Summary
Vi beskriver en metode til vurdering af microRNA-ekspressionen i nyrerne af mus med ensidig urinlederobstruktion (UUO) ved kvantitativ omvendt transskription polymerase kædereaktion. Denne protokol er velegnet til undersøgelse af nyre microRNA-ekspressionsprofiler i mus med UUO og i forbindelse med andre patologiske tilstande.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er enkeltstrengede, ikke-kodende RNA-molekyler, der typisk regulerer genekspression på post-transskriptionelt niveau ved at binde sig til delvist komplementære målsteder i 3 ' uoversat region (UTR) af messenger RNA (mRNA), hvilket reducerer mRNA's oversættelse og stabilitet. MiRNA-udtryksprofilerne i forskellige organer og væv hos mus er blevet undersøgt, men der har ikke været standardmetoder til rensning og kvantificering af miRNA i musenyren. Vi har etableret en effektiv og pålidelig metode til udvinding og evaluering af miRNA-ekspression i musenyr med nyre-interstitiel fibrose ved kvantitativ reverse-transskription polymerase kædereaktion (qRT-PCR). Protokollen krævede fem trin: (1) skabelse af falske og ensidige urinerale obstruktion (UUO) mus; 2) udvinding af nyreprøver fra UUO-musene 3) ekstraktion af total RNA, som omfatter miRNA, fra nyreprøverne 4) komplementær DNA-syntese (cDNA) med omvendt transskription fra miRNA og (5) qRT-PCR ved hjælp af cDNA. Ved hjælp af denne protokol bekræftede vi med succes, at sammenlignet med kontrollerne blev udtrykket af miRNA-3070-3p signifikant forøget, og at ekspressionen af miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p blev signifikant nedsat i nyrerne af en musemodel af nyre interstitiel fibrose. Denne protokol kan bruges til at bestemme miRNA-ekspressionen i nyrerne af mus med UUO.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) - den korte, noncoding RNAs, der forårsager nedbrydning og transskriptionel hæmning af messenger RNA (mRNA)1 - har vist sig at regulere udtrykket af forskellige mRNAs, der har afgørende roller i både fysiologi og sygdom (f.eks betændelse, fibrose, metaboliske lidelser, og kræft). Nogle af miRNA'erne kan derfor være kandidatromanbiomarkører og terapeutiske mål for en række sygdomme2,3,4,5. Selv om miRNA udtryk profiler i mus organer og væv, herunder hjerne, hjerte, lunge, lever og nyre er blevet beskrevet6,,7,8,9,10, der har været nogen standard metoder til ekstraktion og evaluering af miRNAs i musenyr med nyre interstitiel fibrose.
Vi har designet en protokol til pålideligt at rense og opdage udtryk for miRNAs i nyrerne af mus med nyre interstitiel fibrose. Protokollen omfatter fem hovedtrin som følger. (1) 8 uger gamle C57BL/6 hanmus er opdelt i grupper af mus, der gennemgår en fingeret operation (kontrol) og mus, der udsættes for en operation, der giver ensidig ureteral obstruktion (UUO), som er forbundet med nyre interstitiel fibrose. (2) Nyreprøver udvundet af skind- og UUO-mus, homogeniseres separat i en siliciumhomogenisator og overføres derefter til et biopolymer-makuleringssystem på en mikrocentrifuges spin kolonne11,12. (3) Det samlede RNA, der indeholder miRNA, udvindes af nyreprøverne ved en silicamembranbaseret spinkolonne12,13. (4) Ved hjælp af denne ekstraherede total RNA, komplementær DNA (cDNA) er syntetiseret fra den samlede RNA med brug af omvendt transskriptionase, poly (A) polymerase, og oligo-dT primer14,15. (5) MiRNA'ernes udtryk vurderes ved hjælp af en kvantitativ polymerasekædereaktion med omvendt transskription (qRT-PCR) ved hjælp af et interkalkningsfarvestof14,15.
