Summary
Bu çalışma, CRISPR-Cas9 genom düzenleme teknolojisinin nakavt endojen gen OsABCG15'e ve ardından pirinçte istikrarlı bir erkek steril çizgi üretmek için modifiye edilmiş Agrobacteriumaracılı dönüşüm protokolüne kullanımını açıklamaktadır.
Abstract
Erkek kısırlığı genellikle erkek üreme organları / gametfonksiyonel kusurları ile karakterize melez tohum üretimi için önemli bir tarımsal özelliktir. CRISPR-Cas9 genom düzenleme teknolojisindeki son gelişmeler, belirli bölgelerde ki endojen aday genlerin yüksek düzenleme etkinliği ve zaman kazandıran nakavt mutasyonlarına olanak sağlar. Ayrıca, Pirinç Agrobacteriumaracılı genetik dönüşüm de yaygın birçok kamu ve özel laboratuvarlar tarafından kabul edilmiştir gen modifikasyonu için önemli bir yöntemdir. Bu çalışmada CRISPR-Cas9 genom düzenleme araçlarını uyguladık ve OsABCG15'in japonica çeşitlerinde hedeflenen genom düzenlemesi ile üç erkek steril mutant hattını başarıyla oluşturduk. Biz pirinç hibrid tohum üretimi için genetik emasculation mükemmel bir araç sağlayabilir değiştirilmiş Bir Agrobacteriumaracılı pirinç dönüşüm yöntemi kullanılır. Transgenik bitkiler 2-3 ay içinde elde edilebilir ve homozigot transformantlar PCR amplifikasyon ve Sanger dizilimi kullanılarak genotipleme ile tarandı. Erkek steril homozigot çizginin temel henotik karakterizasyonu pirinç erkek üreme organlarının mikroskobik gözlemi, polen canlılık analizi iyot potasyum iyodür (I2-KI) ile yapıldı.
Introduction
Pirinç, özellikle gelişmekte olan ülkelerde en önemli gıda mahsulüdür ve dünya nüfusunun yarısından fazlası için bir temel gıda temsil eder. Genel olarak, pirinç tanesi için talep büyüyor ve 2030 yılına kadar% 50 ve 205011,2%100 artırmak için tahmin edilmektedir. Pirinç veriminde gelecekteki iyileştirmeler, pirinci monocotyledonous bitki araştırmaları için mükemmel bir model haline getiren çeşitli moleküler ve genetik kaynaklardan yararlanmak zorunda kalacaktır. Bunlar arasında etkin bir dönüşüm sistemi, gelişmiş moleküler harita ve uzun yıllar boyunca oluşturulmuş olan ifade edilmiş sıra etiketleri3,,4'üngenel olarak erişilebilir veritabanı bulunmaktadır. Bir strateji ürün verimi artırmak için hibrid tohum üretimi5, hangi erkek doğurganlık işlemek için yeteneği olan merkezi bir unsurdur. Tahıl bitkileri erkek doğurganlık moleküler kontrol anlamak hibrid tohum üretimini artırmak ve bitki verimliliğini artırmak için pratik teknikler içine anahtar bilgi çevirmek için yardımcı olabilir6,7.
Genetik dönüşüm, yabancı genlerin tanıtılmasına veya ekin bitkilerinde endojen genlerin manipülasyonuna olanak sağladığı ve genetiği değiştirilmiş çizgilerin üretilmesiyle sonuçlandığından temel araştırma ve ticari tarım için önemli bir araçtır. Uygun bir dönüşüm protokolü gen regülasyonu nun temel anlaşılması için genetik ve moleküler biyoloji çalışmalarının hızlandırılmasına yardımcı olabilir8. Bakterilerde genetik dönüşüm doğal olarak gerçekleşir; ancak, bitkilerde, yapay moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak yapılır9,10. Agrobacterium tumefaciens t-DNA aktararak bitkilerde taç safra hastalığına neden olan bir toprak kaynaklı, Gram-negatif bakteri, onun Ti plazmid bir bölge, bir tip IV salgı sistemi ile bitki hücresine11,12. Bitkilerde, A. tumefaciens-aracılı dönüşüm gen modifikasyonu için yaygın bir yöntem olarak kabul edilir çünkü konak genom13içine T-DNA kararlı ve düşük kopya sayısı entegrasyonu yol açar. Transgenik pirinç ilk olarak 1990'ların ortalarında japonica çeşitleri14'te Agrobacteriumaracılı gen dönüşümü ile üretildi. Bu protokol kullanılarak 4 aylık bir süre içinde %10-30 oranında dönüşüm verimi ile çeşitli transgenik hatlar elde edilmiştir. Çalışma, başarılı dönüşüm için iki kritik adım olduğunu göstermiştir: biri olgun tohumlardan embriyojenik nasır indüksiyonu ve diğeri de bitkilerde daha yüksek dönüşüm verimliliği sağlayan birlikte ekimi sırasında bakteri kültürüne fenolik bir bileşik olan asetozipon eklenmesidir14,15. Bu protokol yaygın japonica16,17,,18,19 yanı sıra indica20,21,,22,,23 ve tropikal japonica24,25gibi diğer çeşitleri küçük değişiklikler ile kullanılmıştır. Nitekim, pirinç dönüşümünü açıklayan makalelerin% 80'den fazla bir araç olarak Agrobacteriumaracılı gen dönüşümü13kullanın. Bugüne kadar, birkaç genetik dönüşüm protokolleri nasır indüksiyon16,17,,18,19için bir başlangıç malzemesi olarak pirinç tohumu kullanılarak geliştirilmiştir. Ancak, çok az nasır üretimi için eksplandan olarak genç çiçeklenme hakkında bilinmektedir. Genel olarak, fonksiyonel genomik ve mahsul geliştirme çalışmaları için hızlı, tekrarlanabilir ve verimli bir gen dönüşümü ve rejenerasyon protokolü oluşturmak önemlidir.
Son yıllarda, CRISPR-Cas9 teknolojisinin ilerlemesi gen fonksiyonunu anlamak ve bitki ıslahı için tarımsal olarak önemli iyileştirmeler sunmak için hassas bir genom düzenleme mekanizması sonuçlandı26,27. CRISPR aynı zamanda erkek üreme gelişimi ve hibrid üretimin manipülasyon için önemli bir umut vaat ediyor. Bu çalışmada CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak bir gen nakavt sistemi kullandık ve verimli bir pirinç geni dönüşüm protokolüile birleştirerek genç çiçeklenmeleri eksektif olarak kullandık ve böylece üreme gelişimi için istikrarlı erkek steril çizgileri oluşturduk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA-CAS9 bitki ekspresyonu vektör konstrüksiyonu ve Agrobacterium-aracılıdönüşüm
- Yayınlanan literatüre göre pirinç bir erkek steril gen OsABCG15 hedef28.
- OsABCG15'in ikinci eksonlarında 106-125 bp arasında yer alan hedeflenen site için tasarım sgRNA(Şekil 1).
- SgRNA oligolarını sentezlemek için T4 polinükleotid kinaz kullanın (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' ve 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGGATGTGCTT').
- PsR-Cas9 omurga vektörü29'usindirmek için ensoneklease BbsI kullanın.
- Üreticiprotokolünden sonra T4 ligase kullanarak doğrusallaştırılmış psgR-Cas9 omurgalı sentezlenmiş sgRNA oligolarını inceleyin.
- HindIII/EcoRI kullanarak, sgRNA kasetini adım 1.5'ten sindirin ve kararlı dönüşüm için pCAMBIA1300 ikili vektörünün HindIII/EcoRI bölgesine subclone29.
- Enzim sindirimi ve sıralama ile inşa plazmid onaylayın. Daha sonra, ikili yapıyı Agrobacterium tumefaciens strain EHA105'e dönüştürün ve 28 °C'de 2-3 gün boyunca Kan/Rif seçim plakalarında yetiştirin.
2. Pirinç genetik dönüşümü ve bitki doku kültürü
- Nasır indüksiyon ve rejenerasyon
NOT: Nasırı indüklemek için başlangıç malzemesi olarak taze genç pirinç çiçeklerini kullanın (Şekil 2).- 1.6-4.8 mm floret uzunluğu(Şekil 2A)29tarafından belirlenen, meyyoz aşamasında çeltik alan veya yeşil ev genç çiçeklenmeleri toplamak. Pirinç çiçeklenmeleri yaprak kılıf ile kaplı olduğundan emin olun. Her çiçeklenmeyi %70 alkol bezi ile silin ve kesmeden önce kurutun.
- Çiçeklenmeyi temiz bir steril tezgaha getirin. Sterilize makasla küçük parçalar halinde kesin (ne kadar küçük olursa o kadar iyi) ve sonra kesimleri NBD2 ortamı içeren bir Petri plakasına aktarın(Şekil 2B, Tablo 1).
- Plakayı karanlıkta 26 °C'de yaklaşık 10-14 gün boyunca inkünoslayın ve nasır ı indükler (Şekil 3A).
NOT: Agrobacterium infiltrasyonu için yeni oluşan nasırı (adım 2.2.7) doğrudan kullanın veya daha fazla nasır elde etmek için taze NBD2 ortamında bir kez daha yenileyin. Nasırı her 8-10 günde bir yeni NBD2 ortamına aktarın.
- Dönüşüm ve ortak tarım
- Dönüşüm için adım 1.6 ikili plazmid içeren A. tumefaciens bakteri kullanın. A. tumefaciens suşlarını YEB ortamda(Tablo 1)%50 gliserol ile -80 °C'de saklayın.
- Streak A. tumefaciens bir -80 °C gliserol stokye selektif antibiyotik içeren YEB agar orta(Tablo 1) ve 25-28 °C'de 48-72 saat büyür, koloniler görünmesini sağlamak için.
- 50 mL konik steril test tüpünde, aynı seçici antibiyotikleri içeren sıvı YEB ortamının 5 mL'sine seçici antibiyotiklerle YEB plakasından tek bir koloniyi aşılayın. 250 x g,25-28 °C'de bir orbital shaker üzerinde sallayın bakteriler 0.5 OD600 kadar büyür. g
- 250 mL konik şişede aynı seçici antibiyotiklerle 100 mL YEB ortamına(Tablo 1)1 mL bakteriyel süspansiyon ekleyin ve 250 x g'deorbital shaker üzerinde sallayın, 4 saat boyunca 28 °C'de.
- Bakteri toplamak için oda sıcaklığında 10 dakika için 4.000 x g santrifüj. Supernatant atın.
- AAM-AS ortamı(Tablo 1)ile bakteriyel peleti yeniden askıya alın ve süspansiyonu OD600 = 0.4'e seyreltin.
NOT: Bakteriyel süspansiyonun mükemmel od verimli dönüşüm için çok önemlidir. Bu nasır üzerinde aşırı bakteri üreme ortadan kaldırılmasında yardımcı olur. - Adım 2.1.3 bir 150 mL steril şişe içine yaklaşık 150 sağlıklı büyüyen açık sarı kırılgan embriyojenik calli toplayın. Steril şişeiçine adım 2.2.6 dan 50-75 mL bakteri hücresi süspansiyon ekleyin ve sonra 10-20 dakika için calli batırmak için bazı 10-25 mL taze AAM-AS orta ekleyin, zaman zaman sallayarak.
- Şişeden bakteriyel süspansiyonu dikkatlice dökün ve steril filtre kağıdı #1 veya kağıt mendil kullanarak nasırdan fazla bakteriyel süspansiyonu kurulayın. Daha sonra nbd-AS orta(Tablo 1)ile steril bir filtre kağıdı ile kaplı bir Petri çanak üzerine yerleştirin #1. 25-28 °C'de 3 gün boyunca karanlıkta kuluçkaya yatırın ve bakteriyel aşırı büyüme olup olup olup yok.
- Dirençli nasır için seçim
- 3 günlük birlikte ekimden sonra calli'yi steril filtre kağıdı ile steril bir Petri kabına aktarın.
- Temiz bir bankta 2 saat boyunca calli'yi havayla kurutun. Nasırın filtre kağıdına yapışmadığından emin olun.
- Calli'yi steril cımbız kullanarak birincil seçim ortamı NBD2'ye (40 mg/L higromisin ve 250 mg/L timentin ile) eşit olarak aktarın (Tablo 1). 25-28 °C karanlıkta 2 hafta boyunca kültür calli.
