Summary
אנו מתארים כאן שיטה פשוטה לביטוי, חילוץ, וטיהור של IgG אנושי רקומביננטי התמזגו GFP בניקוטיאנה benthamiana. פרוטוקול זה ניתן להרחיב לטיהור והדמיה חזותית של חלבונים רבים המשתמשים כרומטוגרפיה עמודה. יתר על כן, הפרוטוקול הוא הסתגלות למעבדת הוראה פנים אל פנים ווירטואלית במכללה, מתן מחקר מבוסס פרוייקט.
Abstract
ביקוש גבוה לנוגדנים כהתערבויות טיפוליות למחלות זיהומיות, מטבוליות, אוטואימוניות, ניאופלסטיות ומחלות אחרות יוצר צורך הולך וגדל בפיתוח שיטות יעילות לייצור נוגדנים רקומביננטיים. נכון ל-2019, היו יותר מ-70 נוגדנים חד-קלונליים שאושרו על ידי ה-FDA, ויש פוטנציאל צמיחה אקספוננציאלי. למרות הבטחתם, הגבלת הגורמים לשימוש נרחב הם עלויות ייצור ומורכבות. בפוטנציה, צמחים מציעים אסטרטגיות ייצור חלבון בעלות נמוכה, בטוחה ומדרגית בקלות. צמחים כמו Nicotiana benthamiana לא רק יכול לקפל כראוי להרכיב חלבונים יונקים מורכבים, אלא גם יכול להוסיף שינויים קריטיים לאחר תרגום דומה לאלה המוצעים על ידי תרבויות תאים יונקים. בעבודה זו, באמצעות GFP מקורי וגרסה חומצית יציבה של חלבון פלורסנט ירוק (GFP) התמזגו לנוגדנים חד-שבטיים אנושיים, הצלחנו לדמיין את כל תהליך ההבעה והטיהור של נוגדנים ארעיים מצמחי N. benthamiana. בהתאם למטרת הניסוי, היתוך GFP מקורי יכול להבטיח הדמיה קלה יותר במהלך שלב הביטוי בצמחים, בעוד היתוך GFP יציב חומצה מאפשר הדמיה במהלך עיבוד במורד הזרם. הליך מדרגי וישיר זה יכול להתבצע על ידי חוקר יחיד לייצר כמויות מיליגרם של נוגדנים טהורים מאוד או חלבוני היתוך נוגדנים בעניין של ימים באמצעות רק כמה צמחים קטנים. טכניקה כזו יכולה להיות מורחבת להדמיה של כל סוג של תהליך טיהור נוגדנים ופוטנציאל חלבונים רבים אחרים, הן במערכות צמחים והן במערכות ביטוי אחרות. יתר על כן, טכניקות אלה יכולות להפיק תועלת מהוראות וירטואליות ולהיצא לפועל במעבדת הוראה על ידי סטודנטים לתואר ראשון בעלי ניסיון קודם מינימלי עם טכניקות ביולוגיה מולקולרית, מתן בסיס למחקר מבוסס פרוייקט עם יישומים בעולם האמיתי.