Denne protokol er baseret på undersøgelser , der opnåede meningsfulde ekstraktioner og evalueringer af miRNA'er i en række forskellige væv11,12,13,14,15, og det biopolymer-makuleringssystem , der anvendes i protokollen , viste sig at rense total RNA af høj kvalitet fra væv i 200612. Desuden har tidligere undersøgelser bekræftet nøjagtigheden og følsomheden af aspekter af protokollen (dvs. cDNA syntesen med omvendt transskriptionase, poly(A) polymerase, og oligo-dT primere fra ekstraheret total RNA) til bestemmelse af miRNA udtryk ved qRT-PCR med en interkalkningfarvestof 14,15. Da den nye protokol har fordelene ved enkelhed, tidsbesparende og reduktion af tekniske fejl, kan protokollen bruges i forskning, der kræver nøjagtig og følsom identifikation af miRNA-profilen i musenyrerne. Desuden kan protokollen anvendes på undersøgelser af mange patologiske forhold.
Vi beskriver derefter bestemmelsen af miRNA-udtryksprofilerne i mus med UUO, som er forbundet med nyre interstitiel fibrose. Hos mennesker, nyre interstitiel fibrose er et fælles og vigtigt træk ved både kronisk nyresygdom og slutstadiet nyresygdom, uanset deres ætiologi16,17. Denne nyre interstitiel fibrose er forbundet med progression af nyresvigt, og det er kendetegnet ved øget udtryk for ekstracellulære matrix komponenter i de interstitielle rum (f.eks kollagen, fibronectin, og α-glat muskel actin)17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgsprotokoller til dyr blev godkendt af Animal Ethics Committee of Jichi Medical University og blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for anvendelse og pleje af forsøgsdyr fra Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals.
1. Den fingerede kirurgi
- Forbered følgende elementer: isofluran, kork ark, depilatory creme, laboratorieservietter, Petriskål med fosfat-bufferet saltvand (PBS), 4-0 nylon, pincet, kirurgisk saks, vatpinde, og 8-ugers gamle C57BL/6 mandlige mus.
- Bedøve en mus med 1,5% isofluran og vedligeholde på 1,5%. Derefter anvende depilatory creme til musens mave. Efter et par minutter tørres hårfjerfarvet creme af med en PBS-gennemblødt laboratorieslet.
- Injicer 70% ethanol i musens mave og derefter placere musen på kork ark i liggende position.
- Ved hjælp af kirurgisk saks og pincet, foretage et snit i huden på maven og skære muskel og bughindemembranen fra blæren til venstre nederste kant af ribbenene.
- Fugt to vatpinde med PBS og træk derefter tarmene forsigtigt til siden. Placer fugtede svaberprøver til at identificere venstre nyre og ureter.
- Luk bughinden og luk derefter snittet med 4-0 nylon.
2. UUO-operationen
- Forbered følgende elementer: isofluran, kork ark, depilatory fløde, laboratorieservietter, Petriskål med PBS, 4-0 silke, 4-0 nylon, en 2,5 ml sprøjte, vatpinde, pincet, kirurgisk saks, og 8-ugers gamle C57BL/6 mandlige mus.
- Bedøve en mus med 1,5% isofluran og vedligeholde på 1,5%. Derefter anvende depilatory creme til musens mave. Efter et par minutter tørres hårfjerfarvet creme af med en PBS-gennemblødt laboratorieslet.
- Injicer 70% ethanol i musens mavemus, og placer derefter musen i liggende position på korkpladen.
- Ved hjælp af kirurgisk saks og pincet, foretage et snit i huden på maven og skære muskel og bughindemembranen fra blæren til venstre nederste kant af ribbenene.
- Placer 2,5 ml sprøjten under musen. Tag to vatpinde og fugt dem med PBS. Træk tarmene forsigtigt til siden med pincet, og læg de fugtede svaberprøver korrekt til at identificere den venstre ureter. Brug pincet, løft venstre nyre.
- Brug 4-0 silke til at laste venstre ureter to steder ca. 1 cm fra hinanden. Skær ureter i midten af de to ligationer, og derefter bruge 4-0 nylon suturer til at lukke bughindemembranen og snit.