- 2 hafta sonra, calli'yi taze seçim ortamı NBD2 içeren yeni bir plakaya eşit olarak transfer edin (40 mg/L higromisin ve 250 mg/L timentin ile)(Tablo 1). Kültür 25-28 °C karanlıkta başka bir 2 hafta için calli.
- Nasır farklılaşması
- Taze MS Medium'a aktarma (25 mg/L higromisin ve 150 mg/L timentin ile)(Tablo 1). Kültür ışık altında 25-28 °C'de yaklaşık 2 hafta sürer.
- Adımı 2.4.1'i bir kez daha tekrarlayın.
- Daha fazla sürgün çoğalmak için yeni MS ortamı (10 mg / L higromisin ile) ateş tomurcukları aktarın.
- Kök indüksiyonu
- Yeni sürgünleri 1/2 MS ortamına aktarın(Tablo 1). 25 °C - 28 °C ışık altında kültür. Dönüştürülmüş bitkiler 2 hafta içinde kök üretirler.
- 1 hafta sonra, dehidratasyon önlemek için bitki kapsayan tencere temizlemek için bitkiler aktarın.
3. Genotip tanımlama
- Cetyltrimethyl amonyum bromür (CTAB) yöntemi31kullanarak toplam DNA çıkarma için yeni oluşturulan bitkilerden genç yaprakları toplamak.
- Şablon olarak genomik DNA kullanarak, transgen entegrasyonu ve frekansları doğrulamak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirmek için astar (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCACCGTATT 3' ve Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGTCTTTCA 3' Hipgromisin bölgesinde bulunan) polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) gerçekleştirmek için seçin (Şekil 4). Aşağıdaki PCR koşulları: 5 dk için 94 °C; 36 devir (30 s için 94 °C; 30 s için 56 °C; 1 dk için 72 °C); 7 dk için 72 °C. Başarılı PCR reaksiyonları 604 bp amplicon verir.
- Transformatörlerin genotipini belirlemek için CRISPR hedef bölgelerini çevreleyen genomik bölgeyi özel astarlar (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTTTCT 3' ve OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTAAAACATTGCTAT 3') kullanarak güçlendirmek için başka bir PCR gerçekleştirin. PCR koşulları adım 3.2 ile aynıdır.
- Mutasyonları tanımlamak için doğrudan Sanger sıralaması için 3.3 adımdaki PCR parçalarını kullanın.
4. Mutantın temel fenotipini gözlemleyin
- I2-KI çözeltisini hazırlayın: 2 g KI 'yi (potasyum iyodür) 10 mL distile suda çözün ve sonra 0,2 g I2 (resublimed iyot) ekleyin. Karıştırıldıktan sonra, distile su ile 100 mL toplam hacmi getirmek.
- FAA çözeltisini (%63 susuz etanol, %5 buzul asetik asit, %5 formaldehit ve %27 su) hazırlayın ve kullanmadan önce karıştırın.
- %0,5 Toluidin mavisi boyama çözeltisini hazırlayın: 0,5 g Toluidin mavisini 100 mL distile suda çözün.
- Bir dijital kamera ile tüm bitkilergörüntüleme, bitkisel phenotik gözlem gerçekleştirin.
- Üreme fenotip gözlemyapmak, floret palea ve lemma kaldırın. Bir stereomikroskop altında tüm anthers fotoğraf çekmek.
- İyot boyama ile polen canlılığını gözlemleyin.
- Çiçek anthesis önce olgun pirinç spikelets pick, anthers serbest bırakmak için palea ve lemma kaldırın.
- 6 anthers alın ve bir cam slayt üzerine yerleştirin. 1 damla distile su ekleyin, polen tanelerini serbest bırakmak için cımbızla anther'i iyice ezin ve ardından 2-3 damla I2-KI çözeltisi ekleyin. Kapak la kaplayın.
- Düşük büyütme mikroskobu altında gözlemleyin. Polen taneleri boyalı siyah daha güçlü canlılık göstermek, hiçbir renk veya sarı-kahverengi boyalı bodur veya dejenere vardır.
