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Biology

Production de protéines de fusion IgG exprimées transitoirement à Nicotiana benthamiana

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Nous décrivons ici une méthode simple pour l’expression, l’extraction, et la purification de l’IgG humain recombinant fusionné au GFP dans Nicotiana benthamiana. Ce protocole peut être étendu à la purification et à la visualisation de nombreuses protéines qui utilisent la chromatographie des colonnes. De plus, le protocole s’adapte au laboratoire d’enseignement collégial virtuel et en personne, offrant une exploration axée sur des projets.

Abstract

La forte demande d’anticorps en tant qu’interventions thérapeutiques pour diverses maladies infectieuses, métaboliques, auto-immunes, néoplastiques et autres crée un besoin croissant de développer des méthodes efficaces pour la production d’anticorps recombinants. En 2019, il y avait plus de 70 anticorps monoclonaux approuvés par la FDA, et il y a un potentiel de croissance exponentiel. Malgré leur promesse, les coûts de fabrication et la complexité sont des facteurs limitants pour une utilisation généralisée. Potentiellement, les usines offrent des stratégies de fabrication de protéines peu rentables, sûres et facilement évolutives. Des plantes comme Nicotiana benthamiana peuvent non seulement plier et assembler correctement des protéines mammifères complexes, mais aussi ajouter des modifications post-translationnelles critiques semblables à celles offertes par les cultures cellulaires mammifères. Dans ce travail, en utilisant le GFP indigène et une variante acide-stable de protéine fluorescente verte (GFP) fusionnée aux anticorps monoclonaux humains, nous avons pu visualiser l’ensemble du processus transitoire d’expression et de purification d’anticorps des usines de N. benthamiana. Selon le but de l’expérience, la fusion GFP native peut assurer une visualisation plus facile pendant la phase d’expression dans les plantes, tandis que la fusion GFP acidulée permet une visualisation pendant le traitement en aval. Cette procédure évolutive et simple peut être effectuée par un seul chercheur pour produire des quantités milligrammes de protéines de fusion d’anticorps ou d’anticorps très pures en quelques jours en utilisant seulement quelques petites plantes. Une telle technique peut être étendue à la visualisation de tout type de processus de purification des anticorps et potentiellement de nombreuses autres protéines, à la fois dans les systèmes végétaux et d’autres systèmes d’expression. En outre, ces techniques peuvent bénéficier d’instructions virtuelles et être exécutées dans un laboratoire d’enseignement par des étudiants de premier cycle possédant une expérience minimale préalable avec les techniques de biologie moléculaire, fournissant une base pour l’exploration basée sur des projets avec des applications réelles.

Introduction

Les rapports de l’industrie indiquent que treize des vingt médicaments les plus riches aux États-Unis étaient des produits biologiques (produits pharmaceutiques à base de protéines), dont neuf étaient des anticorps. En 2019, il y avait plus de 570 anticorps (Ab) thérapeutiques à différentes phasesde développement clinique 1,2,3. Les ventes mondiales actuelles d’Ab dépassent les 100 milliards USD, et le marché thérapeutique monoclonal ab (mAb) devrait générer jusqu’à 300 milliards usd d’ici 20251,4. Avec une demande aussi forte et des augmentations prévues des revenus, les chercheurs ont travaillé à développer des moyens de produire des produits thérapeutiques Ab à une échelle toujours plus grande, avec une meilleure qualité et des coûts inférieurs. Les systèmes d’expression à base de plantes ont plusieurs avantages par rapport aux lignées cellulaires mammifères traditionnelles pour la fabrication abordable et à grande échelle d’Ab therapeutics5,6. La production de protéines thérapeutiques dans les plantes (« pharming moléculaire ») ne nécessite pas de bioréacteurs coûteux ou d’installations de culture cellulaire, tout comme les techniques traditionnelles de culture cellulairedes mammifères 7,8. Les plantes ne peuvent pas contracter d’agents pathogènes humains, ce qui minimise la contaminationpotentielle 9. L’expression transitoire et transgénique des protéines végétales peut être utilisée comme alternative à moindre coût aux systèmes de production de mammifères ou de bactéries10. Bien que les plantes transgéniques soient préférées pour la production agricole, la production de protéines recombinantes à l’aide de cette méthode peut nécessiter des semaines à des mois. Les progrès de l’expression transitoire à l’aide de vecteurs viraux par l’agroinfiltration seringue ou vide permettent la production à petite et à grande échelle, respectivement, de la protéine désirée dansles jours 11,12,13,14. La production de mAbs contre Ebola, dengue et Zika, et de nombreuses autres protéines recombinantes, ont été produites et purifiées rapidement et efficacement en utilisant l’expression transitoire dans les plantes de N. benthamiana 15,16,17,18,19. Ces circonstances font de l’expression végétale transitoire une option attrayante pour développer plusieurs ab thérapeutiques et les méthodes démontrées dans ce protocole20.

Les mAbs de première génération étaient de dérivation murine, qui a eu comme conséquence l’immunogénicité non spécifique une fois employée dans les essais humains21. Au fil du temps, chimérique, humanisé, et finalement, abs entièrement humains ont été produites pour diminuer l’immunogénicité induite par ab thérapeutique. Malheureusement, certains de ces abs causent encore l’immunogénicité d’hôte due aux différences dans la glycosylation21. Les développements dans l’ingénierie végétale ont permis la modification d’Ab glycans, qui est essentielle puisque la stabilité et la fonction d’un Ab peuvent être sensiblement affectées par son état de glycosylation22. Les progrès ont permis la production dans les systèmes végétaux d’expression de haut niveau de mAbs humanisés, contenant des glycanes humains et, par conséquent, les traits biologiques désirés d’un produit pharmaceutique humainproduit en série 19,21.

En plus des abs recombinants, les molécules de fusion Ab (Fusions Ab) ont été explorées à diverses fins au cours des dernières décennies. Ab fusions se composent souvent d’un ab ou ab fragment fusionné à une molécule ou une protéine et sont conçus pour obtenir des réponses des cellules effectrices immunitaires23. Ces molécules ont été créées comme interventions thérapeutiques potentielles pour traiter diverses pathologies telles que le cancer et les maladies auto-immunes24,25,26,27. Les complexes immunitaires recombinants (CCI) sont une autre classe de fusions Ab qui ont été utilisées comme candidats vaccins28. Les CCI profitent de la capacité du système immunitaire à reconnaître les régions fc des fusions Ab et ont été trouvés pour améliorer l’immunogénicité lorsqu’ils sont combinés avec d’autresplates-formes vaccinales 29,30,31.

La protéine fluorescente verte (GFP) est une protéine bioluminescente dérivée de la méduse Aequorea Victoria, qui émet de la lumière verte lorsqu’elle est excitée par la lumièreultraviolette 32,33. Au fil des ans, l’utilisation de GFP comme marqueur visuel de l’expression des gènes est passé de l’expression chez Escherichia coli à de nombreux systèmes d’expression protéique, y compris les plantes N. benthamiana 34,35,36,37,38. Les marqueurs visibles, tels que le GFP, ont des implications abondantes dans l’enseignement et l’apprentissage des concepts scientifiques. De nombreux étudiants d’entrée de gamme décrivent des difficultés à saisir des concepts scientifiques lorsque l’idée enseignée n’est pas visible à l’œil nu, comme les concepts de biologie moléculaire et les domainesconnexes 39. Les marqueurs visuels, comme le GFP, peuvent ainsi contribuer au traitement de l’information liée aux processus scientifiques et pourraient aider à atténuer les difficultés que les élèves signalent dans l’apprentissage de nombreux concepts scientifiques.

Bien que le GFP soit souvent utilisé comme marqueur pour indiquer le gène et l’expression in vivo,il est difficile de le visualiser dans les processus en aval si l’on utilise des conditions acides. Cette circonstance est principalement parce que GFP ne maintient pas sa structure et la fluorescence qui en résulte à un faible pH40. Des environnements acides temporaires sont souvent nécessaires dans divers processus de purification, tels que la protéine G, la protéine A et la chromatographie L protéique, souvent utilisée pour la purification ab41,42,43,44. Mutants GFP ont été utilisés pour retenir la fluorescence dans des conditions acides45,46.

Nous décrivons ici une méthode simple pour l’expression, l’extraction et la purification des protéines de fusion IgG recombinantes dans les plantes de N. benthamiana. Nous avons produit le GFP traditionnel fusionné au N-terminus d’une chaîne lourde humanisée d’IgG, créant une fusion GFP-IgG. Simultanément, nous avons développé la fusion d’une séquence optimisée par codon végétal pour un GFP acidulé (asGFP) au N-terminus d’une chaîne lourde humanisée d’IgG, créant une fusion asGFP-IgG. Les avantages de la production de GFP-IgG comprennent la capacité de visualiser la présence d’une protéine cible pendant l’expression, tandis que asGFP-IgG permet de voir la présence de protéines recombinantes non seulement dans les étapes d’expression et d’extraction, mais aussi dans les étapes de purification de la protéine. Ce protocole peut être adapté pour la production, la purification et la visualisation d’une gamme de protéines de fusion GFP produites en N. benthamiana et purifiées à l’aide de techniques de chromatographie qui nécessitent un faible pH. Le processus peut également être adapté à diverses quantités de matériaux foliiques. Bien que les abs et les protéines de fusion étiquetées avec GFP ou asGFP ne soient pas destinés à être utilisés pour des thérapies, ces méthodes peuvent être utiles comme témoins pendant les expériences et peuvent également être utilisées comme un outil d’enseignement pour la biologie moléculaire et cellulaire et la biotechnologie, en personne et virtuellement.

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Protocol

1. Cultiver les plantes de N. benthamiana

  1. Déposer les granulés de tourbe du sol sur un plateau et verser les granulés de tourbe préalablement bouillis, encore chauds (~40-45 °C), l’eau sur les granulés de tourbe pour une expansion complète. Une fois les granulés complètement extensés, placez 2-3 graines de benthamiana N. sur chaque granule de tourbe à l’aide d’une pince à épiler.
  2. Verser environ 0,5 dans l’eau pour couvrir le fond du plateau. Étiquetez le plateau avec la date d’ensemencement. Continuer à arroser les semis tous les jours avec des quantités appropriées d’engrais. La concentration d’engrais (aliments végétaux tout usage solubles dans l’eau) est généralement de 2,5 à 2,8 g/L.
  3. Couvrir le plateau d’un dessus humidome lorsqu’il est placé dans la chambre de croissance. Gardez les granulés de tourbe épépinés dans la chambre de croissance à 23-25 °C, avec une photopériodes de 16 h et une humidité relative de 60 %.
  4. Après une semaine, retirer les plantes supplémentaires en laissant chaque granulé avec un seul semis.
  5. Lorsque les plantes ont entre 2 et 3 semaines, transférer chaque granule de tourbe dans un pot individuel contenant un sol anti-humidité. Cette démonstration a utilisé le sol de mise en pot miracle-gro de contrôle d’humidité.
  6. Arroser quotidiennement avec un engrais de 1 g/L. Ne laissez jamais le sol complètement sec. Les plantes sont prêtes pour l’infiltration quand elles sont 5-6 semaines.

2. Préparation d’Agrobacterium tumefaciens pour infiltration

REMARQUE : Les constructions de fusion GFP-IgG peuvent être obtenues comme décrit dans ce document31. Le gène asGFP a été obtenu et optimisé pour les plantes à partir de cetteétude 45. Les étapes suivantes doivent être effectuées à côté d’un brûleur Bunsen, et des techniques aseptiques de base doivent être appliquées pour éviter la contamination.

