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Biology

Agrobacterium-매개 유전 변환, 트랜스 제닉 생산, 그리고 쌀에서 남성 생식 개발의 연구에 대 한 그것의 응용 프로그램

Published: October 6, 2020 doi: 10.3791/61665
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 1,3
1Joint International Research Laboratory of Metabolic and Developmental Sciences, Shanghai Jiao Tong University-University of Adelaide Joint Centre for Agriculture and Health, School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 2College of Agronomy, Anhui Agricultural University, Heifei, China, 3School of Agriculture, Food and Wine, University of Adelaide
* These authors contributed equally

Summary

이 작품은 CRISPR-Cas9 게놈 편집 기술을 사용하여 내인성 유전자 OsABCG15를 녹아웃한 다음 수정된 Agrobacterium-매개변환 프로토콜을 사용하여 쌀에서 안정적인 남성 멸균 라인을 생성합니다.

Abstract

남성 멸균은 일반적으로 남성 생식 기관/게임테의 기능적 결함을 특징으로 하는 하이브리드 종자 생산을 위한 중요한 농업 특성입니다. CRISPR-Cas9 게놈 편집 기술의 최근 발전은 특정 사이트에서 내인성 후보 유전자의 높은 편집 효능 및 시간 절약 녹아웃 돌연변이를 허용합니다. 또한, 쌀의 아그로박테리움-중재된유전적 변화는 또한 많은 공공 및 민간 실험실에서 널리 채택된 유전자 변형을 위한 중요한 방법입니다. 이 연구에서는 CRISPR-Cas9 게놈 편집 도구를 적용하고 japonica 품종에서 OsABCG15의 표적 게놈 편집을 통해 3개의 남성 멸균 돌연변이 라인을 성공적으로 생성했습니다. 우리는 쌀에서 하이브리드 종자 생산을위한 유전 방출의 우수한 수단을 제공 할 수있는 수정 된 Agrobacterium-매개 쌀 변환 방법을 사용했다. 형질전환 식물은 2-3개월 이내에 얻을 수 있으며, 동종변성 변압제는 PCR 증폭 및 Sanger 시퀀싱을 사용하여 유전자를 사용하여 스크리닝하여 스크리닝하였다. 남성 멸균 균성 라인의 기본 피노티픽 특성화는 쌀 남성 생식 기관의 현미경 관찰에 의해 수행되었으며, 요오드 칼륨 요오드 (I2-KI)에 의한 꽃가루 생존 가능성 분석에 의해 개발 중인 멸균의 반 박형 단면화를 염색하였다.

Introduction

쌀은 특히 개발도상국에서 가장 중요한 식품 작물이며, 전 세계 인구의 절반 이상을 위한 주식 식품입니다. 전체적으로 쌀알에 대한 수요가 증가하고 있으며 2030년까지 50%, 2050년1,2에100% 증가할 것으로 예상됩니다.1 쌀 수율의 향후 개선은 쌀을 단장 식물 연구를위한 훌륭한 모델로 만드는 다양한 분자 및 유전 자원을 활용해야합니다. 여기에는 효율적인 변환 시스템, 고급 분자 맵 및 표현된 시퀀스 태그의 공개적으로 액세스할 수 있는 데이터베이스가 포함되며, 이는 수년 동안 생성된3,,4. 작물 수확량을 개선하기 위한 한 가지 전략은 하이브리드 종자 생산5이며,그 중 핵심 요소는 남성 다산을 조작하는 기능입니다. 시리얼 작물에서 남성 다산의 분자 제어를 이해 하이브리드 종자 생산을 개선 하 고 작물 생산성 향상 을 위해 실용적인 기술로 주요 지식을 번역 하는 데 도움이 될 수 있습니다6,,7.

