Summary
Detta arbete beskriver användningen av CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknik för att knockout endogena genen OsABCG15 följt av en modifierad Agrobacterium-medierad omvandling protokoll för att producera en stabil han-steril linje i ris.
Abstract
Manlig sterilitet är en viktig agronomisk drag för hybrid utsäde produktion som vanligtvis kännetecknas av funktionella defekter i manliga reproduktionsorgan / könströ. De senaste framstegen inom CRISPR-Cas9-genomredigeringsteknik möjliggör hög redigeringseffekt och tidsavvisande knockout-mutationer av endogena kandidatgener på specifika platser. Dessutom är Agrobacterium-medieradgenetisk omvandling av ris också en viktig metod för genmodifiering, som har antagits i stor utsträckning av många offentliga och privata laboratorier. I denna studie, vi tillämpas CRISPR-Cas9 genomet redigeringsverktyg och framgångsrikt genererat tre manliga sterila mutant linjer genom riktade genomet redigering av OsABCG15 i en japonica sorter. Vi använde en modifierad Agrobacterium-medierad risomvandlingsmetod som kunde ge utmärkta medel för genetisk emasculation för hybridutsädeproduktion i ris. Transgena växter kan erhållas inom 2– 3 månader och homozygous transformants screenades genom genotypning med hjälp av PCR-förstärkning och Sangersekvensering. Grundläggande fenotypic karakterisering av manliga sterila homozygous linje utfördes genom mikroskopisk observation av de ris manliga reproduktiva organ, pollen viabilitet analys av jod kalium jod jod jod (jag2-KI) färgning halvtunna tvärsnitt av utveckla anthers.
Introduction
Ris är den viktigaste livsmedelsgrödor, särskilt i utvecklingsländerna, och utgör en basföda för över hälften av världens befolkning. Totalt sett växer efterfrågan på rissäd och beräknas öka med 50 % fram till 2030 och 100 % fram till 20501,2. Framtida förbättringar i ris avkastning kommer att behöva kapitalisera på olika molekylära och genetiska resurser som gör ris en utmärkt modell för monocotyledonous växtforskning. Dessa inkluderar ett effektivt omvandlingssystem, avancerad molekylär karta, och allmänt tillgänglig databas med uttryckta sekvens taggar, som har genererats under många år3,4. En strategi för att förbättra skörden är hybrid utsädeproduktion 5, en central del av som är förmågan att manipulera manlig fertilitet. Att förstå den molekylära kontrollen av manlig fertilitet i spannmålsgrödor kan bidra till att översätta viktig kunskap till praktiska tekniker för att förbättra hybridutdröproduktionen och ökagrödornasproduktivitet 6,7.
Genetisk omvandling är ett viktigt verktyg för grundforskning och kommersiellt jordbruk eftersom det möjliggör införande av främmande gener eller manipulering av endogena gener i grödor, och resulterar i generering av genetiskt modifierade linjer. Ett lämpligt omvandlingsprotokoll kan bidra till att påskynda genetiska och molekylärbiologiska studier för grundläggande förståelse av genreglering8. I bakterier sker genetisk transformation naturligt; emellertid, i växter, det utförs artificiellt med hjälp av molekylärbiologiska tekniker9,10. Agrobacterium tumefaciens är en jordburen, Gramnegativ bakterie som orsakar krongall sjukdom i växter genom att överföra T-DNA, en region av dess Ti plasmid, in i växtcellen via en typ IV utsöndring system11,12. I växter, A. tumefaciens-medierad omvandling anses vara en utbredd metod för genmodifiering eftersom det leder till stabil och låg kopia nummer integration av T-DNA i värdgenomet13. Transgena ris först genereras genom Agrobacterium-medierad gen omvandling i mitten av 1990-talet i japonica kultivar14. Med hjälp av detta protokoll erhölls flera transgena linjer inom en period på 4 månader med en omvandlingseffektivitet på 10%–30%. Studien visade att det finns två kritiska steg för den framgångsrika omvandlingen: en är induktion av embryogena callus från mogna frön och en annan är tillsats av acetosyringone, en fenolförening, till bakteriekulturen under samodling, vilket möjliggör högre omvandlingseffektivitet i växter14,15. Detta protokoll har i stor utsträckning använts med mindre ändringar i japonica16,17,18,19 samt andra sorter som indica20,21,22,23 och tropiska japonica24,25. Faktum är att över 80% av de artiklar som beskriver ris omvandling använda Agrobacterium-medierad gen omvandling som ett verktyg13. Hittills har flera genetiska transformationsprotokoll tagits fram med hjälp av risutsäde som startmaterial för kallsinnigainduktion 16,17,18,19. Dock är mycket lite känt om unga blomställning som explants för kallkutproduktion. Sammantaget är det viktigt att upprätta en snabb, reproducerbar, och effektiv gen omvandling och regenerering protokoll för funktionell genomik och studier på gröda förbättring.
Under de senaste åren har utvecklingen av CRISPR-Cas9-tekniken resulterat i en exakt genomredigeringsmekanism för att förstå genfunktionen och leverera agronomiskt viktiga förbättringar för växtförädling26,27. CRISPR ger också ett stort löfte om manipulering av manlig reproduktionsutveckling och hybridproduktion. I denna studie använde vi ett gen knockout-system med CRISPR-Cas9-teknik och kopplade det till ett effektivt testprotokoll för omvandling av risgener med hjälp av unga blomställningar som explants, vilket skapar stabila sterila manliga linjer för studier av reproduktionsutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. sgRNA-CAS9 växtuttryck vektor konstruktion och Agrobacterium-medierad omvandling
- Rikta en manlig steril gen OsABCG15 i ris enligt den publicerade litteraturen28.
- Design sgRNA för den riktade platsen som ligger mellan 106–125 bp i den andra exon av OsABCG15 (Bild 1).
- Använd T4 polynukleotidkinas för att syntetisera sgRNA-oligos (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' och 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCTTCCGAGGATGTGCTT').
- Använd endonuclease BbsI att smälta psgR-Cas9 stamnät vektor29.
- Ligate den syntetiserade sgRNA oligos med linjäriserade psgR-Cas9 ryggraden med hjälp av T4 ligase efter tillverkarens protokoll.
- Med hjälp av HindIII/EcoRI, smälta sgRNA-kassetten från steg 1.5 och subclone in i hindiII/EcoRI-platsen i den binära inktorktorken pCAMBIA1300 för stabil omvandling29.
- Bekräfta den konstruerade plasmiden genom enzymspjältning och sekvensering. Senare, omvandla den binära konstruktionen till Agrobacterium tumefaciens stammen EHA105 och odla dem på Kan / Rif urvalsplattor vid 28 °C för 2 – 3 dagar.
2. Risgenetisk omvandling och växtvävnadskultur
- Callus induktion och regenerering
OBS: Använd färska unga ris blomställningar som utgångsmaterial för att framkalla kallg (Bild 2).- Samla de unga blomställningarna från risfält eller grönt hus på meiosstadiet, bestämt med floretlängd på 1,6-4,8 mm (figur 2A)29. Se till att riskasyrena är täckta med bladskinna. Torka av varje blomställning med en 70% alkoholsudd och låt den torka innan du skär.
- Ta med dig blomställningen till en ren steril bänk. Skär den i små bitar (ju mindre desto bättre) med steriliserad sax och sedan överföra sticklingar till en Petri platta som innehåller NBD2 medium (Figur 2B, Tabell 1).
- Inkubera plattan i mörker vid 26 °C i ca 10-14 dagar för att framkalla callus (Bild 3A).
OBS: Använd den nybildade callus för Agrobacterium infiltration (steg 2.2.7) direkt eller rekondition en gång till i färskt NBD2 medium för att få mer kallvalsning. Överför callusen till det nya NBD2-mediet var 8–10:e dag.
- Omvandling och samodling
- Använd A. tumefaciens bakterier som innehåller den binära plasmid från steg 1.6 för omvandling. Förvara stammarna A. tumefaciens i YEB-medium (Tabell 1) med 50 % glycerol vid -80 °C för vidare användning.
- Strimma A. tumefaciens från ett -80 °C glycerol lager till YEB agar medium som innehåller selektiva antibiotika (Tabell 1) och växa vid 25–28 °C för 48–72 h, för att tillåta kolonier att visas.
- Inokulera en enda koloni från YEB-plattan med selektiv antibiotika till 5 mL flytande YEB-medium som innehåller samma selektiva antibiotika (Tabell 1), i ett 50 mL koniskt sterilt provrör. Skaka på en orbitalskakapparat vid 250 x g, vid 25–28 °C tills bakterier växer till en OD600 på 0,5.
- Tillsätt 1 mL bakteried suspension till 100 mL yeb medium (tabell 1) med samma selektiva antibiotika i en konisk kolv på 250 mL och skaka på en orbitalskakapparat vid 250 x g, vid 28 °C i 4 h.
- Centrifugera vid 4 000 x g i 10 min vid rumstemperatur för att samla in bakterier. Kassera supernatanten.
- Återanvänd bakteriepelleten med AAM-AS-medium (tabell 1) och späd upphängningen till en OD600 = 0.4.
OBS: Den perfekta OD av bakteriell suspension är avgörande för effektiv omvandling. Det hjälper i att eliminera överskott bakterietillväxt på den för callus. - Samla in omkring 150 friska växande ljusgula ömtåliga embryogropi från steg 2.1.3 till en 150 mL steril kolv. Lägg 50– 75 mL bakteriecell suspension från steg 2.2.6 i den sterila kolven, och tillsätt sedan några 10–25 mL färska AAM-AS medium för att sänka in calli för 10–20 min, skakande ibland.
- Häll ut bakterieupphängningen från kolven försiktigt och torka överskottet av bakterieupphängningen från förorken med hjälp av sterilt filterpapper #1 eller mjukpapper. Placera dem sedan på en petriskål med NBD-AS-medium (Tabell 1) täckt med ett sterilt filterpapper #1. Inkubera i 25–28 °C i mörker i 3 dagar och kontrollera om bakteriell överväxt.
- Urval för resistenta valg
- Efter 3 dagars samodling överför du calli till en steril petriskål med ett sterilt filterpapper.
- Lufttorka calli i 2 h på en ren bänk. Se till att anropsutformen inte följs till filtrerpapperet.
- Överför calli jämnt med hjälp av steril pincett till det primära urvalsmediet NBD2 (med 40 mg/L hygromycin och 250 mg/L timentin) (Tabell 1). Kultur calli i 2 veckor vid 25–28 °C i mörker.
- Efter 2 veckor, överför calli jämnt till en ny platta innehållande färskt urvalsmedium NBD2 (med 40 mg/L hygromycin och 250 mg/L timentin) (Tabell 1). Kultur calli i ytterligare 2 veckor vid 25–28 °C i mörker.
- Callus differentiering
- Överför callus till färskt MS Medium (med hygromycin på 25 mg/L och 150 mg/L timentin) (tabell 1). Kultur under ljuset vid 25–28 °C i cirka 2 veckor.
- Upprepa steg 2.4.1 en gång till.
- Överför skjuta knoppar till det nya MS-medium (med 10 mg / L hygromycin) för att föröka fler skott.
- Rot induktion
- Överför de nya skotten i 1/2 MS medium (Tabell 1). Kultur under det ljust på °C 25 - 28 °C. De transformerade växterna producerar rötter inom 2 veckor.
- Efter 1 vecka, överför växterna till rena krukor som täcker växten för att förhindra uttorkning.
3. Identifiering av genotyp
- Samla unga blad från nygenererade anläggningar för total DNA-extraktion med cetyltrimetyl ammoniumbromid (CTAB)metod 31.
- Med hjälp av det genomiska DNA som mall, välj primers (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATT 3' och Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCGTGCTTTCA 3' som ligger i Hygromycinregionen) för att utföra polymeraskedjereaktion (PCR) för att validera transgenintegrationen och frekvenserna (Figur 4). Följande PCR-villkor: 94 °C i 5 min; 36 cykler (94 °C för 30 s; 56 °C för 30 s; 72 °C i 1 min ); 72 °C i 7 min. Framgångsrika PCR reaktioner ger en 604 bp amplicon.
- Utför en annan PCR för att förstärka den genomiska regionen kring CRISPR målplatserna med hjälp av specifika primers (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCATTGCTCAACAGTTTCT 3' och OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTAAAACATTGCTAT 3') för att identifiera genotypen för transformanterna. PCR-villkoren är desamma som i steg 3.2.
- Använd PCR-fragment från steg 3.3 direkt för Sanger-sekvensering för att identifiera mutationer.
4. Observera den grundläggande fenotypen av mutanten
- Förbered I2-KI-lösningen: lös 2 g KI (kaliumjodid) i 10 mL destillerat vatten och tillsätt sedan 0,2 g I2 (resublimed jod) i det. Efter blandning, föra den totala volymen till 100 mL med destillerat vatten.
- Bered FAA-lösningen (63 % vattenfri etanol, 5 % glacial ättiksyra, 5 % formaldehyd och 27 % vatten) och blanda innan du använder.
- Förbered den 0,5% Toluidin blå färgningslösning: lös 0,5 g Toluidinblått i 100 mL destillerat vatten.
- Utför vegetativ fenotypisk observation, genom att avbilda hela växterna med en digitalkamera.
- Utför reproduktions fenotyp observation, ta bort palea och lemma från floret. Ta foton av hela antis under ett stereomikroskop.
- Observera pollen livskraften genom jodfärgning.
- Plocka mogna ris spikelets innan blomman anthesis, ta bort palea och lemma att släppa anthers.
- Ta 6 anthers och placera dem på ett glas slide. Tillsätt 1 droppe destillerat vatten, krossa anther-brunnen med pincett för att frigöra pollenkornen och tillsätt sedan 2–3 droppar I2-KI-lösning. Täck med täckslipet.
- Observera under ett låg förstoringsmikroskop. Pollenkorn färgade svart visar mer kraftfull livskraft, ingen färg eller gul-brun färgade är hämmade eller urartat.
- Utför en halvtunn sektion av ris anther
- Fixera risblommorna från olika utvecklingsstadier till en FAA-lösning. Dammsug materialen vid 4 °C (i allmänhet 15 min) så att fixativet tränger in i vävnaderna tills materialet sjunker till botten av uppsamlingsflaskan.
- Ersätt med en ny FAA-lösning nästa dag. När materialet väl sjunker till botten, ersätt med 70% etanol och förvara vid 4 °C för långvarig användning.
- Torka ut materialen med olika lutningar av etanol (70%, 80%, 95% varje gång för 30 min, 100% etanol för 2 h, 100% etanol som innehåller lite av Safranin färgämne för 2 h).
OBS: Tillsätt lite av Safranin färgämne i den andra 100% etanol för att färga anthers för lättare snittning efteråt. - Utför inbäddning genom att följa tillverkarens instruktion (Table of Materials). Sedan, grädda i en ugn vid 60 °C i 48 h före snittning.
- Dela upp provet till en tjocklek av 2 μm med hjälp av en mikrotom. Tillsätt en droppe vatten på glasglaset. Plocka sedan upp de tunna sektionerna som innehåller anther block av tuppar och lägg dem på ytan av vattendroppar på rutschbanorna.
- Placera rutschkanorna på vattenbadet vid 50 °C för att helt sprida sektionerna för att låta det stadigt hålla fast vid rutschkanan.
- Använd 0,5% toluidin blå lösning fläcken bilderna i 30 min. Skölj sedan med vatten och torka i rökhuven. Täta med neutralt trädlim. Placera försiktigt en täckplatta på rutschkanan och torka i rökhuven.
- Observera och fotografera provet i mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Demonstreras här är användningen av genredigeringsteknik för att skapa en manlig steril linje för framtida forskning av Agrobacterium-medierad genetisk omvandling i ris. För att skapa den manliga sterila raden av osabcg15, crispr-CAS9-medierad mutagenes användes för binära vektor konstruktion. SgRNA drevs av OsU3 promotorn, medan uttrycket kassett av hSpCas9 drevs av den dubbla 35S promotorn, och den mellersta vektorn var sammansatt i en enda binär vektor pCAMBIA1300 avsedd för Agrobacterium-medierad stabil omvandling av ris. En grafisk representation av konstruktionen som användes för CRISPR/Cas9-medierad mutagenes av ris tillhandahålls i figur 1A.
Figur 2 och figur 3 representerar hela förfarandet för ristransgenproduktion. De unga blomställningarna valdes som explants (Figur 2) och inducerade den fribara embryogenic callus (FEC) inom 14 dagar efter inokulering på NBD2-mediet (Figur 3A). Den embryogena calli användes direkt för Agrobacterium-medierad omvandling (Figur 3C) eller subkultur för proliferation för att få mer calli för ytterligare infektion (Figur 3B). Efter samodlade för 48 h på NBD2-AS medium i mörka förhållanden (Figur 3D), var calli flyttas till en andra omgången av urval medium. Efter 10–14 dagar visade transformerade calli några små nybildade mikrocalli i moder callis periferi, medan färgen på otransformad calli förvandlades till brunt och dog så småningom (Bild 3E,F). Senare överfördes friska och krämiga färgade calli i regenereringsmediet två gånger. I detta skede visade transformerade calli gradvis gröna fläckar (skjuta knoppar) (Figur 3G,H). Dessa nygenererade grön-fläckar odlades i en steril plastflaska som innehåller regenerering medium för att möjliggöra skjuta tillväxt (Figur 3I), och sedan förskjuts (som färska skott) till en 1/ 2 MS medium för att framkalla rötter. Senare skördades friska och kraftiga odlingsskott med välutvecklade rötter (Figur 3J).
Totalt erhölls 21 regenererade plantor. PCR-förstärkning för hygromycinregionen visade att 18 av 21 kan förstärka motsvarande band, vilket indikerar att dessa linjer är transgena (figur 4), och motsvarande omvandlingsfrekvens är ca 85,71 % (tabell 2). Transformanterna genotypades för att identifiera mutationerna vid sgRNA målplatsen(er) med hjälp av primers som spänner över målregionen genom PCR amplicon och Sanger sekvensering, Bland 18 T0 transgena växter, åtta heterozygous linjer och tre homozygous linjer var CRISPR-Cas9 positiva, med motsvarande mutation frekvenser på 61,11% (Figur 1B, tabell 2).
De homozygous knockout mutanterna validerades genom grundläggande manliga reproduktiva organ observation (Figur 5). Anthersna av osabcg15 var mindre och palare än de av wild-type (figurera 5A,D), och saknade mogna pollenkorn (figurera 5B,E). Tvärgående snittning mikroskopi utfördes för att undersöka de anther morfologiska defekter i osabcg15 jämfört med den vilda typen. I steg 10 blev mikrosporer av vildtyp rundformad och vakuolerad med mörkblåfärgat exine (Figur 5C). Däremot kollapsade osabcg15 mikrosporer och försämrade, endast skräp av urartat mikrospore finns i anther locule (Figur 5F).
Figur 1: Konstruera information för CRISPR/Cas9-systemet och riktad mutagenes av OsABCG15. (A) SgRNA drevs av osU3 promotorn, medan uttrycket kassett av hSpCas9 drevs av den dubbla 35S promotorn; den mellersta vektorn var ihop i en enda binära vektor avsedd för Agrobacterium-medierad stabil omvandling av ris. (B) Sekvensen (5'-AAGCACATCCTCAAGGGGAT-3') som ligger i den andra exon av OsABCG15 genen valdes som målplats för sgRNA. Tre typer av homozygous mutation händelser genererades av CRISPR-Cas9 i Japonica cultivar 9522 bakgrund, och Sanger sekvensering kromatogram av CRISPR-Cas9 inducerad mutation platser visas. Linje 9522osabcg15-1 har en enkel-nukleotid (1-nt) 'A' insättning; linje 9522osabcg15-2 har en enda nukleotid (1-nt) "G" insättning; och linje 9522osabcg15-3 har en singel-nukleotid (1-nt) "G" radering. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2: Utgångsmaterial för att inducera callus. (A) Unga riskorn blomställningar på meiosstadiet. (B) Dissekerade unga blomställningar som växer på NBD2-mediet. Bar = 2 cm i (A). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Förfarande för att framställa transgena linjer genom Agrobacterium-medierad omvandling. (A) Rice calli genereras från de unga blomställningar. (B) Subkultur av calli. (C) Inkubation av calli med A. tumefaciens. (D) Samodling av calli med A. tumefaciens. (E) Första urvalscykel av omvandlad calli i närvaro av Hygromycin (40 mg/L). (F) Andra urvalscykeln av omvandlad calli i närvaro av Hygromycin (40 mg/L). (G) Första regenerering av omvandlade calli. (H) Den andra regenerering av omvandlas calli, och att man kan lägga till den gröna skottpunkten i odlingsplattan. (I) Skjut induktionskultur. (J) Rotinduktion. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Analys av omvandlingsfrekvenser av regenererade risplantor. Förstärkta PCR-produkter som visar ett 604 bp-fragment (1–8, 10–14, 16–20) efter 1,5 % agarosgelelektrofores indikerar transgena positiva linjer. Linjer som saknar fragmentet är oöverständbara (9, 15, 21), liknande den vilda typ (WT) kontroll. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5: Grundläggande fenotypisk observation av vildtypen (9522) och mutant 9522osabcg15-1. (A) Wild-type (9522) blomma och (D) 9522osabcg15-1 mutant blomma efter avlägsnande av lemma och palea. gl, glume; fi, glödtråd; lo, lodicule; pi, pistill; st, ståndare. (B) I2-KI färgning av mogna pollenkorn från vild-typ (9522) och (E) 9522osabcg15-1 linje. (C) Analys av anther utveckling i vild-typ (9522) och (F) 9522osabcg15-1 mutant genom tvärsnitt observation. DMsp, Degenererade mikrosporer; E, epidermis; Sv, endothecium; Msp, mikrospore; T, bandtum. Staplar = 2 mm i (A) och (D), 100 μm i (B) och (E), 50 μm i (C) och (F). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Tabell 1: Mediesammansättningar för risomvandling. Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Omvandling och genredigeringseffektivitet för mutanterna i OsABCG15 som genereras av CRISPR-Cas9 i T0-generationen. Vänligen klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konstgjorda manliga sterila mutanter är traditionellt genereras av slumpmässiga fysiska, kemiska, eller biologiska mutagenes. Även om dessa är kraftfulla tekniker, misslyckas deras slumpmässiga natur att dra nytta av den stora mängden modern genomisk kunskap som har potential att leverera skräddarsydda förbättringar i molekylär avel32. CRISPR-Cas9-systemet har använts i stor utsträckning i växter på grund av dess enkla och prisvärda medel för att manipulera och redigera DNA29,33; det har potential att spara tid jämfört med traditionella mutagenesis metoder.
Här utvecklade vi ett bekvämt Agrobacterium-medierat transformationssystem med hjälp av unga blomställningar som explants för kallsinnig induktion. Det finns några steg i transgenproceduren som kan utelämnas för att spara tid. Använda unga blomställningar som utgångsmaterial är ett bra val för att minimera den totala varaktigheten av kallsinnorna induktion jämfört med att använda frön som explants. Dessutom celldifferentiering och regenerering kapacitet är mycket stark i calli erhålls från unga blomställningar. I denna process kan subkultur av ris calli undvikas, vilket så småningom sparar tid samt minskar risken för bakteriell och svamp kontaminering. Dessutom användes timentin som ett antibiotikum istället för carbenicillin, vilket är effektivare för att hämma bakterier.
Studien och det introducerade protokollet för grundläggande fenotypisk observation av manlig reproduktiv utveckling i ris är användbart för grund- och forskarstuderande som är intresserade av växtreproduktionsbiologi. Detta bekväma protokoll bör vara snabb att greppa och reproducerbara för användning i efterföljande forskningsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Xiaofei Chen för att ge unga ris blomställningar och hjälp med att göra risvävnad kultur medium. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (31900611).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
References
- FAO. FAO statistical yearbook, World Food and Agriculture. Rome. ISBN 978-92-5-107396-4. , Available from: http://www.fao.org/3/i3107e/i3107e.pdf (2013).
- FAO. The future of food and agriculture: Trends and challenges. Rome. ISBN 978-92-5-109551-5. , Available from: http://www.fao.org/3/a-i6583e.pdf 109551-109555 (2017).
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D.
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B.
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j, Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C.
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. iC. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
