Summary
Diese Arbeit beschreibt den Einsatz der CRISPR-Cas9 Genom-Editing-Technologie, um das endogene Gen OsABCG15 zu knockouten, gefolgt von einem modifizierten Agrobacterium-vermitteltenTransformationsprotokoll, um eine stabile männlich-sterile Linie in Reis zu produzieren.
Abstract
Männliche Sterilität ist eine wichtige agronomische Eigenschaft für die Hybridsamenproduktion, die in der Regel durch funktionelle Defekte in männlichen Fortpflanzungsorganen/Gameten gekennzeichnet ist. Jüngste Fortschritte in der CRISPR-Cas9-Genom-Editing-Technologie ermöglichen eine hohe Editing-Wirksamkeit und zeitsparende Knockout-Mutationen endogener Kandidatengene an bestimmten Standorten. Darüber hinaus ist Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation von Reis auch eine Schlüsselmethode zur Genmodifikation, die von vielen öffentlichen und privaten Laboratorien weit verbreitet ist. In dieser Studie haben wir CRISPR-Cas9 Genombearbeitungswerkzeuge eingesetzt und erfolgreich drei männliche sterile Mutantlinien durch gezielte Genombearbeitung von OsABCG15 in einer Japonica-Sorte erzeugt. Wir verwendeten eine modifizierte Agrobacterium-vermittelteReistransformationsmethode, die hervorragende Mittel zur genetischen Easculation für die Hybridsamenproduktion in Reis bieten konnte. Transgene Pflanzen können innerhalb von 2–3 Monaten erhalten werden und homozygote Transformanten wurden durch Genotypisierung mittels PCR-Amplifikation und Sanger-Sequenzierung gescreent. Die grundlegende phänotypische Charakterisierung der männlichen sterilen homozygoten Linie wurde durch mikroskopische Beobachtung der männlichen Reisvermehrungsorgane, Pollenlebensfähigkeitsanalyse durch Jodkaliumjodid (I2-KI) durchgeführt, indem halbdünne Querschnitte von sich entwickelnden Anthern färben.
Introduction
Reis ist die wichtigste Nahrungsmittelpflanze, insbesondere in Entwicklungsländern, und stellt für mehr als die Hälfte der Weltbevölkerung ein Grundnahrungsmittel dar. Insgesamt wächst die Nachfrage nach Reisgetreide und wird bis 2030 voraussichtlich um 50 % und bis 2050 um 100 % ansteigen1,2. Zukünftige Verbesserungen des Reisertrags müssen aus verschiedenen molekularen und genetischen Ressourcen kapitalisieren, die Reis zu einem ausgezeichneten Modell für monokotyledonöse Pflanzenforschung machen. Dazu gehören ein effizientes Transformationssystem, fortschrittliche molekulare Karte und öffentlich zugängliche Datenbank von ausgedrückten Sequenz-Tags, die über viele Jahre generiert wurden3,4. Eine Strategie zur Verbesserung des Ernteertrags ist die Hybridsaatgutproduktion5, ein zentrales Element davon ist die Fähigkeit, die männliche Fruchtbarkeit zu manipulieren. Das Verständnis der molekularen Kontrolle der männlichen Fruchtbarkeit in Getreidepflanzen kann dazu beitragen, Schlüsselwissen in praktische Techniken umzusetzen, um die Hybridsaatgutproduktion zu verbessern und die Ernteproduktivität zu verbessern6,7.