- Pirinç anther yarı ince bir bölüm gerçekleştirin
- Bir FAA çözüm içine farklı gelişim aşamalarında pirinç çiçekleri düzeltin. Malzeme nin toplama şişesinin dibine banına kadar fiksatifin dokulara nüfuz etmesini sağlamak için malzemeleri 4 °C'de (genellikle 15 dk) vakumlayın.
- Ertesi gün yeni bir FAA çözümü ile değiştirin. Malzeme dibe battıktan sonra % 70 etanol ile değiştirin ve uzun süreli kullanım için 4 °C'de saklayın.
- Etanol farklı degradeleri ile malzeme dehydrate (70%, 80%, 30 dakika için her zaman% 95, 2 saat için% 100 etanol, 2 saat safranin boya biraz içeren% 100 etanol).
NOT: Daha sonra daha kolay kesit için anterler renk ikinci% 100 etanol içine Safranin boya biraz ekleyin. - Üreticinin talimatını (Malzeme Tablosu) izleyerek gömme gerçekleştirin. Daha sonra, kesitleme den önce 60 °C'de 48 saat fırında pişirin.
- Numuneyi bir mikrotom kullanarak 2 μm kalınlığa kadar kesin. Cam slayt üzerine bir damla su ekleyin. Daha sonra, anther blokları içeren ince bölümleri forceps tarafından almak ve slaytlar üzerinde su damla yüzeyine koyun.
- Slaytları 50 °C'de su banyosuna yerleştirin ve kayalıkaya sıkıca yapışmasını bekleyin.
- 30 dakika boyunca slaytlar leke% 0.5 toluidin mavi çözeltisi kullanın. Daha sonra, su ile durulayın ve duman kaputunda kuru. Nötr ağaç tutkal ile mühür. Yavaşça slayt üzerine bir coverslip yerleştirin ve duman kaputunda kuru.
- Örneği mikroskop altında gözlemleyin ve fotoğrafladı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada gösterilmiştir pirinç Agrobacteriumtarafından gelecekteki araştırmalar için bir erkek steril çizgi oluşturmak için gen düzenleme teknolojisinin kullanımıdır-pirinç genetik dönüşüm aracılı. İkili vektör konstrüksiyonu için CRISPR-CAS9 aracılı mutagenez osabg15erkek steril hattını oluşturmak için kullanılmıştır. SgRNA OsU3 organizatörü tarafından tahrik edildi, hSpCas9 ifade kaseti çift 35S organizatörü tarafından tahrik edildi ise, ve orta vektör agrobacteriumiçin tasarlanmış tek bir ikili vektör pCAMBIA1300 monte edildi -pirinç aracılı kararlı dönüşüm. Pirinç CRISPR/Cas9 aracılı mutagenez için kullanılan yapının grafiksel gösterimi Şekil 1A'daverilmiştir.
Şekil 2 ve Şekil 3 pirinç transgen üretiminin tüm prosedürünü temsil ediyor. Genç çiçeklenmeler ekseksiyon olarak seçilmiştir (Şekil 2) ve NBD2 ortamına aşılamadan sonraki 14 gün içinde friable embriyojenik nasır (FEC) indüklenmiştir(Şekil 3A). Embriyojenik calli doğrudan Agrobacteriumaracılı dönüşüm için kullanılmıştır(Şekil 3C) veya daha fazla enfeksiyon için daha fazla calli elde etmek için proliferasyon alt kültür(Şekil 3B). Karanlık koşullarda NBD2-AS ortamüzerinde 48 saat birlikte işlendikten sonra(Şekil 3D),calli ikinci tur seçim ortamına kaydırıldı. 10-14 gün sonra, dönüştürülmüş calli anne calli çevresinde bazı küçük yeni oluşan microcalli gösterdi, dönüştürülmemiş calli rengi kahverengi dönüştü ve sonunda öldü iken(Şekil 3E,F). Daha sonra, sağlıklı ve kremsi renkli calli iki kez rejenerasyon ortamına aktarıldı. Bu aşamada, dönüştürülmüş calli yavaş yavaş yeşil noktalar gösterdi (ateş tomurcukları) (Şekil 3G,H). Bu yeni üretilen yeşil lekeler, sürgün büyümesine izin vermek için rejenerasyon ortamı içeren steril bir plastik şişede kültürlendi(Şekil 3I),ve daha sonra kökleri indüklemek için 1/2 MS ortamına (taze sürgünler olarak) kaydırıldı. Daha sonra, iyi gelişmiş kökleri ile sağlıklı ve güçlü büyüyen sürgünler hasat edildi(Şekil 3J).
