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Bioengineering

Imaging-Integrin Spannung und zelluläre Kraft mit Submicron-Auflösung mit einem integrativen Spannung Sensor

Published: April 25, 2019 doi: 10.3791/59476
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Physics and Astronomy, Iowa State University, 2Department of Physics and Astronomy, Molecular, Cellular, and Developmental Biology Interdepartmental Program, Iowa State University

Summary

Integrin Spannung spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen Zellfunktionen. Mit einem integrativen Spannung Sensor ist Integrin Spannung mit Pikonewton (pN) Empfindlichkeit kalibriert und mit Submikron Auflösung abgebildet.

Abstract

Molekulare Spannung übertragen durch Integrin-Ligand-Bindungen ist das grundlegende mechanische Signal in der Integrin-Weg, der bedeutende Rollen in vielen Zellfunktionen und Verhaltensweisen spielt. Zur Kalibrierung und Bild Integrin Spannung mit hoher Kraft Sensibilität und räumliche Auflösung, haben wir einen integrative Spannung Sensor (ITS), ein DNA-basierte fluoreszierende Spannung Sensor entwickelt. Der ITS ist aktiviert, um fluoreszieren, wenn eine molekulare Spannung aufrechterhalten Fluoreszenzsignal auf molekularer Ebene dadurch Kraft umwandeln. Die Spannung Schwelle für ITS-Aktivierung ist einstellbar im Bereich von 10 – 60 pN, die den Dynamikbereich des Integrin-Spannung in den Zellen gut abdeckt. Auf einem Substrat mit einem ITS veredelt ist die Integrin-Spannung von adhärenten Zellen durch Fluoreszenz visualisiert und mit Submikron Auflösung abgebildet. Der ITS ist auch kompatibel mit Zelle strukturelle Bildgebung in lebenden Zellen und festen Zellen. Der ITS hat sich dem Studium der Thrombozyten Kontraktion und Zellwanderung erfolgreich angewendet. Dieses Papier beschreibt das Verfahren für die Synthese und Anwendung von IVS in der Erforschung der zellulären Kraft Integrin-übertragen.

Introduction

Zellen setzen auf Integrine zu halten und zelluläre Kräfte zur extrazellulären Matrix auszuüben. Integrin-vermittelte Zelle Adhäsion und Kraft Übertragung sind entscheidend für die Zelle verbreiten,1,2, Migration3,4und überleben5,6,7. Auf lange Sicht beeinflusst das Integrin biomechanische Signalisierung auch Zelle Verbreitung8,9,10 und Differenzierung11,12. Forscher entwickelten verschiedene Methoden zur Messung und Karte Integrin übertragbare Mobilfunk Kräfte an der Zellmatrix Schnittstelle. Diese Methoden basieren auf elastischen Substrat13, Array von Micropost14, oder atomic force Microscopy (AFM)15,16. Elastische Substrat und Micropost Methoden beruhen auf der Verformung von Substraten zu berichten die zellulären Stress und haben Einschränkungen in Bezug auf räumliche Auflösung und Empfindlichkeit zu erzwingen. AFM hat hohe Kraftempfindlichkeit, aber es nicht Kraft an mehreren Stellen gleichzeitig erkennen, erschwert das zelluläre Kraft Karte durch Integrine übertragen.

In den letzten Jahren wurden verschiedene Techniken entwickelt, um zelluläre Kraft auf molekularer Ebene zu untersuchen. Eine Sammlung von molekularen Spannung Sensoren basierend auf Polyethylenglykol17,18, Spinne Seide Peptid19und DNA-20,21,22,23 wurden entwickelt, um visualisieren Sie und überwachen Sie Spannung durch molekulare Proteine übertragen. Unter diesen Techniken wurde DNA zuerst angenommen, da die Synthese Material in der Spannung messen Tether (TGT), ein rupturable Linker, der die Obergrenze der Integrin Spannungen in lebenden Zellen22,24moduliert. Später, DNA und Fluoreszenz-Resonanz-Transfertechnik wurden kombiniert, um Haarnadel fluoreszierende Spannung DNA-basierte Sensoren erstellen zuerst nach Chens Gruppe23 und Salaitas Gruppe20. Die Haarnadel DNA-basierte Spannung Sensor berichtet Integrin Spannung in Echtzeit und dem Studium einer Reihe von zellulären Funktionen21erfolgreich angewendet wurde. Danach kombiniert Wangs Lab ein TGT mit dem Fluorophor-Quencher paar Bericht Integrin Spannung. Dieser Sensor ist ein ITS25,26benannt. Der ITS basiert auf doppelsträngige DNA (DsDNA) und hat einen breiteren Dynamikbereich (10-60 pN) für Integrin Spannung Kalibrierung. Im Gegensatz zur Haarnadel DNA-basierte Sensoren ITS meldet keine zelluläre Kraft in Echtzeit sondern zeichnet alle historischen Integrin-Ereignisse wie der Fußabdruck von zellulären Kraft; Dieses Signal Akkumulationsprozess verbessert die Empfindlichkeit für zelluläre Kraft imaging, so dass es möglich ist Bild zellulären Kraft sogar mit einem Low-End Fluoreszenzmikroskop. Die Synthese von IVS ist relativ bequemer, wie es durch Hybridisierung zwei einzelsträngigen DNA (SsDNA) erstellt wird.

