Summary
我们在这里描述了一个简单的方法，表达，提取和纯化重组人类IgG融合到GGFP 在尼科蒂亚娜本thamiana。该协议可以扩展到使用柱色谱的众多蛋白质的纯化和可视化。此外，该协议还适用于本学院教学实验室的亲上和虚拟教学实验室，提供基于项目的探索。
Abstract
对抗体作为各种传染性、代谢性、自身免疫性、肿瘤性和其他疾病的治疗干预措施的高需求，对开发有效的重组抗体生产方法的需求日益增长。截至2019年，有70多个FDA批准的单克隆抗体，并且有指数增长的潜力。尽管他们承诺，广泛使用的限制因素是制造成本和复杂性。工厂可能提供低成本、安全和易于扩展的蛋白质制造策略。像 Nicotiana benthamiana 这样的植物不仅能够正确折叠和组装复杂的哺乳动物蛋白质，还可以添加与哺乳动物细胞培养物类似的关键的翻译后修饰。在这项工作中，通过使用原生GP和绿色荧光蛋白（GFP）与人单克隆抗体融合的酸稳定变种，我们能够可视化来自 N.benthamiana 植物的整个瞬态抗体表达和纯化过程。根据实验的目的，本机 GFP 融合可以确保在植物的表达阶段更容易可视化，而酸稳定的 GFP 融合允许在下游处理期间实现可视化。这种可扩展和直接的程序可以由单个研究人员执行，只需几天就使用少数小植物就产生毫克量的高纯抗体或抗体融合蛋白。这种技术可以扩展到任何类型的抗体纯化过程和潜在的许多其他蛋白质的可视化，无论是植物和其他表达系统。此外，这些技术可以有利于虚拟指令，并在教学实验室由拥有分子生物学技术经验最少的本科生在教学实验室中执行，为基于项目的探索和实际应用奠定了基础。
Introduction
行业报告显示，在美国20种最毛额的药物中，有13种是生物制剂（蛋白质为基础的药物），其中9种是抗体。截至2019年，在1、2、3等不同临床开发阶段，有570多种抗体（Ab）治疗。目前全球Ab销售额超过1000亿美元，到2025年1月4日，单克隆Ab（mAb）治疗市场有望创造高达3000亿美元。由于需求如此之高，预计收入将增加，研究人员一直在努力开发各种方法，以更高的质量和更低的成本，在更大范围下生产Ab疗法。植物表达系统比传统的哺乳动物细胞系具有若干优势，可以负担得起和大规模制造Ab治疗剂5，6。在植物中生产蛋白质疗法（"分子法基"）不需要像传统的哺乳动物细胞培养技术7、8那样需要昂贵的生物反应器或细胞培养设施。植物不能收缩人类病原体，最大限度地减少潜在的污染。瞬态和转基因植物蛋白表达都可以作为哺乳动物或细菌生产系统的低成本替代品。虽然转基因植物是作物生产的首选，但使用这种方法重组蛋白质的生产可能需要数周到数月的时间。使用病毒载体通过注射器或真空农业渗透的瞬态表达方面的进步，允许在第11天、第12天、第13天、第14天分别对所需的蛋白质进行小规模和大规模生产。在N.Benthamiana植物15、16、17、18、19中，利用瞬态表达，生产了埃博拉、登革热和寨卡和许多其他重组蛋白的mAbs。这些情况使得瞬态植物表达成为开发多种Ab疗法的有吸引力的选择，并且本协议20中演示的方法。
第一代mAbs是喃自语衍生的，在人体试验21中使用时导致非特异性免疫原性。随着时间的推移，嵌合，人性化，并最终，完全人类Abs产生，以减轻免疫原性诱导Ab治疗。不幸的是，其中一些Abs仍然导致宿主免疫原性，由于糖基化21的差异。植物工程的发展允许对Ab甘油进行改造，这一点至关重要，因为Ab的稳定性和功能可能受到其糖化状态22的显著影响。进步使得植物系统中能够生产出含有人类甘油的高水平表达，并因此产生了大量生产的人类药物19、21所需的生物特性。
近几十年来，除了重组Abs之外，Ab聚变分子（Ab融合）还被探索用于各种目的。Ab融合通常由融合到分子或蛋白质的Ab或Ab片段组成，旨在引起免疫效应细胞23的反应。这些分子已被创建为潜在的治疗干预措施，以治疗各种病理，如癌症和自身免疫性疾病24，25，26，27。重组免疫复合物（RICs）是另一类Ab融合，已被采用作为疫苗候选28。RIC利用免疫系统识别Ab融合的Fc区域的能力，并被发现与其他疫苗平台29，30，31相结合，以提高免疫原性。
绿色荧光蛋白（GFP）是一种生物发光蛋白，源自维多利亚水母，当被紫外线照射时发出绿光32，33。多年来，GFP作为基因表达的视觉标记的使用已经从大肠杆菌的表达扩展到许多蛋白质表达系统，包括N.Benthamiana植物34，35，36，37，38。可见标记，如GP，对科学概念的教学和学习有着丰富的意义。许多入门级学生描述在所教导的想法肉眼看不见时，如分子生物学的概念和相关领域39时，掌握科学概念的困难。因此，视觉标记（如GP）有助于处理与科学过程有关的信息，并有助于减轻学生报告学习许多科学概念时遇到的困难。