3. Indsamling af nyreprøver
- Forbered følgende: 1,5 ml mikrocentrifuge rør, isofluran, kork ark, 70% ethanol, petriskål med PBS, pincet, og kirurgisk saks.
- Bedøve en mus med 1,5% isofluran og vedligeholde på 1,5%. Injicer 70% ethanol i maven og sæt musen på korkpladen i liggende position.
- Ved hjælp af kirurgisk saks og pincet, foretage et snit i huden på maven og skære muskel og bughindemembranen fra blæren til venstre nederste kant af ribbenene.
- Løft bughinden med pincet. Med den kirurgiske saks, foretage en sidelæns snit på den øverste kant af bughinden, og fortsætte snittet langs den laveste kant af ribbenene.
- Dernæst identificere venstre nyre, refluks det med PBS indtil nyrerne bliver gul-hvid til at vaske blod fra fartøjer, og fjerne nyrerne ved at skære venstre nyrearterie og vene med den kirurgiske saks. Placer nyrerne i petriskålen og vask den omhyggeligt med PBS.
- Skær nyrerne i 10 mg prøver med den kirurgiske saks og pincet (10 mg er en passende størrelse til næste trin). Sæt hvert stykke af nyrerne i sin egen 1,5 ml mikrocentrifuge rør og lukke rørets hætte.
- Hvert mikrocentrifugerør overføres til flydende nitrogen, og rørerne opbevares ved −80 °C til langtidsopbevaring før brug.
4. Ekstraktion af total RNA fra nyreprøverne
- Forbered følgende punkter: 1,5 ml mikrocentrifugerør, 2,0 ml mikrocentrifugerør, 100% ethanol, chloroform, siliciumhomogenisator, is, en vortexblander, biopolymerspinskolonner i 2,0 ml opsamlingsrør11,,12, membranforankrede spinskolonner i 2,0 ml opsamlingsrør12,13, phenol/guanidinbaseret lysis reagens, vaskebuffer indeholdende guanidin og ethanol (vaskebuffer 1), vaskebuffer indeholdende ethanol (vaskebuffer 2) og RNasefrit vand.
- Sæt en 10 mg nyre prøve i silicium homogenisator. Der tilsættes 700 μL af phenol/guanidinbaseret lysis reagens i homogeniseringsmidlet.
- Homogenisatoren klargør homogenisatoren, og tryk/drej langsomt homogenisatorens støder mod nyreprøven for at homogenisere prøven. Presningen/vridningen gentages, indtil nyreprøven er helt opløst i phenol-/guanidinbaseret lysis-reagens.
- For yderligere at homogenisere prøven overføres det homogeniserede lysat (i et 2,0 ml opsamlingsrør) til biopolymerspinskolonnen.
- Det homogeniserede lysat drejes ved 14.000 x g i 3 min ved stuetemperatur (RT), og det udfældede lysat overføres derefter til et ubrugt 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Kombiner lysatet i røret med 140 μL chloroform og luk derefter rørhætten tæt. For at blande lysatet og chloroform, vende røret 15 gange.
BEMÆRK: Kloroformen kan bruges uden hætte. - Hver prøve inkuberes i 2-3 min. ved RT, og drej derefter hver prøve ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4°C.
- Uden at forstyrre bundfaldet overføres supernatanten (som typisk er ~300 μL) til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og der tilsættes derefter 1,5x volumen (typisk ~450 μL) på 100% ethanol. Vortex blandingen til 5 s.
- Prøvens 700 μL læsses på en membranforankret spinskolonne i et 2,0 ml opsamlingsrør. Luk kolonnehætten og drej kolonnen ved 15.000 x g for 15 s. Smid det udfældede lysat i opsamlingsrøret.
- Prøven vaskes grundigt ved at tilsætte 700 μL vaskebuffer 1 til den membranforankrede spinskolonne i et 2,0 ml opsamlingsrør. Luk kolonnehætten, og drej kolonnen med 15.000 x g for 15 s. Smid det udfældede lysat i opsamlingsrøret.
- 500 μL vaskebuffer 2 på den membranforankrede spinskolonne i et 2,0 ml opsamlingsrør for at fjerne sporsalte. Luk kolonnehætten, og drej kolonnen med 15.000 x g for 15 s. Smid det udfældede lysat i opsamlingsrøret.
BEMÆRK: En membranforankret spinskolonne kan adskille RNA og DNA. - Udfør trin 4.11 igen.
- Drej den membranforankrede spinskolonne i et 2,0 ml opsamlingsrør igen ved 15.000 x g i 1 min. Smid det udfældede lysat i opsamlingsrøret.
- Overfør den membranforankrede spinkolonne til et nyt 1,5 ml opsamlingsrør. Det samlede RNA opløses ved at tilsætte 30 μL RNase-frit vand til søjlen. Luk kolonnehætten, og vent 5 min ved stuetemperatur. Drej derefter kolonnen på 15.000 x g i 1 min.
- Den samlede mængde prøve, der indeholder det samlede RNA, overføres til et nyt mikrocentrifugerør. Sæt hver af rørene på is, og måle koncentrationen af det samlede RNA ved spektrofotometri.
- Rørene opbevares med prøver ved −80 °C til langtidsopbevaring før brug.
5. Syntese af cDNA med omvendt transskription af total RNA
BEMÆRK: MIQE-retningslinjerne (Minimum Information for the Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) blev udstedt for at fremme bedre forsøgspraksis og bidrage til at opnå pålidelige ogutvetydige resultater 19. I denne protokol syntetiseres cDNA fra 1,0 μg renset total RNA i en totrinsprocedure ved hjælp af omvendt transskription, poly(A) polymerase og oligo-dT-primer.
- Forbered følgende: 1,5 ml mikrocentrifugerør, otte-brønds strimmel rør med hætter, hætten af hver otte-strip rør, destilleret vand, is, en omvendt transskription (se Tabellen af materialer)14,15 i smeltet tilstand, en termisk cycler, og en vortex mixer.
- Start den termiske cycler.
- Forbered en master mix opløsning: Tilsæt 2,0 μL omvendt transskription mix (inkluderet i sættet) og 2,0 μL af 10x nukleinsyre mix i 4,0 μL af 5x hi-spec buffer (for at opnå i alt 8,0 μL master mix per rør).
- Sæt 8,0 μL af master mix opløsningen i hvert rør af en otte-brønds strimmel rør.
- Juster den samlede RNA-tæthed. For at isolere 1,0 μg total RNA fra nyreprøverne i 12 μL RNase-frit vand overføres den passende mængde samlet RNA til destilleret vand ved hjælp af de tæthedensdata målt som beskrevet i trin 4.15.
BEMÆRK: Hvis der er dna-kontaminering til stede, vil det kontaminerede DNA blive forstærket i qRT-PCR. - Anskaf en 12 μL aliquot total RNA i hvert rør og luk rørets hætte. Centrifuge røret til 15 x.
- Røret anbringes i den termiske cycler og indkubes prøven i 60 minutter ved 37 °C. Derefter inkuberes prøven straks i 5 minutter ved 95 °C for syntese af cDNA.
- Når inkubationen er færdig, overføres cDNA til et nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør, og cDNA fortyndes ti gange (1:10) med destilleret vand. Vortex og centrifuge røret til 5 s.
- Opbevar midlertidigt den fortyndede cDNA på is og flytte prøverne til −80 °C til langtidsopbevaring før brug.
6. qRT-PCR af miRNA
BEMÆRK: Vi brugte intercalatormetoden til at udføre qRT-PCR af miRNA. Primere til RNA er U6 små nukleare 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, og miRNA-7219-5p blev brugt.
- Forbered følgende: 1,5 ml mikrocentrifugerør, en vortex mixer, en 96-brønd reaktionsplade til qRT-PCR, selvklæbende film til den 96-brøndreaktionsplade, en selvklæbende filmapplikator, en 96-brøndcentrifugerotor, miRNA-specifikke primere, et PCR-instrument i realtid og et grønt farvestofbaseret PCR-kit (se materialetabel)14,15 indeholdende2x PCR master mix og 10x universal primer.