Der ITS ist ein 18-Basis gepaart DsDNA konjugiert mit Biotin, ein Fluorophor, einen Quencher (Schwarzloch Quencher 2 [BHQ2])27und eine zyklische Arginylglycylaspartic Säure (RGD) Peptid28 als ein Integrin-Peptid-Liganden (Abbildung 1). Der untere Strang ist mit dem Fluorophor konjugiert (Cy3 in dieser Handschrift, während andere Farbstoffe wie Cy5 oder Alexa-Serie verwendet wird, sind auch möglich in unserem Labor nachgewiesen worden) und das Biotin-Tag, mit denen der ITS wird auf einem Substrat von Biotin-Avidin Bond immobilisiert. Der obere Strang ist konjugiert mit RGD-Peptid und das Schwarzloch Quencher, die Cy3 mit ca. 98 % abschrecken Effizienz26,27stillt. Mit dem Protokoll in diesem Papier präsentiert ist die Beschichtung Dichte des ITS auf einem Substrat um 1.100/µm2. Dies ist die Dichte, die wir zuvor für 18 bp biotinylierte DsDNA auf dem NeutrAvidin funktionalisiert Substrat durch Anschluss an das gleiche Protokoll29Beschichtung beschichtet kalibriert. Wenn Zellen auf das Substrat beschichtet mit dem ITS anhaften, Integrin bindet den ITS durch RGD und überträgt Spannungen an den ITS. Der ITS hat eine bestimmte Spannung Toleranz (TTol) definiert als die Spannung Schwelle, die mechanisch die DsDNA des ITS innerhalb von 2 s22trennt. DER Bruch durch Integrin Spannung führt zur Trennung von der Quencher aus der Farbstoff, der anschließend Fluoreszenz emittiert. Infolgedessen die unsichtbare Integrin-Spannung ist ein Fluoreszenzsignal umgewandelt und die zelluläre Kraft durch Fluoreszenz-Bildgebung abgebildet werden kann.

Um die Anwendung des ITS zu demonstrieren, verwenden wir Fisch auch hier, eine weit verbreitete Zellmodell für Zelle Migration Studie30,31,32CHO-K1-Zelle, eine häufig verwendete nonmotile Zelllinie und NIH-3 t 3-Fibroblasten. Coimaging Integrin Spannung und Zelle Strukturen wird auch durchgeführt.

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Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Use Committee (IACUC, 8-16-8333-I) der Iowa State University genehmigt.