Die genetische Transformation ist ein Schlüsselinstrument für die Grundlagenforschung und die kommerzielle Landwirtschaft, da sie die Einführung fremder Gene oder die Manipulation endogener Gene in Kulturpflanzen ermöglicht und zur Erzeugung genetisch veränderter Linien führt. Ein geeignetes Transformationsprotokoll kann dazu beitragen, genetische und molekularbiologische Studien für ein grundlegendes Verständnis der Genregulation zu beschleunigen8. Bei Bakterien findet die genetische Transformation auf natürliche Weise statt; jedoch wird es in Pflanzen künstlich mit molekularbiologischen Techniken9,10durchgeführt. Agrobacterium tumefaciens ist ein bodengestütztes, gramnegatives Bakterium, das Kronengallenerkrankungen in Pflanzen verursacht, indem es T-DNA, eine Region seines Ti-Plasmids, über ein Sekretionssystem vom Typ IV11,12in die Pflanzenzelle überträgt. In Pflanzen wird die A. tumefaciens-vermittelte Transformation als weit verbreitete Methode zur Genmodifikation betrachtet, da sie zu einer stabilen und niedrigen Kopierzahl der Integration von T-DNA in das Wirtsgenom13führt. Transgener Reis wurde erstmals Mitte der 1990er Jahre durch Agrobacterium-vermittelte Gentransformation in der Japonica-Sorte14erzeugt. Mit diesem Protokoll wurden innerhalb von 4 Monaten mehrere transgene Leitungen mit einer Transformationseffizienz von 10%–30% erhalten. Die Studie zeigte, dass es zwei entscheidende Schritte für die erfolgreiche Transformation gibt: einer ist die Induktion von embryogenen Callus aus reifen Samen und ein anderer ist die Zugabe von Acetosyringon, einer Phenolverbindung, zur Bakterienkultur während der Kokultivierung, die eine höhere Transformationseffizienz in Pflanzenermöglicht 14,15. Dieses Protokoll wurde ausgiebig mit kleineren Änderungen in japonica16,17,18,19 sowie anderen Sorten wie Indica20,21,22,23 und tropischen japonica24,25verwendet. Tatsächlich verwenden über 80% der Artikel, die die Reistransformation beschreiben, Agrobacterium-vermittelte Gentransformation als Werkzeug13. Bis heute wurden mehrere genetische Transformationsprotokolle entwickelt, die Reissamen als Ausgangsmaterial für die Callusinduktion16,17,18,19verwenden. Über den jungen Blütenstand als Explants für die Callusproduktion ist jedoch nur sehr wenig bekannt. Insgesamt ist es wichtig, ein schnelles, reproduzierbares und effizientes Gentransformations- und Regenerationsprotokoll für die funktionelle Genomik und Studien zur Verbesserung von Pflanzen zu erstellen.
In den letzten Jahren hat die Weiterentwicklung der CRISPR-Cas9-Technologie zu einem präzisen Genom-Editing-Mechanismus geführt, um die Genfunktion zu verstehen und agronomisch wichtige Verbesserungen für die Pflanzenzüchtung zu liefern26,27. CRISPR bietet auch erhebliche Versprechen für die Manipulation der männlichen Reproduktionsentwicklung und Hybridproduktion. In dieser Studie nutzten wir ein Gen-Knockout-System mit CRISPR-Cas9-Technologie und koppelten es an ein effizientes Reisgentransformationsprotokoll, das junge Blütenstände als Explanten verwendete, wodurch stabile männliche sterile Linien für die Untersuchung der Reproduktionsentwicklung geschaffen wurden.
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Protocol
1. sgRNA-CAS9 Pflanzenexpressionsvektorkonstruktion und Agrobacterium-vermittelte Transformation
- Ziel eines männlichen sterilen Genos OsABCG15 in Reis nach der veröffentlichten Literatur28.
- Entwerfen Sie sgRNA für den Zielstandort zwischen 106–125 bp im zweiten Exon von OsABCG15 (Abbildung 1).
- Verwenden Sie T4-Polynukleotidkinase, um die sgRNA-Oligos zu synthetisieren (sgR-OsABCG15-F: 5'TGGCAAGCACATCCTCAAGGGGAT3' und 5'sgR-OsABCG15-R: AAACATCCCCTTGAGGATGTGCTT').
- Verwenden Sie Endonuklease BbsI, um den psgR-Cas9 Backbone-Vektor29zu verdauen.
- Ligate die synthetisierten sgRNA Oligos mit linearisiertem psgR-Cas9 Backbone unter Verwendung von T4 Ligase nach dem Herstellerprotokoll.
- Verdauen Sie mit HindIII/EcoRI die sgRNA-Kassette aus Schritt 1.5 und subklonieren Sie in die HindIII/EcoRI-Site des pCAMBIA1300 Binärvektors für eine stabile Transformation29.
- Bestätigen Sie das konstruierte Plasmid durch Enzymverdauung und Sequenzierung. Verwandeln Sie später das binäre Konstrukt in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm EHA105 und wachsen Sie sie auf Kan/Rif-Selektionsplatten bei 28 °C für 2–3 Tage an.
2. Reis-Genumwandlung und Pflanzengewebekultur
- Callus-Induktion und Regeneration
HINWEIS: Verwenden Sie frische junge Reisblüten als Ausgangsmaterial, um Callus zu induzieren (Abbildung 2).- Sammeln Sie die jungen Blütenstände aus dem Reisfeld oder grünen Haus in der Meiose-Stufe, bestimmt durch Die Blütenlänge von 1,6-4,8 mm (Abbildung 2A)29. Stellen Sie sicher, dass die Reisblüten mit Blattscheide bedeckt sind. Wischen Sie jeden Blütenstand mit einem 70% Alkoholabstrich ab und lassen Sie ihn vor dem Schneiden trocknen.
- Bringen Sie den Blütenstand auf eine saubere sterile Bank. Schneiden Sie es in kleine Stücke (je kleiner desto besser) mit sterilisierter Schere und übertragen Sie dann Stecklinge auf eine Petriplatte mit NBD2 Medium (Abbildung 2B, Tabelle 1).
- Inkubieren Sie die Platte im Dunkeln bei 26 °C für etwa 10-14 Tage, um Callus zu induzieren (Abbildung 3A).
HINWEIS: Verwenden Sie den neu gebildeten Callus für Agrobacterium-Infiltration (Schritt 2.2.7) direkt oder rekonditionieren Sie ein anderes Mal in frischem NBD2-Medium, um mehr Callus zu erhalten. Übertragen Sie den Callus alle 8–10 Tage in das neue NBD2-Medium.
- Transformation und Kokultivierung
- Verwenden Sie A. tumefaciens-Bakterien, die das binäre Plasmid aus Schritt 1.6 für die Transformation enthalten. Bewahren Sie die A. tumefaciens-Stämme in YEB-Medium(Tabelle 1) mit 50 % Glycerin bei -80 °C für die weitere Verwendung auf.
- Streifen A. tumefaciens von einem -80 °C Glycerinbestand zu YEB Agar Medium, das selektive Antibiotika enthält (Tabelle 1) und wachsen bei 25–28 °C für 48–72 h, damit Kolonien auftreten können.
- In einem 50 ml konischen sterilen Reagenzglas wird eine einzelne Kolonie von der YEB-Platte mit selektiven Antibiotika auf 5 ml flüssiges YEB-Medium mit denselben selektiven Antibiotika (Tabelle 1)geimpft. Schütteln Sie auf einem Orbital-Shaker bei 250 x gbei 25–28 °C, bis Bakterien auf eine OD600 von 0,5 anwachsen.
- 1 ml bakterielle Suspension zu 100 ml YEB-Medium (Tabelle 1) mit den gleichen selektiven Antibiotika in einem 250 ml konischen Kolben hinzufügen und auf einem Orbital-Shaker bei 250 x gschütteln, bei 28 °C für 4 h.
- Zentrifuge bei 4.000 x g für 10 min bei Raumtemperatur, um Bakterien zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand.
- Das bakterielle Pellet mit AAM-AS-Medium (Tabelle 1) aussetzen und die Suspension auf eine OD600 = 0,4 verdünnen.
HINWEIS: Die perfekte OD der bakteriellen Suspension ist entscheidend für eine effiziente Transformation. Es hilft bei der Beseitigung überschüssiges bakterielles Wachstum auf dem Callus. - Sammeln Sie rund 150 gesunde, leichtgelbe zerbrechliche embryogene Calli aus Schritt 2.1.3 in einen 150 ml sterilen Kolben. Fügen Sie 50–75 ml bakterielle Zellsuspension ab Schritt 2.2.6 in den sterilen Kolben und fügen Sie dann etwa 10-25 ml frisches AAM-AS-Medium hinzu, um den Calli für 10–20 min einzutauchen und gelegentlich zu schütteln.
- Gießen Sie die bakterielle Suspension vorsichtig aus dem Kolben und trocknen Sie die überschüssige bakterielle Suspension aus dem Callus mit sterilem Filterpapier #1 oder Tissuepapier. Dann legen Sie sie auf eine Petrischale mit NBD-AS Medium (Tabelle 1) mit einem sterilen Filterpapier #1 bedeckt. Bei 25–28 °C im Dunkeln 3 Tage lang inkubieren und auf bakterielles Überwuchern überprüfen.
- Auswahl für widerstandsfähigen Callus
- Nach 3 Tagen Kokultivierung die Calli mit einem sterilen Filterpapier in eine sterile Petrischale geben.
- Lufttrocknen Sie den Calli für 2 h auf einer sauberen Bank. Stellen Sie sicher, dass der Callus nicht am Filterpapier haftet.
- Übertragen Sie die Calli gleichmäßig mit steriler Pinzette auf das Primäreselektionsmedium NBD2 (mit 40 mg/L Hygromycin und 250 mg/L Timentin) (Tabelle 1). Kultur calli für 2 Wochen bei 25–28 °C im Dunkeln.
- Nach 2 Wochen Calli gleichmäßig auf eine neue Platte mit frischem Selektionsmedium NBD2 (mit 40 mg/L Hygromycin und 250 mg/L Timentin) übertragen (Tabelle 1). Kultur die Calli für weitere 2 Wochen bei 25–28 °C im Dunkeln.
- Callus-Differenzierung
- Transfer Callus auf frisches MS Medium (mit 25 mg/L Hygromycin und 150 mg/L Timentin) (Tabelle 1). Kultur unter dem Licht bei 25–28 °C für ca. 2 Wochen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4.1 noch einmal.
- Übertragen Sie die Triebknospen auf das neue MS-Medium (mit 10 mg/L Hygromycin), um mehr Triebe zu vermehren.
- Wurzelinduktion
- Übertragen Sie die neuen Triebe in 1/2 MS medium (Tabelle 1). Kultur unter dem Licht bei 25 °C - 28 °C. Die transformierten Pflanzen produzieren Wurzeln innerhalb von 2 Wochen.
- Nach 1 Woche, übertragen Sie die Pflanzen zu reinigen Töpfe, die die Pflanze zu reinigen, um Austrocknung zu verhindern.
3. Genotyp-Identifikation
- Sammeln Sie junge Blätter aus neu erzeugten Pflanzen für die gesamte DNA-Extraktion mit der Cetyltrimethyl-Ammoniumbromid -Methode (CTAB)31.
- Wählen Sie anhand der genomischen DNA als Vorlage die Primer (Hygromycin-F: 5' GATGTTGGCGACCTCGTATT 3' und Hygromycin-R: 5' CGAAGAATCTCTCTTTCA 3' in der Hygromycin-Region) aus, um die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchzuführen, um die Transgenintegration und die Frequenzen zu validieren (Abbildung 4). Folgende PCR-Bedingungen: 94 °C für 5 min; 36 Zyklen (94 °C für 30 s; 56 °C für 30 s; 72 °C für 1 min ); 72 °C für 7 min. Erfolgreiche PCR-Reaktionen ergeben ein 604 bp Amplikon.