유전자 변환은 작물 식물에 있는 외국 유전자의 소개 또는 내인성 유전자의 조작을 가능하게 하고, 유전자 변형 선의 생성귀착되기 때문에 기본적인 연구 및 상업적 농업을 위한 중요한 공구입니다. 적절한 변형 프로토콜은 유전자 조절8의근본적인 이해를 위한 유전 및 분자 생물학 연구를 가속화하는 데 도움이 될 수 있다. 박테리아에서, 유전 변환은 자연적으로 일어난다; 그러나, 식물에서는 분자 생물학 기법9,,10을사용하여 인위적으로 수행된다. Agrobacterium tumefaciens는 T-DNA를 전송하여 식물에 크라운 담즙 질환을 일으키는 토양 매개, 그램 음성 박테리아, T-DNA의 영역, 유형 IV 분비 시스템을 통해 식물 세포로11,,12. 식물에서, A. tumefaciens-매개변환은 숙주 게놈(13)으로 T-DNA의 안정적이고 낮은 복사13수 통합으로 유도되기 때문에 유전자 변형을 위한 광범위한 방법으로 간주됩니다. 트랜스제닉 쌀은 1990년대 중반 자포니카 품종14에서 아그로박테리움-중재유전자변환을 통해 처음 생성되었다. 이 프로토콜을 사용하여 변환 효율이 10%-30%인 4개월 이내에 여러 트랜스제닉 라인을 획득했습니다. 연구 결과는 성공적인 변환을 위한 2개의 중요한 단계가 있다는 것을 표시했습니다: 하나는 성숙한 씨앗에서 배아 원소의 유도이고 다른 하나는 식물14,,15에서더 높은 변환 효율성을 허용하는 공동 재배 도중 세균 문화에 아세토시링곤, 페놀 화합물의 추가입니다. 이 프로토콜은 japonica16,17,,,18,,19뿐만 아니라 인디카,20,21,22, 23및 열대 japonica23 ,24,,25와같은 다른 품종에서 사소한 변경으로 광범위하게 사용되었습니다., 실제로, 쌀 변환을 설명하는 기사의 80% 이상이 Agrobacterium-매개유전자 변환을 도구로사용한다(13). 현재까지, 여러 유전자 변형 프로토콜은,쌀 씨를 서두유도16,17,,18,19의시작 재료로 사용하여 개발되었다., 그러나, 거의 콜러스 생산을위한 흥분으로 젊은 꽃에 대해 알려져있다. 전반적으로 기능성 유전체학 및 작물 개선에 대한 연구를 위한 신속하고 재현 가능하며 효율적인 유전자 변환 및 재생 프로토콜을 확립하는 것이 중요합니다.

최근 몇 년 동안 CRISPR-Cas9 기술의 발전은 유전자 기능을 이해하고 식물 사육26,,27에대한 농업적으로 중요한 개선을 제공하는 정밀한 게놈 편집 메커니즘을 초래했다. CRISPR은 또한 남성 생식 개발 및 하이브리드 생산의 조작에 대한 상당한 약속을 제공합니다. 이 연구에서는 CRISPR-Cas9 기술을 이용한 유전자 녹아웃 시스템을 활용하여 젊은 꽃식물을 사용하여 효율적인 쌀 유전자 변형 프로토콜에 결합하여 생식 발달 연구를 위한 안정적인 남성 멸균 선을 생성했습니다.

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Protocol

1. sgRNA-CAS9 플랜트 발현 벡터 시공 및 아그로박테리움-중재된변환

  1. 발표된문헌(28)에따라 쌀에 남성 멸균 유전자 OsABCG15를 표적으로 한다.
  2. OsABCG15의 두 번째 엑소에서 106-125 bp 사이에 위치한 표적 부위에 대한 sgRNA설계(그림 1).
  3. T4 폴리뉴클레오티드 키나아제는 sgRNA 올리고(sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGAT3' 및 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGATGTGCTT')를 합성합니다.
  4. endonuclease BbsI를 사용하여 psgR-Cas9 백본벡터(29)를소화한다.
  5. 제조업체의 프로토콜에 따라 T4 리구아제를 사용하여 선형화된 psgR-Cas9 백본으로 합성된 sgRNA 올리고를 리게이트합니다.
  6. 힌드III/에코리를 사용하여, sgRNA 카세트를 1단계에서 1.5단계로부터 소화하고 pCAMBIA1300 바이너리 벡터의 힌드III/에코리 부위로 서브클론을 소화하여 안정적인변환(29)을한다.
  7. 효소 소화 및 염열에 의해 생성된 플라스미드를 확인합니다. 나중에, 이진 구조를 Agrobacterium tumefaciens 균주 EHA105로 변환하고 2-3 일 동안 28 °C에서 칸 / 리프 선택 플레이트에 성장한다.

2. 쌀 유전 적 변형 및 식물 조직 배양

  1. 캘러스 유도 및 재생
    참고: 신선한 젊은 쌀 꽃집을 시동재료로 사용하여 캘러스(그림2)를유도합니다.
    1. 1.6-4.8 mm(그림 2A)29의꽃 길이에 의해 결정 된 meiosis 단계에서 논 또는 녹색 집에서 젊은 꽃집을 수집합니다. 쌀 꽃피는 잎 칼집으로 덮여 있는지 확인합니다. 70% 알코올 면봉으로 각 꽃집을 닦고 절단하기 전에 건조하게 하십시오.
    2. 깨끗한 멸균 벤치에 꽃을 가져옵니다. 살균 된 가위로 작은 조각 (더 작은 것)으로 자른 다음 절단을 NBD2 배지(그림 2B, 표 1)가함유 된 페트리 플레이트로 옮겨넣습니다.
    3. 약 10-14일 동안 26°C에서 어둠 속에서 플레이트를 배양하여 캘러스(도3A)를유도한다.
      참고: 새로 형성된 콜러스를 Agrobacterium 침투(단계 2.2.7)에 직접 사용하거나 신선한 NBD2 배지에서 한 번 더 재조정하여 더 많은 callus를 얻습니다. 8-10일마다 캘러스를 새로운 NBD2 매체로 전송합니다.
  2. 변환 및 공동 재배
    1. 변형을 위해 1.6 단계에서 이진 플라스미드를 함유한 A. tumefaciens 박테리아를 사용한다. A. tumefaciens 균주를 YEB배지(표 1)에저장하여 -80°C에서 글리세롤을 50% 저장합니다.
    2. -80°C 글리세롤 스톡에서 선택적항생제(표 1)를함유한 YEB 천 배지로 줄무늬 A. 투메파시엔스는 48-72h에 대해 25-28°C로 성장하여 식민지가 나타날 수 있도록 한다.
    3. 50mL 원추형 멸균 시험관에서 동일한 선택적항생제(표 1)를함유하는 액체 YEB 배지의 5mL에 선택적 항생제를 가진 YEB 플레이트로부터 단일 콜로니를 접종한다. 박테리아가 0.5의 OD 600으로 성장할 때까지 250 x g에서600 궤도 셰이커를 흔들어 25-28 °C에서 흔들어주세요.
    4. 250mL 원추형 플라스크에서 동일한 선택적 항생제를 가진 YEB배지(표 1)의100mL에 세균현탁액 1mL을 넣고 250 x g에서궤도 셰이커를 흔들어 4h에 28°C로 흔들어 줍니다.
    5. 심열기4,000 x g에서 10 분 동안 실온에서 박테리아를 수집합니다. 상부체를 폐기합니다.
    6. AAM-AS배지(표 1)로세균펠릿을 재연하고 현탁액을 OD600 = 0.4로 희석한다.
      참고: 세균 현탁액의 완벽한 OD는 효율적인 변환에 매우 중요합니다. 그것은 callus에 과잉 세균성 성장을 제거에 도움이.
    7. 약 150mL 멸균 플라스크로 단계 2.1.3에서 약 150 건강한 성장하는 밝은 노란색 연약한 배아 성 칼리를 수집합니다. 50-75mL 세균세포 현탁액을 멸균 플라스크에 2.6단계부터 추가한 다음, 10-25mL의 신선한 AAM-AS 배지를 추가하여 10-20분 동안 칼리를 담그고 가끔 흔들어 줍니다.
    8. 플라스크에서 세균 현탁액을 조심스럽게 붓고 멸균 필터 용지 #1 또는 티슈 페이퍼를 사용하여 캘러스에서 과도한 세균 현탁액을 건조시라. 그런 다음 멸균 필터 종이로 덮인 NBD-AS매체(표 1)로페트리 접시에 #1 놓습니다. 3 일 동안 어둠 속에서 25-28 °C에서 배양하고 세균 성 과성장을 확인합니다.
  3. 내성 콜러스 선택
    1. 3일간의 공동 재배 후, 멸균 필터 용지를 사용하여 멸균 페트리 접시에 칼리를 옮기.
    2. 깨끗한 벤치에서 2 시간 동안 칼리를 공기 건조시하십시오. 캘러스가 필터 용지에 부착되지 않았는지 확인합니다.
    3. 1차 선택 매체 NBD2(40 mg/L hygromycin 및 250 mg/L timentin)(표1)로멸균 트위저를 사용하여 캘리를 균등하게 전송한다. 어둠 속에서 25-28 °C에서 2 주 동안 컬쳐 칼리.
    4. 후 2 주, 신선한 선택 매체 NBD2를 포함하는 새로운 플레이트에 고르게 전송 캘리 (와 40 mg/L hygromycin 및 250 mg/L timentin)(표 1). 어둠 속에서 25-28 °C에서 또 다른 2 주 동안 칼리를 문화합니다.
  4. 캘러스 차별화
    1. 신선한 MS 매체로 캘러스를 전송 (와 25 mg/L hygromycin 및 150 mg/L timentin)(표 1). 약 2 주 동안 25-28 °C에서 빛 아래 배양.
    2. 2.4.1 단계를 한 번 더 반복합니다.
    3. 촬영 싹을 새로운 MS 매체(10 mg/L hygromycin)로 전송하여 더 많은 촬영을 증식합니다.
  5. 루트 유도
    1. 새로운 촬영은 1/2 MS매체(표 1)로전송합니다. 25 °C - 28 °C에서 빛 아래 배양. 변형 된 식물은 2 주 이내에 뿌리를 생산합니다.
    2. 1 주 후, 탈수 방지하기 위해 식물을 덮고 깨끗한 냄비에 식물을 전송합니다.

