Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Burada ifade, çıkarma ve rekombinant insan IgG arınma için basit bir yöntem Nicotiana benthamianaGFP erimiş açıklar. Bu protokol, kolon kromatografisi kullanan çok sayıda proteinin saflaştırılması ve görselleştirilmesi için genişletilebilir. Ayrıca protokol, proje tabanlı keşif ler sağlayan, şahsenn ve sanal üniversite öğretim laboratuvarına uyarlanabilir.

Abstract

Çeşitli enfeksiyöz, metabolik, otoimmün, neoplastik ve diğer hastalıklar için terapötik müdahaleler olarak antikorlar için yüksek talep rekombinant antikor üretimi için verimli yöntemler geliştirilmesinde artan bir ihtiyaç oluşturur. 2019 itibariyle 70'ten fazla FDA onaylı monoklonal antikor vardı ve üstel büyüme potansiyeli var. Onların sözüne rağmen, yaygın kullanım için sınırlayıcı faktörler üretim maliyetleri ve karmaşıklığı vardır. Potansiyel olarak, bitkiler düşük maliyetli, güvenli ve kolayca ölçeklenebilir protein üretim stratejileri sunar. Nicotiana benthamiana gibi bitkiler sadece doğru katlayabilir ve karmaşık memeli proteinleri monte ama aynı zamanda memeli hücre kültürleri tarafından sunulan benzer kritik post-çevirisel değişiklikler ekleyebilirsiniz. Bu çalışmada, yerli GFP ve insan monoklonal antikorlar erimiş yeşil floresan protein (GFP) bir asit kararlı varyantı kullanarak, n. benthamiana bitkilerden tüm geçici antikor ekspresyonu ve arıtma süreci görselleştirmek başardık. Deneyin amacına bağlı olarak, yerli GFP füzyonbitkilerde ifade aşamasında daha kolay görselleştirme sağlayabilir, asit kararlı GFP füzyon aşağı işleme sırasında görselleştirme sağlarken. Bu ölçeklenebilir ve basit prosedür sadece birkaç küçük bitkiler kullanarak birkaç gün içinde son derece saf antikor veya antikor füzyon proteinleri miligram miktarlarda üretmek için tek bir araştırmacı tarafından yapılabilir. Böyle bir teknik antikor saflaştırma süreci ve potansiyel olarak diğer birçok proteinlerin her türlü görselleştirme için genişletilebilir, bitki ve diğer ifade sistemlerinde hem de. Ayrıca, bu teknikler sanal talimatlardan yararlanabilir ve moleküler biyoloji teknikleri konusunda en az deneyime sahip lisans öğrencileri tarafından bir öğretim laboratuvarında yürütülebilir ve gerçek dünya uygulamaları ile proje tabanlı keşif için bir temel sağlar.

Introduction

Endüstri raporları, Amerika Birleşik Devletleri'nde en çok hasılat yapan yirmi ilaçtan 13'ünün biyolojik (protein bazlı ilaçlar) olduğunu ve bunların dokuzunun antikor olduğunu göstermektedir. 2019 yılı itibariyle, çeşitli klinik gelişimevrelerinde570'in üzerinde antikor (Ab) terapötik1,2,3idi. Mevcut küresel Ab satışları 100 milyar USD aşan ve monoklonal Ab (mAb) terapötik pazar 20251,4tarafından 300 milyar USD kadar üretmek bekleniyor. Bu kadar yüksek talep ve beklenen gelir artışları ile, araştırmacılar daha yüksek kalite ve daha düşük maliyetler ile, her zamankinden daha büyük bir ölçekte Ab terapötik üretmek için yollar geliştirmek için çalışıyoruz. Bitki tabanlı ifade sistemleri Ab terapötik uygun fiyatlı ve büyük ölçekli üretim için geleneksel memeli hücre hatları üzerinde çeşitli avantajları var5,6. Bitkilerde protein terapötik üretimi ("moleküler pharming") pahalı biyoreaktörler veya hücre kültürü tesisleri geleneksel memeli hücre kültürü teknikleri7,8gibi gerektirmez. Bitkiler insan patojenlerine byüklenici olamaz, potansiyel kontaminasyonu en aza indirir9. Hem geçici hem de transgenik bitki bazlı protein ekspresyonu memeli veya bakteri üretim sistemlerine daha düşük maliyetli alternatifler olarak kullanılabilir10. Mahsul üretimi için transgenik bitkiler tercih edilebilse de, bu yöntemi kullanarak rekombinant protein üretimi haftalar ile aylar arasında sürebilir. Şırınga veya vakum agroinfiltrasyon yoluyla viral vektörler kullanarak geçici ifade gelişmeler, sırasıyla, gün11, 12,13,14istenilen proteinin küçük ve büyük ölçekli üretim için izin verir. Ebola, Dang ve Zika'ya karşı mAbs üretimi ve çok sayıda diğer rekombinant proteinler, hızlı ve verimli N. benthamiana bitkiler15geçici ifade kullanılarak üretilmiş ve saflaştırılmış 15,16,17,18,19. Bu koşullar geçici bitki tabanlı ifade birden fazla Ab terapötik ve bu protokol20gösterilen yöntemler geliştirmek için cazip bir seçenek olun.

Birinci nesil mAb'ler murine türevidir, bu da insan deneylerinde kullanıldığında spesifik olmayan immünjenite ile sonuçlanır21. Zamanla, şeymerik, insancıl, ve sonunda, tamamen insan Abs Ab terapötik tarafından indüklenen immünjenite yi tirmek için üretildi. Ne yazık ki, bu Abs bazıları hala glikozilasyon farklılıkları nedeniyle konak immünojenite neden21. Tesis mühendisliğindeki gelişmeler Ab glikanlarının modifikasyonuna olanak sağlamıştır, bu da ab'nin stabilitesi ve fonksiyonu glikozilasyon durumundan önemli ölçüde etkilenebileceğinden gereklidir22. Gelişmeler insanca mAbs üst düzey ifade bitki sistemlerinde üretim izin verdi, insan glikaniçeren ve sonuçta bir kitle üretilen insan ilaç istenilen biyolojik özellikleri19,21.

Rekombinant Abs ek olarak, Ab füzyon molekülleri (Ab füzyon) son yıllarda çeşitli amaçlar için araştırılmıştır. Ab füzyonları genellikle bir molekül veya proteine kaynaşmış bir Ab veya Ab parçasından oluşur ve bağışıklık efektörü hücrelerinden yanıt almak için tasarlanmıştır23. Bu moleküller kanser ve otoimmün hastalıklar24,25,26,27gibi çeşitli patolojiler tedavi etmek için potansiyel terapötik müdahaleler olarak oluşturulmuştur. Rekombinant bağışıklık kompleksleri (RİCs) aşı adayları28olarak istihdam edilmiştir Ab füzyon başka bir sınıftır. RiCs ab füzyon Fc bölgeleri tanımak için bağışıklık sisteminin yeteneğini yararlanmak ve diğer aşı platformları ile kombine edildiğinde immünojenite geliştirmek için bulunmuştur29,30,31.

Yeşil Floresan Protein (GFP) denizanası Aequorea Victoria elde edilen bir biyolüminesans protein, hangi ultraviyole ışık tarafından heyecanlı yeşil ışık yayan32,33. Yıllar içinde, gen ekspresyonu görsel bir belirteç olarak GFP kullanımı Escherichia coli ifade den çok sayıda protein ekspresyonu sistemleri, N. benthamiana bitkiler34dahil olmak üzere genişletilmiş,35,36,37,38. GFP gibi görünür işaretlerin bilimsel kavramların öğretive öğreniminde çok sayıda etkisi vardır. Çok sayıda giriş seviyesi öğrencisi, öğretilen fikrin çıplak gözle görülemediğinde, moleküler biyoloji ve ilgili alanlar gibi bilimsel kavramları kavramanın zorluklarınıanlatırlar 39. GFP gibi görsel belirteçler, böylece bilimsel süreçlerle ilgili bilgilerin işlenmesine katkıda bulunabilir ve öğrencilerin çok sayıda bilimsel kavramı öğrenmede rapor etme deki zorlukları nazına yardımcı olabilir.

GFP genellikle in vivogen ve ekspresyonu belirtmek için bir belirteç olarak kullanılmasına rağmen, asidik koşullar kullanıyorsanız downstream süreçlerinde görselleştirmek zordur. GFP düşük pH40yapısını ve ortaya çıkan floresan korumak değil çünkü bu durum öncelikle. Geçici asidik ortamlar genellikle protein G, protein A ve protein L kromatografisi gibi çeşitli arıtma süreçlerinde gereklidir, genellikle Ab arıtma için kullanılan41,42,43,44. GFP mutantları asidik koşullar altında floresan korumak için kullanılmıştır45,46.

Burada n. benthamiana bitkilerinde rekombinant IgG füzyon proteinlerinin ekspresyonu, ekstraksiyonu ve saflaştırılması için basit bir yöntem açıklıyoruz. İnsanlaştırılmış bir IgG ağır zincirinin N-terminusuna kaynaşmış geleneksel GFP ürettik ve gfp-igg füzyonu yarattık. Aynı anda, insanlaşmış bir IgG ağır zincirinin N-terminus'una asit-kararlı GFP (asGFP) için bitki kodonu optimize edilmiş bir dizinin füzyonu geliştirdik ve bir asGFP-IgG füzyonu oluşturduk. GFP-IgG üretmenin avantajları arasında ifade sırasında hedef proteinin varlığını görselleştirme yeteneği yer alırken, asGFP-IgG sadece ifade ve ekstraksiyon adımlarında değil, aynı zamanda proteinin saflaştırma adımlarında rekombinant proteinin varlığını da görmenizi sağlar. Bu protokol, N. benthamiana'da üretilen ve düşük pH gerektiren kromatografi teknikleri kullanılarak saflaştırılan bir dizi GFP füzyon proteininin üretimi, saflaştırılması ve görselleştirilmesi için uyarlanabilir. Süreç aynı zamanda yaprak malzeme çeşitli miktarlarda uyarlanmış olabilir. GFP veya asGFP ile etiketlenmiş Abs ve füzyon proteinleri tedaviler için kullanılmak üzere tasarlanmasa da, bu yöntemler deneyler sırasında kontrol olarak yararlı olabilir ve aynı zamanda moleküler ve hücresel biyoloji ve biyoteknoloji için hem bizzat hem de sanal olarak bir öğretim aracı olarak kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. N. benthamiana bitkileri yetiştirmek

  1. Bir tepsiye toprak turba pelet yerleştirin ve daha önce haşlanmış dökün, hala sıcak (~ 40-45 °C), tam genişleme için turba pelet üzerinde su. Peletler tamamen genişletildikten sonra, cımbız kullanarak her turba pelet üzerinde 2-3 N. benthamiana tohumları yerleştirin.
  2. Tepsinin altını kaplayacak şekilde yaklaşık 0,5 su dökün. Tepsiyi tohumlama tarihiyle etiketleyin. Fideleri her gün uygun miktarda gübre ile sulamaya devam edin. Gübre (suda çözünen çok amaçlı bitki gıda) konsantrasyonu genellikle 2.5-2.8 g/L'dir.
  3. Büyüme odasına yerleştirildiğinde tepsiyi bir humidome üst ile kaplayın. Tohumlu turba peletlerini 16 saat fotoperiod ve %60 bağıl nem oranıyla 23-25 °C'de büyüme odasında tutun.
  4. Bir hafta sonra, sadece bir fide ile her pelet bırakarak ekstra bitkiler kaldırın.
  5. Bitkiler 2-3 haftalık olduğunda, her bir turba peletnem kontrol toprak içeren ayrı bir pota aktarın. Bu gösteride Miracle-Gro nem kontrol çömlekçilik toprağı kullanılmıştır.
  6. Günlük 1 g/L gübre ile su. Toprağı asla tamamen kuru bırakmayın. Bitkiler 5-6 haftalıkolduklarında sızmaya hazırdırlar.

2. Sızma için Agrobacterium tumefaciens hazırlanması

NOT: GFP-IgG füzyon yapıları bu yazıda açıklandığı gibi elde edilebilir31. AsGFP geni elde edilmiş ve bu çalışmadan bitki optimize45. Bunsen brülöryanında aşağıdaki adımlar yapılmalı ve kontaminasyonu önlemek için temel aseptik teknikler uygulanmalıdır.

  1. Streak A. tumefaciens EHA105 her yapı için fasulye sarı cüce virüs barındıran EHA105 (asGFP-IgG, GFP-IgG, ışık zinciri) LB agar bir gliserol stok (10 g /L Tryptone, 10 g /L NaCl, 5 g maya ekstresi, 15 g/L agar, 50 μg/mLaac kanami)
  2. 30 °C'lik ayakta kuvözde bir gün büyüyün. Standart koloni ekranı PCR protokolü ile doğrulanması için tek bir koloniyi yalıtın.
  3. Her yapı için doğrulanmış koloni kullanın. Konik tüpü 10 mL LB media (10 g/L tripton, 10 g/L NaCl, 5 g maya özü, 50 g/mL) ile doldurun. Daha sonra 10 μL 100 g/mL kanamisin ekleyin. E. coli kontaminasyonunu önlemek için 10 μL 2,5 g/mL rifampisin ekleyin. Bir gecede 30°C ve 120-150 rpm'de kuluçkaya yatırın.
  4. Ertesi gün, Agrobacterium kültürü OD600 = 0.6-0.9'a yetiştirilirse, sızma için kullanılabilir. Aşırı büyümüşse (OD600 > 1), 1-2 mL antibiyotikle taze LB'ye aktarılmalı ve gerekli OD600'eyetiştirilmelidir. İlk kültürün konsantrasyonuna bağlı olarak, OD600 = 0.6-0.9'a büyümesi iki gün sürebilir.
  5. Bir kez uygun OD600, bir santrifüj kültürleri yerleştirin ve 20 dakika için 4.500 x g santrifüj ile bakteri pelet, oda sıcaklığında (RT).
  6. Her iki örnekten de dekant supernatant, ve sonra son OD almak için 1x infiltrasyon tampon (10 mM 2-(N-morfolino) etanesülfonik asit, 10 mM magnezyum sülfat, koh ile pH 5.5 ayarlanmış her pelet resuspend600 = 0.4. Bu, ilk kültür yoğunluğuna bağlı olarak yaklaşık 15-45 mL infiltrasyon tamponu almalıdır. Her IgG füzyon yapısının eşit hacimli kısmını, her tüpteki yapı başına son OD600 = 0,2'yi elde etmek için ışık zinciri yapısıyla birleştirin.

3. İğnesiz şırınga agroinfiltrasyon

  1. Adım 1 bir düzleştirilmiş ataş ve 5-6 haftalık N. benthamiana bitkiler alın. Ataş'ın keskin kenarını kullanarak, adaxial yüzeyde yaprağın ilk epidermal tabakasında küçük bir delik açın. Sonuna kadar delmekten kaçının.
    NOT: Alt yapraklar infiltrasyon için daha kolay, bitkinin üst yaprakları ise daha zordur. Genellikle, rekombinant proteinlerin ekspresyonu bir bitkinin ortasında bulunan yaprakları en yüksek, ve bu yaprakları da daha az nekrotik olsun.
  2. Adım 2'den hazırlanan Agrobacterium çözeltisi ile 1 mL şırınga, bir iğne bağlı olmadan doldurun. Şırınganın ucuyla önceki adımda yapılan deliği kapatın ve yaprağın arkasından yumuşak karşı basınç uygularken bakterileri yaprağa enjekte etmeye yavaşça bastırın. Çözelti şırıngaya çok fazla basınç uygulamadan enjekte edilirken yaprağın koyulaşmasına dikkat edin.
  3. Yaprak alanının çoğuna en fazla 3-4 kez sızmaya çalışın – aşırı yaprak hasarı protein verimini engelleyebilir. Sızmış bitki yaprağı çoğunlukla alt görünümden karanlık görünür.
    NOT: Bu bakteriyel çözelti yapı başına en az 3-4 bitki için yeterli olmalıdır. Otoklav atmadan önce kalan bakteriyel çözelti.

4. Büyümek ve sızmış N. benthamiana gözlemlemek

  1. Sızmış bitkileri büyüme odasına geri yerleştirin ve her gün su almaya devam edin.
  2. İnmiş bölgelerde kloroz ve nekroz için yaprakları gözlemleyin. Uzun ve kısa dalga UV lambası altında GFP floresan (GFP varsa) için bitkileri gözlemleyin.
  3. Gün 4-5 yapraklarında her iki GFP yapıları en yüksek floresan gösterir. Hasat tüm yaprakları 4-5 dpi (gün sonrası infiltrasyon) ve toplam yaprak malzeme tartmak.
  4. Kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de akış aşağı işleme veya depolamak için hemen kullanın.

5. Protein ekstraksiyonu

  1. Kullanmadan önce arabellek ve blender bardaklarını buzda veya 4 °C'de saklayın.
  2. 1 g bitki malzemesi başına 2-3 mL buz gibi ekstraksiyon tamponu (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, hcl ile pH 8) hazırlayın. Ekstraksiyondan hemen önce ekstraksiyon tamponuna stoktan 2 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve 50 mM sodyum askorbat ekleyin.
  3. Adım 4'ten bitki dokusunu önceden soğutulmuş blender kabına yerleştirin. Blender kabına ölçülen miktarda soğutulmuş ekstraksiyon tamponu ekleyin (adım 5.2'de belirtildiği gibi). Blender kabını blender'ın üzerine yerleştirin. Parafilm önceden kesilmiş bir levha alın ve blender fincan üstüne streç. Gerektiğinde karışım döngüleri arasında iyice karıştırarak, 20 sn aralıklarla homojenliğe karıştırın.
  4. Harmanlanmış malzemeyi bir kabına aktarın. Bir karıştırma çubuğu ekleyin ve protein çözünürlüğünü artırmak ve katıların yağış sağlamak için 30 dakika boyunca 4 °C'de karıştırın.
  5. Buz üzerinde temiz bir beher üzerinde Miracloth 2 kat yerleştirin ve büyük yaprak enkaz kaldırmak için üzerinden özü dökün. Tüm özü dökülür sonra, artık yaprak ekstresi sıkmak için Miracloth katlayın. Ekstre görünür partiküller olmadan koyu yeşil görünmelidir.
  6. Bu numunenin 50 μL'sini yeni bir 1,5 mL tüpe aktarın ve daha sonraki analizler için "toplam ekstresi" etiketini etiketlendirin. Özü santrifüj tüplerine aktarın. 20 dk, 4 °C için 16.000 x g bitki ekstresinin geri kalanını santrifüj ve konik bir tüp için supernatant aktarın.
  7. Çözünür ekstresini 50 mL şırınga ve şırınga cam elyaf filtresi (0,75 m) kullanarak filtreleyin.
  8. Santrifüjden sonra bir numunenin 50 μL'sini toplayın, daha sonra analiz için "çözünür ekstresi" etiketini etiketedin.

6. Protein G kolon kromatografisi prosedürü

NOT: Burada açıklanan protokol Pierce Protein G agarose resin kullanılarak yerçekimi akımı kromatografisi içindir. Farklı bir reçin kullanıyorsanız, ayarlamalar için üreticinin talimatlarına bakın. Resenin kurumasına asla izin vermeyin ve tüm sıvının dışarı akmasını önleyin. Gerektiğinde çıkışı yeniden özetleyin.