Introduction
דו"חות התעשייה מצביעים על כך ש-13 מתוך 20 התרופות המרוויחות ביותר בארה"ב היו ביולוגיות (תרופות מבוססות חלבון), מבין תשע מהן היו נוגדנים. נכון ל-2019, היו יותר מ-570 נוגדנים (Ab)טיפוליים בשלבי פיתוח קליניים שונים 1,2,3. המכירות הגלובליות הנוכחיות של Ab עולות על 100 מיליארד דולר, והשוק הטיפולי המונוקלונלי Ab (mAb) צפוי להניב עד 300 מיליארד דולר עד 20251,4. עם ביקוש גבוה כזה ותוססות צפויות בהכנסות, חוקרים כבר עובדים כדי לפתח דרכים לייצר Ab therapeutics בקנה מידה גדול יותר, עם איכות גבוהה יותר ועלויות נמוכות יותר. מערכות ביטוי המבוססות על צמחים כוללות מספר יתרונות על פני קווי תאים מסורתיים של יונקים לייצור במחיר סביר ובהיקף גדול של Ab therapeutics5,6. ייצור של טיפולים חלבונים בצמחים ("pharming מולקולרי") אינו דורש ביו-כורים יקרים או מתקני תרבות תאים כמו טכניקות מסורתיות של תרבותתאים יונקים 7,8. צמחים לא יכולים לנדבק בפתוגנים אנושיים, מזעור זיהום פוטנציאלי9. ביטוי חלבון ארעי וטרנסגני המבוסס על צמחים יכול להיות מנוצל כחלופות בעלות נמוכה יותר למערכות ייצור יונקים אוחיידקים 10. למרות צמחים טרנסגניים מועדפים לייצור יבול, ייצור חלבון רקומביננטי באמצעות שיטה זו יכול לדרוש שבועות עד חודשים. התקדמות בביטוי ארעי באמצעות וקטורים ויראליים באמצעות מזרק או ואקום אגרו-סינון מאפשרת ייצור בקנה מידה קטן וגדול, בהתאמה, של החלבון הרצויבימים 11,12,13,14. ייצור mAbs נגד אבולה, דנגה, זיקה, וחלבונים רקומביננטיים רבים אחרים, יוצרו וטוהרו במהירות וביעילות באמצעות ביטוי ארעי בצמחים N. benthamiana 15,16,17,18,19. נסיבות אלה הופכות ביטוי ארעי המבוסס על צמחים לאפשרות אטרקטיבית לפיתוח טיפולי Ab מרובים והשיטות שהוצגו בפרוטוקולזה 20.
הדור הראשון mAbs היו של נגזרת מורין, אשר הביא אימונוגנים לא ספציפיים כאשר נעשה שימוש בניסויים בבניאדם 21. לאורך זמן, כימרית, הומנית, ובסופו של דבר, שרירי בטן אנושיים לחלוטין יוצרו כדי להפחית את החיסונים המושרה על ידי Ab therapeutics. למרבה הצער, חלק Abs אלה עדיין לגרום immunogenicity המארח בשל הבדלים גליקוסילציה21. התפתחויות בהנדסת צמחים אפשרו שינוי של גליקנים Ab, וזה חיוני מאז היציבות והפונקציה של Ab יכול להיות מושפע באופן משמעותי על ידי מצב גליקוסילציהשלה 22. ההתקדמות אפשרה ייצור במערכות צמחים של ביטוי ברמה גבוהה של mAbs הומני, המכיל גליקנים אנושיים וכתוצאה מכך את התכונות הביולוגיות הרצויות של תרופות אדם בייצורהמוני 19,21.
בנוסף שרירי בטן רקומביננטי, מולקולות היתוך Ab (היתוך Ab) נחקרו למטרות שונות בעשורים האחרונים. היתוך Ab מורכב לעתים קרובות שבר Ab או Ab התמזגו מולקולה או חלבון נועדו לעורר תגובות מתאי השפעה חיסונית23. מולקולות אלה נוצרו כהתערבויות טיפוליות פוטנציאליות לטיפול בפתולוגיות שונות כגוןסרטן ומחלות אוטואימוניות 24,25,26,27. תסביך חיסוני רקומביננטי (RICs) הם סוג נוסף של היתוך Ab שהועסקו כמועמדים לחיסון28. RICs לנצל את היכולת של המערכת החיסונית לזהות אזורי Fc של היתוך Ab נמצאו כדי לשפר את immunogenicity בשילוב עםפלטפורמות חיסון אחרות 29,30,31.
חלבון פלורסנט ירוק (GFP) הוא חלבון ביולומיין המופק מדוזה אקוורה ויקטוריה, אשר פולט אור ירוק כאשר מתרגש אור אולטרהסגול 32,33. במהלך השנים, השימוש של GFP כסמן חזותי של ביטוי גנים התרחב מביטוי בEscherichia קולי למערכות ביטוי חלבון רבות, כולל נ. benthamiana צמחים 34,35,36,37,38. סמנים גלויים, כגון GFP, יש השלכות בשפע בהוראה ולמידה של מושגים מדעיים. סטודנטים רבים ברמה ההדרגתי מתארים קשיים בתפיסת מושגים מדעיים כאשר הרעיון הנלמד אינו גלוי לעין בלתי, כגון המושגים של ביולוגיה מולקולרית ותחומיםקשורים 39. סמנים חזותיים, כמו GFP, יכולים לתרום לעיבוד מידע הקשור לתהליכים המדעיים, יכולים לעזור להפחית את הקשיים שהתלמידים מדווחים עליהם בלימוד מושגים מדעיים רבים.