1. Synthese von der integrativen Spannung sensor

  1. Anpassen und SsDNAs (siehe die Tabelle der Materialien) zu bestellen.
    Hinweis: Die SsDNA-Sequenzen sind wie folgt. Die oberen Strang ist /5ThioMC6-D/GGG AGG ACG CAG CGG GCC/3BHQ_2 /. Die unteren Stränge sind wie folgt.
    12 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CCT CCC /3Bio//5Cy3 /
    23 pN ITS: GGC CCG CTG CGT CC /iBiodT//5Cy3/CCC
    33 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG CTG CG/iBiodT/CCT CCC
    43 pN ITS: / 5Cy3/GGC CCG C/iBiodT/G CGT CCT CCC
    54 pN ITS: /5Biosg / / iCy3/GGC CCG CTG CGT CCT CCC
    Hier, /5ThioMC6-D / steht für ein Thiol-Modifizierer C6 S-S (Disulfid) am 5'-Ende. /3BHQ_2/ stellt ein Schwarzloch Quencher 2 am 3'-Ende. / 3Bio / / 5Biosg/und /iBiodT/ liegen Biotinylierungen Ende 3', 5'-Ende, und auf die Thymin der interne DNS. /iCy3/ stellt eine Cy3 in das interne Rückgrat der SsDNA eingefügt. Diese Codes werden von den bestimmten kommerziellen Lieferanten verwendet hier verwendet und können in anderen DNA-Unternehmen unterschiedlich sein.
  2. Konjugat RGD Peptid zu SH-SsDNA-Durstlöscher.
    Hinweis: Die verwendeten Reagenzien sind Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 4-(N-Maleimidomethyl) Cyclohexan-1-Carboxylat (Sulfo-SMCC), RGD Peptid und Tris - Sulfosuccinimidyl (2-Carboxyethyl) Phosphin Hydrochlorid, auch bekannt als DÄMMUND-HCl.
    1. Deprotect des Thiol-Modifikators auf der oberen Strang DNA mit DÄMMUND Lösung.
      Hinweis: Thiol-modifizierte DNAs bestellt aus kommerziellen Quellen sind im Lieferumfang in oxidierter Form, die Schwefel-Atome, geschützt durch ein Disulfid-Band, die vor der RGD-DNA Konjugation reduziert werden muss. DÄMMUND ist ein geruchloses Reduktion Reagenz für die Thiol-Deprotection verwendet.
      1. 14,3 mg DÄMMUND-HCl in 300 µL Wasser auflösen. Stellen Sie den pH-Wert der DÄMMUND Lösung für ~7.2–7.4 mit 1 M NaOH-Lösung (ca. 150 µL), mit pH Testpapiere. Fügen Sie reines Wasser zu einem Endvolumen von 0,5 mL. Die Endkonzentration DÄMMUND beträgt 100 mM.
        Hinweis: Es wird empfohlen, DÄMMUND Lösung für DNA-Thiol Deprotection jedesmal frisch zu machen. Vermeiden Sie Strumpf DÄMMUND Lösung für eine lange Zeit.
      2. Die DÄMMUND Lösung 100 µL 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Säurelösung und 400 µL Wasser hinzufügen.
      3. 20 µL 1 mM Thiol-DNA-BHQ2 in PBS 10 µL der DÄMMUND + EDTA-Lösung hinzufügen. Lassen Sie die Lösung für 30 min bei Raumtemperatur zu reagieren.
        Hinweis: Die Disulfid-Anleihe von 5' Thiol-Modifizierer C6 S-S Konjugation bei diesem SsDNA wird durch DÄMMUND, verlassen die Thiol-Gruppe in den nächsten Schritten bereit für Reaktion mit Maleimide abgespalten. Die DÄMMUND beeinträchtigt nicht die folgenden Thiol-Maleimide-Reaktion; so ist es nicht notwendig, DÄMMUND nach diesem Schritt passiviert.
    2. Konjugieren Sie RGD-NH2 mit Sulfo-SMCC.
      1. Lösen Sie 5 mg RGD-NH2 in 100 µL PBS, 11 mM RGD-NH2zu erhalten.
      2. Fügen Sie 200 µL des reinen Wassers in das Röhrchen mit 2 mg Sulfo-SMCC (abgemessene durch den Lieferanten). Smash die Sulfo-SMCC fest mit einer Pipettenspitze und kräftig pipette zur gleichen Zeit zu erleichtern, die SMCC im Wasser auflösen. Die Konzentration von Sulfo-SMCC werden 23 mM.
        Hinweis: Da die NHS-Ester in Sulfo-SMCC unterliegt der Hydrolyse und eine Lebensdauer von ein paar Minuten hat, sollte dieser auflösenden Schritt innerhalb von 1 min. zur Vermeidung übermäßigen Verlust von der NHS-Ester durch Hydrolyse ausgeführt werden. Verwenden Sie reines Wasser Sulfo-SMCC aufzulösen, da seine Löslichkeit in PBS oder anderen Puffer schlecht ist.
      3. Die 100 µL RGD-NH2 Lösung 40 µL Sulfo-SMCC-Lösung hinzufügen und 20 min inkubieren.
        Hinweis: Die NHS-Ester in Sulfo-SMCC der Amingruppe RGD-NH2, bilden eine Amid-Bindung, die Links RGD und Sulfo-SMCC reagiert mit.
    3. Konjugieren Sie RGD-SMCC mit der SH-SsDNA-Quencher.
      1. Mischen Sie die Lösungen, die in den Schritten 1.2.1 und 1.2.2 vorbereitet und inkubieren Sie die Mischung für 1 h bei Raumtemperatur. Verschieben Sie die Lösung auf einen Kühlschrank bei 4 ° C und lassen Sie es über Nacht weiter reagieren. Die Thiol konjugiert auf der oberen Strang DNA wird mit Maleimide auf Sulfo-SMCC, Bildung einer Thioether Gruppe, die mit den oberen Strang DNA RGD links reagieren.
    4. Führen Sie Ethanol Niederschlag RGD SsDNA Durstlöscher aus nicht umgesetztes Sulfo-SMCC, RGD und DÄMMUND zu reinigen.
      1. Kühlen Sie 10 mL 100 % Ethanol in einem 15 mL konische Rohr in einem Gefrierschrank-20 ° C für mindestens 30 min.
      2. Mischen Sie eine 3 M NaCl-Lösung, DNA-Lösung und gekühlte Ethanol ein Volumenverhältnis von 01:10:25. Halten Sie die gemischte Flüssigkeit in einem Gefrierschrank-20 ° C für 30 Minuten oder bis die DNA ausgefällt wird.
      3. Zentrifuge die Flüssigkeit bei 10.000 X g für 30 min. verwerfen den überstand.
      4. Das DNA-Pellet PBS hinzufügen. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Spektrometer.
    5. (Optional) Führen Sie DNA Elektrophorese um eine höhere RGD-SsDNA Reinheit zu erlangen.
      Hinweis: Mit dem oben genannten Protokoll wird etwa 70 – 90 % der der SsDNA mit RGD konjugiert werden. Wenn höherer Reinheit gewünscht wird, kann auch DNA Elektrophorese durchgeführt werden, um konjugierte DNA von unconjugated DNA zu trennen.
      1. Montieren Sie eine vertikale Elektrophorese-System.
      2. Bereiten Sie eine 10 % Polyacrylamid-Gel-Lösung durch das Mischen von 50 mL reines Wasser, 20 mL 40 % Acrylamid Gel, 8 mL 10 x Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer und 800 µL 10 % Ammonium Bleichen (APS).
      3. Die Gel-Lösung 80 µL Tetramethylethylenediamine (TEMED) hinzufügen. Gießen Sie die Lösung in der Glas-Kammer der Elektrophorese-System. Legen Sie einen Single-Well Kamm um einen Brunnen auf dem Gel zu erstellen. 10 min. warten Sie, bis das Gel vernetzt ist.
      4. Mischen Sie die DNA-Lösung mit 100 % Glyzerin in einem Volumenverhältnis von 1:1. Entfernen Sie den Kamm und laden Sie die DNA-Lösung für das Gel gut.
      5. Führen Sie das Gel mit einer Spannung von 200 V. beobachten zwei DNA-Bänder in denen die Verzögerung einer konjugierten DNA ist.
      6. Die Gel-Band mit der konjugierten DNA abgeschnitten und in kleine Stücke würfeln.
      7. Sammeln Sie die gewürfelte Gel in zwei 1,5 mL Zentrifuge Röhren mit Filtern. Jedes Rohr 500 µL PBS hinzufügen.
      8. Setzen Sie die PBS-getränkten Gel an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur für 1 Tag. DNA wird aus dem Gel in die PBS diffundieren.
      9. Sammeln Sie die DNA-Lösung durch die Rohre bei 1.000 X g für 2 min zentrifugieren.
      10. Führen Sie eine weitere Runde von Ethanol Niederschlag (Schritt 1.2.4), die DNA zu sammeln.
  3. Den ITS durch Hybridisierung RGD SsDNA Quencher und Farbstoff-SsDNA-Biotin zu synthetisieren.
    1. Die Lösungen von den oberen Strang und der untere Strang DNA in einem molaren Verhältnis von 1.1:1 zu mischen. Halten Sie die Mischung bei 4 ° C über Nacht zu den ITS durch DNA-Hybridisierung zu produzieren.
      Hinweis: Einem Molverhältnis von 1.1:1 für die DNA-Hybridisierung wird anstelle von 1:1 verwendet. Übermäßige RGD-SsDNA-Löscher wird verwendet, um sicherzustellen, dass alle Farbstoff-SsDNA-Biotin mit RGD SsDNA Quencher hybridisieren wird. RGD-SsDNA-Durstlöscher ohne Hybridisierung wird während der Oberflächenbeschichtung, abgewaschen werden die ITS Oberflächenbeschichtung Qualität nicht beeinträchtigt wird.
    2. Aliquoten und laden die ITS-Lösung bei-20 ° C für langfristige Lagerung.
      Hinweis: Der Speicher-Puffer ist PBS und die Speicher-Konzentration sollte in der Regel über 10 µM. Für den regelmäßigen Gebrauch kann seine Lösung für ein paar Wochen ohne merkliche Verschlechterung bei 4 ° C aufbewahrt werden.