虽然GP经常被用作体内指示基因和表达的标记物，但如果使用酸性条件，很难在下游过程中显示它。这种情况的主要原因是GP不保持其结构和由此产生的荧光在低pH40。在各种纯化过程中，通常需要临时酸性环境，如蛋白质G、蛋白质 A和蛋白质L色谱，通常用于Ab纯化41、42、43、44。GFP突变体已用于在酸性条件下保持荧光45，46。
在这里，我们描述了一个简单的方法，用于表达、提取和纯化重组IgG融合 蛋白在N.Benthamiana植物 。我们生产传统的GP融合到人性化IgG重链的N术语，创造了一个GP-IgG融合。同时，我们开发了一种植物共融优化序列的融合，用于酸性稳定 GFP （asGFP） 与人性化 IgG 重链的 N 术语，从而创建 asGFP-IgG 融合。生产GFP-IgG的优点包括能够在表达过程中可视化目标蛋白的存在，而SigFP-IgG则允许在表达和提取步骤中，而且在蛋白质的纯化步骤中看到重组蛋白的存在。该协议可用于生产、纯化和可视化一系列在 N. benthamiana 中生产的 GFP 融合蛋白， 并使用需要低 pH 值的色谱技术进行纯化。该工艺还可以针对各种数量的叶料进行定制。虽然用GFP或 asGFP 标记的 Abs 和融合蛋白并不可用于治疗，但这些方法在实验期间可用作控制，还可以作为分子和细胞生物学和生物技术的教学工具，无论是亲自还是虚拟。
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Protocol
1. 培育 N. 本特塔米亚纳植物
- 将土壤泥炭颗粒放在托盘上，将以前煮沸、仍然热（+40-45 °C）的泥浆倒在泥炭颗粒上，进行完全膨胀。颗粒完全膨胀后，使用钳子将 2-3 N. 本特纳米纳种子放在每个泥炭颗粒上。
- 倒入约0.5入水以盖住托盘底部。将托盘与播种日期标记。继续每天用适当数量的肥料给幼苗浇水。肥料（水溶性多用途植物食品）浓度一般为2.5-2.8克/升。
- 放入生长室时，用湿润罩顶部盖住托盘。将生长室的种子泥炭颗粒保持23-25°C，具有16小时光度和60%的相对湿度。
- 一周后，去除额外的植物，让每个颗粒只留下一个幼苗。
- 当植物2-3周大时，将每个泥炭颗粒转移到含有水分控制土壤的单个锅中。这个演示使用了奇迹-格罗水分控制盆栽土壤。
- 每天用1克/升肥料浇水。切不要使土壤完全干燥。植物在5-6周大时已经做好了渗透的准备。
2. 准备用于渗透的农业细菌
注：GFP-IgG融合构造可如本文31所述获得。从本研究中获得并优化了 asGFP基因。必须在 Bunsen 燃烧器旁边执行以下步骤，并且应应用基本的无菌技术以避免污染。
- 条纹 A. tumefaciens EHA105 窝藏豆黄矮病毒 （BeydV）19 植物表达载体， 每个结构 （asgFP - Igg， GFP-IgG，轻链）从甘油库存在LB阿加（10克/升 Tryptone，10 g/L NaCl，5 g酵母提取物，15克/升加糖，50μg/mL卡那霉素）板。
- 在30°C站立的培养箱中生长一天。隔离单个殖民地，通过标准殖民地屏幕 PCR 协议进行验证。
- 对每个构造使用经过验证的殖民地。用 10 mL 介质填充锥形管（10 g/L tryptone，10 g/L NaCl，5 g 酵母提取物，50 μg/mL）。接下来，加入10μL的100μg/mL卡那霉素。加入 10 μL 的 2.5 μg/mL 利福平， 以防止大肠杆菌 污染。在 30°C 和 120-150 rpm 过夜孵育。
- 第二天， 如果农业细菌培养 成OD600 = 0.6-0.9，它可用于渗透。如果它过度生长 （OD600 > 1），1-2 mL 应转移到新鲜 LB 与抗生素，并成长为所需的 OD600。根据初始培养物的浓度，可能需要两天时间才能增长到 OD600 = 0.6-0.9。
- 一旦在适当的OD600，将培养物放在离心机，并在4，500 x g的离心下对细菌进行颗粒，20分钟室温（RT）。
- 从两个样品中去除上清液，然后将每个颗粒重新注入 1x 渗透缓冲液（10 mM 2-（N-morpholino）乙烷硫酸，10 mM 硫酸镁，与 KOH 一起调整为 pH 5.5），以获得最终 OD600 = 0.4。这大约需要 15-45 mL 的渗透缓冲液，具体取决于初始培养密度。将每个IgG融合构造的相等体积与光链构造相结合，获得每个管中每个构造的最终OD600 = 0.2。
3. 无针注射器农业渗透
- 从第 1 步开始，采取拉直的回形针和 5-6 周大的 N. benthamiana 植物。使用回形针的锋利边缘，在面膜表面的叶子的第一表皮层上做一个小穿刺。避免一路穿刺。