למרות GFP משמש לעתים קרובות כסמן כדי לציין גן וביטוי vivo, קשה לדמיין את זה בתהליכים במורד הזרם אם באמצעות תנאים חומציים. נסיבות אלה נובעות בעיקר מכך ש-GFP אינו שומר על המבנה שלו ועל הפלואורסץ הנובע מכך ב-pH40 נמוך. סביבות חומציות זמניות נדרשות לעתים קרובות בתהליכי טיהור שונים, כגון חלבון G, חלבון A, וחלבון L כרומטוגרפיה, לעתים קרובותמנוצל עבור Ab טיהור 41,42,43,44. מוטנטים GFP שימשו כדי לשמור על פלואורסצינטי בתנאים חומציים45,46.
בכאן אנו מתארים שיטה פשוטה לביטוי, חילוץ, וטיהור של חלבוני היתוך IgG רקומביננטי בצמחים N. benthamiana. יצרנו GFP מסורתי התמזגו N-terminus של שרשרת כבדה IgG הומני, יצירת היתוך GFP-IgG. במקביל, פיתחנו את ההיתוך של רצף ממוטב codon צמח עבור GFP חומצה יציבה (asGFP) כדי N-terminus של שרשרת כבדה IgG הומני, יצירת היתוך asGFP-IgG. היתרונות של ייצור GFP-IgG כוללים את היכולת לדמיין את הנוכחות של חלבון היעד במהלך הביטוי, בעוד asGFP-IgG מאפשר לראות את הנוכחות של חלבון רקומביננטי לא רק שלבי הביטוי והחילוץ אלא גם בשלבי הטיהור של החלבון. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לייצור, טיהור, והדמיה חזותית של מגוון של חלבוני היתוך GFP המיוצר N. benthamiana ומטוהר באמצעות טכניקות כרומטוגרפיה הדורשות pH נמוך. התהליך יכול להיות מותאם גם לכמויות שונות של חומר עלה. בעוד Abs וחלבונים היתוך מתויגים GFP או asGFP אינם מיועדים לשימוש עבור טיפולים, שיטות אלה יכול להיות שימושי כמו פקדים במהלך ניסויים, ניתן גם להשתמש ככלי הוראה לביולוגיה מולקולרית ותאי וביוטכנולוגיה, הן פנים אל פנים וכמעט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לטפח נ. צמחים benthamiana
- מניחים כדורי כבול אדמה על מגש ויוצקים מבושלים קודם לכן, עדיין חמים (כ-40-45 מעלות צלזיוס), מים מעל כדורי כבול להתרחבות מלאה. לאחר כדורי מורחבים באופן מלא, מניחים 2-3 N. זרעי benthamiana על כל כדור כבול באמצעות פינצטה.
- יוצקים כ-0.5 לתוך מים כדי לכסות את תחתית המגש. תייג את המגש עם תאריך הזרעה. ממשיכים להשקות את השתילים מדי יום עם כמויות מתאימות של דשן. דשן (מסיס במים מזון צמחי לכל מטרה) ריכוז הוא בדרך כלל 2.5-2.8 g/L.
- מכסים את המגש עם ראש לח כאשר הם ממוקמים בתא הצמיחה. שמור את כדורי כבול זרע בתא הצמיחה ב 23-25 ° C, עם 16 שעות photoperiod ו 60% לחות יחסית.
- לאחר שבוע, להסיר צמחים נוספים עוזב כל גלולה עם שתיל אחד בלבד.
- כאשר הצמחים הם בני 2-3 שבועות, להעביר כל כדור כבול סיר בודד המכיל אדמה בקרת לחות. הדגמה זו השתמשה בפיקוח על לחות של מירקל-גרו.
- מים ביום עם דשן 1 גרם/ל. לעולם אל תשאיר את האדמה יבשה לחלוטין. הצמחים מוכנים להסתננות כאשר הם 5-6 שבועות.