2. Vorbereitung der Oberflächen durch Immobilisierung des ITS auf Glasboden-Petrischalen

Hinweis: Die verwendeten Reagenzien sind biotinylierte Rinderserumalbumin (BSA-Biotin), Protein Avidin und ITS. Alle Reagenzien und PBS-Puffer auf ca. 0 ° C mit einem Eiskübel auf Eis abkühlen.

  1. 200 µL von 0,1 mg/mL BSA-Biotin mit PBS-Puffer auf dem Brunnen ein Glasboden-Petrischale (29 mm Durchmesser, mit einem 14 mm auch) zu laden. Bei 4 ° C im Kühlschrank 30 min inkubieren. BSA-Biotin ist physisch auf der Glasoberfläche adsorbiert.
  2. Saugen Sie die Lösung aus dem gut mit einer Pipette und fügen Sie 200 µL PBS zurück zum Brunnen, um die Oberfläche zu waschen. Wiederholen Sie diese 3 X um die Wäsche zu vervollständigen.
  3. Inkubieren Sie 200 µL 50 µg/mL Avidin Protein in den Brunnen für 30 min bei 4 ° c Waschen Sie ihn 3 X mit PBS. Nach diesem Schritt das Protein Avidin bindet an die BSA-Biotin und wird auf der Glasoberfläche immobilisiert.
  4. Inkubieren Sie 200 µL von 0,1 µM ITS in den Brunnen für 30 min bei 4 ° c Waschen Sie die Schüssel mit 3 X mit PBS. Lassen Sie PBS in den Brunnen, bis die Zelle-Beschichtung. Nach diesem Schritt der ITS mit dem Tag Biotin bindet an das Protein Avidin und wird auf der Oberfläche immobilisiert.
    Hinweis: Eine Vorsichtsmaßnahme für seine Beschichtungsqualität und Homogenität in der ITS-Immobilisierung von entscheidender Bedeutung ist, nie die Petrischale Oberfläche austrocknen lassen. Alle Reagenzien und PBS auf 4 ° C oder auf Eis mit einem Eiskübel hilft, die Wasser-Verdunstung während der Waschschritte zu reduzieren um 0 ° C zu halten, wird als PBS aus dem Brunnen abgesaugt.