3. 유전자형 식별

  1. 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB) 방법을 이용하여 총 DNA 추출을 위해 새로 생성된 식물로부터 어린 잎을채집한다(31)
  2. 유전체 DNA를 템플릿으로 사용하여, 프라이머(Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATTATT 3' 및 히그로마이신-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTCA 3' 하이그로마이신 지역에 위치) 중합체 연쇄 반응(PCR)을Figure 4선택하여 중합체 연쇄 반응(PCR)을 수행하여 4가지 유전자 통합을 검증한다. 다음 PCR 조건: 5 분 동안 94 °C; 36 사이클 (30 s에 대 한 94°C; 30 s에 대 한 56°C; 1 분 동안 72°C); 72 °C7 분. 성공적인 PCR 반응은 604 bp 앰플리턴을 생성합니다.
  3. 특정 프라이머(OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTTTCT 3'와 OsABCGG15-ID-R: 5'TTGGTGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACATTGCTAT 3')를 사용하여 CRISPR 표적 사이트를 둘러싼 게놈 영역을 증폭시키기 위해 다른 PCR을 수행합니다. PCR 조건은 3.2단계와 동일합니다.
  4. Sanger 시퀀싱을 위해 3.3 단계에서 PCR 단편을 사용하여 돌연변이를 식별합니다.

4. 돌연변이의 기본 표현형을 준수

  1. I2-KI용액 준비: 10mL의 증류수에 KI(요오드 칼륨)를 2g을 녹인 다음 I 2(재서브요오드)의 0.2 g를 추가합니다.2 혼합 후 총 부피를 증류수와 함께 100mL로 가져옵니다.
  2. FAA 용액(63% 무수성 에탄올, 빙하 아세트산 5%, 포름알데히드 5%, 물 27%)을 준비하고 사용하기 전에 섞는다.
  3. 0.5% Toluidine 블루 스테인닝 솔루션을 준비: 100mL의 증류수에 톨루이딘 블루 0.5g을 녹입니다.
  4. 디지털 카메라로 전체 식물을 이미징하여 식물학적 현상 관찰을 수행합니다.
  5. 생식 표현형 관찰을 수행하고, 꽃에서 팔레아와 뢰마를 제거합니다. 스테레오 현미경으로 전체 anthers의 사진을 찍습니다.
  6. 요오드 염색에 의해 꽃가루 생존가능성을 관찰하십시오.
    1. 꽃 무신 전에 성숙한 쌀 스파이크를 선택하고, 팔레아와 뢰마를 제거하여 마취자를 방출합니다.
    2. 6 개의 anther를 가져 와서 유리 슬라이드에 놓습니다. 증류수 1방울을 넣고 핀셋으로 앤터를 잘 부수고 꽃가루 곡물을 방출한 다음 I2-KI용액2-3방울을 추가합니다. 커버 슬립으로 덮습니다.
    3. 낮은 배율 현미경에서 관찰하십시오. 검은 색으로 염색된 꽃가루 곡물은 더 활발한 생존력을 나타내며, 염색된 색상이나 황갈색은 기절하거나 퇴화되지 않습니다.
  7. 쌀 앤서의 반 박면 부분을 수행
    1. 다양한 개발 단계의 쌀 꽃을 FAA 솔루션으로 수정합니다. 재료가 수집 병의 바닥으로 가라 앉을 때까지 고정이 조직에 침투 할 수 있도록 4 ° C (일반적으로 15 분)에서 재료를 진공 청소기.
    2. 다음 날 새로운 FAA 솔루션으로 교체하십시오. 재료가 바닥에 가라앉으면 70 % 에탄올로 교체하고 4 °C에서 저장하여 장기간 사용하십시오.
    3. 에탄올의 다른 그라데이션으로 재료를 탈수 (70%, 80%, 95% 30 분 동안 매번, 2 h에 대한 100 % 에탄올, 2 h에 대한 사프란 염료의 조금을 포함하는 100 % 에탄올).
      참고: 두 번째 100% 에탄올에 사프란 염료를 약간 추가하여 마취제에 색상을 추가하여 나중에 쉽게 단면할 수 있습니다.
    4. 제조업체의 지시(재료 표)를 따라 포함 작업을 수행합니다. 그런 다음 단면화 하기 전에 48 시간 동안 60 °C에서 오븐에서 구우습니다.
    5. 마이크로토메를 사용하여 샘플을 2 μm두께로 섹션화합니다. 유리 슬라이드에 물 한 방울을 추가합니다. 그런 다음, 집게에 의해 개미 블록을 포함하는 얇은 섹션을 선택하고 슬라이드에 물 방울의 표면에 넣어.
    6. 슬라이드를 50°C의 수조에 놓고 단면을 완전히 분산하여 슬라이드에 단단히 부착합니다.
    7. 0.5% toluidine 블루 용액을 사용하여 슬라이드를 30 분 동안 얼룩지게하십시오. 그런 다음 물로 헹구고 연기 후드에서 건조시다. 중립 나무 접착제로 밀봉하십시오. 슬라이드에 커버슬립을 부드럽게 놓고 연기 후드에 건조시다.
    8. 현미경으로 샘플을 관찰하고 촬영합니다.

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Representative Results

여기에 입증 된 유전자 편집 기술은 쌀에 있는 Agrobacterium-매개 유전 변환에 의하여 미래 연구를 위한 남성 멸균 선을 만드는 것입니다. osabcg15의남성 멸균 라인을 생성하기 위해 CRISPR-CAS9 매개 돌연변이 발생은 이진 벡터 구조에 사용되었다. sgRNA는 OsU3 프로모터에 의해 구동된 반면, hSpCas9의 발현 카세트는 이중 35S 프로모터에 의해 구동되었고, 중간 벡터는 아그로박테리움을위해 설계된 단일 바이너리 벡터 pCAMBIA1300으로 조립되었다-쌀의 안정적인 변형을 중재하였다. 쌀의 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이 발생에 사용되었던 구조의 그래픽 표현이 도 1A에제공됩니다.

도 2 및 도 3은 쌀 유전자 생산의 전체 절차를 나타낸다. 젊은 꽃피는 CBD2배지(도3A)에접종된 후 14일 이내에 절박한 배아원(FEC)을 발동하고, 경박성 배아유발 캘러스(FEC)로 선택되었다. 배아성 캘리는 추가 감염을 위해 더 많은 칼리를 얻기 위해 증식을 위한 Agrobacterium-매개변환(도 3C)또는 하위 배양에 직접 사용되었다(도3B). 어두운 조건에서 NBD2-AS 배지에서 48h를 공동 육성한후(도 3D)칼리는 2차 선발 매체로 이동하였다. 10-14일 후, 변형된 칼리는 모성 칼리의 주변에 새로 형성된 작은 마이크로칼리를 보였고, 변형되지 않은 칼리의 색은 갈색으로 변해 결국사망했다(그림 3E,F). 나중에, 건강하고 크리미한 색깔의 칼리는 재생 매체로 두 번 전송되었다. 이 단계에서 변형 된 칼리는 점차 녹색 반점 (싹)(그림3G, H)을보였습니다. 새로 생성된 녹색 반점은 재생 매체를 함유한 멸균 플라스틱 병에 배양되어 촬영 성장을 가능하게하였다(도 3I),그리고 뿌리를 유도하기 위해 1/2 MS 매체로 (신선한 싹으로) 이동하였다. 나중에, 잘 발달 된 뿌리와 건강하고 활발한 성장 싹을 수확했다(그림 3J).

총 21마리의 재생된 묘목을 얻었다. hygromycin 영역에 대한 PCR 증폭은 21개 중 18개가 해당 대역을 증폭할 수 있음을Figure 4보여주었으며, 이는 이러한 대사가 형질(도 4)이며, 해당 변환 주파수는 약 85.71%(표2)이다. 상기 변압제는 PCR 앰플리코와 생거 시퀀싱에 의해 표적 부위에 걸쳐 프라이머를 이용하여 sgRNA 표적 부위에서 돌연변이를 규명하기 위해 유전자형이 었으며, 18T0 형질화 식물 중, 8개의 이종구선 및 3개의 호질구선은 CRISPR-Cas9 양성, 61.1%의 돌연변이 주파수(표 61.1)를 나타냈다.Figure 1B Table 2

상동성 녹아웃 돌연변이는 기본적인 남성 생식 기관관찰(도 5)에의해 검증되었다. osabcg15의 anthers는 야생형(도5A,D)보다작고 창백했으며 성숙한 꽃가루곡물(그림 5B, E)이부족했다. 횡방향 편면 현미경 검사는 야생 유형에 비해 osabcg15에서 항미 형태 결함을 조사하기 위해 수행되었다. 10단계에서 야생형 마이크로포기는 둥근 모양으로 되어 진한 파란색 으로 얼룩진 엑신(그림5C)으로비우게 되었다. 대조적으로, osabcg15 마이크로포어가 붕괴되고 저하되고, 퇴화된 미세스포어의 파편만이 앤더 로큘러(그림5F)에존재한다.