Toplamda 21 rejenere fide elde edildi. Higromisin bölgesi için PCR amplifikasyon, 21 kişiden 18'inin ilgili bandı yükseltebileceğini göstererek bu çizgilerin transgenik olduğunu göstermiştir(Şekil 4),ve karşılık gelen dönüşüm sıklığı yaklaşık %85,71 'dir(Tablo 2). Transformantlar, 18 T0 transgenik bitkiler, sekiz heterozigot hat ve üç homozigot çizgi arasında CRISPR-Cas9 pozitif, karşılık gelen mutasyon frekansları ile %61,11(Şekil 1B, Tablo 2)ile hedef bölgeye yayılan astarlar kullanılarak sgRNA hedef sahasındaki mutasyonları tanımlamak için genotiplenmiştir .
Homozigot nakavt mutantları temel erkek üreme organı gözlemi ile doğrulandı (Şekil 5). Osabcg15 anthers yabani tip(Şekil 5A,D)daha küçük ve soluk ve olgun polen taneleri yoktu(Şekil 5B,E). Osabcg15'teki anther morfolojik defektlerini araştırmak için yabani tipe göre enine kesitmikroskopisi yapıldı. Evre 10'da, yabani tip mikrosporlar yuvarlak şekilli hale geldi ve koyu mavi lekeli exine(Şekil 5C)ile aşılandı. Buna karşılık, osabcg15 mikrosporlar çöktü ve bozulmuş, sadece dejenere mikrospor enkaz anther lokül(Şekil 5F)bulunmaktadır.
Şekil 1: CRISPR/Cas9 sistemi ve OsABCG15'inhedefli mutagenezi için bilgi oluşturma . (A) SgRNA OsU3 organizatörü tarafından tahrik edildi, hSpCas9 ifade kaseti çift 35S organizatörü tarafından tahrik edildi; orta vektör, pilavın Agrobacteriumaracılı kararlı dönüşümü için tasarlanmış tek bir ikili vektörde bir araya getirilmiştir. (B) OsABCG15 geninin ikinci eksonda yer alan dizi (5'-AAGCACATCCTCACAAGGGGAT-3') sgRNA'nın hedef bölgesi olarak seçilmiştir. Japonica cultivar 9522 arka planında CRISPR-Cas9 tarafından üç tip homozigot mutasyon olayı üretildi ve CRISPR-Cas9 indüklenen mutasyon bölgelerinin Sanger sekanslama kromatisleri gösterilmiştir. Hat 9522osabcg15-1 tek nükleotit (1-nt) 'A' ekleme vardır; hat 9522osabcg15-2 tek nükleotit (1-nt) 'G' ekleme vardır; ve 9522osabcg15-3 satırında tek nükleotit (1-nt) 'G' silme vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Nasır ı indükleyen malzemeler. (A) Genç pirinç çiçeklenmeleri, meyozis evresinde. (B) NBD2 ortamında yetişen genç çiçeklenmeler kesilir. Çubuk = 2 cm içinde (A). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Agrobacteriumaracılı dönüşüm ile transgenik çizgilerin üretilmesi prosedürü. (A) Pirinç calli genç çiçeklenme oluşturulan. (B) Calli alt kültürü. (C) A. tumefaciens ile calli kuluçka. (D) A. tumefaciens ile calli birlikte ekimi. (E) Hygromycin varlığında dönüştürülmüş calli ilk seçim döngüsü (40 mg /L). (F) Hygromycin (40 mg/L) varlığında dönüştürülmüş calli'nin ikinci seçim döngüsü. (G) Dönüştürülmüş calli'nin ilk yenilenmesi. (H) Dönüştürülmüş calli ikinci rejenerasyon, kültür plakayeşil çekim noktası dikkat çekti. (I) İndüksiyon kültürünü vur. (J) Kök indüksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yenilenen pirinç fidelerinin dönüşüm frekanslarının analizi. %1.5 agarose jel elektroforezi sonrası 604 bp parça (1-8, 10-14, 16-20) gösteren amplifiye edilmiş PCR ürünleri transgenik pozitif çizgileri gösterir. Parçadan yoksun çizgiler dönüştürülür (9, 15, 21), vahşi tip (WT) denetimine benzer. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yabani tip (9522) ve mutant 9522osabcg15-1temel fenotik gözlem . (A) Yabani tip (9522) çiçek ve (D) 9522osabcg15-1 mutant çiçek lemma ve palea kaldırıldıktan sonra. gl, glume; fi, filament; lo, lodicule; pi, pistil; st, stamen. (B) I2-YABANI tip (9522) ve (E) 9522osabcg15-1 hattından olgun polen tanelerinin ki boyama. (C) Yabani tip (9522) ve (F) 9522osabcg15-1 mutant'ta anther gelişiminin enine kesit gözlemi ile analizi. DMsp, Dejenere mikrosporlar; E, epidermis; En, endotel; Msp, mikrospor; T, tapetum. Çubuklar = 2 mm in (A) ve (D), 100 μm in (B) ve (E), 50 μm in (C) ve (F). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Pirinç dönüşümü için medya kompozisyonları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 2: Crispr-Cas9 tarafından T0 neslinde üretilen OsABCG15 mutantlarının dönüşüm ve gen düzenleme verimliliği. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yapay gen erkek steril mutantlar geleneksel rasgele fiziksel, kimyasal veya biyolojik mutagenez tarafından oluşturulur. Bu güçlü teknikler olmasına rağmen, onların rasgele doğa moleküler ıslah ıslahı32özel iyileştirmeler sunmak için potansiyele sahip modern genomik bilginin büyük miktarda yararlanmak için başarısız olur. CRISPR-Cas9 sistemi,DNA'yımanipüle etmek ve düzenlemek için basit ve uygun fiyatlı araçları sayesinde bitkilerde yaygın olarak kullanılmaktadır 29,33; geleneksel mutagenez yöntemlerine göre zaman kazanma potansiyeline sahiptir.
Burada, nasır indüksiyonu için eksplorasyon olarak genç çiçeklenmeleri kullanarak uygun bir Agrobacteriumaracılı dönüşüm sistemi geliştirdik. Transgen yordamında zaman kazanmak için atlanabilecek bazı adımlar vardır. Başlangıç malzemesi olarak genç çiçeklenmelerin kullanılması, tohumlarıekbitkiler olarak kullanmakla karşılaştırıldığında nasır indüksiyonunun genel süresini en aza indirmek için iyi bir seçimdir. Buna ek olarak, hücre farklılaşma ve rejenerasyon kapasitesi genç çiçeklenme elde calli çok güçlüdür. Bu süreçte pirinç calli alt kültürü önlenebilir, hangi sonunda zaman kazandırır yanı sıra bakteriyel ve mantar kontaminasyon riskini azaltır. Ayrıca, timentin karsinin yerine antibiyotik olarak kullanılmıştır, hangi bakterileri inhibe daha etkilidir.
Çalışma ve pirinç erkek üreme gelişimi temel fenotipik gözlem için getirilen protokol bitki üreme biyolojisi ilgilenen lisans ve lisansüstü öğrenciler için yararlıdır. Bu uygun protokol, sonraki araştırma çalışmalarında kullanılmak üzere hızlı ve tekrarlanabilir olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Yazarlar genç pirinç çiçeklenme ve pirinç dokusu kültürü orta yapımında yardım sağlamak için Xiaofei Chen kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31900611) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
References
- FAO. FAO statistical yearbook, World Food and Agriculture. Rome. ISBN 978-92-5-107396-4. , Available from: http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf (2013).
- FAO. The future of food and agriculture: Trends and challenges. Rome. ISBN 978-92-5-109551-5. , Available from: http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf 109551-109555 (2017).
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D.
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B.
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j, Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C.
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. iC. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