3. Zelle Beschichtung auf den Oberflächen

  1. Kultur Fisch Keratozyten.
    Hinweis: Hier, Goldfisch (Carassius Auratus) dient als Beispiel, aber andere Fischarten können auch funktionieren.
    1. Zupfen Sie ein Stück von Fischschuppen als ein Fisch mit einer flachen Spitze Pinzette. Drücken Sie vorsichtig die Skala auf dem Brunnen ein Glasboden-Petrischale mit der inneren Seite der Skala, die Kontaktaufnahme mit dem Glas. Warten Sie ca. 30 s für die Fischschuppen die Glasoberfläche des Tellers einzuhalten.
    2. Fügen Sie 1 mL der Iscove Dulbecco Medium (IMDM) komplette Medium um die Fischschuppen in vollem Umfang abdecken geändert. Die Petrischale in einer dunklen und feuchten Box für 6-48 h bei Zimmertemperatur aufbewahren.
      Hinweis: IMDM komplette Medium enthält 79 % IMDM + 20 % fetalen bovine Serum (FBS) + 1 % Penicillin. Keine zusätzliche Versorgung mit Sauerstoff oder CO2 ist erforderlich. Ein paar Tissue-Papier-Rollen, die mit Wasser getränkt können im Feld weiterhin hohen Luftfeuchtigkeit in der Box bleiben. Fisch Keratozyten werden nach ein paar Stunden aus der Fisch-Skala als einem Blatt von Zellen migrieren. Dies kann mit einer Gewebekultur Mikroskop beobachtet werden. Die Zellen sind in der Regel lebensfähig in 48 h.
  2. Lösen und die Platte der Keratozyten Zellen auf ITS Oberflächen.
    1. Entfernen Sie das Medium aus der Petrischale, in denen die Fischschuppen kultiviert wurde. Waschen Sie gut 1 X mit Zelle trennen Lösung, und fügen Sie trennen Lösung zur Deckung der Fischschuppen und 3 min inkubieren.
      Hinweis: Das Rezept für die Zelle trennen EDTA Lösung lautet wie folgt: 10 x Hanks' Balanced Salz Lösung (HBSS) + 10 mL 1 M HEPES (pH 7.6) 100 mL + 10 mL von 7,5 % Natriumbicarbonat + 2,4 mL 500 mM EDTA + 1 L H2O. Der pH-Wert wird auf 7,4 eingestellt.
    2. Saugen Sie alle Zelle Lösung trennen und fügen Sie IMDM komplette Medium. Verteilen Sie die Keratozyten durch sanfte pipettieren. Passen Sie die Zelldichte Lösung auf das gewünschte Niveau (1 x 104– 1 x 105/mL). Platte die Zellen auf der ITS-Oberfläche (zubereitet nach Abschnitt 2). Inkubation der Zellen bei Raumtemperatur für 30 min vor Bildgebung.
      Hinweis: Zellzählung kann mit einem Hemocytometer erfolgen nach Abnehmen der Zellen mit Lösung abnehmen. Die Zelle Dichte Beschichtung ist relativ gering, so dass die Keratozyten viel Fläche haben zu migrieren.
  3. Platte CHO-K1 und NIH-3 t 3-Zellen auf den Oberflächen.
    Hinweis: Das Medium für CHO-K1 Zellen ist 89 % Ham F12 + 10 % FBS + 1 % Penicillin. Das Medium für NIH-3 t 3-Zellen ist 89 % Dulbecco modifizierte Eagle Medium (DMEM) + 10 % Kalb Rinderserum (CBS) + 1 % Penicillin. Die Kulturbedingungen sind 37 ° C und 5 % CO2.
    1. Kultur CHO-K1 oder NIH-3 t 3-Zellen zu 80 – 100 % Einmündung in eine Petrischale (oder Kultur-Kolben).
    2. Die Zelle trennen Lösung und Kulturmedium auf 37 ° c warm
    3. Entfernen Sie alle Kulturmedium in der Petrischale mit einer Pipette. Waschen Sie die Zellen 1 X mit Zelle trennen Lösung. Decken Sie die Zellen mit Lösung abnehmen und bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
    4. Pipettieren, um die Zellen zu verteilen. Die Zelle-Lösung zu sammeln und bei 300 X g für 3 min zentrifugieren.
    5. Saugen Sie des Überstands aus und fügen Sie kompletten Medium oder serumfreien Medium hinzu.
    6. Passen Sie die Zelldichte Lösung auf das gewünschte Niveau (1 x 105 – 1 x 106/mL). Platte die Zellen auf der ITS-Oberflächen (zubereitet nach Abschnitt 2). Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 1 – 2 h vor dem bildgebenden oder 30 min vor der video-Aufzeichnung.

4. Bildgebung, video-Aufnahme und Echtzeit-Integrin Spannung Mapping

  1. Echtzeit-Bildgebung der Integrin-Spannung in lebenden Zellen
    1. Keratozyten auf den Oberflächen (zubereitet nach Abschnitt 2) für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren oder CHO-K1 oder NIH-3 t 3-Zellen für 1 h auf den Oberflächen in einem Inkubator bei 37 ° c inkubieren
    2. Montieren Sie die Petrischale auf einer Fluoreszenz-Mikroskop-Bühne. Durchführen von zellulären Kraft Bildgebung mit einer Belichtungszeit von 1 s. Die Vergrößerung ist 40 X oder 100 X.
    3. Nehmen Sie eine Video von seiner Bilder mit einem Frame-Intervall von 20 s für Keratozyten oder 1 – 2 min. für CHO-K1 oder NIH-3 t 3-Zellen.
    4. Verwenden Sie MATLAB oder ein anderes Bild-Analyse-Tool um zu einen vorherigen Frame des ITS Videos aus einem aktuellen Frame der ITS Signal neu produzierte im aktuellen Frame Intervall berechnen zu subtrahieren. Die neuproduzierten ITS-Signal stellt die Integrin-Spannung erzeugt im aktuellen Frame Intervall, damit die zelluläre Kraft in gewissem Sinne Echtzeit Berichterstattung.
  2. Coimaging der Integrin-Spannung und Zellstruktur in Immunostained Zellen
    1. Führen Sie nach 3.2.2 oder Schritt 3.3.6 Immunostaining anlässlich der strukturellen Zielproteine.
      Hinweis: Verwenden Sie verschiedene Farbstoffe, um die Fluoreszenz-Übersprechen zwischen Integrin Spannung Bildgebung und Zelle strukturelle Bildgebung zu vermeiden. In diesem Manuskript wurde Cy5 Fluorophor für Phalloidin und Alexa 488 für Vinkulin Färbung verwendet wurde. Die Konzentration von primären und sekundären Antikörper ist 2,5 µg/mL. Die Konzentration für Phalloidin beträgt 1,5 Einheiten/µL.
    2. Führen Sie multifluorescent Kanal imaging ein Integrin Spannung Karte und Zelle strukturelle Bildgebung zu erwerben.

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Representative Results

Mit dem ITS wurde die Integrin-Spannung-Karte von Fisch Keratozyten gefangen genommen. Es zeigt, dass eine auch migriert und Integrin Spannung an Kraft zweigleisig (Abbildung 2A erzeugt). Die Auflösung der Karte Kraft war so kalibriert, dass 0,4 µm (Abb. 2 b) werden. Hohen Integrin Spannung konzentriert sich am hinteren Rand (Abb. 3A). Der ITS zeigt auch unterschiedliche spezifische Muster der verschiedenen Zellen. Eine nonmotile Zelle, NIH-3 t 3, bildet eine bestimmte Integrin Spannung Muster (Abb. 3 b) die schnelle Migration auch ganz anders.