- Führen Sie eine weitere PCR-Datei durch, um die genomische Region um die CRISPR-Zielstandorte mit spezifischen Primern (OsABCG15-ID-F: 5' GTCTCTCTCACAACAGTTTCT 3' und OsABCG15-ID-R: 5' TTGGTGTTTAAAACATTGCTAT 3') zu verstärken, um den Genotyp der Transformatoren zu identifizieren. Die PCR-Bedingungen sind die gleichen wie in Schritt 3.2.
- Verwenden Sie PCR-Fragmente aus Schritt 3.3 direkt für die Sanger-Sequenzierung, um Mutationen zu identifizieren.
4. Beobachten Sie den grundlegenden Phänotyp des Mutanten
- Bereiten Sie die I2-KI-Lösung vor: 2 g KI (Kaliumjodid) in 10 ml destilliertem Wasser auflösen und dann 0,2 g I2 (resublimed Jod) darin hinzufügen. Nach dem Mischen das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 100 ml bringen.
- Bereiten Sie die FAA-Lösung (63% wasserfreies Ethanol, 5% Eisessigsäure, 5% Formaldehyd und 27% Wasser) vor und mischen Sie vor der Verwendung.
- Die 0,5% Toluidin-Blaufärbungslösung vorbereiten: 0,5 g Toluidinblau in 100 ml destilliertem Wasser auflösen.
- Führen Sie eine vegetative phätotypische Beobachtung durch, indem Sie die ganzen Pflanzen mit einer Digitalkamera bebildern.
- Führen Sie reproduktive Phänotyp Beobachtung, entfernen Sie die Paläa und Lemma aus dem Florett. Nehmen Sie Fotos von ganzen Anthern unter einem Stereomikroskop auf.
- Beobachten Sie die Pollenlebensfähigkeit durch Jodfärbung.
- Wählen Sie reife Reisspieße vor der Blütenanthese, entfernen Sie die Paläa und Lemma, um die Anther freizusetzen.
- Nehmen Sie 6 Anther und legen Sie sie auf eine Glasrutsche. Fügen Sie 1 Tropfen destilliertes Wasser hinzu, zerkleinern Sie den Anther gut mit einer Pinzette, um die Pollenkörner freizusetzen, und fügen Sie dann 2–3 Tropfen I2-KI Lösung hinzu. Abdeckung mit dem Coverslip.
- Beobachten Sie unter einem Mikroskop mit niedriger Vergrößerung. Pollenkörner, die schwarz gefärbt sind, zeigen eine kräftigere Lebensfähigkeit, keine Farbe oder gelbbraun gefärbt eaktiert oder degeneriert.
- Führen Sie einen halbdünnen Abschnitt Reis-Anther
- Fixieren Sie die Reisblumen aus verschiedenen Entwicklungsstadien in eine FAA-Lösung. Vakuumieren Sie die Materialien bei 4 °C (in der Regel 15 min), damit das Fixativ in das Gewebe eindringen kann, bis das Material auf den Boden der Sammelflasche sinkt.
- Ersetzen Sie dies am nächsten Tag durch eine neue FAA-Lösung. Sobald das Material nach unten sinkt, mit 70% Ethanol ersetzen und bei 4 °C für den langfristigen Einsatz lagern.
- Dehydrieren Sie die Materialien mit unterschiedlichen Ethanolgradienten (70%, 80%, 95% jedes Mal für 30 min, 100% Ethanol für 2 h, 100% Ethanol mit etwas Safraninfarbstoff für 2 h).
HINWEIS: Fügen Sie ein wenig Safranin Farbstoff in die zweite 100% Ethanol, um die Anther für eine einfachere Schnitt nach. - Führen Sie die Einbettung durch befolgen sie der Anweisung des Herstellers (Tabelle der Materialien). Dann im Ofen bei 60 °C für 48 h vor dem Schnitt backen.
- Schneiden Sie die Probe mit einem Mikrotom auf eine Dicke von 2 m ab. Fügen Sie einen Tropfen Wasser auf der Glasrutsche hinzu. Nehmen Sie dann die dünnen Abschnitte, die Antherblöcke enthalten, mit Zangen auf und legen Sie sie auf die Oberfläche des Wassertropfens auf den Rutschen.
- Legen Sie die Rutschen auf das Wasserbad bei 50 °C, um die Abschnitte vollständig zu verteilen, damit sie fest an der Rutsche haften.
- Verwenden Sie 0,5% Toluidin blau Lösung Flecken die Dias für 30 min. Dann mit Wasser abspülen und in der Dunstabzugshaube trocknen. Mit neutralem Baumkleber versiegeln. Legen Sie vorsichtig einen Deckelrutsch auf die Rutsche und trocknen Sie in der Dunstabzugshaube.
- Beobachten und fotografieren Sie die Probe unter dem Mikroskop.
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Representative Results
Gezeigt wird hier der Einsatz von Gen-Editing-Technologie, um eine männliche sterile Linie für zukünftige Forschung von Agrobacterium-vermittelte genetische Transformation in Reis zu schaffen. Um die männliche sterile Linie von osabcg15zu erstellen, wurde CRISPR-CAS9-vermittelte Mutagenese für die binäre Vektorkonstruktion verwendet. Die sgRNA wurde vom OsU3-Promotor angetrieben, während die Expressionskassette von hSpCas9 vom doppelten 35S-Promotor angetrieben wurde und der mittlere Vektor in einem einzigen binären Vektor pCAMBIA1300 für Agrobacterium-vermittelte stabile Transformation von Reis zusammengesetzt wurde. Eine grafische Darstellung des Konstrukts, das für CRISPR/Cas9-vermittelte Mutagenese von Reis verwendet wurde, ist in Abbildung 1Adargestellt.
Abbildung 2 und Abbildung 3 stellen das gesamte Verfahren der Reistransgenproduktion dar. Die jungen Blütenstände wurden als Explanten ausgewählt (Abbildung 2) und induzierten den friable embryogenen Callus (FEC) innerhalb von 14 Tagen nach der Impfung auf dem NBD2-Medium (Abbildung 3A). Die embryogenen Calli wurden direkt für Agrobacterium-vermittelte Transformation (Abbildung 3C) oder Subkultur für die Proliferation verwendet, um mehr Calli für weitere Infektionen zu erhalten (Abbildung 3B). Nach der Kokultivierung für 48 h auf NBD2-AS Medium bei dunklen Bedingungen (Abbildung 3D) wurden die Calli auf eine zweite Runde des Selektionsmediums verschoben. Nach 10-14 Tagen zeigten transformierte Calli einige kleine neu gebildete Mikrocalli am Rande der Mutter Calli, während sich die Farbe der untransformierten Calli in Braun verwandelte und schließlich starb(Abbildung 3E,F). Später wurden gesunde und cremig gefärbte Calli zweimal in das Regenerationsmedium übertragen. In dieser Phase zeigte transformierte Calli nach und nach grüne Flecken (Schießknospen)(Abbildung 3G,H). Diese neu erzeugten Grünflecken wurden in einer sterilen Plastikflasche mit Regenerationsmedium kultiviert, um das Triebwachstum zu ermöglichen (Abbildung 3I), und dann (als frische Triebe) in ein 1/2 MS-Medium verschoben, um Wurzeln zu induzieren. Später wurden gesunde und kräftig wachsende Triebe mit gut entwickelten Wurzeln geerntet (Abbildung 3J).