2. הכנת אגרובקטריום טומפאסינס להסתננות
הערה: ניתן להשיג מבנים היתוך GFP-IgG כמתואר במאמר זה31. הגן asGFP הושג וצמח אופטימיזציה ממחקר זה45. השלבים הבאים חייבים להיעשות לצד מבער Bunsen, וטכניקות aseptic בסיסיות יש להחיל כדי למנוע זיהום.
- פס A. tumefaciens EHA105 מחסה שעועית צהובה ננס וירוס (BeYDV)19 צמח ביטוי וקטור עבור כל מבנה (asGFP-IgG, GFP-IgG, שרשרת אור) מתוך מלאי גליטרול על LB אגר (10 גרם / L טריפטון, 10 g/L NaCl, 5 גרם תמצית שמרים, 15 גרם / L אגר, 50 μg / מ"ל kanamycin) צלחת.
- לגדול ליום אחד ב 30 מעלות C עומד אינקובטור. בודד מושבה אחת לאימות על-ידי פרוטוקול PCR סטנדרטי של מסך המושבה.
- השתמש במושבה מאומתת עבור כל מבנה. מילוי צינור חרוכי עם 10 מ"ל של LB מדיה (10 g/L טריפטון, 10 g/L NaCl, 5 גרם של תמצית שמרים, 50 μg / מ"ל). לאחר מכן, להוסיף 10 μL של 100 μg / מ"ל kanamycin. להוסיף 10 μL של 2.5 μg / מ"ל rifampicin כדי למנוע זיהום E. coli. דגירה ב-30 מעלות צלזיוס ו-120-150 סל"ד למשך הלילה.
- למחרת, אם תרבות אגרובקטריום גדל OD600 = 0.6-0.9, זה יכול לשמש לחדירה. אם הוא מגודל (OD600 > 1), 1-2 מ"ל יש להעביר LB טרי עם אנטיביוטיקה וגדל ODהנדרש 600. בהתאם לריכוז התרבות הראשונית, ייתכן שיהיה להימשך יומיים כדי לגדול ל- OD600 = 0.6-0.9.
- פעם אחת ב ODהמתאים 600, למקם את התרבויות צנטריפוגה, גלולה החיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4,500 x g עבור 20 דקות, טמפרטורת החדר (RT).
- Decant supernatant משתי הדגימות, ולאחר מכן לתלות מחדש כל גלולה 1x מאגר חדירה (10 mM 2-(N-morpholino) חומצה אתנוסולפונית, 10 mm מגנזיום סולפט, מותאם pH 5.5 עם KOH) כדי לקבל ODהסופי 600 = 0.4. זה צריך לקחת בערך 15-45 מ"ל של חיץ חדירה, בהתאם לצפיפות התרבות הראשונית. שלב כרכים שווים של כל מבנה היתוך IgG עם מבנה שרשרת האור כדי לקבל ODסופי 600 = 0.2 לכל מבנה בכל צינור.
3. מילוי אגרו-סינון מזרק ללא מחט
- קח מהדק נייר מיושר וצמחים N. benthamiana בן 5-6 שבועות ממדרגה 1. בעזרת הקצה החד של מהדק הנייר, בצע ניקוב קטן בשכבה האפידרמיסית הראשונה של העלה על פני השטח האדקסיאליים. הימנע מניקוב זה לאורך כל הדרך.
הערה: העלים הנמוכים קלים יותר לחדירה, בעוד העלים על החלק העליון של הצמח קשים יותר. בדרך כלל, הביטוי של חלבונים רקומביננטי הוא הגבוה ביותר בעלים הממוקמים באמצע צמח, ועלים אלה גם לקבל פחות נמק. - מלא מזרק 1 מ"ל, ללא מחט מחוברת, עם פתרון אגרובקטריום מוכן מ שלב 2. לכסות את החור שנעשה בשלב הקודם עם סוף המזרק ולדחוף לאט להזריק את החיידקים לתוך העלה תוך החלת לחץ נגד עדין מאחורי העלה. צפה עלה להכהות כמו הפתרון מוזרק מבלי להפעיל יותר מדי לחץ על המזרק.
- נסו לחדור לרוב אזור העלים במהירות מקסימלית של 3-4 פעמים – נזק מוגזם לעלים עלול לעכב את תפוקת החלבון. עלה הצמח הסתנן יופיע בעיקר כהה מהנוף התחתון.