  1. 20 mL numune tutan bir polipropilen sütun ayarlayın.
  2. Hedef immünglobulin tipine ve rezorine olan yakınlığına bağlı olarak gerekli bulamaç miktarını tahmin edin. Genel olarak, 1,5 mL yatak hacmi ile toplam bulamaç 3 mL Ab birkaç miligram saflaştırma için yeterlidir.
  3. Dikkatlice kapaklı sütuniçine resuspended bulamaç gerekli miktarda dökün. Sütun çıkışını sütunun altındakinden açın ve arabellek gidene kadar boşalmasını bekleyin.
  4. Hemen üzerine yıkama tampon 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 HCl ile) dökün. Drenaj ve bu yıkama adım 2x tekrarlayın.
  5. Filtrelenmiş numuneyi 5. Ab'nin rezorne bağlanmaması ihtimaline karşı akışın geri kalanını kaydedin.
    NOT: Yeni bir sütuna yeniden akış uygulamak genellikle iyi bir verim ile sonuçlanmaz; bu nedenle yeni yaprak malzeme ile başlamak için tavsiye edilir.
  6. Spesifik olmayan bağlamayı azaltmak için reçiyiyi 10 mL 1x PBS ile iki kez yıkayın. İstenirse, arabellek sütundan geçerken aliquot 50 μL yıkama, hedef Ab'nin bir yıkama tamponuyla dolu olmadığını doğrulamak için sütundan geçer.
  7. PH 8'de 125 μL steril 1 M Tris-HCl ile beş tüp kurun ve etiketlendi. Bu olası yapısal değişiklikleri önlemek için asidik elüs tampon Abs nötralize etmektir. Alternatif olarak, daha az seyreltilmiş numune almak için 30 μL 2 M Tris taban ekleyin.
    DİkKAT: Elüsyon sırasında görselleştirme için UV ışığı kullanılabilir. Bunun elüsiyon süresi boyunca yapılması gerekmez. UV kullanılıyorsa, gözlere ve cilde zarar vermemek için uygun PPE kullandığınızdan emin olun. Uv ışığının elüsyon adımı sırasında kullanılması gerekmez.
  8. Abs'i kolona 5 mL elüsyon tamponu (100 mM glisin, pH 2.5 HCl) uygulayarak ve bir önceki adımdan belirlenen her tüpiçin 1 mL fraksiyon toplayarak elüsyonu saplayın.
  9. 20 mL yıkama tamponu uygulayarak kolonu hemen yeniler, ardından 10 mL yıkama tamponu uygulayın. Resenin asidik bir ortamda uzun süre bırakılmadığından emin olun. Elutions floresan görünmelidir, genellikle en yüksek floresan ikinci elüsiyon görülür ama ekstraksiyon için ekstraksiyon değişebilir.
  10. Depolama için reçini PBS'de %20 etanolün 10 mL'si ile yıkayın ve yarıya kadar boşaltın. Üst, sonra sütunun alt recap ve 4 °C dik tutun.
    NOT: Genellikle protein G recineleri önemli verimlilik kaybı olmadan 10 kata kadar yeniden kullanılabilir. Belirli ayrıntılar için üreticinin yönergelerine bakın.
  11. Elüsyon tamponu boş olarak kullanarak, 280 nm'de emiciliği ölçerek bir spektrofotometre kullanarak Ab konsantrasyonu belirleyin. Eluatları -80 °C'de ve her fraksiyonun 50 μL'lik kısmını daha fazla analiz için ayrı bir tüpe saklayın.

7. GFP-Ig füzyon algılama için SDS-PAGE

  1. SDS-PAGE'i kurmadan önce tüm örnekleri hazırlayın.
    1. 4 μL numune tamponu ekleyin (örnek tamponu 6kat azaltArak: 3,0 mL gliserol, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 mL 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 mg bromofenol mavisi); (6x non-reducing örnek tampon: 3.0 mL gliserol, 1 g SDS, 7 mL 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 mg bromofenol mavisi) için 20 μL her örnek (toplam ekstresi, çözünür ekstresi, akış, yıkama, tüm elution fraksiyonları) analiz için. Tüp kapaklarının güvenli bir şekilde sabitlendirilmesini sağlayın.
    2. Sadece bir kaynar su banyosunda 5 dakika için örnekleri azaltarak tedavi ve sonra buz üzerinde 5 dakika için örnekleri koyun. ~5 s için mikrosantrifüj de spin örnekleri ve jel kuyuları içine toplama sırasına göre her örnek 20 μL yükleyin. Ayrı bir kuyuda 3 μL çift renkli protein merdiveni yükleyin.
  2. SDS-PAGE jelini sabit 100 V'de istenilen protein bandı ayrımına çalıştırın; yaklaşık 1,5 saat sürer. Protein ayrımının bir göstergesi olarak merdiveni izleyin.
  3. GFP floresansını gözlemlemek için jeli UV'nin altında görselleştirin.
  4. İstenirse, her örnekte toplam proteindeğerlendirmek için Coomassie leke ile jel leke. Alternatif olarak, belirli Abs kullanarak hedef protein değerlendirmek için batı leke yapmak.
    NOT: Hem Coomassie boyama ve batı leke standart protokolleri 47 ,48aşağıdaki yapılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu çalışma, rekombinant proteinler üretmek ve aşağı akım süreçleri boyunca görselleştirmek için kolay ve hızlı bir yöntem göstermektedir. N. benthamiana kullanılarak ve sağlanan protokolü izleyerek, burada açıklanan rekombinant protein üretimi bir haftadan kısa bir sürede sağlanabilir. Bitki ekspresyonu, ekstraksiyonu ve saflaştırmanın genel iş akışı Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 1B nekroz(Şekil 1B-1) veya kloroza bağlı yaprak morfolojik değişikliklerini tasvir ederken, 2 haftalık fideler, 4 haftalık bitkiler ve 6 haftalık bitkilerden bitki büyüme aşamaları sırasıyla Şekil1A'da (1-3) gösterilir. İnfiltrasyondan sonra enjeksiyon bölgesinde 3-5 gün arasında nekroz oluşabilir. Bu değişiklikler genellikle proteinin ifade edilen özelliklerine ve sızmış bitkilerin sağlığına bağlıdır (daha fazla tartışmada incelenir). Aynı anda, kloroz da kullanılan bitkilerin sağlığına güvenebilir (daha fazla tartışma da incelenmiştir). Agrobacterium büyüme süreci ve infiltrasyon için hazırlık Şekli 1C'degösterilmiştir. Şekil 1C-1, Agrobacterium'unizole kolonilerini görüntüler. Şekil 1C (2-5), tek bir izole koloni ile aşılandıktan sonra ortamın beklenen görünümünü görüntüler. Bu adımlarla ilgili daha fazla bilgi için Şekil 3'e bakın. Bitki infiltrasyon işlemi Şekil 1D'de gösterilmiştir ve sızmamış bir bitki ile başlar ve ardından sızma işlemi yapılır. Bitki proteinlerinin ekspresyonu, ekstraksiyonu ve açıklanması Şekil 1E'degösterilmiştir. Yaprak malzeme bir blender yerleştirilir ve homojenize edilir, Şekil 1E (1-3) gösterilir. Daha sonra toplam homojenliği temsil eden bir örnek alınır. Daha sonra bir Miracloth (gazlı bez hatta bir kahve filtresi azaltılmış giderleri yerine geçebilir) ile süzülür ve açıklık süspansiyon santrifüj edilir. Santrifüj, Şekil 1E (4-6)'dagösterildiği gibi supernatant'ın kalan malzemelerden ayrılmasını sağlar. Açıklığa kavuşturulan süpernatant daha sonra Protein G affinity kromatografi sütunu, Şekil 1F (1-3) yüklenir. Proteinin çoğu bağlandıktan sonra, Şekil 1F-4, proteinler reçin Şekil 1F (5,6)eluted.