Insgesamt wurden 21 regenerierte Sämlinge gewonnen. Die PCR-Verstärkung für den Hygromycin-Bereich zeigte, dass 18 von 21 das entsprechende Band verstärken können, was darauf hindeutet, dass diese Linien transgen sind (Abbildung 4), und die entsprechende Transformationshäufigkeit beträgt etwa 85,71% (Tabelle 2). Die Transformationsmittel wurden genotypisiert, um die Mutationen an der sgRNA-Zielstelle(n) mit Primern zu identifizieren, die die Zielregion durch PCR-Amplicon und Sanger-Sequenzierung überspannen, unter 18 T0 transgenen Pflanzen, acht heterozygoten Linien und drei homozygoten Linien waren CRISPR-Cas9 positiv, mit entsprechenden Mutationsfrequenzen von 61,11%(Abbildung 1B, Tabelle 2).
Die homozygoten Knockout-Mutanten wurden durch grundlegende männliche Fortpflanzungsorganbeobachtung validiert (Abbildung 5). Die Anther von osabcg15 waren kleiner und blasser als die der Wildart (Abbildung 5A,D), und es fehlten reife Pollenkörner (Abbildung 5B,E). Transversalschnittmikroskopie wurde durchgeführt, um die anther morphologischen Defekte in osabcg15 im Vergleich zum Wildtyp zu untersuchen. In Stufe 10 wurden wilde Mikrosporen rund geformt und mit dunkelblau gefärbtem Exin e.V. verfüllt (Abbildung 5C). Im Gegensatz dazu kollabierten osabcg15 Mikrosporen und degradierten, nur Trümmer von degeneriertem Mikrosporen existieren in der Anther-Locule (Abbildung 5F).
Abbildung 1: Konstruktinformationen für das CRISPR/Cas9-System und gezielte Mutagenese des OsABCG15. (A) Die sgRNA wurde vom OsU3-Promoter angetrieben, während die Expressionskassette von hSpCas9 vom doppelten 35S-Promotor angetrieben wurde; Der mittlere Vektor wurde in einem einzigen binären Vektor für Agrobacterium-vermittelte stabile Transformation von Reis zusammengestellt. (B) Die Sequenz (5'-AAGCACATCCTCAAGGGGAT-3') im zweiten Exon des OsABCG15-Gens wurde als Zielort von sgRNA ausgewählt. Drei Arten von homozygoten Mutationsereignissen wurden von CRISPR-Cas9 im Japonica-Sorte 9522-Hintergrund erzeugt, und Sanger-Sequenzierungschromatogramme von CRISPR-Cas9-induzierten Mutationsstellen werden gezeigt. Die Linie 9522osabcg15-1 hat ein Single-Nukleotid (1-nt) 'A' Insertion; Zeile 9522osabcg15-2 hat ein Single-Nukleotid (1-nt) 'G' Insertion; und Zeile 9522osabcg15-3 hat eine Single-Nukleotid (1-nt) 'G' Löschung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ausgangsmaterialien für die Induktion von Callus. (A) Junge Reisblüten im Meiosestadium. (B) Sezierte junge Blütenstände, die auf dem NBD2-Medium wachsen. Bar = 2 cm in (A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Verfahren zur Herstellung transgener Linien durch Agrobacterium-vermittelte Transformation. (A) Reis-Calli, die aus den jungen Blütenstand erzeugt werden. (B) Subkultur von Calli. (C) Inkubation von Calli mit A. tumefaciens. (D) Ko-Anbau von Calli mit A. tumefaciens. (E) Erster Selektionszyklus von transformierten Calli in Gegenwart von Hygromycin (40 mg/L). (F) Zweiter Selektionszyklus von transformierten Calli in Gegenwart von Hygromycin (40 mg/L). (G) Erste Regeneration der transformierten Calli. (H) Die zweite Regeneration der transformierten Calli, unter Hinweis auf den grünen Triebpunkt in der Kulturplatte. (I) Schießen Sie Induktionskultur. (J) Wurzelinduktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Analyse der Transformationshäufigkeiten von regenerierten Reissämlingen. Verstärkte PCR-Produkte, die ein 604 bp-Fragment (1–8, 10–14, 16–20) nach 1,5% Agarose-Gel-Elektrophorese aufweisen, weisen auf transgene positive Linien hin. Linien, denen das Fragment fehlt, sind nicht transformiert (9, 15, 21), ähnlich dem Wildtyp-Steuerelement (WT). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Grundlegende phänotypische Beobachtung des Wildtyps (9522) und Mutanten 9522osabcg15-1. (A) Wild-Type (9522) Blume und (D) 9522osabcg15-1 mutierte Blume nach Entfernung der Lemma und Paläa. gl, glume; fi, Filament; lo, lodicule; pi, pistil; st, stamen. (B) I2-KI Färbung von reifen Pollenkörnern aus Wildart (9522) und (E) 9522osabcg15-1 linie. (C) Analyse der Antherentwicklung im Wildtyp (9522) und (F) 9522osabcg15-1 Mutant durch Querschnittsbeobachtung. DMsp, degenerierte Mikrosporen; E, Epidermis; En, endothecium; Msp, Mikrospore; T, tapetum. Stäbe = 2 mm in (A) und (D), 100 'm in (B) und (E), 50 'm in (C) und (F). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1: Medienzusammensetzungen für die Reisumwandlung. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: Transformations- und Gen-Editing-Effizienz der Mutanten von OsABCG15, die von CRISPR-Cas9 in der T0-Generation erzeugt werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Künstliche genegene männliche sterile Mutanten werden traditionell durch zufällige physikalische, chemische oder biologische Mutagenese erzeugt. Obwohl dies mächtige Techniken sind, kann ihre zufällige Natur nicht aus der riesigen Menge an modernem genomischem Wissen Kapital schlagen, das das Potenzial hat, maßgeschneiderte Verbesserungen in der molekularen Züchtung zu liefern32. Das CRISPR-Cas9-System ist aufgrund seiner einfachen und erschwinglichen Möglichkeiten zur Manipulation und Bearbeitung von DNA29,33in Pflanzen weit verbreitet. es hat das Potenzial, Zeit im Vergleich zu herkömmlichen Mutagenesemethoden zu sparen.
Hier haben wir ein komfortables Agrobacterium-vermitteltesTransformationssystem entwickelt, das junge Blütenstände als Explanten für die Callusinduktion verwendet. Es gibt einige Schritte im Transgenverfahren, die weggelassen werden können, um Zeit zu sparen. Die Verwendung junger Blütenstände als Ausgangsmaterial ist eine gute Wahl, um die Gesamtdauer der Callusinduktion im Vergleich zur Verwendung von Samen als Expflanzen zu minimieren. Darüber hinaus sind die Zelldifferenzierungs- und Regenerationsfähigkeit sehr stark in den Kali, die von jungen Blütenstände erhalten werden. Dabei kann eine Subkultur von Reis-Calli vermieden werden, was letztlich Zeit spart und das Risiko einer bakteriellen und Pilzkontamination reduziert. Darüber hinaus wurde Timentin als Antibiotikum anstelle von Carbenicillin verwendet, das bei der Hemmung von Bakterien effektiver ist.
Die Studie und das eingeführte Protokoll zur grundlegenden phätotypischen Beobachtung der männlichen Fortpflanzungsentwicklung in Reis ist nützlich für Studenten, die sich für Pflanzenreproduktivbiologie interessieren. Dieses bequeme Protokoll sollte schnell zu erfassen und reproduzierbar für den Einsatz in nachfolgenden Forschungsstudien sein.
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Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen Xiaofei Chen für die Bereitstellung der jungen Reisblüten und Hilfe bei der Herstellung der Reisgewebekultur Medium. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31900611) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2, 4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(II) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
References
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