הערה: פתרון חיידקי זה צריך להיות מספיק עבור לפחות 3-4 צמחים לכל מבנה. Autoclave כל פתרון חיידקי שנותר לפני ההשלכה.
4. לגדול ולצפות N. benthamiana הסתנן
- המקום חדר צמחים בחזרה בתא הצמיחה ולהמשיך להשקות מדי יום.
- שימו לב לעלים של כלורוזיס ונמק באזורים שחדרו. צפה צמחים עבור פלואורססכיות GFP (אם GFP קיים) תחת מנורת UV ארוך וקצר גל.
- היום 4-5 מראה את הפלואורססנציה הגבוהה ביותר של שני המבנים GFP על העלים. לקצור את כל העלים ב 4-5 dpi (ימים לאחר הסתננות) ולשקול את החומר עלה הכולל.
- השתמש בו באופן מיידי לעיבוד במורד הזרם או לאחסון ב- -80 °C עד מוכן לשימוש.
5. חילוץ חלבונים
- שמור מאגרים וגביעי בלנדר על קרח או ב-4 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
- הכן 2-3 מ"ל של מאגר חילוץ קר כקרח (100 מ'מ טריס-HCl, 50 מ"מ NaCl, 2 מ"מ EDTA, pH 8 עם HCl) לכל 1 גרם של חומר צמחי. הוסף 2 mm פנילמתילsulfonyl פלואוריד (PMSF) מן המלאי (100 mM) ו 50 mM נתרן ascorbate למאגר החילוץ ממש לפני החילוץ.
- מניחים רקמת צמח משלב 4 לתוך בלנדר מראש. הוסף כמות מדודה של מאגר חילוץ צויר לספל הבלנדר (כפי שצוין בשלב 5.2). מניחים את הבלנדר על הבלנדר. לוקחים סדין חתוך מראש של פרפילם ומותחים אותו מעל החלק העליון של הבלנדר. מערבבים להומוגניות עם מרווחי זמן של 20 שניות, ומערבבים היטב בין מחזורי התערובת במידת הצורך.
- מעבירים חומר מעורבב לבקת. מוסיפים בר ערבוב ומערבבים ב-4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לשפר את מסיסות החלבון ולאפשר משקעים של מוצקים.
- מניחים 2 שכבות של מירפלת על גבי שקית נקייה על קרח ושופכים את התמצית דרכו כדי להסיר פסולת עלים גדולה. לאחר כל התמצית מוזגת, מקפלים את מירהבד כדי לסחוט את תמצית העלים הירית. התמצית צריכה להיראות ירוק כהה ללא חלקיקים גלויים.
- להעביר 50 μL של מדגם זה צינור חדש 1.5 מ"ל תווית "תמצית מוחלטת" לניתוח מאוחר יותר. מעבירים את התמצית לצינורות צנטריפוגה. צנטריפוגה שאר תמצית הצמח ב 16,000 x g עבור 20 דקות, 4 ° C ולהעביר את supernatant לצינור חוט.
- מסננים את התמצית המסיסה באמצעות מזרק 50 מ"ל ומסנן סיבי זכוכית מזרק (0.75 μm).
- לאסוף 50 μL של מדגם לאחר צנטריפוגה, תווית "תמצית מסיסה" לניתוח מאוחר יותר.
6. הליך כרומטוגרפיה של עמודת חלבון G
הערה: הפרוטוקול המתואר כאן הוא עבור כרומטוגרפיה זרימת כבידה באמצעות שרף אגרוז חלבון פירס. אם אתה משתמש ב- resin אחר, עיין בהוראות היצרן להתאמות. לעולם אל תיתן לאשף להתייבש ולמנוע מכל הנוזלים להתנקז. לסכם את השקע כצריך.
- הגדר עמודת פוליפרופילן המכילה 20 מ"ל של דגימה.
- להעריך את כמות slurry הדרושה בהתאם לסוג immunoglobulin היעד ואת זיקתו לארין. בדרך כלל, 3 מ"ל של slurry הכולל עם 1.5 מ"ל נפח המיטה מספיק לטיהור של כמה מיליגרם של Ab.
- שופכים בזהירות את הכמות הנדרשת של slurry מחדש לתוך העמודה כתרים. פתח את שקע העמודה מתחתית העמודה ואפשר לו לנקז עד שרוב המאגר ייעלם.
- מיד לשפוך 10 מ"ל של מאגר כביסה 1x PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 עם HCl) על גבי. תן לו לנקז ולחזור על שלב השטיפה הזה פי 2.
- החל את הדגימה המסוננת בשלב 5 על העמודה ואסוף את התעבורה - aliquot 50 μL של זרימה דרך לניתוח מאוחר יותר. שמור את שאר התזרמים למקרה שה-Ab לא נקשר לאשרף.
הערה: החלה מחדש של זרימה דרך עמודה חדשה אינה גרמה בדרך כלל לתשואה טובה; לכן מומלץ להתחיל עם חומר עלה חדש. - לשטוף את השף פעמיים עם 10 מ"ל של PBS 1x כדי להפחית איגוד לא ספציפי. אם תרצה, aliquot 50 μL של שטיפה כמו המאגר מתנקז דרך העמודה כדי לוודא כי Ab היעד אינו מנומק עם מאגר כביסה.
- תארגן ותתייגי חמישה צינורות עם 125 μL של סטרילי 1 M Tris-HCl ב pH 8. זה כדי לנטרל את שרירי הבטן במאגר ההתחסה חומצי כדי למנוע שינויים מבניים פוטנציאליים. לחלופין, להוסיף 30 μL של 2 M Tris בסיס כדי לקבל מדגם מדולל פחות.
התראה: במהלך ההתמהמהות, ניתן להשתמש באור UV להדמיה חזותית. אין צורך לעשות זאת למשך ההתרמה. אם UV נמצא בשימוש, הקפד ללבוש PPE מתאים כדי למנוע נזק לעיניים ולעור. אין צורך להשתמש באור UV במהלך שלב ההתרה. - להגן על שרירי הבטן על ידי החלת 5 מ"ל של מאגר חומת (100 mM גלצין, pH 2.5 עם HCl) על העמודה ולאסוף שברים 1 מ"ל לכל צינור ייעודי מהצעד הקודם.
- מיד לחדש את העמודה על ידי החלת 20 מ"ל של מאגר כביסה, ואחריו 10 מ"ל של מאגר כביסה. ודא כי השרף לא נשאר בסביבה חומצית למשך זמן ממושך. תסנומות אמורות להופיע פלואורסצנטיות, לעתים קרובות הפלואורסצנטיות הגבוהה ביותר נראית בהתמהמה השנייה, אך עשויה להשתנות מחילוץ לחילוץ.
- לאחסון, לשטוף את השרף עם 10 מ"ל של 20% אתנול PBS ולתת לו לנקז באמצע הדרך. לסכם את החלק העליון, לאחר מכן את החלק התחתון של העמודה, ולשמור זקוף ב 4 ° C.
הערה: בדרך כלל, חלבון G resins ניתן לעשות בו ערך רב עד 10 פעמים ללא אובדן משמעותי של יעילות. עיין בהנחיות היצרן לקבלת פרטים ספציפיים. - לקבוע ריכוז Ab באמצעות ספקטרופוטומטר על ידי מדידת ספיגה ב 280 מילימטר, באמצעות מאגר ההתחכות כריק. לאחסן את ההבהרות ב -80 °C ו aliquot 50 μL של כל שבר לצינור נפרד לניתוח נוסף.
7. SDS-PAGE לזיהוי היתוך GFP-Ig
- הכן את כל הדוגמאות לפני הגדרת ה-SDS-PAGE.
- להוסיף 4 μL של מאגר מדגם (6x הפחתת מאגר מדגם: 3.0 מ"ל של גליצטרול, 0.93 גרם של DTT, 1 גרם של SDS, 7 מ"ל של 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 מ"ג של כחול ברומונול); (6x מאגר מדגם ללא הפחתה: 3.0 מ"ל של גליסרול, 1 גרם של SDS, 7 מ"ל של 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 מ"ג של כחול ברומונול) כדי 20 μL של כל מדגם (תמצית כוללת, תמצית מסיסה, flowthrough, לשטוף, כל חלקי אלוטי) לניתוח. ודא כי כיפות הצינור מהוקצות היטב.
