Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Bewertung der microRNA-Expression in den Nieren von Mäusen mit einseitiger Harnleiterobstruktion (UUO) durch quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion. Dieses Protokoll eignet sich zur Untersuchung von Nieren-MicroRNA-Expressionsprofilen bei Mäusen mit UUO und im Kontext anderer pathologischer Erkrankungen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind einsträngige, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die typischerweise die Genexpression auf posttranskriptionaler Ebene regulieren, indem sie an teilweise komplementäre Zielstandorte in der 3' unübersetzten Region (UTR) von Messenger RNA (mRNA) binden, was die Translation und Stabilität der mRNA reduziert. Die miRNA-Expressionsprofile in verschiedenen Organen und Geweben von Mäusen wurden untersucht, standardmethoden zur Reinigung und Quantifizierung von miRNA in der Mausniere waren jedoch nicht verfügbar. Wir haben eine effektive und zuverlässige Methode zur Extraktion und Bewertung der miRNA-Expression in der Mausniere mit renaler interstitielle Fibrose durch quantitative Reverse-Transkriptionspolymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) etabliert. Das Protokoll erforderte fünf Schritte: (1) Schaffung von Schein- und einseitigen Harnleiter-Obstruktions-Mäusen (UUO); (2) Extraktion von Nierenproben von den UUO-Mäusen; (3) Extraktion der gesamten RNA, einschließlich miRNA, aus den Nierenproben; (4) komplementäre DNA-Synthese (cDNA) mit umgekehrter Transkription aus miRNA; und (5) qRT-PCR mit dem cDNA. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich bestätigt, dass im Vergleich zu den Kontrollen die Expression von miRNA-3070-3p signifikant erhöht wurde und die von miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p signifikant in den Nieren eines Mausmodells der renalen interstitiellen Fibrose verringert wurden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die miRNA-Expression in den Nieren von Mäusen mit UUO zu bestimmen.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) – die kurzen, nicht kodierenden RNAs, die den Abbau und die transkriptionelle Hemmung von Boten-RNA (mRNA)1 verursachen – regulieren nachweislich die Expression verschiedener mRNAs, die sowohl in der Physiologie als auch bei Krankheiten eine entscheidende Rolle spielen (z. B. Entzündungen, Fibrose, Stoffwechselstörungen und Krebs). Einige der miRNAs können daher Kandidaten neuartige Biomarker und therapeutische Ziele für eine Vielzahl von Krankheiten2,3,4,5. Obwohl miRNA-Expressionsprofile in Mausorganen und Geweben einschließlich Gehirn, Herz, Lunge, Leber und Niere beschrieben wurden6,7,8,9,10, gab es keine Standardmethoden für die Extraktion und Bewertung von miRNAs in der Mausniere mit renaler interstitielle Fibrose.
Wir haben ein Protokoll entwickelt, um die Ausdrücke von miRNAs in den Nieren von Mäusen mit renaler interstitielle Fibrose zuverlässig zu reinigen und zu detektieren. Das Protokoll umfasst fünf Hauptschritte, wie folgt. (1) 8 Wochen alte C57BL/6-Mäuse werden in Gruppen von Mäusen eingeteilt, die einer Scheinoperation (Kontrollen) unterzogen werden, und Mäusen, die einer Operation unterzogen werden, die einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) bietet, die mit renaler interstitielle Fibrose verbunden ist. (2) Nierenproben werden aus den Schein- und UUO-Mäusen extrahiert, in einem Siliziumhomogenisator getrennt homogenisiert und dann auf eine Mikrozentrifugen-Spin-Säule11,12in ein Biopolymer-Zerkleinerungssystem übertragen. (3) Die gesamte RNA, die miRNA enthält, wird aus den Nierenproben durch eine Kieselsäuremembran-basierte Spinsäule12,13extrahiert. (4) Mit Dieser extrahierten Gesamt-RNA wird komplementäre DNA (cDNA) aus der gesamten RNA unter Verwendung von Reverse-Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primer14,15synthetisiert. (5) Die Ausdrücke von miRNAs werden durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) mit einem interkalierenden Farbstoff14,15ausgewertet.
Dieses Protokoll basiert auf Untersuchungen, die sinnvolle Extraktionen und Auswertungen von miRNAs in einer Vielzahl von Geweben erhaltenhaben 11,12,13,14,15, und das im Protokoll verwendete Biopolymer-Zerkleinerungssystem wurde 2006 nachweislich hochwertige, gesamte RNA aus Geweben gereinigt12. Darüber hinaus haben frühere Studien die Genauigkeit und Empfindlichkeit von Aspekten des Protokolls (d. h. der cDNA-Synthese mit Reverse-Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primern aus extrahierter Gesamt-RNA) zur Bestimmung der miRNA-Expression durch qRT-PCR mit einem interkalierenden Farbstoff14,15bestätigt. Da das neue Protokoll die Vorteile der Einfachheit, Zeitersparnis und Reduzierung von technischen Fehlern hat, kann das Protokoll in der Forschung verwendet werden, die eine genaue und sensible Identifizierung des miRNA-Profils in der Mausniere erfordert. Darüber hinaus könnte das Protokoll auf Untersuchungen unter vielen pathologischen Bedingungen angewendet werden.
Als nächstes beschreiben wir die Bestimmung der miRNA-Expressionsprofile bei Mäusen mit UUO, die mit renaler interstitielle Fibrose verbunden ist. Beim Menschen, renale interstitielle Fibrose ist ein häufiges und wichtiges Merkmal sowohl der chronischen Nierenerkrankung und im Endstadium Nierenerkrankungen, unabhängig von ihrer Ätiologie16,17. Diese renale interstitielle Fibrose ist mit dem Fortschreiten des Nierenversagens verbunden und zeichnet sich durch erhöhte Ausdrücke extrazellulärer Matrixkomponenten in den interstitiellen Räumen (z.B. Kollagen, Fibronectin und α-glatten Muskelakt)17,18aus.
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Protocol
Alle Tierversuchsprotokolle wurden von der Animal Ethics Committee der Jichi Medical University genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Verwendung und Pflege von Versuchstieren des Jichi Medical University Guide for Laboratory Animals durchgeführt.
1. Die Scheinoperation
- Bereiten Sie folgende Artikel vor: Isofluran, Korkblatt, Enthaarungscreme, Labortücher, Petrischale mit phosphatgepufferter Saline (PBS), 4-0 Nylon, Pinzette, chirurgische Schere, Wattestäbchen und 8 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse.
- Anästhesisieren Sie eine Maus mit 1,5% Isofluran und halten Sie bei 1,5%. Dann tragen Sie Enthaarungscreme auf den Bauch der Maus auf. Nach einigen Minuten die Enthaarungscreme mit einem PBS-getränkten Labortuch abwischen.
- 70% Ethanol in den Bauch der Maus injizieren und dann die Maus auf das Korkblatt in die Supine-Position legen.
- Mit chirurgischer Schere und Pinzette, machen einen Schnitt in der Haut am Bauch und schneiden Sie den Muskel und peritoneale Membran von der Blase bis zum linken unteren Rand der Rippen.
- Befeuchten Sie zwei Wattestäbchen mit PBS und ziehen Sie dann den Darm vorsichtig zur Seite. Legen Sie die befeuchteten Tupfer, um die linke Niere und Harnleiter zu identifizieren.
- Schließen Sie die Peritonealmembran und schließen Sie dann den Schnitt mit 4-0 Nylon.
2. Die UUO-Chirurgie
- Bereiten Sie folgende Artikel vor: Isofluran, Korkblech, Enthaarungscreme, Labortücher, Petrischale mit PBS, 4-0 Seide, 4-0 Nylon, eine 2,5 ml Spritze, Wattestäbchen, Pinzette, chirurgische Schere und 8 Wochen alte C57BL/6 männliche Mäuse.
- Anästhesisieren Sie eine Maus mit 1,5% Isofluran und halten Sie bei 1,5%. Dann Enthaarungscreme auf den Bauch der Maus auftragen. Nach einigen Minuten die Enthaarungscreme mit einem PBS-getränkten Labortuch abwischen.
- Injizieren Sie 70% Ethanol in die Bauchmaus der Maus und legen Sie die Maus dann in die Supine-Position auf dem Korkblatt.
- Mit chirurgischer Schere und Pinzette, machen einen Schnitt in der Haut am Bauch und schneiden Sie den Muskel und peritoneale Membran von der Blase bis zum linken unteren Rand der Rippen.
- Legen Sie die 2,5 ml Spritze unter die Maus. Nehmen Sie zwei Wattestäbchen und befeuchten Sie sie mit PBS. Ziehen Sie den Darm vorsichtig zur Seite mit der Pinzette, und legen Sie die befeuchteten Tupfer entsprechend, um den linken Harnleiter zu identifizieren. Heben Sie mit der Pinzette die linke Niere an.
- Verwenden Sie die 4-0 Seide, um den linken Harnleiter an zwei Stellen ca. 1 cm auseinander zu ligieren. Schneiden Sie den Harnleiter am Mittelpunkt der beiden Ligationen, und verwenden Sie dann 4-0 Nylon Nähte, um die Peritonealmembran und Inzision zu schließen.
3. Entnahme von Nierenproben
- Bereiten Sie folgendes vor: 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre, Isofluran, Korkblech, 70% Ethanol, Petrischale mit PBS, Pinzette und chirurgische Schere.
- Anästhesisieren Sie eine Maus mit 1,5% Isofluran und halten Sie bei 1,5%. 70% Ethanol in den Bauch injizieren und die Maus auf das Korkblatt in die Rückenlage legen.
- Mit chirurgischer Schere und Pinzette, machen einen Schnitt in der Haut am Bauch und schneiden Sie den Muskel und peritoneale Membran von der Blase bis zum linken unteren Rand der Rippen.
- Heben Sie die Peritonealmembran mit der Pinzette an. Mit der chirurgischen Schere, machen Sie einen seitlichen Schnitt am oberen Rand der Peritonealmembran, und setzen Sie den Schnitt entlang der untersten Kante der Rippen.
- Als nächstes identifizieren Sie die linke Niere, refluxes sie mit PBS, bis die Niere gelb-weiß wird, um Blut aus den Gefäßen auszuwaschen, und entfernen Sie die Niere, indem Sie die linke Nierenarterie und Vene mit der chirurgischen Schere schneiden. Die Niere in die Petrischale geben und sorgfältig mit PBS waschen.
- Schneiden Sie die Niere in 10 mg Proben mit der chirurgischen Schere und Pinzette (10 mg ist eine geeignete Größe für den nächsten Schritt). Legen Sie jedes Stück der Niere in ein eigenes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und schließen Sie die Kappe des Rohres.
- Übertragen Sie jedes Mikrozentrifugenrohr in flüssigen Stickstoff und halten Sie die Rohre vor gebrauchen bei 80 °C für eine langfristige Lagerung.
4. Extraktion der gesamten RNA aus den Nierenproben
- Bereiten Sie folgende Artikel vor: 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre, 2,0 ml Mikrozentrifugenrohre, 100% Ethanol, Chloroform, Siliziumhomogenisator, Eis, Ein Wirbelmischer, Biopolymer-Spinsäulen in 2,0 ml Sammelröhrchen11,12, membranverankerte Spinsäulen in 2,0 ml Sammelröhrchen12,13, Phenol-/Guanidin-basiertes Lysereage, Waschpuffer mit Guanidin und Ethanol (Waschpuffer 1), Waschpuffer mit Ethanol (Waschpuffer 2) und RNase-freies Wasser.
- Legen Sie eine 10 mg Nierenprobe in den Siliziumhomogenisator. 700 l des phenol-guanidinbasierten Lysereagenzes in den Homogenisator geben.
- Bereiten Sie den Homogenisator vor und drücken/drehen Sie dann langsam den Stößel des Homogenisators gegen die Nierenprobe, um die Probe zu homogenisieren. Wiederholen Sie das Pressen/Verdrehen, bis die Nierenprobe vollständig im Phenol-/Guanidin-basierten Lysereagenz gelöst ist.
- Um die Probe weiter zu homogenisieren, übertragen Sie das homogenisierte Lysat (in einem 2,0 ml Sammelrohr) in die Biopolymer-Spinsäule.
- Das homogenisierte Lysat bei 14.000 x g 3 min bei Raumtemperatur (RT) drehen und dann das ausgefällte Lysat in ein ungenutztes 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen.
- Kombinieren Sie das Lysat im Rohr mit 140 l Chloroform und schließen Sie dann die Rohrkappe fest. Um das Lysat und Chloroform zu mischen, das Rohr 15 Mal invertieren.
HINWEIS: Das Chloroform kann ohne Haube verwendet werden. - Jede Probe für 2–3 min bei RT inkubieren und dann jede Probe bei 12.000 x g für 15 min bei 4°C drehen.
- Ohne den Niederschlag zu stören, übertragen Sie den Überstand (der typischerweise 300 l) auf ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr überträgt, und fügen Sie dann das 1,5-fache seines Volumens (typischerweise 450 , L) von 100 % Ethanol hinzu. Wirbel die Mischung für 5 s.
- Laden Sie 700 l der Probe auf eine membranverankerte Spinsäule in einem 2,0 ml Sammelrohr. Schließen Sie die Spaltenkappe und drehen Sie die Spalte bei 15.000 x g für 15 s. Werfen Sie das gefällte Lysat im Sammelrohr weg.
- Waschen Sie die Probe gründlich, indem Sie der membranverankerten Spinsäule in einem 2,0 ml Sammelrohr 700 l Waschpuffer 1 hinzufügen. Schließen Sie die Spaltenkappe, und drehen Sie die Spalte bei 15.000 x g für 15 s. Werfen Sie das gefällte Lysat im Sammelrohr weg.
- Laden Sie 500 l Waschpuffer 2 auf die membranverankerte Spinsäule in ein 2,0 ml Sammelrohr, um Spurensalze zu entfernen. Schließen Sie die Spaltenkappe, und drehen Sie die Spalte bei 15.000 x g für 15 s. Werfen Sie das gefällte Lysat im Sammelrohr weg.
HINWEIS: Eine membranverankerte Spinsäule kann RNA und DNA trennen. - Führen Sie Schritt 4.11 erneut aus.
- Drehen Sie die membranverankerte Spinsäule in einem 2,0 ml Sammelrohr 1 min bei 15.000 x g erneut. Werfen Sie das gefällte Lysat im Sammelrohr weg.
- Übertragen Sie die membranverankerte Spinsäule in ein neues 1,5 ml Sammelrohr. Lösen Sie die gesamte RNA auf, indem Sie der Säule 30 L RNase-freies Wasser hinzufügen. Schließen Sie die Säulenkappe, und warten Sie 5 min bei Raumtemperatur. Drehen Sie dann die Säule bei 15.000 x g für 1 min.
- Übertragen Sie die Gesamtmenge der Probe, die die gesamte RNA enthält, in ein neues Mikrozentrifugenrohr. Legen Sie jede der Röhren auf Eis und messen Sie die Konzentration der gesamten RNA durch Spektrophotometrie.
- Bewahren Sie die Rohre mit Proben bei 80 °C für die Langzeitlagerung vor Gebrauch auf.
5. Synthese von cDNA mit der umgekehrten Transkription der gesamten RNA
ANMERKUNG: Die MIQE-Leitlinien (Minimum Information for the Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) wurden herausgegeben, um bessere experimentelle Verfahren zu fördern und zu zuverlässigen und eindeutigen Ergebnissen beizutragen19. In diesem Protokoll wird cDNA in einem zweistufigen Verfahren mit Reverse-Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primer aus 1,0 g gereinigter Gesamt-RNA synthetisiert.
- Bereiten Sie folgendes vor: 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre, acht-Well-Bandrohre mit Kappen, die Kappe jedes achtbandigen Rohres, destilliertes Wasser, Eis, ein Reverse-Transkriptase-Kit (siehe Materialtabelle)14,15 im geschmolzenen Zustand, ein thermischer Cycler und ein Wirbelmischer.
- Starten Sie den Thermischen Cycler.
- Bereiten Sie eine Master-Mix-Lösung vor: Fügen Sie 2,0 l Reverse-Transkriptase-Mix (im Kit enthalten) und 2,0 l 10x Nukleinsäure-Mix in 4,0 l 5x Hi-Spec-Puffer (um insgesamt 8,0 L Master-Mix pro Tube zu erhalten).
- Legen Sie 8,0 l der Master-Mix-Lösung in jedes Rohr eines Acht-Well-Bandrohrs.
- Passen Sie die gesamte RNA-Dichte an. Um 1,0 g Gesamt-RNA aus den Nierenproben in 12 l RNase-freiem Wasser zu isolieren, übertragen Sie die entsprechende Menge an Gesamt-RNA in destilliertes Wasser, unter Verwendung der in Schritt 4.15 beschriebenen Dichtedaten.
HINWEIS: Wenn eine DNA-Kontamination vorliegt, wird die kontaminierte DNA in der qRT-PCR mitverstärkt. - Legen Sie ein 12-L-Aliquot der gesamten RNA in jede Röhre und schließen Sie die Kappe der Röhre. Zentrifugieren Sie das Rohr für 15 x.
- Legen Sie das Rohr in den thermischen Cycler und inkubieren Sie die Probe für 60 min bei 37 °C. Als nächstes sofort die Probe für 5 min bei 95 °C für die Synthese von cDNA inkubieren.
- Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, übertragen Sie die cDNA in ein neues 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und verdünnen Sie die cDNA zehnmal (1:10) mit destilliertem Wasser. Wirbel und Zentrifugieren sie das Rohr für 5 s.
- Die verdünnte cDNA vorübergehend auf Eis aufbewahren und die Proben vor gebrauchen auf 80 °C verschieben.
6. qRT-PCR von miRNA
HINWEIS: Wir haben die Intercalator-Methode verwendet, um die qRT-PCR von miRNA durchzuführen. Primer für RNA sind U6 small nuclear 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p wurden verwendet.
- Bereiten Sie folgendes vor: 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre, ein Wirbelmischer, eine 96-Well-Reaktionsplatte für die qRT-PCR, Klebefolie für die 96-Well-Reaktionsplatte, ein Klebefolienapplikator, ein 96-Well-Zentrifugenrotor, miRNA-spezifische Primer, ein Echtzeit-PCR-Instrument und ein grünes, farbbasiertes PCR-Kit (siehe Materialtisch)14,15 mit 2x PCR-Master-Mix und 10x Universal-Primer.
- Nach dem Mischen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhren die folgenden Elemente wirbeln: 6,25 l destilliertes Wasser, 1,25 l je 5 M miRNA-Grundierung in Nuklease-freiem Wasser, 12,5 l von 2× PCR-Master-Mix und 2,5 l 10x Universalprimer.
- Bereiten Sie die in Schritt 5 beschriebene cDNA vor und schmelzen Sie sie. Vortex und Zentrifugieren der cDNA für 5 s.
- Legen Sie einen 22,5 L Aliquot des Reagenzes (erstellt wie in Schritt 6.2 beschrieben) in jeden Brunnen der 96-Well-Platte.
- Legen Sie einen 2,5-L-Aliquot cDNA in jede Bohrung der Platte.
- Mit dem Klebefolienapplikator den Klebefilm fest auf der 96-Well-Platte festhalten. Zentrifugieren Sie die Platte mit dem 96-Well-Zentrifugenrotor bei 1.000 x g für 30 s, um die Reaktionen an der Unterseite jedes Brunnens zu begleichen.
7. PCR-Zyklus
- Starten Sie das Echtzeit-PCR-System, und platzieren Sie die in Schritt 6.6 erstellte Platte. im Echtzeit-PCR-System. Legen Sie die Experimenteigenschaften als Nächstes fest. den Versuchsnamen zu identifizieren. Wählen Sie Folgendes aus: "96-well (0.2 mL)" als Experimenttyp des Systems, "Comparative CT ('CT)' als Quantitationsmethode, "SYBR Green Reagents" als Reagenzien zur Erkennung der Zielsequenz und "Standard" als Systemlauf.
- Weisen Sie dem Beispiel und der Ziel-miRNA einen Namen zu, und weisen Sie dann der Probe und der Ziel-miRNA in jedem Brunnen einen Namen zu. Die Proben sollten in zweifacher Ausfertigung zugewiesen werden, um geeignete Daten zur Bestätigung der Ergebnisse zu erhalten. Wählen Sie eine Referenzprobe und eine endogene Kontrolle aus, und wählen Sie "keine" für den Farbstoff aus, der als passive Referenz verwendet werden soll. Stellen Sie sicher, dass Sie die negative Reverse-Transkriptase und die Nicht-Vorlagen-Kontrolle für die miRNA-Expression festlegen, um die Kreuzkontamination von Reagenzien zu beseitigen.
- Stellen Sie sicher, dass die Einstellung des Reaktionsvolumens "20 l" ist und die PCR-Zyklusbedingungen 15 min auf 95 °C eingestellt sind, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 15 s, Glühen bei 55 °C für 30 s und Verlängerung bei 70 °C für 30 s.
- Nachdem der qRT-PCR-Prozess abgeschlossen ist, verwenden Sie das Softwareprogramm des Systems, um die qRT-PCR-Daten zu analysieren. Stellen Sie sicher, dass die Schwellenwertzeile, die automatisch vom Softwareprogramm ausgewählt wird, für jeden Brunnen geeignet ist.
- Überprüfen Sie den Schwellenwert des Schwellenwerts (CT) der endogenen Kontrolle und zielgerichteten miRNA, die in jeder Probe analysiert werden. Der CT-Wert wird durch den Schnittpunkt der Verstärkungskurve und der Schwellenlinie bestimmt. In der vorliegenden Studie verwendeten wir RNU6-2 als endogene Kontrolle für die Ziel-miRNA-Expressionsebene, und wir verwendeten die Methode "CT", um den relativen Expressionspegel jedes Ziels miRNA20zu bestimmen.
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Representative Results
Ein UUO-Mausmodell wurde durch linke Harnleiterligation erstellt, wie21 in 8 Wochen alten männlichen Mäusen mit einem Gewicht von 20–25 g beschrieben. Ureters wurden durch Doppelligation mit 4:0 Seidennähten völlig behindert. Ein Schmerzmittel (Meloxicam 5 mg/kg, subkutane Injektion) wurde vor der Operation und auch täglich an den 2 Tagen nach der Operation verabreicht. Nach 8 Tagen nach der Operation wurden Nieren gesammelt, mit PBS abgerinnen, seziert und zur weiteren Analyse in flüssigem Stickstoff gelagert. Scheinbetriebene Mäuse dienten als Kontrollen. Die Doppelligation ist erfolgreich, wenn die linke Niere Hydronephrose hat. Basierend auf den miRNA qRT-PCR-Daten, die mit diesem UUO-Modell gewonnen wurden, wurde der MiRNA-3070-3p-Spiegel signifikant erhöht und die Konzentrationen von miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p wurden in den Nieren der UUO-Mäuse im Vergleich zu den Kontrollen signifikant verringert (Abbildung 1).
Abbildung 1: Differenzierte miRNAs in den Nieren von UUO-Mäusen. qRT-PCR-Analyse von miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p-Expression bei Scheinmäusen (n=8) und UUO-Mäusen (n=8). Werte sind ± Standardfehler (Fehlerbalken) mittels. T-Tests wurden verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu untersuchen. T-Tests mit einem p-Wert <0,05 wurden als signifikant angesehen. miRNA: microRNA, n.s.: nicht signifikant, qRT-PCR: quantitative Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion, UUO: einseitige Harnleiterobstruktion. *p<0.05. Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das oben beschriebene Protokoll mit qRT-PCR hat erfolgreich die Expressionsebenen der zielgerichteten miRNAs bestimmt. Die Bewertung der extrahierten miRNAs ist wichtig, wenn man sinnvolle qRT-PCR-Daten erhalten möchte, und um die Qualität der miRNAs vor der Durchführung der qRT-PCR zu bestätigen, sollte das Verhältnis der Absorption bei 260 nm zu dem bei 280 nm mit einem Spektralphotometer überprüft werden. Wenn eine einzelne PCR-Verstärkung der erwarteten Länge und Schmelztemperatur oder eine monomodale Schmelzkurve nicht durch qRT-PCR erreicht werden kann, kann es in jedem Bohrkörper der Reaktionsplatte zu einer DNA-Kontamination oder einem Primer-Dimer kommen.
Die Expressionsniveaus von miRNAs können mit anderen Methoden als qRT-PCR ausgewertet werden, einschließlich Mikroarray-, Nordblotting- und Ribonuklease-Schutz-Assay-Methoden. QRT-PCR ist jedoch ein einfaches, hochreproduzierbares Verfahren, das sowohl genau als auch empfindlich ist, und kleinere Probenvolumina können für qRT-PCR im Vergleich zu nördlichen Blotting- und Ribonuklease-Schutz-Assays22verwendet werden. Da Mikroarrays die gleichzeitige Messung der Expression von Zehntausenden von miRNAs ermöglichen, können sie Kandidaten-miRNA-Marker identifizieren. Mikroarray-Daten haben eine insgesamt hohe Korrelation mit Daten gezeigt, die von qRT-PCR23erhalten wurden, aber ein Konsens über die optimale Methodik für den Vergleich der Mikroarray-Daten, die in unterschiedlichen Studien gewonnen wurden, wurde nicht erreicht24.
Das neue Protokoll hat die folgenden Einschränkungen. Der Nutzen dieses Protokolls wurde in anderen Organen wie Leber und Lunge nicht validiert; und das Protokoll wurde nicht an anderen Labortieren (z. B. Ratten, Hunden und Schweinen) getestet. Mehrere Gruppen berichteten, dass dieses Protokoll (zur Reinigung und Detektion von miRNAs durch qRT-PCR) die Reinigung hochwertiger RNA aus Geweben12,14,15ermöglichte. Die Methode hat eine hohe Genauigkeit und Empfindlichkeit für den Nachweis der miRNA-Expression12,14. Der vorliegende Bericht zeigt, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um die miRNA-Expression in der Mausniere erfolgreich zu erkennen. Das Protokoll kann somit verwendet werden, um die miRNA-Expressionsprofile in den Nieren von Mäusen mit einer Vielzahl von Krankheitszuständen zu bestimmen. Aufgrund der Einfachheit des Protokolls können viele Proben gleichzeitig verarbeitet werden, und die Verwendung des Protokolls kann somit zur Analyse der Expression vieler miRNAs unter verschiedenen pathologischen Bedingungen der Niere beitragen.
Es gibt bestimmte Aspekte des Protokolls, die sie beachten und im Auge behalten sollten. Zunächst müssen die gereinigten RNAs auf Eis gehalten werden, um eine Verschlechterung bei Raumtemperatur zu verhindern. Die Nierenproben müssen homogenisiert werden, bis die Proben vollständig im Lysereage geschmolzen sind. Da Mausnieren ein erhebliches Bindegewebe enthalten, das sich nicht in Lysereagenz auflöst, ist für die weitere Homogenisierung ein Säulenzerkleinerer notwendig. Zweitens muss die richtige endogene Kontrolle miRNA (deren Expression unter den Proben stabil ist) während des gesamten qRT-PCR-Experimentalaufbaus überprüft werden, da die Invasion verschiedener Substanzen unter diesem Protokoll den Expressionsgrad der endogenen Kontroll-miRNA verändern und möglicherweise die Ergebnisse gefährden könnte.
Abschließend haben wir die Details eines qRT-PCR-Protokolls zur Detektion, Reinigung und Auswertung von microRNA-Ausdrücken in der Mausniere mit UUO vorgestellt.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Acknowledgments
Wir danken Michelle Goody, PhD, von der Edanz Group (https://en-author-services.edanzgroup.com/) für die Bearbeitung eines Entwurfs dieses Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
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