Tablo 1, pBY'de ASGFP45 (üst sıra) üretmek için kullanılan bitki optimize edilmiş nükleik asit dizilerini görüntüler! KEAM-GFPasH vektörü bu çalışmada GFP-IgG füzyonunu ifade etmek için kullanılan PBYEAM-GFPHgp vektöründe asGFP-IgG füzyonu ve GFP33 (alt sıra) ifade etmek için kullanılmıştır. Nükleik asit dizileri amino asit dizilerini belirlemek için Expasy protein çevirme aracı (https://web.expasy.org/translate/) kullanılarak incelendi.

Bu protokol kullanılarak hazırlanan temsili bir Agrobacterium plakası Şekil 2'degösterilmiştir. İstenilen koloniler şekil ve renk olarak yuvarlak ve düzgün görünmelidir. Plakanın merkezine yakın kolonilerin kanamisin direncini ifade etme olasılığı daha yüksek. Sıvı kültürler tek bir izole koloniden hazırlanacak.

Kültürleri içeren ortamların beklenen görünümü Şekil 3'tegösterilmiştir. İzole edilmiş bir koloninin ilk aşılanması üzerine LB ortamı Şekil 3A'dagösterildiği gibi açık sarı ve yarı saydam görünür. Bir gecede 30 °C'de izole edilmiş bir koloninin kuluçkaya yatırılmasından sonra LB ortamı bulanık görünecektir. Şekil 3B'degösterildiği gibi, lb'de büyüme olduğunda nesneler artık ortam aracılığıyla görülemez. Santrifüjden sonra tüpün alt kısmında bir pelet oluşmalıdır. Tüp, LB ortamının pelet üzerinde net bir ayrımına sahip olacak ve Şekil 3C'degösterildiği gibi açık sarı ve yarı saydam görünecektir. LB media supernatant atılır ve pelet sızma tamponunda yeniden askıya alınır. 0,2'nin OD600'ünde, ortam Şekil 3D'degösterildiği gibi bulanık görünür. OD600 yöntemlerde açıklandığı gibi ölçülmelidir.

Şekil 4 yaprak infiltrasyon sürecini temsil eder. Bir ataş ile yaprak hafif bir prod tamamen yaprak geçmez yaprak epidermis bir mola vermelidir. Sızma tamponu Şekil 4A-C'degösterilen yaprağa enjekte edilebilsin diye kırılan nokta yaprağı zar zor delmelidir. Agrobacterium ve infiltrasyon tampon süspansiyon doğrudan yaprak içinde mola içine enjekte edilir ve biraz sızmış yaprağın rengini değiştirir; bkz. Şekil 4D-F.

IgG füzyonlarını ifade eden yaprakların görünümü Şekil 5'tetemsil edilmektedir. Beyaz ışık altında asGFP-IgG füzyonları(Şekil 5A)ve GFP-IgG füzyonlarını(Şekil 5C)gösteren yaprakları görüntüler. Bu protokoldeki yapılar kullanılırsa, 0.2 OD600'desızdığında, yapraklar gfp-IgG füzyonlarını ifade eden her iki yaprak için 1-5 gün sağlıklı görünmelidir. 5. günde enjeksiyon bölgelerinde hafif bir nekrotik görünüm olabilir, bu da genellikle bu bölgelerdeki bitki dokusunun aydınlatılmasıyla belirgindir. Şekil 5 ayrıca yaprağın üst görünümünden uzun dalga UV ışığı altında asGFP-IgG füzyonlarını(Şekil 5B)ve GFP-IgG füzyonlarını(Şekil 5D)ifade eden yaprakları görüntüler. Her iki yapı için de gün ilerledikçe floresan şiddeti artar. AsGFP-IgG füzyonlarını ifade eden yapraklar, gfp-IgG füzyonlarını tüm günlerde ifade eden yapraklara göre biraz daha az yoğun floresana sahip olma eğilimindedir.

AsGFP-IgG ekstresinin süpernatantı Protein G sütununa eklendiğinde, reçine klorofil pigmentleri bitkisi nedeniyle beyaz ışık altında biraz yeşil olur(Şekil 6A). Kısa dalga UV ışığı altında süpernatant eklenmesi, Şekil 6B'degösterildiği gibi Protein G reçisinde floresan birikimine neden olabilir. Supernatant da UV ışığı altında tek başına floresan olacağını unutmayın. Yine de, asGFP-IgG füzyon reçine bağlanmaya başladığında floresan çok daha konsantre olması bekleniyor.

AsGFP-IgG'nin süpernatantının G reçin proteini ile geçirilmesinden sonra, reçin Şekil 7A'dagösterildiği gibi kısa dalga UV ışığı altında aydınlatılmalıdır. Bu noktada, IgG çoğu rezorin bağlı olacaktır. Elüsyon tamponu eklendikten sonra, G reçinin proteininde bulunan floresan kısa dalga UV ışığı altında görünür hale gelir ve düşük pH'ın daha fazla elüsyon tamponu rezorinden geçerken yoğunluk kaybetmeye başlar. Floresan eluatlarda birikmeye başlar (Şekil 7B). Eluat fraksiyonları floresan değişir. Şekil 8'degörüldüğü gibi floresan ilk elüsyondaki en düşük yoğunluk, ikinci ve üçüncü eluatlarda ise en yüksek yoğunluktadır. Floresan proteinin ekspresyonuna, hasat edilen yaprak materyaline ve deneyde kullanılan diğer koşullara bağlı olacağından, sonuçlar değişebilir.

Arınma işlemi sonlandıktan sonra, numuneler azaltıcı koşullar altında %10 SDS-PAGE jeli üzerinde analiz edilir (numune tamponu DTT içerir ve numuneler 5 dk kaynatılır) ve azaltıcı olmayan koşullar (numune tamponu DTT içermez ve numuneler haşlanmamıştır). Şekil 9A'dagösterildiği gibi, kısa dalga UV ışığına maruz kaldığında, sadece Elution 2 NR şeritli gibi sadece azaltmaya nindirilmeyen numuneler floresan olacaktır. Bu şeridin ilk bant tam ürünün beklenen boyutu ~ 200 kDa floresan olduğunu, asGFP hala konformasyonel doğru olduğunu gösteren. Jelin alt kısmındaki floresan bantlar, azaltıcı tampondan boyadır. ASGFP'nin 95 °C'de veya üzerindeki sıcaklıklara maruz kaldığında 5 dakika floresan kaybettiğini unutmayın; Bu eGFP farklıdır (gelişmiş GFP), aynı koşullar altında bazı floresan koruyacak49,50. Merdivenin iki bant, 75 kDa ve 25 kDa, ayrıca floresan. Şekil 9B, Şekil 9A'daaynı jelin Coomassie lekesini temsil eder. 6-9 şeritli elutions azaltma koşulları altında hazırlanmıştır. Bir jel ve Coomassie-lekeli çalıştırıldığında, bu örnekler ayrı ayrı asGFP-IgG füzyon bileşenleri görüntülemek gerekir. Bu bileşenler arasında GFP (~75 kDa), tek başına ağır zincir (50 kDa), hafif zincir (25 kDa) ve asGFP'nin kendisi (27 kDa) erimiş ağır zincir bulunmaktadır. Olmayan azaltma örnek karşılaştırma amaçlı jel son şeritte dahil edildi ve tek bir büyük bant (~ 200 kDa), hangi iki ağır zincirleri asGFP ve ilgili hafif zincirleri erimiş yapılmış olmalıdır görüntülemek gerekir. Ayrıca, küçük bantları büyük olasılıkla yerli proteazlar neden olur. Bu dekolte proteaz inhibitörleri eklenmesi ile önlenebilir ve her zaman protein ekstresi soğuk tutarak, kolon arıtma yaparken de dahil olmak üzere. IgG füzyon proteininin bireysel bileşenleri Coomassie jel üzerinde olmayan azaltıcı örneklerde ayırt edilemez.

Figure 1
Şekil 1: Bitki ekspresyonu, çıkarma ve arıtma süreçlerinin iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Nükleotit Dizisi Kullanılmış Amino Asit Dizisi
Dizi
için kullanılan
içinde asGFP
pBY! Kartal
-GFPasH
Vektör
kullanılan
ve
Ifa -de
ve
asGFP-IgG
Füzyon		 ATGGTGTCCAAGGGAGAGGAAGCTTCTGGAAGAGCCTTGTTC
CAGTACCCTATGACTTCTAAAATCGAGTTGAATGGCGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTTGCTGGAGAGGGTGTTTCACCCCTTC
ATCTGGAAGATTCAATATGCACGCTTACTGTACTACCGGAGAC
TTGCCTATGTCCTGGGTTGTTATAGCTTCCCCGCTTCAGTACGG
GTTTCACATGTTTGCCCACTACCCTGAGGATATCACTCACTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
CCAAGAATGTTTTCCTGGGTCTTATCTCGACAGAACTTTGA
GGATGGAGGGAGACGGTACTCTTACTACTCACCACGAGTACTC
CCTTGAGGACGGTTGCGTTACTTCCAAGACTACTTTGAACGCTT
CTGGATTCGACCCCAAGGGAGCCACTATGACTAAGTCTTTCGT
CAAACAGCTCCCAAACGAGGTCAAATCACCCCACACGGGCCA
AATGGTATTAGACTTACTTCCACTGTTCTACCTTAAGGAGGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAAGACTGCATCGTTACCCCA
GTTGGCGGCAGAAAAGTTACTCAGCCTAAGGCTCACTTTCTTC
ATACTCAGATCATCATTCAGAAGGACCCAAACGACACCAGAG
ATCACATCGTTCAGACTGAGCTTGCCGTTGCTGGAAATCTTTG
GCACGGCATGGATGAGCTTTACAAGA		 MVSKGEEASGRALF
QYPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEGFTP
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
DRTLRMEGDGTLTT
HHEYSLEDGCVTSK
TTLNASGFDPKGAT
MTKSFVKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQIGTQD
CIVTPVGGRKVTQP
KAHFLHTQIIQKKDP
NDTRDHIVQTELAV
AGNLWHGMDELY
Kahraman
Dizi
için kullanılan
GFP içinde
pBYEAMGFPHgp
Vektör
kullanılan
ve
Ifa -de
onun GFP-IgG
Füzyon		 ATGGCTAACAAGCACCTCTCATTGTCTCTCtTCCTGTGCTCCTTT
GGTCTTTCTGCTTCTTGCTTCtTCTTCTTCTGGGGTGAGCAAGGGCG
AGGAGCTGTTCACCGGGGTGGGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGG
GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA
TCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGT
GACCACCACCTTCAGCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCC
GACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCG
AAGGCTACTACCCAGGAGCGCACCTTCTTCAAGGACGACGG
KARAKACAAGACCCCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACAC
CCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGCATCGACTTCAAGGA
GGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAA
CAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGG
CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCGGC
AGCGTGCAGCTCGCCGACCACCACCACCAGCAGAACACCCCCATCG
GCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACCACCTGAGCAC
CCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGACGCGATCA
CATGGTCCTGCTGGAGTGTGTGACCGCCGCCGGGATCACTCAC
GGCATGGACGAGCTGTACAAGA		 MANKHLSLSLFLVLL
GLSASLASGMVSKG
EELFTGVVPILVELD
GDVNGHKFSVSGE
GEGDATYGKLTLKFI
CTTGKLPVPWPTLV
TTFSYGVQCFSRYP
DHMKQHDFFKSA
MPEGYVQERTIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
KEDGNILGHKLEYN
YNSHNVYIMADKQ
KNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNH
YLSTQSALSKDPNEK
RDHMVLLEFVTAA
Gür

Tablo 1: ASGFP ve GFP oluşturmak için kullanılan diziler

Figure 2
Şekil 2: Kanamisin içeren LB plakaüzerinde yetişen agrobacterium kolonileri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Agrobacterium'unbüyümesi ve işlenmesi boyunca medyanın görünümü. (A) Izole Agrobacterium kolonisinin aşılanmasından hemen sonra LB media'nın görünümü. (B) 30°C.'de izole edilmiş bir koloninin bir gecede kuluçkaya yatırılmasından sonra medyanın varlığı (C) Kültürlerden sonra medyanın görünümü 20 dk boyunca 4.500 x g. (D) Pellet infiltrasyon tamponunda yeniden asılı kalır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: N. benthamiana bitkilerinin sızma süreci. (A-B) Yaprağı hafifçe dürtmek yaprağın üst kısmında ince bir delik açar. (C-D) Agrobacterium süspansiyonunun yaprağa enjeksiyonu. (E) Üst görünümden sızmış Bitki yaprağı. (F) Üst görünümden sızmış birden fazla yapraklı bitki. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: AsGFP-IgG füzyonu ve GFP-IgG füzyonu içeren yaprakların görselleştirilmesi ilk satırda 1 gün sonrası infiltrasyon (dpi) ile başlar ve tüm koşullar için son sırada 5 dpi güne kadar devam eder. A) beyaz ışık altında asGFP-IgG füzyon. B) uzun dalga UV altında asGFP-IgG füzyon. C) GFP-IgG füzyonu beyaz ışık altında. D) Uzun dalga UV altında GFP-IgG füzyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Protein G sütununa eklenen asGFP-IgG ekstresinin süpernatantı. A) Beyaz ışık altında ilave. B) Kısa dalga UV ışığı altında ilave. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Protein G reçinesi kısa dalga UV ışığı altında asGFP-IgG ekstresinin süpernatant sonra sütun üzerinden çalıştırıldı. A) Protein G reçine kısa dalga UV ışığı altında. B) Düşük PH koşullarında proteinlerin elüsasyonu üzerine Protein G rezorin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 8
Şekil 8: Saflaştırma yoluyla düşük pH koşullarına maruz kaldıktan sonra elde edilen asGFP-IgG saflaştırılmış elutions. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: Sütun Örneklerinin SDS-PAGE.. "R" ile etiketlenmiş örnekler azaltma koşullarında, "NR" etiketli numuneler ise azaltmayan koşullardadır. A) UV ışığı altında, elütion 2 NR şeritte görüldüğü gibi, %10 poliakrilamid jelde sadece azaltıcı olmayan örnekler floresandır. 75 kDa ve 25 kDa merdiven bantları da floresan. B) Aynı jelin coomassie boyanmasi örnekteki tüm proteinlerin varlığını ortaya çıkarır. Azaltılmış elutions, hafif zincir olmadan IgG füzyon, ağır zincir, hafif zincir, ve muhtemelen bozulmuş GFP ~ 75 kDa mevcuttur, ~ 50 kDa, ~ 25 kDa, ve ~ 10 kDa, sırasıyla. Buna karşılık, azaltılmış olmayan elutions, bir belirgin bant mevcut, tüm asGFP-IgG füzyon (~ 200 kDa) boyutu ile tutarlı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, sütun arıtma amaçlı asidik ortamlara geçici maruz kalma gerektirenler de dahil olmak üzere, N. benthamiana tesislerinde üretilen herhangi bir rekombinant Ab veya rekombinant proteinin görsel doğrulaması için kullanılabilir42,43,44. Ayrıca, farklı ifade sistemlerinde diğer proteinler için ASGFP füzyon deneysel görselleştirme ve eğitim için yararlı bir araç olabilir. Buradaki protokol, istenilen miktarda rekombinant protein üretmek için daha büyük ve daha küçük miktarlarda yaprak materyaline ölçeklendirilebilir. Açıklanan yöntemler, asidik koşullar altında sabit kalan GFP versiyonlarını tanımlayan ve yapan önceki çalışmalardan yararlanmaktadır46. Kapsamlı önceki çalışmalar immünglobulin etki alanları ilgi bir protein erimiş oluşturduk, genellikle IgG-füzyon olarak adlandırdığı, Bu protokol de barındırabilir28. GFP ve ASGFP'ye kaynaşmış insanlaşmış bir IgG1'den oluşan bir IgG-füzyon uyup ifade ederek, ifade, çıkarma ve saflaştırma işlemleri sırasında istenilen proteinin varlığını görselleştirmeyi başardık.

Yetenekli bir araştırmacı bu protokolü uygularsa, yapraklar 4-5 gün arasında sızma bölgelerinde nekroz işaretleri göstermeye başlar. Ancak, açıklanan vektörleri kullanırken, yaprakların sızmış alanları uygun bakım ile 5 güne kadar sağlıklı görünmelidir. Bu agrobacterium enfeksiyonu kendi başına sonunda bitki hücresi bağışıklık yanıtı51,52bir parçası olarak reaktif oksijen türlerinin birikimi nedeniyle bitki yapraklarının nekroz neden olacağını unutmayın önemlidir . Bu bağışıklık yanıtı ve nekroz sonucu düzeyi hücresel hedefleme, proteinin konumu, üretilen protein türü, ekspresyon vektörü ve kullanılan Agrobacterium suş 53 ,54dahil olmak üzere çeşitli faktörlere göre değişebilir51. Ayrıca, infiltrasyon için kullanılan Agrobacterium optik yoğunluğu (OD600)varyasyonları nekroz düzeylerini etkileyebilir55. Birçok ekspresyon vektörleri sentez (S) faz ve hücre bölünmesi ve dönüşüm sıklığını artırmak için retinoblastom protein bağlamak proteinleri kullanır56,57. Retinoblastom proteinine bağlanmanın neden olduğu gibi protein üretimindeki artışlar nekroza yol açabilir56,57. Bu protokolde kullanılan geminivirus BeYDV replicons değiştirilmiş sürümlerinde kullanılan gibi vektör tasarımı, gelişmeler, yüksek protein ifade düzeyleri korurken nekroz en aza indirilmiş var58. Ayrıca, BeYDV replicons olmayan rekabet, bilinen boyut sınırlamaları olmadan tek bir kaset üzerinde birden fazla protein ifade sağlayan53,59.

Çeşitli faktörler infiltrasyon öncesi ve sonrası bitki büyümesini etkiler, hangi sonunda düşük protein verimi yol açabilir. Tohumlama bitkileri, bitki pelet başına çok fazla tohum daha mütevazı bitki büyümesine yol açan birçok küçük bitki filizi neden olabilir. Bu nedenle, turba pelet başına tohum sayısını azaltarak ve bir hafta sonra ekstra lahana kaldırma daha iyi bitki büyümesi neden olacaktır. Uygun toprak nemini korumak genel bitki sağlığını etkileyen bir diğer faktördür. Aşırı sulama, sualtılama, çok fazla veya çok az gübre ekleyerek kloroz katkıda bulunabileceği ve bitki sağlığını etkileyebilir60,61,62. Nekroz ve kloroz ayrıca hücre stresine neden olan bir proteinin üretimi neden olabilir. Bu fenomen rekombinant immün komplekslerin ekspresyonu ile birçok kez görülmüştür (RIC)56. Protein yapısındaki ve protein füzyonundaki değişikliklerin nekrozu en aza indirmeye yardımcı olabileceğini gözlemledik; ancak, bazı proteinler çeşitli değişikliklerden sonra bile bitkiler için toksik kalabilir. Burada özetlenen ifade vektörleri kullanılarak, protein ekstraksiyonu erken ve önemli nekroz başlangıcından önce yapılabilir, yüksek protein verimi ile sonuçlanan56.

Farklı büyüme koşulları agrobacterium büyümesini yavaşlatabilir ve hatta engelleyebilir. Agrobacterium 28 °C-30 °C'de en iyi şekilde büyür ve 30 °C'nin üzerinde kuluçkaya yattığında ısı şoku yaşanarak hücre bölünmesi hatalarına neden olur62. Büyüme de çok fazla rifampisin eklenmesi ile engellenebilir, farklı Agrobacterium suşları bu antibiyotik daha fazla veya daha az doğal olarak dirençli olarak62. Önerilenden önemli ölçüde daha yüksek OD600 ile infiltrasyon için hazırlanan bakteri kültürü büyük olasılıkla nekroz neden olacaktır55. Kültürün biraz daha yüksek OD600 genellikle verimi etkilemez, ancak 0.1 daha düşük ise, protein verimi önemli ölçüde azalabilir. Ölü hücrelerin birikimi iki koşulda oluşabilir; 1) kültür, OD ölü hücreler olmanın önemli bir kısmını yol ve 2) zarar / kimyasal kalıntı veya yüksek santrifüj hızları gibi büyüme den sonra Agrobacterium öldürme, büyümüştü. Kültürde ölü hücrelerin artan sayıda kullanarak infiltrasyonlar protein ekspresyonu azaltabilir. Ayrıca, çok fazla basınç uygulayarak yaprakları delme yaprakları zarar verebilir ve bu nedenle erken nekroz yol açabilir. Nicotiana benthamianarekombinant proteinlerifade ederken bu olası faktörler göz önüne alındığında , gelişmiş protein üretimine yol açabilir.

Düşük protein verimi elde çıkarma ve arıtma adımlarında bazı sorunlar nedeniyle olabilir. İlk olarak, ekstraksiyon tampon ilgi proteinbağlı olarak optimizasyon gerekebilir. Karıştırma sırasında, bitki materyali görünür yaprak parçaları olmadan homojen olmalıdır. Daha sonra, bazı proteinler çıkarma tamponu çözünme için deterjanlar gerektirir, Tween-20 veya Triton gibi. Diğer proteinler leşme için ~ 7.5 M yüksek konsantrasyonlarda üre gerekebilir, bazı sadece PBS ile elde edilebilir iken. Tamponlar, bitki dokusu, santrifüjler, vb ekstraksiyon işlemi sırasında serin tutulmazsa protein bozulması oluşabilir. Proteaz inhibitörleri ve sodyum askorbat veya ekstraksiyon tampon benzer kimyasalların eksikliği de bozulmaveya agregasyona neden olabilir. PMSF gibi bazı proteaz inhibitörleri hızla bozulur ve sodyum askorbat sulu olmak için biraz zaman alır. Genel olarak, araştırmacılar ilgi protein için en uygun koşulları belirlemelidir.

IgG-füzyonların saflaştırılması, düşük protein verimi elde edilirse değişiklik gerektirebilecek birkaç adım içerir. Tüm işlem sırasında SDS-PAGE ve Western tarafından toplanan örnek alıntıların analiz edilmesi, yöntemlerin hatasını belirlemeye yardımcı olacaktır. Örneğin, akış önemli miktarda protein içeriyorsa, arabelleğin pH'ı değiştirilerek proteinin bağlanması kolaylaşabilir. Çıkarma işlemi sırasında yüksek oranda deterjan kullanılması, özellikle rezorin birkaç kez yeniden kullanılması durumunda resenin bağlayıcı özelliğini etkileyebilir. Resenin doğru depolanması, yöntemlerde açıklandığı gibi, resenin ömrü için hayati önem taşımaktadır. Ayrıca, yıkama adımı rezorin den ilgi proteini kaldırırsa, tamponlar bu sorunu çözmek için yeniden yapılması gerekebilir. Protein saflaştırma ile ilgili diğer sorunlar, genel protein tasarımının daha fazla analiz edilmesini gerektirebilecek yanlış katlanmış veya bozulmuş proteinlere bağlı olabilir. Açıklanan sorun giderme atıfta bu protokolü kullanarak arıtma verimliliğini artırabilir.

Açıklanan GFP-IgG füzyon arıtma bir öğretim ortamında yararlıdır. Görselleştirme bilim eğitiminin temelini oluşturmaktır çünkü öğrencilerin kavramları daha kolay kavramalarını sağlar39. Öğrenciler genellikle moleküler düzeyde kavramları anlamakta güçlük ek olarak yanlış anlamalar rapor39. Özellikle, her adımda belirli protein konumunun anlaşılmasını gerektiren deneyler floresan moleküllerile ilgi protein etiketleme tarafından değiştirilebilir. Bu nedenle, GFP veya asGFP, kullanılan pH ortamına bağlı olarak, öğrenciler için protein arıtma tekniğinin açıklanmasını kolaylaştırmak için floresanlarını kullanmak için kullanılabilir.

Özetle, n. benthamiana tesislerinde bir GFP'ye kaynaşmış bir rekombinant Ab'nin dışavurumlanması ve arınması için basit bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, istenilen hedef proteine kaynaşmış bir Ab'nin saflaştırılması için kullanılabilir. Süreç yaprak malzeme çeşitli miktarlarda karşılamak için düzenlenebilir ve önce protein varlığının görsel belirlenmesi için izin verir, sırasında, ve protein çıkarma ve arıtma sürecinin tamamlanmasından sonra. Bu yöntemler kontrol olarak yararlı olabilir ve öğretim teknikleri için amaçlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Biz video düzenleme için Maria Pia DiPalma teşekkür ederiz. Ayrıca Arizona State Üniversitesi Eğitim Sosyal Yardım ve Öğrenci Hizmetleri Ofisi onların cömert yayın ücreti yardım için teşekkür ederiz. Bu protokol için yapılan araştırmalar Arizona Eyalet Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81 (2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Tags

Biyoloji Sayı 167 antikor monoklonal antikor moleküler pharming agroinfiltrasyon geçici ekspresyon Nicotiana benthamiana yeşil floresan protein asit kararlı yeşil floresan protein antikor füzyonu IgG-füzyon protein G arıtma
<em>Nicotiana benthamiana'da</em> Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P.,… More

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter