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Biology

एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थता आनुवंशिक परिवर्तन, ट्रांसजेनिक उत्पादन, और चावल में पुरुष प्रजनन विकास के अध्ययन के लिए इसका आवेदन

Published: October 6, 2020 doi: 10.3791/61665
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 1,3
1Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, Shanghai Jiao Tong University-University of Adelaide Joint Centre for Agriculture and Health, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 2College of Agronomy, Anhui Agricultural University, Heifei, China, 3School of Agriculture, Food and Wine, University of Adelaide
* These authors contributed equally

Summary

यह काम CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी के उपयोग का वर्णन करने के लिए नॉकआउट अंतर्जात जीन OsABCG15 के बाद एक संशोधित Agrobacterium-मध्यस्थतापरिवर्तन प्रोटोकॉल के लिए चावल में एक स्थिर पुरुष बाँझ लाइन का उत्पादन ।

Abstract

पुरुष बंध्यता हाइब्रिड बीज उत्पादन के लिए एक महत्वपूर्ण कृषि लक्षण है जो आमतौर पर पुरुष प्रजनन अंगों/गेमेस में कार्यात्मक दोषों की विशेषता है । CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी में हाल ही में प्रगति विशिष्ट स्थलों पर अंतर्जात उम्मीदवार जीन के उच्च संपादन प्रभावकारिता और टाइम्सविंग नॉकआउट म्यूटेशन के लिए अनुमति देती है। इसके अतिरिक्त, चावल का एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताआनुवंशिक परिवर्तन भी जीन संशोधन के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है, जिसे कई सार्वजनिक और निजी प्रयोगशालाओं द्वारा व्यापक रूप से अपनाया गया है। इस अध्ययन में, हमने CRISPR-Cas9 जीनोम संपादन उपकरण लागू किए और एक जैपोनिका कल्टिवर में ओसाबीसीजी15 के लक्षित जीनोम संपादन द्वारा तीन पुरुष बाँझ उत्परिवर्ती लाइनों को सफलतापूर्वक उत्पन्न किया। हमने एक संशोधित एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताचावल परिवर्तन विधि का उपयोग किया जो चावल में हाइब्रिड बीज उत्पादन के लिए आनुवंशिक विकृति के उत्कृष्ट साधन प्रदान कर सकता है। ट्रांसजेनिक पौधों को 2-3 महीने के भीतर प्राप्त किया जा सकता है और पीसीआर प्रवर्धन और सेंगर अनुक्रमण का उपयोग करके जीनोटाइपिंग द्वारा होमोज़िगस ट्रांसफॉर्मेंट की जांच की गई। पुरुष बाँझ होमोज़िगस लाइन का मूल फेनोटाइपिक लक्षण वर्णन चावल पुरुष प्रजनन अंगों के सूक्ष्म अवलोकन द्वारा किया गया था, आयोडीन पोटेशियम आयोडाइड(आई-के) द्वारा पराग व्यवहार्यता विश्लेषण।

Introduction

चावल सबसे महत्वपूर्ण खाद्य फसल है, विशेष रूप से विकासशील देशों में, और दुनिया की आबादी के आधे से अधिक के लिए एक मुख्य भोजन का प्रतिनिधित्व करता है । कुल मिलाकर चावल के दाने की मांग बढ़ रही है और 2030 तक 50 प्रतिशत और 2050 तक 100 प्रतिशत वृद्धि होने का अनुमान1,है. चावल की उपज में भविष्य में सुधार के लिए विविध आणविक और आनुवंशिक संसाधनों है कि चावल मोनोकॉयलेडोनस संयंत्र अनुसंधान के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल बनाने पर भुनाने की आवश्यकता होगी । इनमें एक कुशल परिवर्तन प्रणाली, उन्नत आणविक मानचित्र और व्यक्त अनुक्रम टैग का सार्वजनिक रूप से सुलभ डाटाबेस शामिल है, जो कई वर्षों में उत्पन्न किया गया है3,,4. फसल उपज में सुधार करने के लिए एक रणनीति हाइब्रिड बीज उत्पादन5है, जिसका एक केंद्रीय तत्व पुरुष प्रजनन क्षमता में हेरफेर करने की क्षमता है। अनाज फसलों में पुरुष उर्वरता के आणविक नियंत्रण को समझने से हाइब्रिड बीज उत्पादन में सुधार और फसल उत्पादकता6,7में वृद्धि करने के लिए महत्वपूर्ण ज्ञान को व्यावहारिक तकनीकों में तब्दील करने में मदद मिल सकती है ।

आनुवंशिक परिवर्तन बुनियादी अनुसंधान और वाणिज्यिक कृषि के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है क्योंकि यह विदेशी जीन या फसल पौधों में अंतर्जात जीन के हेरफेर की शुरूआत में सक्षम बनाता है, और आनुवंशिक रूप से संशोधित लाइनों के उत्पादन में परिणाम है । एक उपयुक्त परिवर्तन प्रोटोकॉल जीन नियमन8की मौलिक समझ के लिए आनुवंशिक और आणविक जीव विज्ञान अध्ययन में तेजी लाने में मदद कर सकता है । बैक्टीरिया में, आनुवंशिक परिवर्तन स्वाभाविक रूप से होता है; हालांकि, पौधों में, यह कृत्रिम रूप से आणविक जीव विज्ञानतकनीकोंका उपयोग कर किया जाता है 9,10. एग्रोबैक्टीरियम tumefaciens एक मिट्टी जनित, ग्राम-नकारात्मक जीवाणु है जो पौधों में ताज पित्त रोग का कारण बनता है टी-डीएनए, इसके टीआई प्लाज्मिड के एक क्षेत्र को टाइप IV स्राव प्रणाली11, 12,12के माध्यम से संयंत्र कोशिका में स्थानांतरित करके। पौधों में, ए tumefaciens-मध्यस्थतापरिवर्तन जीन संशोधन के लिए एक व्यापक विधि माना जाता है क्योंकि यह मेजबान जीनोम13में टी डीएनए के स्थिर और कम कॉपी संख्या एकीकरण की ओर जाता है । ट्रांसजेनिक चावल सबसे पहले 1990 के दशक के मध्य में जैपोनिका कल्टीवर14में एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताजीन परिवर्तन के माध्यम से उत्पन्न हुआ था । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, 10%-30% की परिवर्तन दक्षता के साथ 4 महीने की अवधि के भीतर कई ट्रांसजेनिक लाइनें प्राप्त की गई थीं। अध्ययन से संकेत मिलता है कि सफल परिवर्तन के लिए दो महत्वपूर्ण कदम हैं: एक परिपक्व बीजों से भ्रूणजनित कॉलस का शामिल होना है और दूसरा सह-खेती के दौरान जीवाणु संस्कृति के लिए एक फेनोलिक यौगिक, एसीटोसिरिंगोन का जोड़ है, जो पौधों में उच्च परिवर्तन दक्षता के लिए अनुमति देता है14,,15। इस प्रोटोकॉल का बड़े पैमाने पर इस्तेमाल जैपोनिका,2216 ,17, 18,,19के साथ - साथ इंडिका2018,21 ,22 ,23और उष्णकटिबंधीय जैपोनिका23 24,,25में मामूली परिवर्तनकेसाथ किया गया है । दरअसल, चावल परिवर्तन का वर्णन करने वाले 80% से अधिक लेख एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताजीन परिवर्तन को एक उपकरण के रूप में उपयोग करते हैं13। आज तक, चावल के बीज का उपयोग करके कॉलस प्रेरण 16 ,,,17, 18,,1819के लिए एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में कई आनुवंशिक परिवर्तन प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं ।19 हालांकि, बहुत कम कॉलस उत्पादन के लिए एक्सप्लांट के रूप में युवा इनफ्लोरेसेंस के बारे में जाना जाता है। कुल मिलाकर, कार्यात्मक जीनोमिक्स और फसल सुधार पर अध्ययन के लिए एक तेजी से, प्रजनन योग्य और कुशल जीन परिवर्तन और पुनर्जनन प्रोटोकॉल स्थापित करना महत्वपूर्ण है।

हाल के वर्षों में, CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी की उन्नति के परिणामस्वरूप जीन समारोह को समझने और पौधों के प्रजनन के लिए कृषि विज्ञानात्मक रूप से महत्वपूर्ण सुधार देने के लिए एक सटीक जीनोम संपादन तंत्र,हुआहै।26 CRISPR भी पुरुष प्रजनन विकास और संकर उत्पादन के हेरफेर के लिए काफी वादा प्रदान करता है । इस अध्ययन में, हमने CRISPR-Cas9 प्रौद्योगिकी का उपयोग करके एक जीन नॉकआउट प्रणाली का उपयोग किया और इसे एक कुशल चावल जीन परिवर्तन प्रोटोकॉल के साथ मिलकर युवा इनफ्लोरेसेंस का उपयोग करके एक्सप्लांट्स के रूप में जोड़ा, जिससे प्रजनन विकास के अध्ययन के लिए स्थिर पुरुष बाँझ लाइनें बनाई जा सके।

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Protocol

1. sgRNA-CAS9 संयंत्र अभिव्यक्ति वेक्टर निर्माण और एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थतापरिवर्तन

  1. प्रकाशित साहित्य28के अनुसार चावल में एक पुरुष बाँझ जीन OsABCG15 लक्ष्य ।
  2. ओसाबीसीजी15(चित्रा1) के दूसरे एक्सोन में 106-125 बीपी के बीच स्थित लक्षित साइट के लिए डिजाइन sgRNA । OsABCG15
  3. SgRNA oligos (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACACCCCCAAGGAT3' और 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCCCGATGGCT') संश्लेषित करने के लिए T4 पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज़ का उपयोग करें।
  4. पीएसजीआर-Cas9 बैकबोन वेक्टर29को पचाने के लिए एंडोन्यूक्लिज बीबीएसआई का उपयोग करें।
  5. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए टी 4 लीगास का उपयोग करके रैखिक पीएसजीआर-Cas9 बैकबोन के साथ संश्लेषित sgRNA ओलिगोस को लिगेट करें।
  6. हिंडियाई/इकोरी का उपयोग करके, स्टेप १.५ से एसजीआरएनए कैसेट को पचाें और स्थिर परिवर्तन29के लिए pCAMBIA1300 बाइनरी वेक्टर के हिंडीआइ/इकोरी साइट में उपक्लीकीय ।
  7. एंजाइम पाचन और अनुक्रमण द्वारा निर्मित प्लाज्मिड की पुष्टि करें। बाद में, बाइनरी निर्माण को एग्रोबैक्टीरियम टमेफैफियंस स्ट्रेन ईएचए 105 में बदल दें और उन्हें कान/रिफ चयन प्लेटों पर 2-3 दिनों के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर उगाएं।

2. चावल आनुवंशिक परिवर्तन और संयंत्र ऊतक संस्कृति

  1. कॉलस इंडक्शन और पुनर्जनन
    नोट: कॉलस(चित्रा 2)को प्रेरित करने के लिए शुरुआती सामग्री के रूप में ताजा युवा चावल इनफ्लोरेसेंस का उपयोग करें।
    1. 1.6-4.8 मिमी(चित्रा 2A) 29की फ्लोरेट लंबाई द्वारा निर्धारित, मेयोसिस चरण29में धान के खेत या ग्रीन हाउस से युवा फूलों की जांच करें। सुनिश्चित करें कि चावल के फूलों को पत्ती म्यान से ढका हुआ है। प्रत्येक फूलों को 70% शराब के साथ पोंछें और काटने से पहले इसे सूखने दें।
    2. फूलों को एक साफ बाँझ बेंच पर लाएं। इसे निष्फल कैंची के साथ छोटे टुकड़ों (छोटे बेहतर) में काट लें और फिर एनबीडी2 माध्यम(चित्रा 2B, तालिका 1)वाली पेट्री प्लेट में कलमों को स्थानांतरित करें।
    3. कॉलस(चित्रा 3 ए)को प्रेरित करने के लिए लगभग 10-14 दिनों के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: एग्रोबैक्टीरियम घुसपैठ (चरण 2.2.7) के लिए नवगठित कॉलस का उपयोग सीधे करें या अधिक कॉलस प्राप्त करने के लिए ताजा NBD2 माध्यम में एक और समय को फिर से शर्त करें। कॉलस को हर 8-10 दिनों में नए NBD2 माध्यम में स्थानांतरित करें।
  2. परिवर्तन और सह-खेती
    1. परिवर्तन के लिए चरण 1.6 से बाइनरी प्लाज्मिड युक्त ए टमेफैपियंस बैक्टीरिया का उपयोग करें। आगे के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर 50% ग्लाइस्रोल के साथ YEB माध्यम(तालिका 1)में ए tumefaciens उपभेदों को स्टोर करें।
    2. स्ट्रीक ए-80 डिग्री सेल्सियस ग्लाइस्रोल स्टॉक से चुनिंदा एंटीबायोटिक्स(टेबल 1)वाले वाईबी एगर मीडियम तक और 48-72 घंटे के लिए 25-28 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि, उपनिवेशों को प्रकट होने की अनुमति देने के लिए।
    3. एक 50 एमएल शंकु बाँझ टेस्ट ट्यूब में एक ही चयनात्मक एंटीबायोटिक दवाओं(तालिका 1)युक्त तरल YEB माध्यम के 5 एमएल के साथ येब प्लेट से एक कॉलोनी टीका। 250 x ग्रामपर एक कक्षीय शेखर पर हिलाएं, 25-28 डिग्री सेल्सियस पर जब तक बैक्टीरिया0.5 के ओडी 600 तक नहीं बढ़ता है।
    4. 250 एमएल शंकुधारी फ्लास्क में एक ही चुनिंदा एंटीबायोटिक दवाओं के साथ YEB माध्यम(टेबल 1)के 100 मिलीएल में बैक्टीरियल सस्पेंशन का 1 एमएल जोड़ें और 250 x gपर एक कक्षीय शेखर पर हिलाएं, 4 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर।
    5. बैक्टीरिया को इकट्ठा करने के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्याग दें।
    6. आम-एएस माध्यम(तालिका 1)के साथ बैक्टीरियल पेलेट को फिर से खर्च करें और निलंबन को ओडी600 = 0.4 में पतला करें।
      नोट: कुशल परिवर्तन के लिए बैक्टीरियल निलंबन का सही ओडी महत्वपूर्ण है। यह कॉलस पर अतिरिक्त बैक्टीरियल ग्रोथ को खत्म करने में मदद करता है।
    7. एक 150 मिलीएल बाँझ फ्लास्क में कदम 2.1.3 से लगभग 150 स्वस्थ बढ़ते प्रकाश-पीले नाजुक भ्रूणजनित कैली को इकट्ठा करें। स्टेप 2.2.6 से बाँझ फ्लास्क में 50-75 एमएल बैक्टीरियल सेल सस्पेंशन जोड़ें, और फिर कैली को 10-20 मिनट के लिए विसर्जित करने के लिए कुछ 10-25 मिलीग्राम ताजा आम-एएस माध्यम जोड़ें, कभी-कभी मिलाते हुए।
    8. फ्लास्क से बैक्टीरियल सस्पेंशन को ध्यान से डालें और बाँझ फिल्टर पेपर #1 या टिश्यू पेपर का उपयोग करके कॉलस से अतिरिक्त बैक्टीरियल सस्पेंशन को सुखा लें। फिर उन्हें बाँझ फिल्टर पेपर #1 के साथ कवर किए गए NBD-AS मध्यम(तालिका 1)के साथ पेट्री डिश पर रखें। 3 दिनों के लिए अंधेरे में 25-28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट और बैक्टीरियल ओवरग्रोथ की जांच करें।
  3. प्रतिरोधी कॉलस के लिए चयन
    1. सह-खेती के 3 दिनों के बाद, कैली को बाँझ फिल्टर पेपर के साथ बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    2. हवा-एक साफ बेंच पर 2 घंटे के लिए कैली सूखी । सुनिश्चित करें कि कॉलस फिल्टर पेपर का पालन न करें।
    3. कैली को प्राथमिक चयन माध्यम NBD2 (40 मिलीग्राम/एल हाइग्रोमाइसिन और 250 मिलीग्राम/एल टाइमरटिन)(टेबल 1)में बाँझ चिमटी का उपयोग करके समान रूप से स्थानांतरित करें। अंधेरे में 25-28 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह के लिए संस्कृति कैली।
    4. 2 सप्ताह के बाद, कैली को एक नई प्लेट में समान रूप से स्थानांतरित करें जिसमें ताजा चयन माध्यम NBD2 (४० मिलीग्राम/एल हाइग्रोमाइसिन और २५० मिलीग्राम/एल टाइमरटिन)(टेबल 1)शामिल है । अंधेरे में 25-28 डिग्री सेल्सियस पर एक और 2 सप्ताह के लिए कैली संस्कृति।
  4. कैलस भेदभाव
    1. फ्रेश एमएस मीडियम (25 मिलीग्राम/एल हाइग्रोमाइसिन और १५० मिलीग्राम/एल टाइमरटिन के साथ)(टेबल 1)में कॉलस ट्रांसफर करें । लगभग 2 सप्ताह के लिए 25-28 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश के तहत संस्कृति।
    2. एक बार और कदम 2.4.1 दोहराएं।
    3. अधिक शूटिंग पैदा करने के लिए नए एमएस माध्यम (10 मिलीग्राम/एल हाइग्रोमाइसिन के साथ) के लिए शूट कलियों को स्थानांतरित करें ।
  5. रूट इंडक्शन
    1. नए शूट को 1/2 एमएस मीडियम(टेबल 1)में ट्रांसफर करें । 25 डिग्री सेल्सियस - 28 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश के तहत संस्कृति। परिवर्तित पौधे 2 सप्ताह के भीतर जड़ों का उत्पादन करते हैं।
    2. 1 सप्ताह के बाद, पौधों को निर्जलीकरण को रोकने के लिए पौधे को कवर करने वाले बर्तनों को साफ करने के लिए स्थानांतरित करें।

3. जीनोटाइप पहचान

  1. 31सेटील्रिमिथाइल अमोनियम ब्रोमाइड (सीटीएबी) विधि का उपयोग करके कुल डीएनए निष्कर्षण के लिए नए उत्पन्न पौधों से युवा पत्तियों को एकत्र करें ।
  2. टेम्पलेट के रूप में जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके, ट्रांसजेन इंटीग्रेशन और फ्रीक्वेंसी(चित्रा 4)को मान्य करने के लिए पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) करने के लिए प्राइमर (हाइग्रोमाइसिन-एफ: 5' गेटगेटजीजीसीजीटीसीटीसीजीटीटी 3' और हाइग्रोमाइसिन-आर: 5 ' सीजीएगाएटटीसीटीसीजीटीटीसीटीसीटीसीटीसीए 3' चुनें। निम्नलिखित पीसीआर की स्थिति: 5 मिनट के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 36 चक्र (30 एस के लिए 94 डिग्री सेल्सियस; 30 एस के लिए 56 डिग्री सेल्सियस; 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस); 7 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस। सफल पीसीआर प्रतिक्रियाओं से 604 बीपी एम्प्लिकॉन उत्पन्न होती है।
  3. एक और पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए विशिष्ट प्राइमर (OsABCG15-आईडी-एफ: 5 ' GTCTCATTTTCAACATTCTTTTTTTTTTT ' और OsABCG15-आईडी-आर: 5 ' TTGGTGTTTAAAACACATTGCTAT 3 ' का उपयोग कर CRISPR लक्ष्य साइटों के आसपास जीनोमिक क्षेत्र बढ़ाना । पीसीआर की स्थिति चरण 3.2 के समान है।
  4. म्यूटेशन की पहचान करने के लिए सीधे सेंगर सीक्वेंसिंग के लिए स्टेप 3.3 से पीसीआर टुकड़ों का उपयोग करें।

4. उत्परिवर्ती के मूल फेनोटाइप का निरीक्षण करें

  1. I2-KI समाधान तैयार करें: आसुत पानी के 10 एमएल में केआई (पोटेशियम आयोडाइड) के 2 ग्राम को भंग करें और फिर इसमें 0.2 ग्राम I2 (resublimed आयोडीन) जोड़ें। मिक्स करने के बाद कुल वॉल्यूम को डिस्टिल्ड वॉटर के साथ 100 एमएल पर लाएं।
  2. एफएए समाधान (63% निर्जल इथेनॉल, 5% हिमनद एसिटिक एसिड, 5% फॉर्मलडिहाइड और 27% पानी) तैयार करें और उपयोग करने से पहले मिलाएं।
  3. 0.5% टोलुइडीन ब्लू स्टेनिंग समाधान तैयार करें: आसुत पानी के 100 एमएल में 0.5 ग्राम टोलुइडीन ब्लू को भंग करें।
  4. डिजिटल कैमरे के साथ पूरे पौधों की इमेजिंग करके वनस्पति फेनोटाइपिक अवलोकन करें।
  5. प्रजनन फेनोटाइप अवलोकन करें, फ्लोरेट से पालिया और लेमा को हटा दें। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत पूरे एंथर्स की तस्वीरें लें।
  6. आयोडीन धुंधला द्वारा पराग व्यवहार्यता का निरीक्षण करें।
    1. फूल एंथेसिस से पहले परिपक्व चावल स्पाइकलेट चुनें, एंथर्स को छोड़ने के लिए पालिया और लेमा को हटा दें।
    2. 6 एंथर्स लें और उन्हें एक ग्लास स्लाइड पर रखें। आसुत पानी की 1 बूंद जोड़ें, पराग कणों को छोड़ने के लिए चिमटी के साथ एंथर को अच्छी तरह से कुचलें, और फिर आई 2 -KI समाधान की2-3 बूंदेंजोड़ें। कवरस्लिप के साथ कवर करें।
    3. कम आवर्धन माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें। पराग कण रंगे काले अधिक जोरदार व्यवहार्यता दिखाते हैं, कोई रंग या पीले-भूरे रंग का रंगा अवरुद्ध या विकृत नहीं होता है।
  7. चावल एंथर का एक अर्द्ध पतला खंड प्रदर्शन
    1. विभिन्न विकास चरणों से चावल के फूलों को एफएए समाधान में ठीक करें। संग्रह बोतल के नीचे सामग्री डूबने तक जब तक सामग्री ऊतकों में प्रवेश करने की अनुमति देने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (आमतौर पर 15 मिनट) पर सामग्री को वैक्यूम करें।
    2. अगले दिन एक नए एफएए समाधान के साथ बदलें। एक बार जब सामग्री नीचे तक डूब जाए, तो 70% इथेनॉल के साथ बदलें और दीर्घकालिक उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. इथेनॉल के विभिन्न ढाल के साथ सामग्री को निर्जलित करें (70%, 80%, 30 मिनट के लिए हर बार 95%, 2 घंटे के लिए 100% इथेनॉल, 100% इथेनॉल जिसमें 2 घंटे के लिए थोड़ा सैफरानिन डाई होता है)।
      नोट: बाद में आसान सेक्शनिंग के लिए एंथर्स को रंगने के लिए दूसरे 100% इथेनॉल में थोड़ा सैफरिन डाई जोड़ें।
    4. निर्माता के निर्देश (सामग्रियों की तालिका) का पालन करके एम्बेडिंग करें। फिर, सेक्शनिंग से पहले 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में बेक करें।
    5. एक माइक्रोटॉम का उपयोग कर 2 माइक्रोन की मोटाई के लिए नमूना अनुभाग। कांच की स्लाइड पर पानी की एक बूंद डालें। फिर, संदंश द्वारा एंथर ब्लॉक युक्त पतले वर्गों को उठाएं और उन्हें स्लाइड पर पानी की बूंद की सतह पर रखें।
    6. स्लाइड्स में है पानी के स्नान पर 50 डिग्री सेल्सियस पर पूरी तरह से फैलाने के लिए वर्गों को पूरी तरह से फैलाने के लिए यह दृढ़ता से स्लाइड का पालन करते हैं ।
    7. 0.5% टोल्यूडीन ब्लू सॉल्यूशन का उपयोग करें 30 मिनट के लिए स्लाइड दाग। फिर, पानी से कुल्ला और धुएं हुड में सूखी। तटस्थ पेड़ गोंद के साथ सील। धीरे-धीरे स्लाइड पर एक कवरलिप रखें और धुएं के हुड में सूखें।
    8. माइक्रोस्कोप के नीचे नमूने का निरीक्षण और फोटोग्राफ करें।

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Representative Results

यहां प्रदर्शित जीन संपादन प्रौद्योगिकी का उपयोग करने के लिए चावल में Agrobacterium-मध्यस्थताआनुवंशिक परिवर्तन द्वारा भविष्य के अनुसंधान के लिए एक पुरुष बाँझ लाइन बनाने के लिए है । ओसाबीसीजी15की नर बाँझ रेखा बनाने के लिए, CRISPR-CAS9-मध्यस्थता वाले म्यूटेनेसिस का उपयोग बाइनरी वेक्टर निर्माण के लिए किया गया था। SgRNA OsU3 प्रमोटर द्वारा संचालित किया गया था, जबकि hSpCas9 की अभिव्यक्ति कैसेट डबल 35S प्रमोटर द्वारा संचालित किया गया था, और मध्य वेक्टर एक बाइनरी वेक्टर pCAMBIA1300 में इकट्ठे हुए थे जो चावल के एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थतास्थिर परिवर्तन के लिए डिज़ाइन किया गया था। चावल के CRISPR/Cas9-मध्यस्थता म्यूटेनेसिस के लिए उपयोग किए जाने वाले निर्माण का एक चित्रमय प्रतिनिधित्व चित्र 1 एमें प्रदान किया जाता है ।

चित्रा 2 और चित्रा 3 चावल ट्रांसजीन उत्पादन की पूरी प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करते हैं। युवा फूलों को एक्सप्लांट(चित्रा 2)के रूप में चुना गया था और NBD2 माध्यम(चित्रा 3A)पर टीका लगाने के 14 दिनों के भीतर फ्रिबल भ्रूणजनीय कॉलस (FEC) को प्रेरित किया गया था। भ्रूणीय कैली का उपयोग सीधे एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थतापरिवर्तन(चित्रा 3सी)या प्रसार के लिए उपसंस्कृति के लिए किया जाता था ताकि आगे संक्रमण(चित्रा 3 बी)के लिए अधिक कैली प्राप्त किया जा सके। अंधेरे परिस्थितियों(चित्रा 3 डी)में NBD2-AS माध्यम पर 48 घंटे के लिए सह-खेती करने के बाद, कैली को चयन माध्यम के दूसरे दौर में स्थानांतरित कर दिया गया था। 10-14 दिनों के बाद, परिवर्तित कैली ने मां कैली की परिधि पर कुछ छोटे नवगठित माइक्रोकैली को दिखाया, जबकि अअनुवादित कैली का रंग भूरे रंग में बदल गया और अंततः मर गया(चित्रा 3ई, एफ)। बाद में, स्वस्थ और मलाईदार रंग की कैली को दो बार पुनर्जनन माध्यम में स्थानांतरित कर दिया गया। इस स्तर पर, बदल कैली धीरे-धीरे हरे धब्बे (शूट कलियों)(चित्रा 3जी, एच)दिखाया। इन नए उत्पन्न हरे रंग के धब्बे एक बाँझ प्लास्टिक की बोतल में सुसंस्कृत थे जिसमें पुनर्जनन माध्यम होता है ताकि शूट ग्रोथ(चित्रा 3I)की अनुमति दी जा सके, और फिर जड़ों को प्रेरित करने के लिए 1/2 एमएस माध्यम में (ताजा शूटिंग के रूप में) स्थानांतरित कर दिया गया। बाद में, अच्छी तरह से विकसित जड़ों के साथ स्वस्थ और जोरदार बढ़ती शूटिंग(चित्रा 3J)काटा गया ।

कुल मिलाकर, 21 पुनर्जीवित रोपण प्राप्त किए गए । हाइग्रोमाइसिन क्षेत्र के लिए पीसीआर प्रवर्धन से पता चला है कि 21 में से 18 संबंधित बैंड को बढ़ा सकते हैं, यह दर्शाता है कि ये लाइनें ट्रांसजेनिक(चित्रा 4)हैं, और इसी परिवर्तन आवृत्ति लगभग 85.71%(तालिका 2)है। पीसीआर एम्प्लीक और सेंगर अनुक्रमण द्वारा लक्षित क्षेत्र में फैले प्राइमर का उपयोग करके एसजीआरएनए लक्ष्य स्थल (एस) में म्यूटेशन की पहचान करने के लिए परिवर्तनकर्ताओं को जीनोटाइप किया गया था, 18 टी0 ट्रांसजेनिक पौधों में से आठ विषम लाइनें और तीन समरूप लाइनें CRISPR-Cas9 सकारात्मक थीं, 61.11%(चित्रा 1 बी, टेबल 2)के इसी उत्परिवर्तन आवृत्तियों के साथ

होमोज़िगस नॉकआउट म्यूटेंट को बुनियादी पुरुष प्रजनन अंग अवलोकन(चित्रा 5)द्वारा मान्य किया गया था। ओसाबीसीजी15 के एंथर्स जंगली प्रकार(चित्रा 5ए, डी)की तुलना में छोटे और पालर थे, और परिपक्व पराग कणों(चित्रा 5बी, ई)का अभाव था। जंगली प्रकार की तुलना में ओसाबीसीजी15 में एंथर रूपात्मक दोषों की जांच करने के लिए ट्रांसवर्स सेक्शनिंग माइक्रोस्कोपी का प्रदर्शन किया गया था। स्टेज 10 में, जंगली प्रकार के माइक्रोस्पोर गोल आकार के हो गए और गहरे नीले रंग के दाग वाले एक्सीन(चित्रा 5C) केसाथ vacuolated हो गए । इसके विपरीत, ओसाबीसीजी15 माइक्रोस्पोर ढह गए और अवक्रमित हो गए, एंथर लोकुल(चित्रा 5F)में केवल विकृत माइक्रोस्पोर का केवल मलबा मौजूद है।