  1. Streak A. tumefaciens EHA105 hébergeant le virus nain jaune haricot (BeYDV)19 vecteur d’expression végétale pour chaque construction (asGFP-IgG, GFP-IgG, chaîne légère) à partir d’un stock de glycérol sur l’agar LB (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g d’extrait de levure, 15 g/L d’agar, 50 μg/mL de kanamycine).
  2. Cultivez pendant une journée dans un incubateur permanent de 30 °C. Isoler une colonie unique pour vérification selon le protocole PCR standard de l’écran de la colonie.
  3. Utilisez la colonie vérifiée pour chaque construction. Remplir le tube conique de 10 mL de lb (tryptone de 10 g/L, 10 g/L de NaCl, 5 g d’extrait de levure, 50 μg/mL). Ensuite, ajouter 10 μL de 100 μg/mL de kanamycine. Ajouter 10 μL de 2,5 μg/mL de rifampicine pour prévenir la contamination par E. coli. Incuber à 30°C et 120-150 rpm pendant la nuit.
  4. Le lendemain, si la culture agrobactérienne est cultivée à600 OD = 0,6-0,9, elle peut être utilisée pour l’infiltration. S’il est envahi (OD600 > 1), 1-2 mL doit être transféré à LB frais avec des antibiotiques et cultivé à l’OD600 requis. Selon la concentration de la culture initiale, il peut potentiellement prendre deux jours pour atteindre600 OD = 0,6-0,9.
  5. Une fois à l’OD600approprié, placer les cultures dans une centrifugeuse, et pelleter les bactéries par centrifugation à 4500 x g pendant 20 min, température ambiante (RT).
  6. Supernatant décantant des deux échantillons, puis résuspendez chaque granulé dans le tampon d’infiltration de 1x (10 mM 2-(N-morpholino) acide éthanesulfonique, 10 mM de sulfate de magnésium, ajusté au pH 5,5 avec KOH) pour obtenir l’ODfinal 600 = 0,4. Cela devrait prendre environ 15-45 mL de tampon d’infiltration, selon la densité de culture initiale. Combinez des volumes égaux de chaque construction de fusion IgG avec la construction de la chaîne de lumière pour obtenir l’ODfinal 600 = 0,2 par construction dans chaque tube.

3. Agroinfiltration de seringue sans aiguille

  1. Prenez un trombone redressé et des plants de N. benthamiana vieux de 5 à 6 semaines dès l’étape 1. À l’aide du bord tranchant du trombone, faire une petite ponction dans la première couche épidermique de la feuille sur la surface adaxiale. Évitez de le percer jusqu’au bout.
    REMARQUE : Les feuilles inférieures sont plus faciles à in infiltration, tandis que les feuilles sur le dessus de la plante sont plus dures. En général, l’expression des protéines recombinantes est la plus élevée dans les feuilles situées au milieu d’une plante, et ces feuilles deviennent également moins nécrotiques.
  2. Remplissez une seringue de 1 mL, sans aiguille attachée, avec la solution Agrobacterium préparée dès l’étape 2. Couvrez le trou fait dans l’étape précédente avec l’extrémité de la seringue et poussez lentement pour injecter les bactéries dans la feuille tout en appliquant la contre-pression douce de derrière la feuille. Regardez la feuille s’assombrir au fur et à mesure que la solution est injectée sans appliquer trop de pression sur la seringue.
  3. Essayez de vous infiltrer dans la majeure partie de la zone des feuilles à un maximum de 3 à 4 fois – des dommages excessifs aux feuilles peuvent nuire au rendement en protéines. La feuille de plante infiltrée apparaîtra la plupart du temps foncée de la vue du bas.
    REMARQUE : Cette solution bactérienne devrait suffire pour au moins 3 à 4 plantes par construction. Autoclave toute solution bactérienne restante avant de jeter.

4. Cultivez et observez le N. benthamiana infiltré

  1. Placez les plantes infiltrées dans la chambre de croissance et continuez à arroser quotidiennement.
  2. Observez les feuilles pour la chlorose et la nécrose dans les zones infiltrées. Observez les plantes pour la fluorescence GFP (si GFP est présent) sous une lampe UV à ondes longues et courtes.
  3. Le jour 4-5 montre la fluorescence la plus élevée des deux constructions GFP dans les feuilles. Récoltez toutes les feuilles à 4-5 dpi (jours après l’infiltration) et pesez la matière totale des feuilles.
  4. Utilisez-le immédiatement pour le traitement en aval ou conservez-le à -80 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.

5. Extraction de protéines

  1. Gardez les tampons et les tasses de mélangeur sur la glace ou à 4 °C avant utilisation.
  2. Préparer 2-3 mL de tampon d’extraction glacée (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 avec HCl) par 1 g de matériel végétal. Ajouter 2 mM de fluorure de phényléthylsulfonyl (PMSF) provenant du bouillon (100 mM) et 50 mM d’ascorbate de sodium au tampon d’extraction juste avant l’extraction.
  3. Placer le tissu végétaux de l’étape 4 dans la tasse du mélangeur préchaillé. Ajouter une quantité mesurée de tampon d’extraction réfrigérée à la tasse du mélangeur (comme indiqué à l’étape 5.2). Déposer la tasse du mélangeur sur le mélangeur. Prenez une feuille pré-coupée de parafilm et étirez-la sur le dessus de la tasse du mélangeur. Mélanger à l’homogénéité avec des intervalles de 20 secondes, en remuant bien entre les cycles de mélange au besoin.
  4. Transférer le matériel mélangé dans un bécher. Ajouter une barre de remue-remuer et remuer à 4 °C pendant 30 min pour améliorer la solubilité protéique et permettre la précipitation des solides.
  5. Placez 2 couches de Miracloth sur un bécher propre sur la glace et versez l’extrait à travers elle pour enlever les gros débris de feuilles. Après que tout l’extrait soit versé, pliez le Miracloth pour presser l’extrait résiduel de feuille. L’extrait doit apparaître vert foncé sans particules visibles.
  6. Transférer 50 μL de cet échantillon dans un nouveau tube de 1,5 mL et étiqueter « extrait total » pour analyse ultérieure. Transférer l’extrait dans des tubes de centrifugeuse. Centrifuger le reste de l’extrait végétal à 16 000 x g pendant 20 min, 4 °C et transférer le supernatant dans un tube conique.
  7. Filtrer l’extrait soluble à l’aide d’une seringue de 50 mL et d’un filtre à fibres de verre seringue (0,75 μm).
  8. Recueillir 50 μL d’un échantillon après centrifugation, étiqueter « extrait soluble » pour une analyse ultérieure.

6. Procédure de chromatographie de colonne de protéine G

REMARQUE : Le protocole décrit ici est pour la chromatographie de gravity-flow utilisant la résine d’agarose de protéine de Pierce G. Si vous utilisez une résine différente, consultez les instructions du fabricant pour les ajustements. Ne laissez jamais la résine sécher et empêchez tout liquide de s’écouler. Récapitulez la prise au besoin.