注：较低的叶子更容易渗透，而植物顶部的叶子更难。一般来说，重组蛋白的表达在植物中间的叶子中含量最高，这些叶子的坏死性也较小。 - 填充 1 mL 注射器，不连接针头，使用步骤 2 中准备好的 农业细菌溶液。用注射器的端子盖住上一步中制造的孔，然后缓慢地推动将细菌注入叶子，同时从叶子后面施加温和的反压。在注射溶液时，注意叶变暗，而不会对注射器施加太大的压力。
- 尝试在最多3-4次时渗透大部分叶区 - 过量的叶损伤可能会阻碍蛋白质的产生。从底部的视图中，渗透的植物叶将大多显示为深色。
注：这种细菌溶液应该足够至少3-4个植物每个结构。在丢弃之前，请先将任何剩余的细菌溶液中解。
4. 生长和观察渗透的 N. 本thamiana
- 将渗透的植物放回生长室，每天继续浇水。
- 观察渗透区域的叶叶的氯酸和坏死。观察长波和短波紫外灯下有GP荧光（如果存在GP的话）的植物。
- 第 4-5 天显示叶子中两个 GFP 构造的最高荧光。以 4-5 dpi（渗透后天）收获所有叶子，并称重总叶材料。
- 立即将其用于下游处理或储存在 -80°C，直到准备使用。
5. 蛋白质提取
- 使用前，将缓冲液和搅拌杯放在冰上或4°C。
- 每1克植物材料准备2-3 mL的冰冷萃取缓冲液（100 mM Tris-HCl，50 mM NaCl，2 mM EDTA，pH 8 与 HCl）。在提取前，从库存（100 mM）和50 mM中加入2 mM苯基硫磺醇氟化物（PMSF）和50 mM丙酸钠。
- 将植物组织从步骤 4 放入预冷搅拌杯中。在搅拌杯中加入测量量的冰镇萃取缓冲液（如步骤 5.2 所示）。将搅拌杯放在搅拌机上。拿一张预切的副膜片，把它伸展到搅拌杯的顶部。以 20 秒间隔混合到均匀性，根据需要在混合循环之间搅拌良好。
- 将混合材料转移到烧杯上。加入搅拌棒，在4°C搅拌30分钟，以提高蛋白质溶解度，并允许固体沉淀。
- 将 2 层 Miracloth 放在干净的烧杯上，然后将提取物倒入冰上，以清除大叶碎屑。浇注所有提取物后，折叠米拉布挤压残留的叶子提取物。提取物应显示为深绿色，没有可见的颗粒物。
- 将样品的 50 μL 转移到新的 1.5 mL 管中，并标记"总提取物"，供以后分析。将萃取器转移到离心管。将植物提取物的剩余以16，000 x g离心20分钟，4°C，将上流液转移到锥形管中。
- 使用 50 mL 注射器和注射器玻璃纤维过滤器（0.75 μm）过滤可溶性提取物。
- 离心后采集50μL样品，标签"可溶性提取物"供以后分析。
6. 蛋白质G柱色谱程序
注：此处描述的协议是使用穿孔蛋白 G 加糖树脂进行重力流色谱。如果使用其他树脂，请参阅制造商的调整说明。切不要让树脂干燥，防止所有液体排出。根据需要重新回顾插座。
- 设置一个包含 20 mL 样品的聚丙烯柱。
- 根据目标免疫球蛋白类型及其与树脂的亲和力估计所需的浆量。一般来说，3 mL 的总浆料与 1.5 mL 床体积足以纯化几毫克的 Ab。
- 小心地将所需数量的重新浇注的泥浆倒入盖柱中。从柱底部打开柱出口，并允许其排出，直到大部分缓冲区消失。
- 立即倒 10 mL 洗涤缓冲液 1x PBS （137 mM NaCl， 2.7 mM KCl， 10 mM Na2HPO4， 1.8 mM KH2PO4， pH 7.4 与 HCl） 的顶部。让它排空，重复这个洗涤步骤2x。
- 将步骤 5 中筛选的样本应用于列，并收集流通 - 等值 50 μL 流通，供以后分析。保存其余流经，以防 Ab 未与树脂结合。
注：重新应用流到新列通常不会产生良好的收益;因此，建议从新的叶材料开始。 - 用 10 mL 的 1x PBS 清洗树脂两次，以减少非特异性结合。如果需要，当缓冲液通过柱排出时，等同 50 μL 的洗涤液，以验证目标 Ab 未使用洗涤缓冲液洗涤。
- 在 pH 8 下设置并标注五管，125 μL 无菌 1 M Tris-HCl。这是为了中和酸性洗脱缓冲液中的 Abs，以避免潜在的结构变化。或者，添加 30 μL 的 2 M Tris 基座，以获得稀释较少的样品。
注意：在洗脱过程中，紫外线可用于可视化。在洗脱期间不需要这样做。如果使用紫外线，请务必佩戴适当的 PPE，以避免对眼睛和皮肤造成伤害。在洗脱步骤期间不需要使用紫外线。 - 通过将 5 mL 的洗脱缓冲液（100 mM 甘氨酸，pH 2.5 带 HCl）应用于柱，从上一步收集 1 mL 分数到每个指定管。
- 通过应用 20 mL 洗涤缓冲液，然后应用 10 mL 洗涤缓冲液，立即重新生成柱。确保树脂长时间不留在酸性环境中。洗脱应出现荧光，通常最高荧光出现在第二洗脱中，但可能因提取而异。
- 储存时，用 PBS 中 10 mL 的 20% 乙醇清洗树脂，让它半排干。回顾顶部，然后列的底部，并保持直立在4°C。
注：一般来说，蛋白质G树脂可重复使用多达10次，而不会造成重大效率损失。有关具体详情，请参阅制造商指南。 - 使用分光光度计测量 280 nm 的吸光度，使用洗脱缓冲液作为空白确定 Ab 浓度。将每分馏物的 eluate 储存在 -80 °C 中，每个分数的等分为 50 μL，并储存到单独的管中，以作进一步分析。
7. 用于 GFP-Ig 融合检测的 SDS-PAGE
- 在设置 SDS-PAGE 之前准备所有示例。
- 加入 4 μL 样品缓冲液（6 倍还原样品缓冲液：3.0 mL 甘油、0.93 g DTT、1 g SDS、7 mL 4x Tris （pH 6.8） 0.5 M、1.2 mg 肉酚蓝色）;（6x非还原样品缓冲液：3.0 mL甘油，1克SDS，7 mL 4x Tris（pH 6.8） 0.5 M，1.2毫克的布罗莫酚蓝色）至20μL的每个样品（总提取物，可溶性提取物，流经，洗涤，所有洗脱分数）进行分析。确保管盖牢固固定。
- 在沸水浴中只处理减少样品5分钟，然后将样品放在冰上5分钟。将样品在微离心中旋转±5 s，并按收集顺序将每个样品的20μL加载到凝胶孔中。将 3 μL 的双色蛋白梯装进单独的井中。
- 以恒定的100 V运行SDS-PAGE凝胶，以达到所需的蛋白带分离;大约需要 1.5 小时监测梯子作为蛋白质分离的指标。
- 在紫外线下可视化凝胶，观察 GFP 荧光。
- 如果需要，用库马西污渍染色凝胶，以评估每个样品中的总蛋白质。或者，执行西部印迹，使用特定的 Abs 评估目标蛋白质。
注：库马西染色和西部印迹都可以通过遵循标准协议47，48执行。
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Representative Results
这项研究演示了一种简单而快速的方法，可以产生重组蛋白，并在整个下游过程中可视化它们。使用N. benthamiana并遵循所提供的协议，可在不到一周内实现此处描述的重组蛋白生产。植物表达、提取和纯化的总体工作流程如图1所示。图1 A（1-3）显示了2周大幼苗、4周岁幼苗和6周岁幼苗的生长阶段，而图1B则描绘了因坏死（图1B-1）或氯虫（图1B-2）引起的叶形态变化。渗透后第3-5天之间，注射部位可能发生坏死。这些变化往往取决于蛋白质的特性和渗透植物的健康（在讨论中进一步研究）。同时，氯酸也可以依靠正在使用的植物的健康（在讨论中进一步检查）。农业细菌的生长过程和渗透的准备情况如图1C所示。图1C-1显示了分离的农业细菌菌落。图 1C （2-5）显示介质在接种单个隔离菌落后的预期外观。有关这些步骤的更多详细信息，请参阅图 3。工厂渗透过程如图1D 所示，从未渗透的工厂开始，然后是渗透过程。植物蛋白的表达、提取和澄清如图1E所示。叶材料被放置在搅拌机中，并均质化，如图1E （1-3） 所示。然后取一个表示总均质的样品。然后通过 Miracloth 过滤（纱布甚至咖啡过滤器可以替代减少的费用），澄清的悬架是离心的。离心允许将上经剂与剩余材料分离，如图1E（4-6）所示。澄清的上清液然后加载到蛋白质G亲和色谱柱图1F（1-3）。 大多数蛋白质结合后，图1F-4，蛋白质从树脂图1F（5，6）中洗出。
表 1 显示了用于在 pBY 中生产 asGFP45（ 上排）的工厂优化核酸序列！本研究中使用的KEAM-GFPasH向量用于表达本研究用于表达GFP-IgG融合的PBYEAM-GFPHgp向量中的作为GFP-IgG融合和GFP33（ 下排）。使用Expasy蛋白质翻译工具（https://web.expasy.org/translate/）对核酸序列进行了检查，以确定氨基酸序列。
图2 显示了使用 本协议准备的具有代表性的 农业细菌板。所需的菌落应以圆形和均匀的形状和颜色出现。靠近板块中心的菌群表达卡那霉素耐药性的可能性较高。液体培养物将从一个孤立的殖民地中准备。
图 3 显示了包含区域性的媒体 的预期外观。首次接种隔离菌落后，LB 介质会出现浅黄色和半透明，如图 3A 所示。在30°C下孵育一个孤立的菌落过夜后，LB介质会出现浑浊。如图 3B 所示，当 LB 中存在增长时，不能再通过介质看到对象。离心后，在管的底部应形成颗粒。管将具有一个清晰的分离LB介质上方的颗粒，并会出现浅黄色和半透明，如图 3C所示。LB 介质上一液被处置，颗粒在渗透缓冲液中重新释放。在 0.2 的 OD600 下，介质将显示浑浊，如图 3D 所示。OD600 应按方法中所述进行测量。
图 4 表示叶渗透的过程。用回形针对叶子稍稍生产，在叶表皮上应有一个中断，而该表皮不会完全穿过叶子。断裂应勉强穿透叶子，以便渗透缓冲液可以注入到叶子，如图 4A-C所示。农业细菌 和渗透缓冲 液的悬浮液直接注入叶的断裂，稍微改变渗透的叶子的颜色;参见 图 4D-F。
图5中表示表达IgG融合 的叶子的外观。它显示在白光下表达的GFP-IgG融合（图5A）和GFP-IgG融合（图5C）的叶子。如果使用此协议中的构造，当渗透到 0.2 OD600时，叶应在第 1-5 天显示为健康，对于表示 asGFP-IgG 融合和表达 GFP-IgG 融合的叶子。在第5天注射部位可能有轻微的坏死性外观，这通常通过这些区域植物组织的闪电而明显。 图5 还显示叶分别从叶片顶部视图的长波紫外光下，表达着GFP-IgG融合（图5B）和GFP-IgG融合（图5D）。荧光的强度随着两个构造的天进度的表达而增加。表达 asGFP-IgG 融合的叶子荧光强度往往低于所有天表达 GFP-IgG 融合的叶子。
当 ASGFP-IgG 提取物的上清液被添加到蛋白质 G 柱中时，由于植物叶绿素颜料，树脂在白光下会变得微绿色（图 6A）。在短波紫外光下添加上清液会导致蛋白质G树脂中荧光的积累，如图 6B所示。请注意，在紫外线下，上清液也是单独荧光的。不过，当 asGFP-IgG 融合开始与树脂结合时，荧光预计会更加集中。
在 asGFP-IgG 的上清液通过蛋白质 G 树脂后，树脂应在短波紫外光下发光，如图 7A 所示。此时，大部分IgG将绑定到树脂上。加入洗脱缓冲液后，蛋白质G树脂中所含的荧光在短波紫外光下仍可见，随着更多低pH的洗脱缓冲液通过树脂，荧光将开始失去强度。荧光将开始在水卢酸盐中积累（图7B）。Eluate 分数在荧光中会有所不同。如图8 所示，荧光是第一次洗脱中的最低强度，在第二次和第三洗脱中，荧光的强度最高。结果可能会有所不同，因为荧光将取决于蛋白质的表达、收获的叶料以及实验中使用的其他条件。
完成纯化过程后，在还原条件下（样品缓冲液含有DTT，样品煮5分钟）和非还原条件下（样品缓冲液不含DTT，样品未煮沸）上对10%SDS-PAGE凝胶进行样品分析。如图9A所示，只有非还原样品（如Elution 2 NR通道中）在暴露于短波紫外线时会发荧光。该通道的第一个频段在完整产品的预期尺寸 ±200 kDa 时荧光，表明 asGFP 仍然符合要求。凝胶底部附近的荧光带是还原缓冲液中的染料。请注意，ASGFP 在 95 °C 或高于 95°C 的温度下暴露 5 分钟时会失去荧光;这与eGFP（增强型GFP）不同，eGFP在相同条件下保持一些荧光49，50。梯子的两个频段，75kDa和25kDa，也荧光。图9B表示图9A中同一凝胶的库马西污渍。在减少条件下，已准备了6-9号车道的洗脱。当在凝胶和库马西染色上运行时，这些样品应分别显示 asGFP-IgG 融合组件。这些组件包括熔融到 GFP（+75 kDa）、仅重链（50 kDa）、轻链（25 kDa）和 asGFP 本身（27 kDa）。非还原样品包含在凝胶的最后一条通道中进行比较，并且应显示单个大带（±200 kDa），该带应由两个与 asGFP 和各个轻链熔合的重链组成。此外，较小的波段可能是由原生蛋白酶引起的。通过添加蛋白酶抑制剂和保持蛋白质提取物的冷，包括执行柱纯化时，可以防止这种裂解。IgG 融合蛋白的单个成分在 Coomassie 凝胶上的非还原样品中无法区分。
图1：植物表达、提取和纯化过程的工作流程。请单击此处查看此图的较大版本。
| 使用核苷酸序列 | 氨基酸序列 | ||
| 序列 用于 asgfp 在 比！基姆 - 格夫帕什 向量 用于 表达 的 asgfp - igg 融合 |
Atggtgtccaagaggaggcttctgagagggcttttttc 卡格塔特加特加加特加加加卡 Acgaagagttggttggagggaggttcctcc Atctggaagttcaatatgccgctactgtactacccggagac Ttgcctatgtcctttgttatagctccccctctactacgg 格特卡特格特克克切克格加塔加塔特克特卡特克特特 卡加特格特加特特克特克切加加格特加 Ggatggagacggtacttactactcaccacgagtactc Ccttgaggacggttgcgttacttcaagactactttgaacgctt Ctggattcgacagagccactatgactaagttcgt 卡卡格特克加格特卡卡卡卡卡 AATGGTATATAACTTACTTCCACTTTTCTCTCTAAGAGGGAG Cggaactatccagatcggaactcaagactgcatcgttacca 格特格格格加格格特卡特卡特克塔格特克卡特克特克特 阿泰卡特卡特卡加卡加格 Atcacatcgttcagactgagcttcggttggttttg 格加加特加特加 |
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|
| 序列 用于 Gfp in pbyeamgfphgp 向量 用于 表达 格夫普 - 伊格 融合 |
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|
表 1：用于创建 asGFP 和 GFP 的序列
图2：在含有卡那霉素的LB板上生长的农业菌群。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：在整个农业细菌的生长和加工过程中，介质的出现。（A）在接种分离的农业菌群后立即出现LB介质。（B）在30°C下隔夜孵育一个孤立的菌落后，介质的存在。（C）培养物在4，500克（D）渗透缓冲液中重新沉淀后，培养物的外观旋转20分钟。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：N. 本thamiana植物的渗透 过程。（A-B） 稍微戳叶子会导致叶子顶部有一个微妙的洞。 （C-D） 将 农业细菌悬浮液 注射到叶子中。 （E） 从顶部视图渗入植物叶。 （F） 从顶部视图渗入有多个叶子的植物。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 5：包含 asGFP-IgG 融合和 GFP-IgG 融合的叶子的可视化在第一行的第 1 天开始渗透后 （dpi），在所有条件下，最后一行的第 5 天 dpi 开始。A）在白光下 asGFP-IgG 融合。B）在长波紫外线下 asGFP-IgG 融合。C）在白光下融合GP-IgG。D）长波紫外线下的GP-IgG融合。请单击此处查看此图的较大版本。
图6：将 ASGFP-IgG 提取物的上一体添加到蛋白质 G 列中。A） 在白光下添加。 B） 在短波紫外线下添加。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：在短波紫外光下，在上清液的sGFP-IgG提取物通过柱流后，蛋白G树脂。A） 短波紫外光下的蛋白质G树脂。 B） 低PH条件下蛋白质洗脱时蛋白G树脂。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8：通过纯化在低pH条件下接触后获得的 asGFP-IgG 的纯化洗脱。请单击此处查看此图的较大版本。
图9：列样本的SDS-PAGE。 标有"R"的样品在还原条件下，标有"NR"的样品在非还原条件下。 A） 在紫外光下，只有非还原样品在 10% 聚丙烯酰胺凝胶中荧光，如 Elution 2 NR 通道中显示的。75 kDa 和 25 kDa 梯带也发荧光。 B） 同一凝胶的库马西染色显示样品中所有蛋白质的存在。在减少的洗脱中，无轻链的IgG融合、重链、轻链和可能降解的GP分别出现在+75 kDa、+50 kDa、+25 kDa和±10kDa。相比之下，在非减小洗脱中，存在一个突出的波段，与整个 asGFP-IgG 融合 （+200 kDa） 的大小一致。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该协议可用于视觉验证在N.Benthamiana植物生产的任何重组Ab或重组蛋白，包括那些需要暂时暴露在酸性环境中用于柱纯化目的42，43，44。此外，ASGFP与不同表达系统中的其他蛋白质的融合是实验可视化和教育的有用工具。此处的协议可以进一步缩放到更大和更小的叶材料，以产生所需的重组蛋白量。所述方法利用了先前的研究，这些研究已经确定并制作了在酸性条件下保持稳定的GP版本。先前的综合研究已经创造了免疫球蛋白域融合到感兴趣的蛋白质，通常被称为IgG-融合，该协议也可以容纳28。通过创建和表达由与 GFP 和 asGFP 融合的人性化 IgG1 组成的 IgG 融合，我们能够在表达、提取和纯化过程中可视化所需蛋白质的存在。
如果熟练的研究人员遵循此协议，叶子将在第4-5天之间开始在渗透点显示坏死迹象。然而，当使用所述的载体时，渗透的叶子区域应该看起来健康，直到第5天适当小心。重要的是要注意，农业细菌感染本身将导致植物叶坏死，由于活性氧物种（ROS）的积累作为植物细胞免疫反应的一部分51，52。这种免疫反应和由此产生的坏死水平可能因几个因素而有所不同，包括细胞靶向、蛋白质的位置、产生的蛋白质类型、表达载体以及使用53、54的农业细菌菌株。此外，用于渗透的农业细菌的光学密度（OD600）的变化会影响坏死水平55。许多表达载体利用结合视网膜母细胞瘤蛋白的蛋白质，使植物细胞保持合成（S）相，并增加细胞分裂和转化频率56，57。蛋白质产量的增加，如与视网膜母细胞瘤蛋白结合引起的蛋白质增加，可导致坏死56，57。载体设计方面的进步，如在本文使用中的宝石病毒 BeYDV 重孔的修改版本中使用的进展，在保持高蛋白表达水平58的同时，最大限度地减少了坏死。此外，BeYDV复制物是非竞争的，在单个盒式磁带上提供多种蛋白质的表达，没有已知的大小限制53，59。
几个因素影响植物在渗透之前和之后的生长，这最终可能导致低蛋白质产量。当播种植物时，每个植物颗粒的种子太多会导致许多小植物芽，导致更温和的植物生长。因此，减少每个泥炭颗粒的种子数量，并在一周后去除多余的芽，将改善植物的生长。保持适当的土壤水分是影响植物整体健康的另一个因素。过度脱水、水下、添加太多或太少的肥料都可能导致氯病，影响植物健康60、61、62。坏死和氯酸可能另外是由产生一种导致细胞应激的蛋白质引起的。这种现象已经多次与重组免疫复合物（RIC）的表达（RIC）的表达。我们观察到，蛋白质结构和蛋白质融合的变化可以帮助最大限度地减少坏死;然而，一些蛋白质可以保持有毒的植物，即使经过各种修改。如果使用本文概述的表达载体，蛋白质的提取可以提前和在发生重大坏死之前进行，从而产生高蛋白产量56。
不同的生长条件可以减缓甚至 抑制农业细菌 的生长。 农业细菌在 28°C-30°C下生长最佳，在30°C以上孵育时出现热冲击，产生细胞分裂误差62。生长也可能因添加太多的利福平而受阻，因为不同的 农业细菌菌株 或多或少对这种抗生素有天然耐药性。为渗透准备的细菌培养与明显高于建议的OD600 将可能导致坏死55。稍微高一点的OD 600 培养物通常不会影响产量，但如果低于0.1，蛋白质的含量可能会显著降低。死亡细胞的积累可能发生在两种情况下;1） 培养物过度生长，导致相当一部分OD是死细胞，2）生长后破坏/杀死农业 细菌 ，如化学残留物或高离心机速度。在培养物中使用增加的死细胞进行渗透可能会减少蛋白质表达。此外，施加太大的压力来刺穿叶子会损害叶子，因此可能导致过早坏死。在表达尼科蒂亚娜本thamiana中的重组 蛋白时考虑到这些可能的因素，可以提高蛋白质的产生。
获得低蛋白产量可能是由于提取和纯化步骤中的一些问题。首先，提取缓冲液可能需要根据感兴趣的蛋白质进行优化。在混合过程中，植物材料应均匀，没有任何可见的叶片。其次，一些蛋白质需要洗涤剂在萃取缓冲液中溶解，如Tween-20或Triton。其他蛋白质可能需要高浓度为7.5M的尿素进行溶解，而有些蛋白质只能用PBS提取。如果缓冲液、植物组织、离心机等在提取过程中不保持凉爽，则蛋白质的降解可能发生。缺乏蛋白酶抑制剂和抗酸钠或类似化学物质在提取缓冲液也可能导致降解或聚集。一些蛋白酶抑制剂，如PMSF迅速降解，和抗坏血钠需要一些时间才能变得水。总的来说，研究人员应该确定他们感兴趣的蛋白质的最佳条件。
IgG-融合的纯化包括几个步骤，如果获得低蛋白质产量，可能需要修改。分析SDS-PAGE和西法在整个过程中收集的样品等分，将有助于识别方法的故障。例如，如果流经含有大量的蛋白质，那么可以通过改变缓冲液的pH值来促进蛋白质的结合。在萃取过程中使用高浓度的洗涤剂可能会影响树脂的结合性能，尤其是在树脂多次重复使用时。如方法所述，正确储存树脂对树脂的使用寿命至关重要。此外，如果洗涤步骤从树脂中去除感兴趣的蛋白质，可能需要重新制作缓冲液来解决这个问题。蛋白质纯化的其他问题可能是由于蛋白质的折叠或降解，这可能需要进一步分析整个蛋白质的设计。参考所述故障排除可能会提高使用此协议进行纯化的效率。
所述的GP-IgG融合纯化在教学环境中是有帮助的。可视化是科学教育的根本，因为它使学习者更容易理解概念。学生经常报告误解，除了难以理解在分子水平39的概念。特别是，需要了解每个步骤中特定蛋白质位置的实验可以通过用荧光分子标记感兴趣的蛋白质来修改。因此，GFP 或 asGFP，根据使用的 pH 环境，可以利用其荧光，以促进对学生的蛋白质纯化技术的阐明。
总之，我们描述了一个简单的方法，用于表达和纯化一个重组的Ab融合到 N.Benthamiana植物的GP。 该协议可用于纯化Ab融合到任何所需的靶蛋白。该过程可以编辑，以适应各种数量的叶材料，并允许在蛋白质提取和纯化过程结束之前、期间和之后对蛋白质存在进行视觉测定。这些方法可以作为控件使用，并且可用于教学技术。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢玛丽亚皮娅迪帕尔玛编辑的视频。我们还感谢亚利桑那州立大学教育外联和学生服务办公室慷慨的出版费援助。该议定书的研究得到了亚利桑那州立大学生命科学学院的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringe | any | N/A | |
| 50 mL syringe | any | N/A | |
| Agar | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
| Blender with cups | any | N/A | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Glycerol | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
| Glycine | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
| HCl (Hydrochloric acid) | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
| Heating block | any reputable supplier | N/A | |
| Jiffy-7 727 w/hole peat pellets | Hummert International | 14237000 | |
| Kanamycin | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
| KCl (Potassium Chloride) | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
| KH2PO4 (Potassium Phosphate) | J.t.baker | 3248-05 | |
| KOH (Potassium Hydroxide) | VWR | BDH0262 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
| MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
| Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
| Moisture control potting mix | Miracle-Gro | 755783 | |
| Na2HPO4 (Sodium Phosphate) | J.t.baker | 3827-01 | |
| NaCl (Sodium Chloride) | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | N/A | |
| PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) | G-Biosciences | 786-787 | |
| Polypropylene Column | any | N/A | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610394 | |
| Protein G resin | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | G-Biosciences | DG093 | |
| Sodium Ascorbate | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
| Spectrophotometer | any reputable supplier | N/A | |
| Titan3 0.75 µm glass fiber filter | ThermoScientific | 40725-GM | |
| Tray for peat pellets with dome | any | N/A | |
| TRIS Base | J.t.baker | 4109-02 | |
| Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
| Tryptone | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
| UV lamp | any | N/A | |
| Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2000992 | |
| Yeast extract | SIGMA-ALDRICH | 9182 |
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