Mit Immunostaining coimaged fokalen Adhäsionen und Integrin-Spannung der Fische waren Keratozyten (Abb. 4A). Das Verhältnis zwischen Integrin Spannung und Zellstruktur in Keratozyten wurde von Wang Et Al.25im Detail untersucht. Integrin Anspannung und Stress Fasern in CHO-K1-Zellen wurden auch coimaged (Abbildung 4 b). Diese Experimente zeigen, dass der ITS der Coimaging der Zelle Klebekraft und Zellstrukturen gleichzeitig unter ähnlichen bildgebenden Einstellungen, wodurch das Studium der Zelle Struktur/Force Zusammenspiel ermöglicht.

Figure 1
Abbildung 1: Schaltpläne von der seiner. Der ITS ist ein DsDNA, dekoriert mit einer RGD-Liganden, ein Fluoreszenz-Durstlöscher, ein Farbstoff und ein Biotin-Tag. Der Farbstoff (Kreis grün gefüllt) wird durch den Quencher abgeschreckt. Unter Integrin Spannung der DsDNA geplatzten und Cy3 ist befreit von abschrecken und emittiert Fluoreszenz, die durch Fluoreszenz-Mikroskopie nachgewiesen werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Integrin Spannung Karte ein Fisch auch und die Submikron-Auflösung des ITS. (A) während der schnelle Migration erzeugt eine auch konsequent eine Integrin Spannung Karte in zwei Kraft-Tracks. (B) der Abstand zwischen den beiden Force Tracks ist in der Regel 40 µm. Die räumliche Auflösung der zellulären Kraft Karte durch den ITS abgebildet ist um 0,4 µm. Das lineare Profil der Cy3 Fluoreszenz Intensität der durch eine kurze rote Linie im unteren linken Fenster markierten Bereich errechnet sich für die Kalibrierung der Auflösung in zellulären Kraft Bildgebung. Das Ergebnis ist in der unteren rechten Seite gezeigt und mit einer Gaußschen Kurve ausgestattet. Die Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Echtzeit-Integrin Spannung Karte von einem Fisch auch und NIH-3 t 3. (A) A Fisch auch und die Integrin-Spannung-Map. (Oben links) Eine bewegliche Fische auch. (Unten links) Integrin Spannung Karte die auch von der ITS gemeldet. (Oben rechts) Echtzeit-Integrin Spannung wurde durch Rahmen Subtraktion erhalten. Es zeigt, dass die neu generierten Integrin-Spannung mit der hinteren Kante der Zelle colocalized ist. (Unten rechts) Integrin Spannung Karte (grün) und Echtzeit-Integrin-Spannung (Magenta) werden in einem zusammengeführten Abbildung dargestellt. Die Maßstabsleiste = 10 µm. (B) einem NIH-3 t 3 Fibroblasten und die Integrin-Spannung-Map. (Oben links) Ein NIH-3 t 3 Fibroblasten. (Unten links) Integrin Spannung Karte von der NIH-3 t 3 Fibroblasten. Integrin-Spannung wurde in einem Streifenmuster generiert. (Oben rechts) Echtzeit-Integrin Spannung zeigt, dass neu generierten Integrin Spannung vor allem an der Zelle peripheren Region bildet. (Unten rechts) Integrin Spannung Karte (grün) und Echtzeit-Integrin-Spannung (Magenta) werden in einem zusammengeführten Abbildung dargestellt. Die Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Coimaging Spannung und Zelle Struktur Integrin. (A) Coimaging der Integrin-Spannung, Vinkulin und F-Aktin in einem auch. Die auch wurde behoben und Immunostained Vinkulin und F-Aktin Bericht zu erstatten. (B) Coimaging der Integrin-Spannung, Vinkulin und F-Aktin in einer Zelle CHO-K1. Die Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Der ITS ist eine hochverfügbare, aber dennoch leistungsfähige Technik für zellulares zwingen Zuordnung im Hinblick auf die Synthese und Anwendung. Mit allen Materialien bereit kann der ITS innerhalb 1 Tages synthetisiert werden. Während der Experimente sind nur drei Schritte der Oberflächenbeschichtung vor der Zelle Beschichtung erforderlich. Vor kurzem haben wir weiter vereinfacht Coating-Verfahren für einen Schritt durch direkte Verknüpfung des ITS zu Rinderserumalbumin, ermöglicht direkte physikalische Adsorption des ITS, Glas oder Polystyrol Oberflächen33. Der ITS bringt die fluoreszente Intensität der zellulären Kraft Signal auf ein vergleichbares Niveau der zellulären strukturelle Bildgebung. Die bequeme Synthese und Probenvorbereitung, bescheidenen Anforderungen für die Mikroskopie und hohe Empfindlichkeit für zelluläre Kraft machen dem ITS eine robuste und zuverlässige Technik für das Studium der Zelle Mechanik. In diesem Papier haben wir ein umfassendes Verfahren für seine Synthese und Anwendung vorgestellt.

Konjugation RGD ist Liganden mit SsDNA das wichtigste Verfahren in der ITS-Synthese. Wie im Abschnitt Protokoll erwähnt, ist die NHS-Ester auf Sulfo-SMCC nicht stabil im Wasser. Je länger es dauert, Sulfo-SMCC in Wasser aufzulösen, die Menge von Sulfo-SMCC verliert NHS Ester zur Hydrolyse und wird "Blindgänger", die konjugiert mit DNA durch die Maleimide-Thiol-Reaktion, aber nicht mit RGD-NH2konjugieren. Infolgedessen, ein großer Teil der DNA-Moleküle wird von den Toten Sulfo-SMCC belegt und kann nicht verbinden mit RGD, führt zu einer geringen Ausbeute von SsDNA-RGD. Aus diesem Grund sollte die Sulfo-SMCC in Wasser auflösen schnell, in der Regel innerhalb von 1 min. abgeschlossen sein. Es wird auch empfohlen, um die Ausbeute an SsDNA-RGD mit Elektrophorese zu überprüfen. Wenn die Ausbeute höher als 80 %, Reinigung ist in der Regel nicht erforderlich. Andernfalls wird die DNA Reinigung durch Polyacrylamid-Gel empfohlen. Die Wiederfindungsrate von DNA durch Polyacrylamid-Gel ist etwa 60 – 80 %.

Um einen angemessenen Betrag von RGD SsDNA BHQ2zu synthetisieren, sollte der Ausgangsbetrag der Thiol-SsDNA-BHQ2 mindestens 20 Nmol (1 mM x 20 µL). Beachten Sie, dass DNA-Modifikationen erheblich die Menge der SsDNA von DNA Unternehmen bestellt reduzieren. Zum Beispiel, wenn 1.000 Nmol SsDNA mit zwei Modifikationen bestellt wird, möglicherweise die Ertragssicherheit nur 20 Nmol. Wenn dies der Fall ist, bestellen Sie mindestens 1.000 Nmol SsDNA für die RGD-SsDNA Konjugation. Forscher können auch eigene Sequenzen für ihre Konstrukte entwerfen. Normalerweise halten wir den GC-Gehalt im ITS höher als 70 % der DsDNA thermische Stabilität zu verbessern. DNA-Sequenzanalysen kann durchgeführt werden, um die Wahrscheinlichkeit der Bildung selbst-Haarnadel, selbständige Hybridisierung, stabile Sekundärstruktur zu minimieren. Das Analyse-Tool ist online verfügbar. In der Handschrift gilt der obere Strang DNA für ITSs mit verschiedenen T-Tol. Wir variieren die Biotin-Lage am unteren Strang DNA, ein anderes TTolzu erreichen. Jedoch kann variieren die Position des RGD auf dem oberen Strang auch angewendet werden um die T-Tol des ITS zu optimieren. Die Berechnung der TTol für eine unterschiedliche DsDNA-Geometrie wird von Wang und Ha22 und Mosayebi Et Al.34, vor allem für die DsDNA entpacken Modus35,36 und die Scherung Modus bereitgestellt. 37,38.

Obwohl seine Oberflächen alle Integrin Spannungen, die stattgefunden haben in der Vergangenheit aufnehmen durch eine Videoaufnahme der zellulären Kraft Karte hintereinander, können Forscher die Integrin-Spannung erzeugt im aktuellen Frame Intervall durch Subtraktion des vorherigen Frames berechnen. aus einem aktuellen Frame "Echtzeit zellulären Kraft Karte" zu generieren. Das Frame-Intervall im ITS Video variiert je nach der Zelltypen aber ist in der Regel 20 s für schnelle Migration von Zellen und 1 – 2 min. für stationäre Zellen. Der Frame Subtraktion Methode meldet die Echtzeit Integrin-Spannung unter Beibehaltung der hohen Empfindlichkeit für Integrin Spannung Bildgebung durch Akkumulation Signalwirkung. Immunofluoreszenz ist minimal zwischen zwei aufeinander folgenden Bildern und hat daher keine beobachtbaren Einfluss der Frame-Subtraktion-Methode.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Gründerfonds zur Verfügung gestellt von der Iowa State University und durch das National Institute of General Medical Sciences (R35GM128747) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA-biotin Sigma-Aldrich A8549
Neutravidin Thermo Fisher Scientific 31000
Streptavidin Thermo Fisher Scientific 434301
upper strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequence is shown in PROTOCOL section
lower strand DNA Integrated DNA Technologies N/A Customer designed. DNA sequences are shown in PROTOCOL section.
sulfo-SMCC Thermo Fisher Scientific A39268
Cyclic peptide RGD with an amine group Peptides International PCI-3696-PI
IMDM ATCC ‎62996227
FBS ATCC 302020
Penicillin gibco 15140122
TCEP Sigma-Aldrich C4706
200 uL petri dish Cellvis D29-14-1.5-N
NanoDrop 2000 Thermo Scientific N/A spectrometer
SE410 Tall Air-Cooled Vertical Protein Electrophoresis Unit Hoefer SE410-15-1.5 Device for electroporesis
CHO-K1 cell line ATCC CCL-61
NIH/3T3 cell line ATCC CRL-1658
Anti-Vinculin Antibody EMD Millipore 90227 Primary antibody for vinculin immunostaining
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Superclonal Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A28175 Secondary antibody for vinculin immunostaining
Alexa Fluor 647 Phalloidin Invitrogen A22287
Eclipse Ti Nikon N/A microscope