  1. Installez une colonne de polypropylène qui contient 20 mL d’échantillon.
  2. Estimer la quantité de boue nécessaire en fonction du type d’immunoglobuline cible et de son affinité avec la résine. En général, 3 mL de boue totale avec un volume de lit de 1,5 mL est suffisant pour la purification de plusieurs milligrammes d’Ab.
  3. Versez soigneusement la quantité requise de boue résuspendée dans la colonne plafonnée. Ouvrez la sortie de colonne à partir du bas de la colonne et laissez-la s’écouler jusqu’à ce que la majeure partie du tampon soit partie.
  4. Versez immédiatement 10 mL de tampon de lavage 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.4 avec HCl) sur le dessus. Laissez-le s’écouler et répétez cette étape de lavage 2x.
  5. Appliquez l’échantillon filtré de l’étape 5 à la colonne et recueillez le flowthrough — aliquot 50 μL de flowthrough pour une analyse ultérieure. Enregistrez le reste du flux au cas où l’Ab ne se lierait pas à la résine.
    REMARQUE : Le ré-application de la procédure d’écoulement à une nouvelle colonne n’entraîne généralement pas un bon rendement; il est donc conseillé de commencer par de nouveaux matériaux folio.
  6. Lavez la résine deux fois avec 10 mL de 1x PBS pour réduire la liaison non spécifique. Si désiré, aliquot 50 μL de lavage que le tampon s’écoule à travers la colonne pour vérifier que la cible Ab n’est pas élucidé avec un tampon de lavage.
  7. Installez et étiquetez cinq tubes avec 125 μL de Tris-HCl stérile de 1 M au pH 8. Il s’agit de neutraliser les abdos dans le tampon d’élitution acide pour éviter les changements structurels potentiels. Sinon, ajoutez 30 μL de base tris de 2 M pour obtenir un échantillon moins dilué.
    ATTENTION : Pendant l’éution, la lumière UV peut être utilisée pour la visualisation. Cela n’a pas besoin d’être fait pour la durée de l’élitution. Si les UV sont utilisés, assurez-vous de porter des EPI appropriés pour éviter les dommages aux yeux et à la peau. Une lumière UV n’a pas besoin d’être utilisée pendant l’étape d’élitution.
  8. Elute les Abdos en appliquant 5 mL de tampon d’élitution (100 mM de glycine, pH 2,5 avec HCl) à la colonne et de recueillir 1 fractions mL à chaque tube désigné de l’étape précédente.
  9. Régénérez immédiatement la colonne en appliquant 20 mL de tampon de lavage, suivi de 10 mL de tampon de lavage. Assurez-vous que la résine n’est pas laissée dans un environnement acide pendant une longue période. Les élitutions doivent apparaître fluorescentes, souvent la fluorescence la plus élevée est observée dans la deuxième élitution, mais peut varier d’une extraction à l’autre.
  10. Pour le stockage, laver la résine avec 10 mL de 20% d’éthanol dans PBS et laisser égoutter à mi-chemin. Récapitulez le haut, puis le bas de la colonne, et maintenez la verticale à 4 °C.
    REMARQUE : En général, les résines de protéine G peuvent être réutilisées jusqu’à 10 fois sans perte significative d’efficacité. Consultez les lignes directrices du fabricant pour plus de détails.
  11. Déterminer la concentration d’Ab à l’aide d’un spectrophotomètre en mesurant l’absorption à 280 nm, en utilisant le tampon d’élitution comme blanc. Conservez les évasés en -80 °C et aliquot 50 μL de chaque fraction dans un tube séparé pour une analyse plus approfondie.

7. SDS-PAGE pour la détection de fusion GFP-Ig

  1. Préparez tous les échantillons avant de mettre en place le SDS-PAGE.
    1. Ajouter 4 μL de tampon d’échantillon (tampon d’échantillon réducteur de 6 x : 3,0 mL de glycérol, 0,93 g de TNT, 1 g de SDS, 7 mL de Tris 4x (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg de bleu bromophénol); (tampon d’échantillon non réducteur 6x : 3,0 mL de glycérol, 1 g de SDS, 7 mL de Tris 4x (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg de bromophénol bleu) à 20 μL de chaque échantillon (extrait total, extrait soluble, écoulement, lavage, toutes les fractions d’elution) pour analyse. Assurez-vous que les bouchons de tube sont solidement fixés.
    2. Traiter seulement les échantillons de réduction pendant 5 min dans un bain d’eau bouillante, puis mettre des échantillons pendant 5 min sur la glace. Faites tourner des échantillons dans une microcentrifugeuse pendant ~5 s et chargez 20 μL de chaque échantillon dans l’ordre de collecte dans les puits de gel. Chargez 3 μL d’échelle protéique bicolore dans un puits séparé.
  2. Exécutez le gel SDS-PAGE à une séparation constante de 100 V à la bande protéique désirée; cela prend environ 1,5 heure. Surveillez l’échelle comme indicateur de séparation des protéines.
  3. Visualisez le gel sous les UV pour observer la fluorescence GFP.
  4. Si désiré, tacher le gel avec la tache coomassie pour évaluer la protéine totale dans chaque échantillon. Alternativement, effectuez la tache occidentale pour évaluer la protéine cible utilisant des abs spécifiques.
    REMARQUE : La coloration de Coomassie et la tache occidentale peuvent être exécutées en suivant les protocoles standard47,48.

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Representative Results

Cette étude démontre une méthode facile et rapide pour produire des protéines recombinantes et les visualiser tout au long des processus en aval. En utilisant N. benthamiana et en suivant le protocole fourni, la production de protéines recombinantes décrite ici peut être réalisée en moins d’une semaine. Le flux de travail global de l’expression, de l’extraction et de la purification des plantes est indiqué à la figure 1. Les stades de croissance des plantes à partir de semis de 2 semaines, de plantes de 4 semaines et de plantes de 6 semaines sont affichés dans la figure 1A (1-3), respectivement, tandis que la figure 1B représente les changements morphologiques des feuilles dus à la nécrose(figure 1B-1)ou à la chlorose (figure 1B-2). La nécrose peut se produire au site d’injection entre les jours 3-5 après infiltration. Ces changements dépendent souvent des propriétés de la protéine exprimées et de la santé des plantes infiltrées (examinée plus en détail dans la discussion). En même temps, la chlorose peut également compter sur la santé des plantes utilisées (examinée plus en détail dans la discussion). Le processus de croissance d’Agrobactérie et de préparation à l’infiltration est indiqué à la figure 1C. La figure 1C-1 présente des colonies isolées d’Agrobactérie. Les figures 1C (2-5) montrent l’apparence attendue des médias après qu’il soit inoculé avec une seule colonie isolée. Consultez la figure 3 pour plus de détails sur ces étapes. Le processus d’infiltration de l’usine est indiqué dans la figure 1D et commence par une plante non infiltrée et est suivi par le processus d’infiltration. L’expression, l’extraction et la clarification des protéines végétales sont affichées dans la figure 1E. Le matériau folio est placé dans un mélangeur et homogénéisé, indiqué dans les figures 1E (1-3). Un échantillon représentant l’homogénéité totale est ensuite prélevé. Il est ensuite filtré à travers un Miracloth (gaze ou même un filtre à café peut remplacer les dépenses réduites), et la suspension clarifiée est centrifugée. La centrifugation permet la séparation du supernatant des matériaux restants, comme le montrent les figures 1E (4-6). Le supernatant clarifié est ensuite chargé sur une colonne de chromatographie d’affinité de protéine G, figure 1F (1-3). Une fois que la majeure partie de la protéine est liée, figure 1F-4, les protéines sont élucidées de la résine Figure 1F (5,6).

Le tableau 1 affiche les séquences d’acide nucléique optimisées utilisées pour produire l’asGFP45 (rangée supérieure) dans le pBY! Vecteur KEAM-GFPasH utilisé dans cette étude pour exprimer la fusion ASGFP-IgG et GFP33 (rangée inférieure) dans le vecteur PBYEAM-GFPHgp utilisé dans cette étude pour exprimer la fusion GFP-IgG. Des séquences d’acide nucléique ont été examinées à l’aide de l’outil de traduction de la protéine Expasy (https://web.expasy.org/translate/) pour déterminer les séquences d’acides aminés.

Une plaque agrobactérienne représentative préparée à l’aide de ce protocole est indiquée à la figure 2. Les colonies désirées doivent apparaître rondes et uniformes dans leur forme et leur couleur. Les colonies plus près du centre de la plaque ont une plus grande probabilité d’exprimer une résistance à la kanamycine. Les cultures liquides seront préparées à partir d’une seule colonie isolée.

L’apparition prévue de médias contenant des cultures est indiquée à la figure 3. Dès l’inoculation initiale d’une colonie isolée, les médias LB apparaîtront jaune clair et translucides, comme le montre la figure 3A. Après l’incubation d’une colonie isolée pendant la nuit à 30 °C, les médias LB apparaîtront trouble. Comme le montre la figure 3B,les objets ne peuvent plus être vus à travers les médias lorsque la croissance est présente dans le LB. Après centrifugation, une pastille doit se former au fond du tube. Le tube aura une séparation claire des supports LB au-dessus de la pastille et apparaîtra jaune clair et translucide, comme le montre la figure 3C. Le supernatant multimédia LB est éliminé, et la pastille est réutilisée dans le tampon d’infiltration. Lors d’unOD 600 de 0,2, les médias apparaîtront trouble, comme le montre la figure 3D. OD600 doit être mesuré tel que décrit dans les méthodes.

La figure 4 représente le processus d’infiltration des feuilles. Un léger prod de la feuille avec un trombone devrait donner une rupture dans l’épiderme de feuille qui ne passe pas entièrement par la feuille. La rupture doit à peine percer la feuille de sorte que le tampon d’infiltration peut être injecté dans la feuille, indiqué dans la figure 4A-C. La suspension de l’agrobactérie et du tampon d’infiltration est injectée directement dans la rupture de la feuille et modifie légèrement la couleur de la feuille infiltrée; voir figure 4D-F.

L’apparition de feuilles exprimant les fusions IgG est représentée à la figure 5. Il affiche des feuilles qui expriment des fusions asGFP-IgG (Figure 5A) et fusions GFP-IgG (Figure 5C) sous lumière blanche. Si les constructions de ce protocole sont utilisées, lorsqu’elles sont infiltrées à un 0,2 OD600,les feuilles devraient apparaître en bonne santé les jours 1-5 pour les deux feuilles exprimant des fusions asGFP-IgG et des feuilles exprimant des fusions GFP-IgG. Il peut y avoir un léger aspect nécrotique aux sites d’injection le jour 5, ce qui est habituellement évident par l’éclaircissement du tissu végétal dans ces zones. La figure 5 affiche également les feuilles exprimant les fusions asGFP-IgG (figure 5B) et les fusions GFP-IgG (figure 5D), respectivement, sous la lumière UV à ondes longues de la vue supérieure de la feuille. La fluorescence augmente en intensité au fur et à mesure que les jours avancent pour les deux constructions exprimées. Les feuilles exprimant des fusions asGFP-IgG ont tendance à avoir une fluorescence légèrement moins intense que les feuilles exprimant des fusions GFP-IgG tous les jours.

Lorsque le surnatant de l’extrait asGFP-IgG est ajouté à la colonne Protéine G, la résine deviendra légèrement verte sous la lumière blanche en raison des pigments de chlorophylle végétale (Figure 6A). L’ajout de supernatant sous la lumière UV à ondes courtes entraîne l’accumulation de fluorescence dans la résine de protéine G, comme le montre la figure 6B. Notez que le supernatant sera également fluorescent seul sous la lumière UV. Pourtant, la fluorescence devrait être beaucoup plus concentrée lorsque la fusion asGFP-IgG commence à se lier à la résine.

À la suite du passage du surnatant de l’asGFP-IgG par la protéine G résine, la résine devrait s’illuminer sous la lumière UV à ondes courtes, comme le montre la figure 7A. À ce stade, la majeure partie de l’IgG sera liée à la résine. Lors de l’ajout du tampon d’élitution, la fluorescence contenue dans la résine de protéine G sera toujours visible sous la lumière UV à ondes courtes et commencera à perdre de l’intensité à mesure qu’une plus grande zone tampon d’élitution de faible pH traversera la résine. La fluorescence commencera à s’accumuler dans les élitates (Figure 7B). Les fractions d’élixate varient en fluorescence. Comme on le voit à la figure 8,la fluorescence est l’intensité la plus faible de la première élitution et l’intensité la plus élevée des deuxième et troisième exaltations. Les résultats peuvent varier, car la fluorescence dépendra de l’expression de la protéine, du matériau des feuilles récoltées et d’autres conditions utilisées dans l’expérience.

Après avoir terminé le processus de purification, les échantillons sont analysés sur le gel SDS-PAGE à 10 % dans des conditions réducteurs (le tampon de l’échantillon contient de la TNT et les échantillons ont été bouillis pendant 5 minutes) et les conditions non réducteurs (le tampon de l’échantillon ne contient pas de TNT et les échantillons n’ont pas été bouillis). Comme le montre la figure 9A,seuls les échantillons non réducteurs, comme dans la voie Elution 2 NR, fluorent lorsqu’ils sont exposés à la lumière UV à ondes courtes. La première bande de cette voie fluore à la taille prévue du produit ~200 kDa, ce qui indique que l’asGFP est toujours conformement correct. Les bandes fluorescentes près du fond du gel sont des colorants du tampon réductur. Notez que l’ASGFP perd de la fluorescence lorsqu’il est exposé à des températures supérieures ou supérieures à 95 °C pendant 5 minutes; c’est différent de l’eGFP (GFP amélioré), qui maintiendrait une certaine fluorescence dans les mêmes conditions49,50. Deux bandes de l’échelle, 75 kDa et 25 kDa, également fluoresce. La figure 9B représente une tache Coomassie du même gel dans la figure 9A. Des élitutions dans les voies 6-9 ont été préparées dans des conditions de réduction. Lorsqu’ils sont exécutés sur un gel et coomassie-tachés, ces échantillons devraient afficher les composants de fusion asGFP-IgG séparément. Ces composants comprennent la chaîne lourde fusionnée à GFP (~75 kDa), la chaîne lourde seule (50 kDa), la chaîne légère (25 kDa), et l’asGFP lui-même (27 kDa). L’échantillon non réductur a été inclus dans la dernière voie du gel à des fins de comparaison et devrait afficher une seule grande bande (~200 kDa), qui devrait être composée de deux chaînes lourdes fusionnées à l’asGFP et aux chaînes lumineuses respectives. En outre, les bandes plus petites sont probablement causées par des protéases indigènes. Ce clivage peut être évité avec l’ajout d’inhibiteurs de la protéase et en gardant l’extrait de protéines froid en tout temps, y compris lors de l’exécution de la purification de la colonne. Les composants individuels de la protéine de fusion IgG ne seront pas distinguables dans les échantillons non réducturants du gel Coomassie.

Figure 1
Figure 1 : Flux de travail des processus d’expression, d’extraction et de purification des plantes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Séquence nucléotide utilisée Séquence d’acides aminés
Séquences
utilisé pour
asGFP dans
Hydravion! KEAM ( KEAM )
-GFPasH
Vecteur
utilisé dans
Lla
Expression
de la
asGFP-IgG
Fusion		 ATGGTGTCCAAGGGAGAGGAAGCTTGGAAGAGCCTTGTTC ATGGTGTCCAAGGGAGAGGGGGCTTGGAAGAGCCTTGTTC ATGGTGTAGGGGGGGGGGGAGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG
CAGTACCCTATGACTTAAAATCGAGTTGAATGGCGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTTGCTGGGGGTTTCACCCCTTC
ATCTGGAAGATTCAATATGCACGCTTACTGTACTACCGGAGAC
TTGCCTATGTCCTGGGTTTTATAGCTCTCCCGCTTCAGTACGG
GTTTCACATGTTTGCCCACTACCCTGAGGATATCACTCACTTCTT
CCAAGAATGTTTTCCTGGGTCTTATACTCTCGACAGAACTTTGA
GGATGGAGGGAGACGGTACTCACTACTCACCACGAGTACTC
CCTTGAGGACGGTTGCGTTACTTCCAAGACTTTGAACGCTT
CTGGATTCGACCCCAAGGGAGCCACTATGACTAAGTCTTTCGT
CAAACAGCTCCCAAACGAGGTCAAAATCACCCCACCCCCGGGCCA
AATGGTATTAGACTTACTTCCACTGTTCTACCTTAAGGAGGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAAGACTGCATCGTTACCCCA
GTTGGCGGCAGAAAAGTTACTCAGCCTAAGGCTCACTTTCTTC
ATACTCAGATCATCATAGAAGAAGGACCCAAACGACACCAGAG
ATCACATCGTTCAGACTGAGCTTGCTTGCTGGAAATCTTTG
GCACGGCATGGATGAGCTTTACAAGA		 MVSKGEEASGRALF
QYPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEGFTP (en)
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL GDLPMSWVVIASPL GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
DRTLRMEGDGTLTT
HHEYSLEDGCVTSK
TTLNASGFDPKGAT
MTKSFVKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQIGTQD
CIVTPVGGRKVTQP
KAHFLHTQIIQKKDP KAHFLHTQIIQKKDP
NDTRDHIVQTELAV
AGNLWHGMDELY
K
Séquences
utilisé pour
GFP à
pBYEAMGFPHgp
Vecteur
utilisé dans
Lla
Expression
de GFP-IgG
Fusion		 ATGGCTAACAAGCACCTCATTGTCTCTCTCTTCCTTGTGCTCCTT
GGTCTTTCTTTCTCTTGCTTTTGGTATGGTGAGCAAGGGCG
AGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCTCCTGGTCGAGCTGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGGGGGGGGGGGG
GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA
TCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGT
GACCACCTTCAGCTACGGCGTGCTGCTTCAGCCGCTACCCCCC
GACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCGCCCG
AAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGG
CAACTACAAGACCCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACAC
CCTGGTGAACCGCATCGAGGAAGGGCATCGACTTCAAGGA
GGACGGCAACATCCTGGGGCAAGCTGGAGTACAACTACAA
CAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGGAAGAACGG
CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGC
AGCGTGCAGCTCGCCCCACTACCAGCAGAACACCCCCCCG
GCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCAC
CCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCA
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCCGGGATCACTCAC
GGCATGGACGAGCTGTACAAGA GGCATGGACGAGCTGTACAAGA		 MANKHLSLSLFLVLL
GLSASLASGMVSKG
EELFTGVVPILVELD
GDVNGHKFSVSGE GDVNGHKFSVSGE
GEGDATYGKLTLKFI
CTTGKLPVPWPTLV
TTFSYGVQCFSRYP
DHMKQHDFFKSA
MPEGYVQERTIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
KEDGNILGHKLEYN
YNSHNVYIMADKQ
KNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNH
YLSTQSALSKDPNEK
RDHMVLLEFVTAA
GITH (GITH)

Tableau 1 : Séquences utilisées pour créer asGFP et GFP

Figure 2
Figure 2 : Colonies d’agrobactéries cultivées sur une plaque LB contenant de la kanamycine. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Apparition des médias tout au long de la croissance et de la transformation d’Agrobactérie. (A) L’apparition des médias LB immédiatement après l’inoculation de la colonie d’Agrobactérie isolée. (B) La présence de médias après l’incubation pendant la nuit d’une colonie isolée à 30 °C. (C) L’apparition des médias après que les cultures sont filées pendant 20 min à 4 500 x g. (D) Granulés résuspendus dans le tampon d’infiltration. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Processus d’infiltration des plantes de N. benthamiana. (A-B) Piquer légèrement la feuille entraîne un trou subtil au sommet de la feuille. (C-D) Injection de suspension Agrobacterium dans la feuille. (E) Feuille de plante infiltrée de la vue supérieure. (F) Plante avec plusieurs feuilles infiltrées à partir de la vue supérieure. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : La visualisation des feuilles contenant la fusion ASGFP-IgG et la fusion GFP-IgG commence le jour 1 après infiltration (dpi) dans la première rangée, menant au jour 5 dpi dans la dernière rangée pour toutes les conditions. A) fusion asGFP-IgG sous lumière blanche. B) fusion asGFP-IgG sous UV à ondes longues. C) Fusion GFP-IgG sous lumière blanche. D) Fusion GFP-IgG sous UV à ondes longues. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Supernatant de l’extrait asGFP-IgG ajouté à la colonne Protéine G. A) Ajout sous lumière blanche. B) Addition sous la lumière UV d’onde courte. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Résine de protéine G sous la lumière UV à ondes courtes après que le supernatant de l’extrait d’asGFP-IgG ait été exécuté par la colonne. A) Résine de protéine G sous la lumière UV à ondes courtes. B) Résine de protéine G lors de l’élitution des protéines dans de faibles conditions de PH. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Elutions purifiées de l’asGFP-IgG obtenues après exposition à de faibles conditions de pH par purification. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9
Figure 9 : SDS-PAGE d’échantillons de colonnes. Les échantillons étiquetés « R » sont dans des conditions de réduction, et les échantillons étiquetés « NR » sont dans des conditions non réducteur. A) Sous la lumière UV, seuls les échantillons non réducteurs fluoresce dans le gel de polyacrylamide de 10%, comme on le voit dans Elution 2 NR lane. Les bandes d’échelle de 75 kDa et 25 kDa fluorescent également. B) La coloration coomassie du même gel révèle la présence de toutes les protéines dans l’échantillon. Dans les elutions réduites, la fusion IgG sans chaîne de lumière, la chaîne lourde, la chaîne de lumière, et éventuellement dégradé GFP sont présents à ~ 75 kDa, ~ 50 kDa, ~ 25 kDa, et ~ 10 kDa, respectivement. En revanche, dans les elutions non réduites, une bande proéminente est présente, compatible avec la taille de l’ensemble de la fusion asGFP-IgG (~200 kDa). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Ce protocole peut être utilisé pour la vérification visuelle de tout Ab recombinant ou protéine recombinante produite dans les plantes de N. benthamiana, y compris celles qui nécessitent une exposition temporaire à des environnements acides à des fins de purification descolonnes 42,43,44. En outre, la fusion de l’asGFP à d’autres protéines dans différents systèmes d’expression peut être un outil utile pour la visualisation expérimentale et l’éducation. Le protocole ci-après peut encore être mis à l’échelle à des quantités de plus en plus petites de matériaux foliaire pour produire la quantité désirée de protéines recombinantes. Les méthodes décrites profitent d’études antérieures qui ont identifié et fait des versions de GFP qui restent stables dans des conditions acides46. Des études antérieures complètes ont créé des domaines d’immunoglobuline fusionnés à une protéine d’intérêt, souvent appelé IgG-fusions, que ce protocole peut égalementaccueillir 28. En créant et en exprimant une fusion IgG composée d’un IgG1 humanisé fusionné à un GFP et asGFP, nous avons pu visualiser la présence de la protéine désirée lors des processus d’expression, d’extraction et de purification.

Si un chercheur qualifié suit ce protocole, les feuilles commenceront à afficher des signes de nécrose aux sites d’infiltration entre les jours 4-5. Cependant, lors de l’utilisation des vecteurs décrits, les zones infiltrées des feuilles devraient sembler saines jusqu’au jour 5 avec des soins appropriés. Il est important de noter que l’infection par Agrobactérie à elle seule finira par entraîner la nécrose des feuilles de plantes en raison de l’accumulation d’espèces réactives d’oxygène (ROS) dans le cadre de la réponse immunitaire des cellulesvégétales 51,52. Cette réponse immunitaire et le niveau de nécrose qui en résulte peuvent varier en fonction deplusieurs facteurs 51, y compris le ciblage cellulaire, l’emplacement de la protéine, le type de protéine produite, le vecteur d’expression, et la souche d’Agrobactérie utilisée 53,54. En outre, les variations de la densité optique (OD600) de l’Agrobactérie utilisée pour l’infiltration peuvent affecter les niveaux de nécrose55. De nombreux vecteurs d’expression utilisent des protéines qui lient la protéine du rétinoblastome pour maintenir les cellules végétales en phase de synthèse (S) et augmenter la division cellulaire et la fréquence de transformation56,57. L’augmentation de la production de protéines, comme celles causées par la liaison à la protéine de rétinoblastome, peut conduire à lanécrose 56,57. Les progrès de la conception vectorielle, tels que ceux utilisés dans les versions modifiées du geminivirus BeYDV replicons utilisés dans ce protocole, ont minimisé la nécrose tout en maintenant des niveaux élevés d’expressiondes protéines 58. En outre, les replicons BeYDV ne sont pas concurrents, fournissant l’expression de protéines multiples sur une seule cassette sans limitations de tailleconnues 53,59.

Plusieurs facteurs influent sur la croissance des plantes avant et après l’infiltration, ce qui pourrait éventuellement entraîner un faible rendement en protéines. Lors de l’ensemencement des plantes, trop de graines par granulé végétal peut entraîner de nombreuses petites pousses de plantes conduisant à une croissance plus modeste des plantes. Par conséquent, la réduction du nombre de graines par granule de tourbe et l’élimination des pousses supplémentaires après une semaine se traduira par une meilleure croissance des plantes. Le maintien d’une humidité adéquate du sol est un autre facteur affectant la santé globale des plantes. L’assèchement, l’eau sous-marine, l’ajout de trop ou trop peu d’engrais pourraient contribuer à la chlorose et affecter la santédes plantes 60,61,62. La nécrose et la chlorose peuvent en outre être causées par la production d’une protéine qui cause le stress cellulaire. Ce phénomène a été vu plusieurs fois avec l’expression des complexes immunitaires recombinants (RIC)56. Nous avons observé que les changements dans la structure protéique et la fusion des protéines peuvent aider à minimiser la nécrose; cependant, certaines protéines peuvent rester toxiques pour les plantes, même après diverses modifications. Si l’on utilise les vecteurs d’expression décrits dans les herein, l’extraction des protéines peut être effectuée tôt et avant le début de la nécrose significative, ce qui entraîne un rendement élevéen protéines 56.

Différentes conditions de croissance peuvent ralentir, voire inhiber la croissance d’Agrobacterium. L’agrobactérie pousse de façon optimale à 28 °C-30 °C et subit un choc thermique lorsqu’elle est incubée au-dessus de 30 °C, produisant des erreurs de divisioncellulaire 62. La croissance peut également être entravée par l’ajout de trop de rifampicine, car différentes souches agrobactériennes sont plus ou moins naturellement résistantes à cetantibiotique 62. La culture bactérienne préparée pour l’infiltration avec l’OD600 sensiblement plus élevé que recommandé causera probablement la nécrose55. Un OD600 légèrement plus élevé de la culture n’affecte généralement pas le rendement, mais s’il est inférieur à 0,1, le rendement en protéines pourrait être considérablement réduit. L’accumulation de cellules mortes peut se produire dans deux circonstances; 1) la culture a été envahie, menant à une fraction significative de l’OD étant des cellules mortes, et 2) endommageant/tuant l’Agrobactérie après croissance, telle qu’avec des résidus chimiques ou des vitesses élevées de centrifugeuse. Les infiltrations utilisant un nombre accru de cellules mortes dans la culture pourraient réduire l’expression des protéines. En outre, ponctuer les feuilles en appliquant trop de pression peut endommager les feuilles et peut donc conduire à une nécrose prématurée. Compte tenu de ces facteurs possibles lors de l’expression de protéines recombinantes dans Nicotiana benthamiana, peut conduire à une production accrue de protéines.

L’obtention d’un faible rendement en protéines pourrait être due à certains problèmes dans les étapes d’extraction et de purification. Tout d’abord, le tampon d’extraction peut avoir besoin d’optimisation en fonction de la protéine d’intérêt. Pendant le mélange, le matériel végétal doit être homogène sans morceaux visibles de feuilles. Ensuite, certaines protéines nécessitent des détergents pour la solubilisation dans le tampon d’extraction, comme Tween-20 ou Triton. D’autres protéines pourraient avoir besoin d’urée à des concentrations élevées ~ 7,5 M pour la solubilisation, tandis que certains peuvent être extraits avec PBS seulement. La dégradation des protéines peut se produire si les tampons, les tissus végétaux, les centrifugeuses, etc. ne sont pas conservés au frais pendant le processus d’extraction. Le manque d’inhibiteurs de la protéase et d’ascorbate de sodium ou de produits chimiques similaires dans le tampon d’extraction peut également causer une dégradation ou une agrégation. Certains inhibiteurs de la protéase comme le PMSF se dégradent rapidement, et l’ascorbate de sodium prend un certain temps pour devenir aqueux. Dans l’ensemble, les chercheurs devraient déterminer les conditions optimales de leur protéine d’intérêt.

La purification des fusions IgG comprend peu d’étapes qui pourraient avoir besoin de modifications si un faible rendement en protéines est obtenu. L’analyse de l’échantillon aliquots recueillies pendant tout le processus par SDS-PAGE et Western aidera à identifier la faute des méthodes. Par exemple, si le flowthrough contient une quantité substantielle de protéine, alors la liaison de la protéine peut être facilitée en changeant le pH du tampon. L’utilisation de fortes concentrations de détergents pendant le processus d’extraction peut affecter la propriété de liaison de la résine, surtout si la résine est réutilisée plusieurs fois. Un stockage adéquat de la résine, tel que décrit dans les méthodes, est vital pour la durée de vie de la résine. En outre, si l’étape de lavage élimine la protéine d’intérêt de la résine, les tampons pourraient avoir besoin d’être refaits pour résoudre ce problème. D’autres problèmes liés à la purification des protéines pourraient être dus à des protéines mal dépliées ou dégradées, ce qui pourrait nécessiter une analyse plus approfondie de la conception globale des protéines. Le référencement du dépannage décrit peut augmenter l’efficacité de la purification à l’aide de ce protocole.

La purification de fusion GFP-IgG décrite est utile dans un environnement d’enseignement. La visualisation est fondamentale pour l’enseignement des sciences parce qu’elle permet aux apprenants de comprendre plus facilement les concepts39. Les élèves signalent souvent des malentendus en plus de la difficulté à comprendre les concepts au niveaumoléculaire 39. En particulier, les expériences qui nécessitent une compréhension de l’emplacement spécifique des protéines à chaque étape peuvent être modifiées en étiquetant les protéines d’intérêt avec les molécules fluorescentes. Par conséquent, GFP ou asGFP, selon l’environnement de pH utilisé, peut être utilisé pour exploiter leur fluorescence pour faciliter l’élucidation de la technique de purification des protéines pour les étudiants.

En résumé, nous décrivons une méthode simple pour l’expression et la purification d’un Ab recombinant fusionné à un GFP dans les plantes de N. benthamiana. Ce protocole peut être utilisé pour la purification d’un Ab fusionné à n’importe quelle protéine cible désirée. Le processus peut être modifié pour tenir compte de diverses quantités de matière foliique et permet une détermination visuelle de la présence de protéines avant, pendant et après la conclusion du processus d’extraction et de purification des protéines. Ces méthodes peuvent être utiles en tant que contrôles et peuvent être utilisées pour les techniques d’enseignement.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Maria Pia DiPalma d’avoir édité la vidéo. Nous remercions également le Bureau de la sensibilisation à l’éducation et des services aux étudiants de l’Université d’État de l’Arizona pour leur généreuse aide aux frais de publication. La recherche pour ce protocole a été soutenue par la School of Life Sciences de l’Université d’État de l’Arizona.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologie Numéro 167 anticorps anticorps monoclonal pharming moléculaire agroinfiltration expression transitoire Nicotiana benthamiana protéine fluorescente verte protéine fluorescente verte acide stable fusion d’anticorps IgG-fusion purification de protéine G
Production de protéines de fusion IgG exprimées transitoirement à <em>Nicotiana benthamiana</em>
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Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

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