Figure 1
चित्रा 1: CRISPR/Cas9 प्रणाली के लिए जानकारी का निर्माण और OsABCG15के लक्षित mutagenesis । (क)एसजीआरएनए को ओस्यू3 प्रमोटर द्वारा संचालित किया गया था, जबकि एचएसपीसी9 की अभिव्यक्ति कैसेट डबल 35S प्रमोटर द्वारा संचालित थी; मध्य वेक्टर को चावल के एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थतास्थिर परिवर्तन के लिए डिज़ाइन किए गए एक बाइनरी वेक्टर में इकट्ठा किया गया था। (ख) ओसाबीसीजी15 जीन के दूसरे एक्सॉन में स्थित अनुक्रम (5'-AAGCACATCCCCCAAGGAT-3') को एसजीआरएनए के लक्ष्य स्थल के रूप में चुना गया था । तीन प्रकार के होमोज़िगस उत्परिवर्तन घटनाओं को CRISPR-Cas9 द्वारा जैपोनिका कल्टिवर 9522 पृष्ठभूमि में उत्पन्न किया गया था, और CRISPR-Cas9 प्रेरित उत्परिवर्तन साइटों के सेंगर अनुक्रमण क्रोमोग्राम दिखाए गए हैं। लाइन 9522ओसाबीसीजी15-1 में एकल-न्यूक्लियोटाइड (1-एनटी) 'ए' प्रविष्टि है; लाइन 9522ओसाबीसीजी15-2 में एकल-न्यूक्लियोटाइड (1-एनटी) 'जी' प्रविष्टि है; और लाइन 9522ओसाबीसीजी15-3 में एकल-न्यूक्लियोटाइड (1-एनटी) 'जी' विलोपन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कॉलस को प्रेरित करने के लिए सामग्री शुरू करना। (A)मेयोसिस स्टेज पर युवा चावल पुष्पाएं। (ख)NBD2 माध्यम पर बढ़ रही विच्छेदित युवा पुष्पकंपक । बार = 2 सेमी में (ए) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थतापरिवर्तन द्वारा ट्रांसजेनिक लाइनों के उत्पादन के लिए प्रक्रिया। (A)युवा इनफ्लोरेंस से उत्पन्न चावल कैली। (ख)कैली की उपसंस्कृति । (ग)कैली का इनक्यूबेशन ए तुमेफैपियंस के साथ ।(D) एक tumefaciens के साथ कैली की सह-खेती ।(ई)हाइग्रोमाइसिन (४० मिलीग्राम/एल) की उपस्थिति में परिवर्तित कैली का पहला चयन चक्र । (F)हाइग्रोमाइसिन (40 मिलीग्राम/एल) की उपस्थिति में परिवर्तित कैली का दूसरा चयन चक्र। (जी)बदल कैली का पहला उत्थान । (ज)संस्कृति की थाली में ग्रीन शूट प्वाइंट को देखते हुए, बदल कैली का दूसरा उत्थान । (I)शूट इंडक्शन कल्चर । (J)रूट इंडक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: पुनर्जीवित चावल रोपण की परिवर्तन आवृत्तियों का विश्लेषण। 1.5% एगरेज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद 604 बीपी टुकड़ा (1-8, 10-14, 16-20) दिखाने वाले एम्पलित पीसीआर उत्पाद ट्रांसजेनिक पॉजिटिव लाइनों का संकेत देते हैं। जिन लाइनों में टुकड़े की कमी होती है, वे अन्रांसता नहीं होती हैं (9, 15, 21), जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) नियंत्रण के समान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: जंगली प्रकार (9522) और उत्परिवर्ती 9522ओसाबीसीजी15-1 का मूलफेनोटाइपिक अवलोकन। (ए)लेम्मा और पालिया को हटाने के बाद वाइल्ड टाइप (9522) फ्लावर और(डी) 9522 ओसाबीसीजी15-1 म्यूटेंट फ्लावर। जीएल, ग्लैम; फाई, फिलामेंट; लो, लोडिक्यूल; पीआई, पिस्टिल; अनुसूचित जनजाति, पुंकेसर। (ख)मैं2-KIजंगली प्रकार (९५२२) और(ई) ९५२२osabcg15-1 लाइन से परिपक्व परागकों का धुंधला । (ग)ट्रांसवर्स सेक्शन ऑब्जर्वेशन द्वारा वाइल्ड-टाइप (9522) और(एफ) 9522ओसाबीसीजी15-1 म्यूटेंट में एंथर डेवलपमेंट का विश्लेषण। डीएमएसपी, डीरेज माइक्रोस्पोर; ई, एपिडर्मिस; एन, एंडोथेसियम; एमएसपी, माइक्रोस्पोर; टी, टेप्टम। बार = 2 मिमी में(ए)और(डी),100 माइक्रोन में(बी)और(ई),50 माइक्रोन में(सी)और(एफ)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: चावल परिवर्तन के लिए मीडिया रचनाएं। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

तालिका 2: टी0 पीढ़ी में CRISPR-Cas9 द्वारा उत्पन्न OsABCG15 के म्यूटेंट की परिवर्तन और जीन संपादन दक्षता। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कृत्रिम जेनिक पुरुष बाँझ म्यूटेंट पारंपरिक रूप से यादृच्छिक भौतिक, रासायनिक, या जैविक म्यूटेनेसिस द्वारा उत्पन्न होते हैं। यद्यपि ये शक्तिशाली तकनीकें हैं, लेकिन उनकी यादृच्छिक प्रकृति आधुनिक जीनोमिक ज्ञान की विशाल मात्रा को भुनाने में विफल रहती है जिसमें आणविक प्रजनन32में अनुरूप सुधार करने की क्षमता है। डीएनए29,33में हेरफेर और संपादन करने के लिए अपने सरल और किफायती साधनों के कारण पौधों में CRISPR-Cas9 प्रणाली का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है । इसमें पारंपरिक म्यूटेनेसिस विधियों की तुलना में समय बचाने की क्षमता है।

यहां, हमने कॉलस प्रेरण के लिए एक्सप्लांट के रूप में युवा इनफ्लोरेसेंस का उपयोग करके एक सुविधाजनक एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थतापरिवर्तन प्रणाली विकसित की। ट्रांसजीन प्रक्रिया में कुछ कदम हैं जिन्हें समय बचाने के लिए छोड़ा जा सकता है। प्रारंभिक सामग्री के रूप में युवा फूलों का उपयोग करना एक्सप्लांट के रूप में बीजों का उपयोग करने की तुलना में कॉलस प्रेरण की समग्र अवधि को कम करने के लिए एक अच्छा विकल्प है। इसके अलावा, युवा फूलों से प्राप्त कैली में सेल भेदभाव और पुनर्जनन क्षमता बहुत मजबूत होती है। इस प्रक्रिया में चावल कैली की उपसंस्कृति से बचा जा सकता है, जो अंततः समय की बचत करता है और साथ ही बैक्टीरियल और फंगल संदूषण के जोखिम को कम करता है। इसके अलावा, टाइमनटिन का उपयोग कार्बेनेसिलिन के बजाय एंटीबायोटिक के रूप में किया जाता था, जो बैक्टीरिया को बाधित करने में अधिक प्रभावी होता है।

चावल में पुरुष प्रजनन विकास के बुनियादी फेनोटाइपिक अवलोकन के लिए अध्ययन और शुरू किया गया प्रोटोकॉल स्नातक और स्नातक छात्रों के लिए उपयोगी है जो पौधे प्रजनन जीव विज्ञान में रुचि रखते हैं। इस सुविधाजनक प्रोटोकॉल को समझने के लिए जल्दी होना चाहिए और बाद के शोध अध्ययनों में उपयोग के लिए पुन: पेश किया जाना चाहिए।

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Disclosures

कोई नहीं.

Acknowledgments

लेखकों को युवा चावल inflorescences और चावल के ऊतक संस्कृति माध्यम बनाने में सहायता प्रदान करने के लिए Xiaofei चेन स्वीकार करना चाहते हैं । इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (31900611) ने सपोर्ट किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Naphthaleneacetic acid Sigma-Aldrich N0640
2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid Sigma-Aldrich D7299
6-Benzylaminopurine (6-BA) Sigma-Aldrich B3408
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
Agar Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10000561
Ammonium sulfate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10002918
Aneurine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218
Bacteriological peptone Sangon Biotech A100636
Beef extract Sangon Biotech A600114
Boric acid Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10004808
Calcium chloride dihydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20011160
Casein acid hydrolysate Beijing XMJ Scientific Co., Ltd C184
Cobalt(II) chloride hexahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10007216
Copper(II) sulfate pentahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10008218
D(+)-Glucose anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 63005518
D-sorbitol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 63011037
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate Sigma-Aldrich E5134
EOS Digital SLR and Compact System Cameras Canon EOS 700D
Formaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10010018
Fully Automated Rotary Microtome Leica Biosystems Leica RM 2265
Glacial acetic acid Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10000208
Glycine Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 62011516
Hygromycin Beijing XMJ Scientific Co., Ltd H370
Inositol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 63007738
Iodine Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011517
Iron(II) sulfate heptahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012116
Kanamycine Beijing XMJ Scientific Co., Ltd K378
Kinetin Sigma-Aldrich K0753
L-Arginine Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 62004034
L-Aspartic acid Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 62004736
L-Glutamine Beijing XMJ Scientific Co., Ltd G229
L-proline Beijing XMJ Scientific Co., Ltd P698
Magnesium sulfate heptahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10013018
Manganese sulfate monohydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10013418
Microscopes NIKON Eclipse 80i
MS Phytotech M519
Nicotinic acid Sigma-Aldrich N0765
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Potassium chloride Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10016308
Potassium dihydrogen phosphate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10017608
Potassium iodide Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10017160
Potassium nitrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 1001721933
Pyridoxine Hydrochloride (B6) Sigma-Aldrich 47862
Rifampicin Beijing XMJ Scientific Co., Ltd R501
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019718
Sodium molybdate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019816
Stereo microscopes Leica Microsystems Leica M205 A
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10021418
Technovit embedding Kits 7100 Heraeus Teknovi, Germany 14653
Timentin Beijing XMJ Scientific Co., Ltd T869
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260
Water bath for paraffin sections Leica Biosystems Leica HI1210
Yeast extract Sangon Biotech A515245
Zinc sulfate heptahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10024018

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References

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Xu, D., Mondol, P. C., Uzair, M., Tucker, M. R., Zhang, D. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice. J. Vis. Exp. (164), e61665, doi:10.3791/61665 (2020).

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