- Efter blanding af dem i 1,5 ml mikrocentrifugerør, vortex følgende punkter: 6,25 μL destilleret vand, 1,25 μL af hver 5 μM miRNA primer opløst i nuklease-frit vand, 12,5 μL af 2× PCR master mix, og 2,5 μL 10x universal primer.
- Forbered cDNA syntetiseret som beskrevet i trin 5, og smelte det. Vortex og centrifuge cDNA for 5 s.
- Sæt en 22,5 μL aliquot af reagenset (skabt som beskrevet i trin 6.2) i hver brønd af 96-brøndpladen.
- Sæt en 2,5 μL aliquot cDNA i hver brønd af pladen.
- Ved hjælp af den selvklæbende filmapplikator skal du fastgøre den klæbende film stramt på 96-brøndpladen. Centrifuge pladen med 96-brønd centrifuge rotor på 1.000 x g for 30 s at bilægge reaktionerne i bunden af hver brønd.
7. PCR-cykling
- Start pcr-systemet i realtid, og placer den plade, der er oprettet som beskrevet i trin 6.6. i pcr-systemet i realtid. Angiv eksperimentegenskaberne næste gang. identificere eksperimentnavnet. Vælg følgende: "96-well (0,2 ml)" som systemets forsøgstype, "Comparative CT (ΔΔCT)" som kvantiseringsmetode, "SYBR Green Reagenser" som reagenser til detektering af målsekvensen og "standard" som systemets kørsel.
- Tildel et navn til prøven og målmernarna, og tildel derefter et navn til prøven og målmernarna i hver brønd. Prøverne bør tildeles i to eksemplarer for at indhente passende data til bekræftelse af resultaterne. Vælg en referenceprøve og et endogent kontrolelement, og vælg "ingen" for det farvestof, der skal bruges som passiv reference. Sørg for at indstille den negative omvendte transskription og ikke-skabelonkontrol for miRNA-udtrykket for at eliminere krydskontaminering af reagenser.
- Reaktionsvolumenindstillingen er "20 μL", og at PCR-cykelforholdene er indstillet til 95 °C i 15 min. efterfulgt af 40 denatureringscyklusser ved 94 °C i 15 s, glødning ved 55 °C i 30 s og forlængelse ved 70 °C i 30 s.
- Når qRT-PCR-processen er fuldført, skal du bruge systemets softwareprogram til at analysere qRT-PCR-dataene. Sørg for, at den tærskellinje, der automatisk vælges af softwareprogrammet, er passende for hver brønd.
- Kontroller tærskelværdien (CT) for den endogene kontrolkontrol og målmeRNA, der analyseres i hver prøve. CT-værdien bestemmes af skæringspunktet mellem forstærkningskurven og tærskellinjen. I denne undersøgelse brugte vi RNU6-2 som en endogen kontrol for målmerna-ekspressionsniveauet, og vi brugte ΔΔCT-metoden til at bestemme det relative udtryksniveau for hvert målmemRNA20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En UUO musemodel blev skabt af venstre ureteral ligation som beskrevet21 i 8 uger gamle hanmus, der vejer 20-25 g. Ureters blev fuldstændig blokeret af dobbelt ligation med 4-0 silkesuturer. En smertestillende (meloxicam 5 mg/kg, subkutan injektion) blev administreret før operationen og også dagligt på 2 dage efter operationen. Efter 8 dage efter operationen blev nyrerne indsamlet, skyllet med PBS, dissekeret og opbevaret i flydende nitrogen til yderligere analyse. Sham-opererede mus fungerede som kontrol. Den dobbelte ligation er vellykket, hvis den venstre nyre har hydronephrosis. Baseret på miRNA qRT-PCR-data, der blev indhentet ved hjælp af denne UUO-model, blev miRNA-3070-3pniveauet betydeligt forøget, og niveauerne af miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p blev betydeligt reduceret i nyrerne af UUO-musene sammenlignet med kontrollerne (Figur 1).
Figur 1: Differentieret udtrykt miRNA'er i nyrerne af UUO-mus. qRT-PCR-analyse af miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p og miRNA-7219-5p ekspression i sham mus (n=8) og UUO mus (n=8). Værdier er ± standardfejl (fejllinjer). T-test blev anvendt til at undersøge betydelige forskelle mellem grupperne. T-test med en p-værdi <0,05 blev anset for signifikant. miRNA: microRNA, n.s.: ikke signifikant, qRT-PCR: kvantitative real-time reverse-transskription polymerase kædereaktion, UUO: ensidig ureteral obstruktion. *p<0,05. Klik her for at se en større version af dette tal. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovenfor beskrevne protokol med qRT-PCR har bestemt udtryksniveauerne for de målrettede miRNA'er. Vurderingen af udtrukne miRNA'er er vigtig, når man søger at opnå meningsfulde qRT-PCR-data, og for at bekræfte kvaliteten af miRNA'erne, før qRT-PCR udføres, skal absorbansforholdet ved 260 nm og ved 280 nm kontrolleres med et spektrofotometer. Hvis en enkelt PCR-forstærkning af den forventede længde og smeltetemperatur eller en monomodal smeltekurve ikke kan opnås ved qRT-PCR, kan der være DNA-kontaminering eller en primerdæmper i hver brønd af reaktionspladen.
Udtryksniveauerne for miRNA'er kan evalueres ved hjælp af flere andre metoder end qRT-PCR, herunder mikroarray, nordlige blotting og ribonucleasebeskyttelsesanalysemetoder. QRT-PCR er dog en enkel, meget reproducerbar procedure, der er både nøjagtig og følsom, og mindre prøvevolumener kan bruges til qRT-PCR sammenlignet med nordlige blotting og ribonuclease beskyttelse analyser22. Da microarrays desuden muliggør samtidig måling af udtrykket af titusindvis af miRNA'er, kan de identificere kandidatmerna-markører. Microarray-data har vist en overordnet høj korrelation med data fra qRT-PCR23, men der er ikke opnået enighed om den optimale metode til sammenligning af de mikroarraydata , der er opnået i forskellige undersøgelser ,ikke nået 24.
Den nye protokol har følgende begrænsninger. Nytten af denne protokol er ikke blevet valideret i andre organer, såsom lever og lunge; og protokollen ikke er blevet testet hos andre laboratoriedyr (f.eks. rotter, hunde og svin). Flere grupper rapporterede, at denne protokol (til rensning og påvisning af miRNA'er ved qRT-PCR) gjorde det muligt at rense RNA af høj kvalitetfra væv 12,14,15. Metoden har høj nøjagtighed og følsomhed til påvisning af miRNA-udtryk12,14. Denne rapport viser, at denne protokol kan bruges til at detektere miRNA-udtryk i musenyrerne. Protokollen kan således bruges til at bestemme miRNA udtryksprofiler i nyrerne af mus med en bred vifte af sygdomsstater. På grund af protokollens enkelhed kan mange prøver behandles samtidigt, og ved hjælp af protokollen kan derfor bidrage til analyserne af ekspressionen af mange miRNA'er under forskellige patologiske tilstande i nyrerne.
Der er visse aspekter af protokollen at være opmærksom på og huske på. For det første skal de rensede RNA'er opbevares på is for at forhindre nedbrydning ved stuetemperatur. Nyreprøverne homogeniseres, indtil prøverne er helt smeltet i lysis reagenset. Da musenyrerne indeholder et betydeligt bindevæv, der ikke opløses i lysis reagens, er en kolonnemakulator nødvendig for yderligere homogenisering. For det andet skal den korrekte endogene kontrol miRNA (hvis udtryk er stabilt blandt prøver) verificeres i hele qRT-PCR eksperimentelle setup, fordi invasionen af forskellige stoffer under denne protokol kan ændre udtryksniveauet for den endogene kontrol miRNA, muligvis kompromittere resultaterne.
Afslutningsvis har vi præsenteret detaljerne i en qRT-PCR protokol til påvisning, rensning og evaluering af microRNA-ekspressioner i musenyr med UUO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker Michelle Goody, ph.d., fra Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) for at redigere et udkast til dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
- Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
- Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
- Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L.
- Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
- Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
- Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
- Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
- Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
- Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
- Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).