Figure 1
그림 1: CRISPR/Cas9 시스템에 대한 정보를 구성하고 OsABCG15의표적 돌연변이 발생을 목표로 한다. (A)sgRNA는 OsU3 프로모터에 의해 구동된 반면, hSpCas9의 발현 카세트는 이중 35S 프로모터에 의해 구동되었다; 중간 벡터는 아그로박테리움을위해 설계된 단일 바이너리 벡터로 조립되었다-쌀의 안정적인 변환을 중재하였다. (B) OsABCG15 유전자의 제2 엑소에 위치한 서열(5'-AAGCACATCCTCAAGGGAT-3')은 sgRNA의 표적 부위로 선택되었다. 3가지 유형의 호모자구스 돌연변이 발생은 자포니카 품종 9522 배경에서 CRISPR-Cas9에 의해 생성되었으며, CRISPR-Cas9 유도 돌연변이 부위의 샹거 시퀀싱 크로마토그램이 나타났다. 라인 9522osabcg15-1은 단일 뉴클레오티드(1-nt) 'A' 삽입; 라인 9522osabcg15-2는 단일 뉴클레오티드(1-nt) 'G' 삽입; 및 라인 9522osabcg15-3은 단일 뉴클레오티드(1-nt) 'G' 삭제를 가한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 콜러스 유도를 위한 시작 재료입니다. (A)메이오시스 단계에서 젊은 쌀 꽃피는. (B)NBD2 배지에서 자라는 젊은 꽃봉기. 바 = 2cm (A). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: Agrobacterium-매개변환에 의해 형질 전환선을 생성하는 절차. (A)젊은 꽃에서 생성 된 쌀 칼리. (B)칼리의 서브컬쳐. (C) A. tumefaciens와 칼리의 인큐베이션.(D) A. tumefaciens와 칼리의 공동 재배.(E)Hygromycin의 존재에 변형 된 칼리의 첫 번째 선택 주기 (40 mg/L). (F)히그로마이신(40 mg/L)의 존재 속에서 변형된 칼리의 두 번째 선택 주기. (G)변형 된 칼리의 첫 번째 재생. (H)배양판의 녹색 촬영 지점을 지적하여 변형 된 칼리의 두 번째 재생. (I)촬영 유도 문화. (J)뿌리 유도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 재생된 쌀 모종의 변형 주파수 분석. 증폭된 PCR 제품은 1.5% 아가로즈 겔 전기포고후 604bp 단편(1-8, 10-14, 16-20)을 나타내며 형질성 양성선을 나타낸다. 단편이 없는 선은 야생형(WT) 컨트롤과 유사하게 변형되지 않은(9, 15, 21)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 야생형(9522) 및 돌연변이 9522osabcg15-1의기본 표현관찰. (A)야생형(9522) 꽃과(D) 9522osabcg15-1 돌연변이 꽃은 렘마와 팔레아를 제거한 후. gl, 글루메; fi, 필라멘트; 로, 로디쿨; 파이, 피스틸; 세인트, 스타멘. (B)야생형(9522)으로부터 성숙한 꽃가루 곡물의2-KI염색 및(E) 9522osabcg15-1 라인. (C)횡단구간 관찰에 의한 야생형(9522)과(F) 9522osabcg15-1 돌연변이체에서 의 미테르 발달분석. DMsp, 퇴화 된 미세 포자; E, 표피; 엔, 내도시움; Msp, 현미경; T, 테이텀. 바 = 2mm in(A)및(D),100 μm(B)및(E),50 μm(C)및(F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 쌀 변환을 위한 미디어 컴포지션. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: T0 세대의 CRISPR-Cas9에 의해 생성된 OsABCG15의 돌연변이의 변환 및 유전자 편집 효율. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

인공 유전자 남성 멸균 돌연변이는 전통적으로 무작위 물리적, 화학적, 또는 생물학적 돌연변이발생에 의해 생성됩니다. 이들은 강력한 기술이지만, 그들의 무작위 자연은 분자사육32에있는 맞춤형 개선을 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있는 현대 유전체 지식의 광대 한 양을 활용하지 못합니다. CRISPR-Cas9 시스템은 DNA29,,33을조작하고 편집하는 간단하고 저렴한 수단으로 인해 식물에서 널리 사용되어 왔습니다. 그것은 전통적인 돌연변이 발생 방법에 비해 시간을 절약 할 수있는 잠재력을 가지고.

여기에서, 우리는 callus 유도를 위한 병으로 젊은 꽃식물을 사용하여 편리한 Agrobacterium-매개변환 시스템을 개발했습니다. 시간을 절약하기 위해 생략 할 수있는 트랜스진 절차에몇 가지 단계가 있습니다. 시작 재료로 젊은 꽃식물을 사용하는 것은 절삭씨앗을 절개로 사용하는 것과 비교하여 캘러스 유도의 전반적인 지속 시간을 최소화하는 것이 좋습니다. 또한, 세포 분화 및 재생 능력은 젊은 꽃에서 얻은 칼리에서 매우 강하다. 이 과정에서 쌀 칼리의 하위 배양을 피할 수 있으며, 결국 시간을 절약할 뿐만 아니라 세균 및 곰팡이 오염의 위험을 줄입니다. 더욱이, timentin 대신 카베니실린의 항생제로 사용 되었다, 박테리아를 억제에 더 효과적이다.

쌀에서 남성 생식 발달의 기본적인 현상 관측을 위한 연구 결과 그리고 소개된 프로토콜은 식물 생식 생물학에 관심이 있는 학부 및 대학원생을 위해 유용합니다. 이 편리한 프로토콜은 후속 연구 연구에서 사용하기 위해 빠르고 재현해야합니다.

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Disclosures

없음.

Acknowledgments

저자는 샤오페이 첸이 쌀 조직 배양 배지를 만드는 데 있어 젊은 쌀 꽃가루와 도움을 제공한 것에 대해 인정하고 자합니다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31900611)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Naphthaleneacetic acid Sigma-Aldrich N0640
2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid Sigma-Aldrich D7299
6-Benzylaminopurine (6-BA) Sigma-Aldrich B3408
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
Agar Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10000561
Ammonium sulfate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10002918
Aneurine hydrochloride Sigma-Aldrich T4625
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218
Bacteriological peptone Sangon Biotech A100636
Beef extract Sangon Biotech A600114
Boric acid Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10004808
Calcium chloride dihydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20011160
Casein acid hydrolysate Beijing XMJ Scientific Co., Ltd C184
Cobalt(II) chloride hexahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10007216
Copper(II) sulfate pentahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10008218
D(+)-Glucose anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 63005518
D-sorbitol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 63011037
EDTA, Disodium Salt, Dihydrate Sigma-Aldrich E5134
EOS Digital SLR and Compact System Cameras Canon EOS 700D
Formaldehyde Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10010018
Fully Automated Rotary Microtome Leica Biosystems Leica RM 2265
Glacial acetic acid Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10000208
Glycine Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 62011516
Hygromycin Beijing XMJ Scientific Co., Ltd H370
Inositol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 63007738
Iodine Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011517
Iron(II) sulfate heptahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012116
Kanamycine Beijing XMJ Scientific Co., Ltd K378
Kinetin Sigma-Aldrich K0753
L-Arginine Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 62004034
L-Aspartic acid Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 62004736
L-Glutamine Beijing XMJ Scientific Co., Ltd G229
L-proline Beijing XMJ Scientific Co., Ltd P698
Magnesium sulfate heptahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10013018
Manganese sulfate monohydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10013418
Microscopes NIKON Eclipse 80i
MS Phytotech M519
Nicotinic acid Sigma-Aldrich N0765
Phytagel Sigma-Aldrich P8169
Potassium chloride Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10016308
Potassium dihydrogen phosphate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10017608
Potassium iodide Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10017160
Potassium nitrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 1001721933
Pyridoxine Hydrochloride (B6) Sigma-Aldrich 47862
Rifampicin Beijing XMJ Scientific Co., Ltd R501
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019718
Sodium molybdate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019816
Stereo microscopes Leica Microsystems Leica M205 A
Sucrose Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10021418
Technovit embedding Kits 7100 Heraeus Teknovi, Germany 14653
Timentin Beijing XMJ Scientific Co., Ltd T869
Toluidine Blue O Sigma-Aldrich T3260
Water bath for paraffin sections Leica Biosystems Leica HI1210
Yeast extract Sangon Biotech A515245
Zinc sulfate heptahydrate Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10024018

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References

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이번 달 조브 호브 호 제 164 쌀 CRISPR-Cas9 아그로박테리움,callus 조직 배양 유전자형 표현형 앤테르 꽃가루
<em>Agrobacterium</em>-매개 유전 변환, 트랜스 제닉 생산, 그리고 쌀에서 남성 생식 개발의 연구에 대 한 그것의 응용 프로그램
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Xu, D., Mondol, P. C., Uzair, M., Tucker, M. R., Zhang, D. Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice. J. Vis. Exp. (164), e61665, doi:10.3791/61665 (2020).

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