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References

  1. Price, L. S., Leng, J., Schwartz, M. A., Bokoch, G. M. Activation of Rac and Cdc42 by Integrins Mediates Cell Spreading. Molecular Biology of the Cell. 9 (7), 1863-1871 (1998).
  2. Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands. Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).
  3. Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Integrins in cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), a005074 (2011).
  4. Hood, J. D., Cheresh, D. A. Role of integrins in cell invasion and migration. Nature Reviews Cancer. 2 (2), 91-100 (2002).
  5. Giancotti, F. G. Integrin signaling: specificity and control of cell survival and cell cycle progression. Current Opinion in Cell Biology. 9 (5), 691-700 (1997).
  6. Illario, M., et al. Integrin-Dependent Cell Growth and Survival Are Mediated by Different Signals in Thyroid Cells. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 88 (1), 260-269 (2003).
  7. Aoudjit, F., Vuori, K. Integrin Signaling in Cancer Cell Survival and Chemoresistance. Chemotherapy Research and Practice. 2012, 1-16 (2012).
  8. Hou, S., et al. Distinct effects of β1 integrin on cell proliferation and cellular signaling in MDA-MB-231 breast cancer cells. Scientific Reports. 6, 18430 (2016).
  9. Shankar, G., Davison, I., Helfrich, M. H., Mason, W. T., Horton, M. A. Integrin receptor-mediated mobilisation of intranuclear calcium in rat osteoclasts. Journal of Cell Science. 105 (Pt 1) (1), 61-68 (1993).
  10. Moreno-Layseca, P., Streuli, C. H. Signalling pathways linking integrins with cell cycle progression. Matrix Biology. 34, 144-153 (2014).
  11. Gómez-Lamarca, M. J., Cobreros-Reguera, L., Ibáñez-Jiménez, B., Palacios, I. M., Martín-Bermudo, M. D. Integrins regulate epithelial cell differentiation by modulating Notch activity. Journal of Cell Science. 127 (Pt 1), 4667-4678 (2014).
  12. Wang, H., Luo, X., Leighton, J. Extracellular Matrix and Integrins in Embryonic Stem Cell Differentiation. Biochemistry Insights. 8 (Suppl 1), 15-21 (2015).
  13. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
  14. Rittié, L. Traction Force Measurement Using Deformable Microposts. Fibrosis. Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. 235-244 (2017).
  15. Radmacher, M. Studying the Mechanics of Cellular Processes by Atomic Force Microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  16. Charras, G. T., Lehenkari, P. P., Horton, M. A. Atomic force microscopy can be used to mechanically stimulate osteoblasts and evaluate cellular strain distributions. Ultramicroscopy. 86 (1-2), 85-95 (2001).
  17. Miller, J. S., et al. Bioactive hydrogels made from step-growth derived PEG-peptide macromers. Biomaterials. 31 (13), 3736-3743 (2010).
  18. Legant, W. R., Miller, J. S., Blakely, B. L., Cohen, D. M., Genin, G. M., Chen, C. S. Measurement of mechanical tractions exerted by cells within three-dimensional matrices. Nature Methods. 7 (12), 969 (2010).
  19. Brenner, M. D., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Letters. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  20. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167 (2014).
  21. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  22. Wang, X., Ha, T. Defining Single Molecular Forces Required to Activate Integrin and Notch Signaling. Science. 340 (6135), (2013).
  23. Blakely, B. L., et al. A DNA-based molecular probe for optically reporting cellular traction forces. Nature Methods. 11 (12), 1229-1232 (2014).
  24. Wang, Y., Wang, X. Integrins outside focal adhesions transmit tensions during stable cell adhesion. Scientific Reports. 6 (1), 36959 (2016).
  25. Wang, Y., et al. Force-activatable biosensor enables single platelet force mapping directly by fluorescence imaging. Biosensors and Bioelectronics. 100, 192-200 (2018).
  26. Zhao, Y., Wang, Y., Sarkar, A., Wang, X. Keratocytes Generate High Integrin Tension at the Trailing Edge to Mediate Rear De-adhesion during Rapid Cell Migration. iScience. 9, 502-512 (2018).
  27. Crisalli, P., Kool, E. T. Multi-Path Quenchers: Efficient Quenching of Common Fluorophores. Bioconjugate Chemistry. 22 (11), 2345-2354 (2011).
  28. Mondal, G., Barui, S., Chaudhuri, A. The relationship between the cyclic-RGDfK ligand and αvβ3 integrin receptor. Biomaterials. 34 (26), 6249-6260 (2013).
  29. Wang, X., et al. Integrin Molecular Tension within Motile Focal Adhesions. Biophysical Journal. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  30. Euteneuer, U., Schliwa, M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules. Nature. 310 (5972), 58-61 (1984).
  31. Kucik, D. F., Elson, E. L., Sheetz, M. P. Cell migration does not produce membrane flow. The Journal of Cell Biology. 111 (4), 1617-1622 (1990).
  32. Mueller, J., et al. Load Adaptation of Lamellipodial Actin Networks. Cell. , (2017).
  33. Sarkar, A., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Force-activatable coating enables high-resolution cellular force imaging directly on regular cell culture surfaces. Physical Biology. 15 (6), 065002 (2018).
  34. Mosayebi, M., Louis, A. A., Doye, J. P. K., Ouldridge, T. E. Force-Induced Rupture of a DNA Duplex: From Fundamentals to Force Sensors. ACS Nano. 9 (12), 11993-12003 (2015).
  35. Bockelmann, U., Essevaz-Roulet, B., Heslot, F. Molecular Stick-Slip Motion Revealed by Opening DNA with Piconewton Forces. Physical Review Letters. 79 (22), 4489-4492 (1997).
  36. Krautbauer, R., Rief, M., Gaub, H. E. Unzipping DNA oligomers. Nano Letters. 3 (4), 493-496 (2003).
  37. de Gennes, P. G. Maximum pull out force on DNA hybrids. Comptes Rendus de l’Académie des Sciences - Series IV - Physics. 2 (10), 1505-1508 (2001).
  38. Hatch, K., Danilowicz, C., Coljee, V., Prentiss, M. Demonstration that the shear force required to separate short double-stranded DNA does not increase significantly with sequence length for sequences longer than 25 base pairs. Physical Review E. 78 (1), 011920 (2008).

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Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X.… More

Zhao, Y., Wetter, N. M., Wang, X. Imaging Integrin Tension and Cellular Force at Submicron Resolution with an Integrative Tension Sensor. J. Vis. Exp. (146), e59476, doi:10.3791/59476 (2019).

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