של מולקולות DNA שהוזמנה על ידי מת sulfo-SMCC, אין באפשרותך לקשר עם RGD, שמוביל תשואה נמוכה של ssDNA-RGD. מסיבה זו, המסת sulfo-SMCC במים צריך להסתיים במהירות, בדרך כלל בתוך 1 דקות. כמו כן מומלץ לבדוק את התשואה של ssDNA-RGD עם אלקטרופורזה. אם התשואה גבוהה מ- 80%, טיהור אינה נחוצה כלל. אחרת, טיהור DNA על ידי ג'ל לזיהוי מומלץ. קצב ההתאוששות של ה-DNA על ידי ג'ל לזיהוי הוא כ 60%-80%.

לסנתז כמות סבירה של RGD-ssDNA-BHQ2, הסכום ההתחלתי של תיול-ssDNA-BHQ2 צריך להיות לפחות 20 nmol (1 מ מ x 20 µL). הערה שינויים DNA להפחית באופן משמעותי את כמות ssDNA הורה מחברות ה-DNA. לדוגמה, אם nmol 1,000 של ssDNA עם שני שינויים הוא הורה, התשואה מובטחת רק ייתכן 20 nmol. אם זה המקרה, להזמין לפחות 1,000 nmol של ssDNA עבור הבניין RGD-ssDNA. חוקרים יכולים גם עיצוב משלהם רצפי בונה שלה. בדרך כלל, אנחנו שומרים את התוכן GC ב- ITS גבוה מ- 70% כדי לשפר את יציבות תרמית של dsDNA. ניתן לבצע ניתוח רצף הדנ א כדי לצמצם את ההסתברות של יצירת העצמי-סיכת ראש, הכלאה עצמית, מבנה שניוני יציב, וכו '. כלי הניתוח זמין באינטרנט. בכתב היד, סטרנד העליון הדנ א הוא זהה עבור ITSs עם Tשונהtol. אנחנו משתנים המיקום ביוטין ב סטרנד התחתון דנ א כדי להשיג של Tשונהtol. עם זאת, שינוי המיקום של RGD על סטרנד העליון ניתן גם להחיל לכוון את Ttol של ITS. החישוב של Ttol עבור הגיאומטריה dsDNA שונים מסופק על ידי וואנג ו Ha22 ו Mosayebi et al.34, במיוחד עבור dsDNA35,מצב unzipping36 ובמצב הטיה 37,38.

למרות משטחים שלה להקליט כל המתחים אינטגרין שהתרחשו בעבר, ע י הקלטת וידאו של המפה הסלולר כוח ברצף, חוקרים יכולים לחשב את המתח אינטגרין המיוצר במרווח המסגרת האחרונה על-ידי חיסור המסגרת הקודמת מן המסגרת הנוכחית כדי ליצור את 'מפת כוח הסלולר quasi-real-time'. מרווח מסגרת וידאו ITS משתנה בהתאם סוגי תאים, אך בדרך כלל 20 s עבור תאים נודדים מהיר ו- 1-2 דקות עבור תאים נייח. שיטת החיסור מסגרת דוחות את המתח אינטגרין quasi-real-time תוך שמירה על רגישות גבוהה עבור אינטגרין הדמיה מתח בגלל ההשפעה הצטברות אות. Photobleaching הוא מינימאלי בין שתי תמונות עוקבות, לכן, יש השפעה הנצפה בשיטה חיסור מסגרת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי קרן האתחול המסופקים על-ידי איווה סטייט ומאת הלאומית המכון כללי רפואי למדעים (R35GM128747).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA-biotin Sigma-Aldrich A8549
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Streptavidin Thermo Fisher Scientific 434301
upper strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group Peptides International PCI-3696-PI
IMDM ATCC ‎62996227
FBS ATCC 302020
Penicillin gibco 15140122
TCEP Sigma-Aldrich C4706
200 uL petri dish Cellvis D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000 Thermo Scientific N/A spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit Hoefer SE410-15-1.5 Device for electroporesis
CHO-K1 cell line ATCC CCL-61
NIH/3T3 cell line ATCC CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody EMD Millipore 90227 Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175 Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287
Eclipse Ti Nikon N/A microscope

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
  2. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  3. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
  4. Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
  5. Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
  6. Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
  7. Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
  8. Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
  9. Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
  10. Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
  11. Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
  12. Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
  13. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
  14. Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 235-244 (2017).
  15. Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  16. Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
  17. Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
  18. Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
  19. Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  20. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
  21. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  22. Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
  23. Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
  24. Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
  25. Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
  26. Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
  27. Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
  28. Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
  29. Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  30. Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
  31. Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
  32. Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
  33. Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
  34. Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
  35. Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
  36. Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
  37. de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
  38. Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).

Tags

הכחשה גיליון 146 מכניקה תא mechanobiology אינטגרין המתח אינטגרין מיפוי כוח הסלולר חיישן המתח אינטגרין
הדמיה אינטגרין מתח וכוח הסלולר ברזולוציה כחיוניים עם חיישן המתח אינטגרטיבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X.… More

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor. J. Vis. Exp. (146), e59476, doi:10.3791/59476 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter