Summary
Dit werk beschrijft het gebruik van CRISPR-Cas9 genoombewerkingstechnologie om het endogene gen OsABCG15 uit te sluiten, gevolgd door een gemodificeerd Agrobacterium-gemedieerdtransformatieprotocol om een stabiele mansteriele lijn in rijst te produceren.
Abstract
Mannelijke steriliteit is een belangrijke agronomische eigenschap voor hybride zaadproductie die meestal wordt gekenmerkt door functionele defecten in mannelijke voortplantingsorganen / gameten. Recente ontwikkelingen in CRISPR-Cas9 genoombewerkingstechnologie zorgen voor een hoge bewerkingseffectie en tijdbesparende knock-out mutaties van endogene kandidaat-genen op specifieke locaties. Bovendien, Agrobacterium-bemiddelde genetische transformatie van rijst is ook een belangrijke methode voor genmodificatie, die op grote schaal is overgenomen door vele openbare en particuliere laboratoria. In deze studie hebben we CRISPR-Cas9 genoombewerkingstools toegepast en met succes drie mannelijke steriele mutantlijnen gegenereerd door gerichte genoombewerking van OsABCG15 in een japonica cultivar. We gebruikten een gemodificeerde Agrobacterium-gemedieerderijst transformatie methode die uitstekende middelen van genetische emasculatie voor hybride zaadproductie in rijst zou kunnen bieden. Transgene planten kunnen worden verkregen binnen 2-3 maanden en homozygoottransgeefmiddelen werden gescreend door genotyperen met behulp van PCR-versterking en Sanger sequencing. Fundamentele fenotypische karakterisering van de mannelijke steriele homozygootlijn werd uitgevoerd door microscopische observatie van de rijst mannelijke voortplantingsorganen, pollen levensvatbaarheid analyse door jodium kalium jodide (I2-KI) vlekken semi-dunne dwarsdoorsnede van de ontwikkeling van anthers.
Introduction
Rijst is het belangrijkste voedselgewas, met name in ontwikkelingslanden, en is een basisvoedsel voor meer dan de helft van de wereldbevolking. Over het geheel genomen groeit de vraag naar rijstkorrels en zal de vraag naar rijstkorrels naar verwachting met 50% toenemen in 2030 en 100% in 20501,2. Toekomstige verbeteringen in de rijstopbrengst zullen moeten profiteren van diverse moleculaire en genetische hulpbronnen die rijst een uitstekend model maken voor monocotyledonous plantonderzoek. Deze omvatten een efficiënt transformatiesysteem, geavanceerde moleculaire kaart en openbaar toegankelijke database van uitgedrukte sequentietags, die gedurende vele jaren3,4zijn gegenereerd . Een strategie om de gewasopbrengst te verbeteren is hybride zaadproductie5, waarvan een centraal element de mogelijkheid is om de mannelijke vruchtbaarheid te manipuleren. Inzicht in de moleculaire controle van de mannelijke vruchtbaarheid in graangewassen kan helpen om belangrijke kennis te vertalen naar praktische technieken om de hybride zaadproductie te verbeteren en de productiviteit van gewassen te verbeteren6,7.
Genetische transformatie is een belangrijk instrument voor fundamenteel onderzoek en commerciële landbouw, omdat het de introductie van vreemde genen of manipulatie van endogene genen in gewasplanten mogelijk maakt, en resulteert in het genereren van genetisch gemodificeerde lijnen. Een passend transformatieprotocol kan helpen om genetische en moleculaire biologiestudies te versnellen voor een fundamenteel begrip van genregulatie8. Bij bacteriën vindt genetische transformatie op natuurlijke wijze plaats; echter, in planten, het wordt kunstmatig uitgevoerd met behulp van moleculaire biologie technieken9,10. Agrobacterium tumefaciens is een door de bodem overgedragen, Gram-negatieve bacterie die kroongalziekte in planten veroorzaakt door T-DNA, een gebied van zijn Ti plasmid, via een type IV-afscheidingssysteem11,12over te brengen. In planten wordt A. tumefaciens-gemedieerdetransformatie beschouwd als een wijdverbreide methode voor genmodificatie omdat het leidt tot stabiele en lage integratie van het kopienummer van T-DNA in het gastheergenoom13. Transgene rijst werd voor het eerst gegenereerd door Agrobacterium-gemedieerdegen transformatie in het midden van de jaren 1990 in de japonica cultivar14. Met behulp van dit protocol werden verschillende transgene lijnen verkregen binnen een periode van 4 maanden met een transformatie-efficiëntie van 10%-30%. De studie gaf aan dat er twee kritieke stappen zijn voor de succesvolle transformatie: een daarvan is de inductie van embryoneieke callus uit volwassen zaden en een andere is de toevoeging van acetosyringone, een fenolische verbinding, aan de bacteriële cultuur tijdens de co-teelt, wat een hogere transformatie-efficiëntie in planten14,15mogelijk maakt . Dit protocol is op grote schaal gebruikt met kleine wijzigingen in japonica16,17,18,19 evenals andere cultivars zoals indica20,21,22,23 en tropische japonica24,25. Inderdaad, meer dan 80% van de artikelen waarin rijsttransformatie wordt beschreven, gebruikt Agrobacterium-gemedieerdegentransformatie als hulpmiddel13. Tot op heden zijn verschillende protocollen voor genetische transformatie ontwikkeld met behulp van rijstzaad als uitgangsmateriaal voor callusinductie16,17,18,19. Er is echter weinig bekend over jonge bloeiwijze als explants voor de productie van kalelt. Over het algemeen is het belangrijk om een snel, reproduceerbaar en efficiënt protocol voor gentransformatie en regeneratie vast te stellen voor functionele genomics en studies over gewasverbetering.
In de afgelopen jaren heeft de vooruitgang van crispr-Cas9-technologie geresulteerd in een nauwkeurig genoombewerkingsmechanisme om de genfunctie te begrijpen en agronomisch belangrijke verbeteringen te leveren voor plantenveredeling26,27. CRISPR biedt ook een aanzienlijke belofte voor de manipulatie van mannelijke reproductieve ontwikkeling en hybride productie. In deze studie gebruikten we een gen knock-out systeem met crispr-Cas9 technologie en koppelden het aan een efficiënt rijstgentransformatieprotocol met behulp van jonge bloeiwijzen als explants, waardoor stabiele mannelijke steriele lijnen werden gemaakt voor de studie van reproductieve ontwikkeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA-CAS9 plantenexpressie vectorbouw en Agrobacterium-gemedieerdetransformatie
- Target een mannelijk steriel gen OsABCG15 in rijst volgens de gepubliceerde literatuur28.
- Ontwerp sgRNA voor de beoogde site gelegen tussen 106-125 bp in de tweede exon van OsABCG15 (figuur 1).
- Gebruik T4 polynucleotide kinase om de sgRNA oligos (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACACACACACACACACCTCAAGGGGAT3' en 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCGAGGTGTGCTT' te synthetiseren).
- Gebruik endonuclease BbsI om de psgR-Cas9 backbone vector29te verteren.
- Ligate de gesynthetiseerde sgRNA oligo's met gelinelineiseerde psgR-Cas9 backbone met behulp van T4 ligase volgens het protocol van de fabrikant.
- Ververt met HindIII/EcoRI de sgRNA-cassette vanaf stap 1.5 en subclone naar de HindIII/EcoRI-site van de pCAMBIA1300 binaire vector voor stabiele transformatie29.
- Bevestig de geconstrueerde plasmide door enzymvertering en sequencing. Later, zet de binaire constructie in de Agrobacterium tumefaciens stam EHA105 en groeien ze op Kan / Rif selectieplaten op 28 °C voor 2-3 dagen.
2. Rijstgene genetische transformatie en plantenweefselkweek
- Callus inductie en regeneratie
OPMERKING: Gebruik verse jonge rijstflores als uitgangsmateriaal om callus(figuur 2)op te wekken.- Verzamel de jonge bloeiwijzen van het rijstveld of het groene huis in meiosestadium, bepaald door een flostlengte van 1,6-4,8 mm (Figuur 2A)29. Zorg ervoor dat de rijstbloeseiten zijn bedekt met bladmantel. Veeg elke bloeiwijze met een 70% alcoholuitstrijkje en laat het drogen voor het snijden.
- Breng de bloeiwijze naar een schone steriele bank. Snijd het in kleine stukjes (hoe kleiner hoe beter) met gesteriliseerde schaar en breng stekken vervolgens over naar een petriplaat met NBD2 medium (Figuur 2B, Tabel 1).
- Broed de plaat in het donker op 26 °C gedurende ongeveer 10-14 dagen om callus(figuur 3A)te induceren.
OPMERKING: Gebruik de nieuw gevormde eelt voor Agrobacterium infiltratie (stap 2.2.7) direct of reconditioneer nog een keer in verse NBD2 medium om meer eelt te verkrijgen. Zet de eelt elke 8-10 dagen over naar het nieuwe NBD2-medium.
- Transformatie en co-teelt
- Gebruik A. tumefaciens bacteriën die de binaire plasmid van stap 1.6 voor transformatie. Bewaar de A. tumefaciens stammen in YEB medium (Tabel 1) met 50% glycerol bij -80 °C voor verder gebruik.
- Streep A. tumefaciens van een -80 °C glycerol voorraad naar YEB agar medium met selectieve antibiotica (Tabel 1) en groeien bij 25-28 °C voor 48-72 uur, om kolonies te laten verschijnen.
- Inenting van één kolonie van de YEB-plaat met selectieve antibiotica tot 5 mL vloeibaar YEB-medium met dezelfde selectieve antibiotica(tabel 1), in een kegelvormige steriele reageerbuis van 50 mL. Schud op een orbitale shaker bij 250 x g, bij 25-28 °C totdat bacteriën uitgroeien tot een OD600 van 0,5.
- Voeg 1 mL bacteriële suspensie toe aan 100 mL YEB-medium(tabel 1) met dezelfde selectieve antibiotica in een conische kolf van 250 mL en schud op een orbitale shaker bij 250 x g, bij 28 °C gedurende 4 uur.
- Centrifuge op 4.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om bacteriën te verzamelen. Gooi de supernatant weg.
- Resuspend de bacteriële pellet met AAM-AS medium (Tabel 1) en verdun de suspensie tot een OD600 = 0,4.
LET OP: De perfecte OD van bacteriële suspensie is van cruciaal belang voor een efficiënte transformatie. Het helpt bij het elimineren van overtollige bacteriële groei op de eelt. - Verzamel ongeveer 150 gezonde groeiende lichtgele fragiele embryoneieke calli van stap 2.1.3 in een 150 mL steriele kolf. Voeg 50-75 mL bacteriële cel suspensie van stap 2.2.6 in de steriele kolf, en voeg dan ongeveer 10-25 mL verse AAM-AS medium om de calli onder te dompelen voor 10-20 min, af en toe schudden.
- Giet de bacteriële suspensie uit de kolf voorzichtig en droog de overtollige bacteriële suspensie van de eelt met behulp van steriel filterpapier #1 of weefselpapier. Plaats ze vervolgens op een petrischaaltje met NBD-AS medium (Tabel 1) bedekt met een steriel filterpapier #1. Incubeer 3 dagen lang in het donker bij 25-28 °C en controleer op bacteriële begroeiing.
- Selectie voor resistente eelt
- Breng de calli na 3 dagen co-teelt over op een steriel petrischaaltje met een steriel filterpapier.
- Luchtdroog de calli voor 2 uur op een schone bank. Zorg ervoor dat de eelt niet aan het filterpapier wordt vastgehangen.
- Breng de calli gelijkmatig over met steriele pincet naar het primaire selectiemedium NBD2 (met 40 mg/L hygromycine en 250 mg/L-tijdindop) (tabel 1). Cultuur calli voor 2 weken bij 25-28 °C in het donker.
- Na 2 weken, breng calli gelijkmatig over naar een nieuwe plaat met vers selectiemedium NBD2 (met 40 mg/L hygromycine en 250 mg/L timentin) (Tabel 1). Cultuur de calli nog 2 weken bij 25-28 °C in het donker.
- Callusdifferentiatie
- Breng callus over naar vers MS Medium (met 25 mg/L hygromycine en 150 mg/L timentin) (tabel 1). Cultuur onder het licht op 25-28 °C gedurende ongeveer 2 weken.
- Herhaal stap 2.4.1 nog één keer.
- Breng de schietknoppen naar het nieuwe MS-medium (met 10 mg/L hygromycine) om meer scheuten te verspreiden.
- Wortelinductie
- Breng de nieuwe scheuten over in 1/2 MS medium(tabel 1). Cultuur onder het licht bij 25 °C - 28 °C. De getransformeerde planten produceren wortels binnen 2 weken.
- Na 1 week, breng de planten naar schone potten die de plant bedekken om uitdroging te voorkomen.
3. Genotype-identificatie
- Verzamel jonge bladeren van nieuw gegenereerde planten voor totale DNA-extractie met behulp van de cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) methode31.
- Met behulp van de genomische DNA als sjabloon, kies de primers (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGAGACCTCGTATT 3' en Hygromycine-R: 5' CGAAGAATCTCGTTTTTCA 3' gelegen in de Hygromycine regio) om polymerase kettingreactie (PCR) uit te voeren om de transgene integratie en frequenties te valideren (figuur 4). De volgende PCR-voorwaarden: 94 °C gedurende 5 minuten; 36 cycli (94 °C voor 30 s; 56 °C voor 30 s; 72 °C gedurende 1 min); 72 °C gedurende 7 min. Succesvolle PCR reacties leveren een 604 bp amplicon op.
- Voer een andere PCR uit om de genomische regio rond de CRISPR-doelsites te versterken met behulp van specifieke primers (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTTTCT 3' en OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTAAAAAACATTGCTAT 3') om het genotype van de transformanten te identificeren. De PCR-voorwaarden zijn hetzelfde als in stap 3.2.
- Gebruik PCR-fragmenten uit stap 3.3 direct voor Sanger-sequencing om mutaties te identificeren.
4. Let op het basisfenotype van de mutant
- Bereid de I2-KI-oplossing voor: los 2 g KI (kaliumjodide) op in 10 mL gedestilleerd water en voeg er vervolgens 0,2 g I2 (opnieuwublimed jodium) in toe. Breng na het mengen het totale volume op 100 mL met gedestilleerd water.
- Bereid de FAA-oplossing (63% watervrije ethanol, 5% glaciale azijnzuur, 5% formaldehyde en 27% water) en meng voor gebruik.
- Bereid de 0,5% Toluidine blauwe kleuroplossing: los 0,5 g Toluidine blauw op in 100 mL gedestilleerd water.
- Voer vegetatieve fenotypische observatie uit, door de hele planten met een digitale camera te beelden.
- Voer reproductieve fenotypeobservatie uitvoeren, verwijder de palea en lemma uit de floret. Maak foto's van hele anthers onder een stereomicroscoop.
- Let op de pollen levensvatbaarheid door jodium vlekken.
- Kies rijpe rijstpieken voor de bloem anthese, verwijder de palea en lemma om de anthers vrij te geven.
- Neem 6 anthers en leg ze op een glazen glijbaan. Voeg 1 druppel gedestilleerd water, plet de anther goed met een pincet om de stuifmeelkorrels vrij te geven en voeg vervolgens 2-3 druppels I2-KI-oplossing toe. Dek af met de coverslip.
- Observeer onder een lage vergrotingsmicroscoop. Stuifmeel korrels geverfd zwart tonen meer krachtige levensvatbaarheid, geen kleur of geel-bruin geverfd zijn onvolgroeid of gedegenereerd.
- Voer een semi-dun deel van rijst anther
- Bevestig de rijstbloemen uit verschillende ontwikkelingsstadia tot een FAA-oplossing. Vacuüm de materialen op 4 °C (over het algemeen 15 min) om het fixatief in de weefsels te laten doordringen totdat het materiaal naar de bodem van de opvangfles zinkt.
- Vervang de volgende dag door een nieuwe FAA-oplossing. Zodra het materiaal naar de bodem zinkt, vervang het door 70% ethanol en bewaar bij 4 °C voor langdurig gebruik.
- Dehydrateer de materialen met verschillende gradiënten ethanol (70%, 80%, 95% telkens voor 30 min, 100% ethanol voor 2 uur, 100% ethanol met een beetje Safranin kleurstof voor 2 uur).
OPMERKING: Voeg een beetje Safranin kleurstof in de tweede 100% ethanol om de anthers kleur voor gemakkelijker sectioning achteraf. - Voer inbedding uit door de instructies van de fabrikant (Tabel van Materialen) te volgen. Bak vervolgens 48 uur in een oven op 60 °C voor de doorsnede.
- Doorsnee het monster tot een dikte van 2 μm met behulp van een microtome. Voeg een druppel water toe aan de glazen schuif. Dan, pak de dunne secties met anther blokken door tangen en zet ze op het oppervlak van het waterdruppel op de glijbanen.
- Plaats de glijbanen op het waterbad op 50 °C om de secties volledig te spreiden om het stevig aan de glijbaan te laten hechten.
- Gebruik 0,5% toluidine blauwe oplossing vlek de dia's gedurende 30 min. Spoel vervolgens af met water en droog in de rookkap. Verzegel met neutrale boomlijm. Plaats voorzichtig een coverslip op de glijbaan en droog in de rookkap.
- Observeer en fotografeer het monster onder een microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier wordt aangetoond dat het gebruik van genbewerkingstechnologie is om een mannelijke steriele lijn te creëren voor toekomstig onderzoek door Agrobacterium-gemedieerdegenetische transformatie in rijst. Om de mannelijke steriele lijn van osabcg15te creëren, werd CRISPR-CAS9-gemedieerde mutagenesis gebruikt voor binaire vectorbouw. De sgRNA werd aangedreven door de OsU3 promotor, terwijl de expressie cassette van hSpCas9 werd aangedreven door de dubbele 35S promotor, en de middelste vector werd geassembleerd in een enkele binaire vector pCAMBIA1300 ontworpen voor Agrobacterium-bemiddelde stabiele transformatie van rijst. Een grafische weergave van de constructie die werd gebruikt voor CRISPR/Cas9-gemedieerde mutagenese van rijst is opgenomen in figuur 1A.
Figuur 2 en figuur 3 vertegenwoordigen de gehele procedure van de productie van rijsttransgene. De jonge bloeiwijzen werden gekozen als explants (Figuur 2) en veroorzaakten de friable embryogene callus (FEC) binnen 14 dagen na inenting op het NBD2-medium (figuur 3A). De embryogene calli werden direct gebruikt voor Agrobacterium-gemedieerdetransformatie (figuur 3C) of subcultuur voor proliferatie om meer calli voor verdere infectie te verkrijgen (figuur 3B). Na co-cultiveren voor 48 uur op NBD2-AS medium in donkere omstandigheden (Figuur 3D), de calli werden verschoven naar een tweede ronde van de selectie medium. Na 10-14 dagen, getransformeerd calli toonde een aantal kleine nieuw gevormde microcalli aan de periferie van de moeder calli, terwijl de kleur van ongevormde calli omgezet in bruin en stierf uiteindelijk(Figuur 3E, F). Later, gezonde en romige gekleurde calli werden overgebracht naar de regeneratie medium tweemaal. In dit stadium vertoonde getransformeerde calli geleidelijk groene vlekken (schietknoppen)(figuur 3G,H). Deze nieuw gegenereerde groene vlekken werden gekweekt in een steriele plastic fles met regeneratiemedium om shoot groei mogelijk te maken(figuur 3I),en vervolgens verschoven (als verse scheuten) in een 1/2 MS medium om wortels te induceren. Later werden gezonde en krachtige groeischeuten met goed ontwikkelde wortels geoogst(figuur 3J).
In totaal werden 21 geregenereerde zaailingen verkregen. Pcr-versterking voor het hygromycinegebied toonde aan dat 18 van de 21 de overeenkomstige band kunnen versterken, wat aangeeft dat deze lijnen transgeen zijn (figuur 4), en de overeenkomstige transformatiefrequentie ongeveer 85,71%(tabel 2). De transformanten werden gemoedteerd om de mutaties op de sgRNA-doellocatie(s) te identificeren met behulp van primers die het doelgebied door PCR amplicon en Sanger sequencing, Onder 18 T0 transgene planten, acht heterozygoot lijnen en drie homozygoot lijnen waren CRISPR-Cas9 positief, met overeenkomstige mutatiefrequenties van 61,11% (Figuur 1B, Tabel 2).
De homozygootvormige knock-out mutanten werden gevalideerd door elementaire mannelijke reproductieve orgaan observatie(Figuur 5). De anthers van osabcg15 waren kleiner en bleker dan die van het wilde type (Figuur 5A,D), en ontbrak rijpe stuifmeelkorrels (Figuur 5B,E). Transversale sectioning microscopie werd uitgevoerd om de anther morfologische defecten in osabcg15 te onderzoeken in vergelijking met het wilde type. In fase 10, wild-type microsporen werd rond gevormd en vacuolated met donkerblauw gekleurde exine (Figuur 5C). Daarentegen, osabcg15 microsporen ingestort en afgebroken, alleen puin van gedegenereerde microspore bestaan in de anther locule (Figuur 5F).
Figuur 1: Construeren van informatie voor het CRISPR/Cas9-systeem en gerichte mutagenese van de OsABCG15. aA) Het sgRNA werd aangedreven door de OsU3-promotor, terwijl de expressiecassette van hSpCas9 werd aangedreven door de dubbele 35S-promotor; de middelste vector werd geassembleerd in een enkele binaire vector ontworpen voor Agrobacterium-bemiddeldestabiele transformatie van rijst. (B) De sequentie (5"-AAGCACATCCTCAAGGGGAT-3") in de tweede exon van het OsABCG15-gen werd geselecteerd als doellocatie van sgRNA. Drie soorten homozygootische mutatiegebeurtenissen werden gegenereerd door CRISPR-Cas9 in japonica cultivar 9522 achtergrond, en Sanger sequencing chromatogrammen van CRISPR-Cas9 geïnduceerde mutatie sites worden getoond. Lijn 9522osabcg15-1 heeft een single-nucleotide (1-nt) 'A' inbrengen; lijn 9522osabcg15-2 heeft een single-nucleotide (1-nt) 'G' inbrengen; en lijn 9522osabcg15-3 heeft een single-nucleotide (1-nt) 'G' verwijdering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Uitgangsmateriaal voor het opwekken van eelt. (A) Jonge rijstbloeseseiten in meiose stadium. (B) Ontleed jonge bloeiwijzen groeien op de NBD2 medium. Bar = 2 cm in (A). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Procedure voor de productie van transgene lijnen door Agrobacterium-gemedieerde transformatie. (A) Rijst calli gegenereerd uit de jonge bloeiwijzen. (B) Subcultuur van calli. (C) Incubatie van calli met A. tumefaciens. (D) Co-teelt van calli met A. tumefaciens. (E) Eerste selectiecyclus van getransformeerde calli in aanwezigheid van Hygromycine (40 mg/L). (F) Tweede selectiecyclus van getransformeerde calli in aanwezigheid van Hygromycine (40 mg/L). (G) Eerste regeneratie van getransformeerde calli. (H) De tweede regeneratie van getransformeerde calli, wijzend op de groene schietpunt in de cultuur plaat. (I) Schiet inductie cultuur. (J) Wortelinductie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Analyse van transformatiefrequenties van geregenereerde rijstzaailingen. Versterkte PCR-producten die een 604 bp-fragment (1-8, 10-14, 16-20) vertonen na 1,5% agarose gel elektroforese geven transgene positieve lijnen aan. Lijnen die het fragment missen zijn niet-vervormd (9, 15, 21), vergelijkbaar met de wild-type (WT) controle. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Basisfenotypische observatie van het wilde type (9522) en mutant 9522osabcg15-1. (A) Wild-type (9522) bloem en (D) 9522osabcg15-1 mutant bloem na verwijdering van de lemma en palea. gl, glume; fi, filament; lodicule; pi, stamper; st, meeldraden. (B) I2-KI kleuring van volwassen stuifmeelkorrels van wildtype (9522) en (E) 9522osabcg15-1 lijn. CC) Analyse van de ontwikkeling van anther in het wilde type (9522) en (F) 9522osabcg15-1 mutant door transversale sectieobservatie. DMsp, Gedegenereerde microsporen; E, opperhuid; En, endothecium; Msp, microspore; T, tapetum. Staven = 2 mm in (A) en (D), 100 μm in (B) en (E), 50 μm in (C) en (F). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Tabel 1: Mediasamenstellingen voor rijsttransformatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Transformatie en genbewerkingsefficiëntie van de mutanten van OsABCG15 gegenereerd door CRISPR-Cas9 in de T0-generatie. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kunstmatige geniale mannelijke steriele mutanten worden traditioneel gegenereerd door willekeurige fysische, chemische of biologische mutagenese. Hoewel dit krachtige technieken zijn, slaagt hun willekeurige aard er niet in om op de enorme hoeveelheid moderne genomische kennis te kapitaliseren die het potentieel heeft om op maat gemaakte verbeteringen in moleculaire veredeling32te leveren. Het CRISPR-Cas9-systeem wordt veel gebruikt in planten vanwege de eenvoudige en betaalbare middelen om DNA29,33te manipuleren en te bewerken; het heeft potentieel om tijd te besparen in vergelijking met traditionele mutagenesis methoden.
Hier ontwikkelden we een handig Agrobacterium-gemedieerdtransformatiesysteem met behulp van jonge bloeiwijzen als explants voor callusinductie. Er zijn enkele stappen in de transgene procedure die kunnen worden weggelaten om tijd te besparen. Het gebruik van jonge bloeiwijzen als uitgangsmateriaal is een goede keuze om de totale duur van de callusinductie te minimaliseren in vergelijking met het gebruik van zaden als explants. Bovendien zijn de celdifferentiatie en regeneratiecapaciteit zeer sterk in de calli verkregen uit jonge bloeiwijzen. In dit proces kan subcultuur van rijst calli worden vermeden, wat uiteindelijk tijd bespaart en het risico op bacteriële en schimmelbesmetting vermindert. Bovendien werd timentin gebruikt als een antibioticum in plaats van carbenicilline, wat effectiever is in het remmen van bacteriën.
De studie en het ingevoerde protocol voor fundamentele fenotypische observatie van mannelijke reproductieve ontwikkeling in rijst is nuttig voor undergraduate en graduate studenten die geïnteresseerd zijn in plantaardige reproductieve biologie. Dit handige protocol moet snel te begrijpen en reproduceerbaar zijn voor gebruik in latere onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
De auteurs willen Xiaofei Chen erkennen voor het verstrekken van de jonge rijstbloeseseiten en hulp bij het maken van de rijstweefsel cultuur medium. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31900611).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
References
- FAO. FAO statistical yearbook, World Food and Agriculture. Rome. ISBN 978-92-5-107396-4. , Available from: http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf (2013).
- FAO. The future of food and agriculture: Trends and challenges. Rome. ISBN 978-92-5-109551-5. , Available from: http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf 109551-109555 (2017).
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D.
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B.
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j, Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C.
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. iC. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