- לטפל רק הפחתת דגימות במשך 5 דקות באמבט מים רותחים, ולאחר מכן לשים דגימות במשך 5 דקות על קרח. ספין דגימות microcentrifuge עבור ~ 5 s ולטעון 20 μL של כל מדגם בסדר של איסוף לתוך בארות הג'ל. טען 3 μL של סולם חלבון דו-צבעי בבאר נפרדת.
- הפעל את הג'ל SDS-PAGE ב- 100 V קבוע להפרדת רצועות החלבון הרצויה; זה לוקח בערך שעה וחצי. נטר את הסולם כאינדיקטור להפרדת חלבונים.
- לדמיין את הג'ל תחת UV כדי לצפות פלואורסוצטי GFP.
- אם תרצה, הכתים את הג'ל עם כתם Coomassie כדי להעריך את החלבון הכולל בכל מדגם. לחלופין, לבצע כתם מערבי כדי להעריך חלבון היעד באמצעות Abs ספציפי.
הערה: ניתן לבצע גם כתמי Coomassie וגם כתם מערבי על-ידי ביצועפרוטוקולים סטנדרטיים 47,48.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מחקר זה מדגים שיטה קלה ומהירה לייצר חלבונים רקומביננטיים ולדמיין אותם לאורך תהליכים במורד הזרם. באמצעות N. benthamiana ובעקבות הפרוטוקול שסופק, ייצור חלבון רקומביננטי המתואר כאן ניתן להשיג בתוך פחות משבוע. זרימת העבודה הכוללת של ביטוי צמח, חילוץ וטיהור מוצגת באות 1. השלבים של גידול צמחים מתוך שתילים בני שבועיים, צמחים בני 4 שבועות וצמחים בני 6 שבועות מוצגים בדמות 1A (1-3), בהתאמה, בעוד איור 1B מתאר שינויים מורפולוגיים עלים עקב נמק (איור 1B-1) או כלורוזיס (איור 1B-2). נמק עלול להתרחש באתר ההזרקה בין ימים 3-5 לאחר חדירה. שינויים אלה תלויים לעתים קרובות במאפיינים של החלבון המתבטאים ובריאות הצמחים הסתננו (בהמשך לדיון). בו זמנית, כלורוזיס יכול גם להסתמך על הבריאות של צמחים בשימוש (נבדק נוסף בדיון). התהליך של גידול אגרובקטריום והכנה להסתננות מוצג בדמות 1C. איור 1C-1 מציג מושבות מבודדות של אגרובקטריום. נתונים 1C (2-5) מציגים את המראה הצפוי של התקשורת לאחר שהיא מחוסנת במושבה מבודדת אחת. עיין בדמות 3 לקבלת פרטים נוספים על שלבים אלה. תהליך החדירה של הצמח מוצג בדמות 1D ומתחיל בצמח שלא חדר, ואחריו תהליך החדירה. הביטוי, החילוץ וההבהרה של חלבוני הצמח מוצגים באות 1E. חומר העלה ממוקם בבלנדר והוא הומוגני, המוצג באותיות 1E (1-3). לאחר מכן נלקחה דגימה המייצגת הומוגניות מוחלטת. לאחר מכן הוא מסונן דרך Miracloth (גזה או אפילו מסנן קפה יכול להחליף הוצאות מופחתות), ואת ההשעיה הבהירה הוא צנטריפוגה. הצנטריפוגה מאפשרת הפרדת העל מהחומרים הנותרים, כפי שמצוין בדמויות 1E (4-6). לאחר מכן נטען הסופרנט המובהר על עמודת כרומטוגרפיה של זיקה לחלבון G, איור 1F (1.3). לאחר שרוב החלבון כבול, איור 1F-4, החלבונים הם ג'ים מן שרף איור 1F (5,6).
טבלה 1 מציגה את רצפי חומצת גרעין ממוטב הצמח המשמשים לייצור asGFP45 (שורה עליונה) pBY! KEAM-GFPasH וקטור המשמש במחקר זה כדי לבטא asGFP-IgG היתוך GFP33 (שורה נמוכה יותר) בוקטור PBYEAM-GFPHgp המשמש במחקר זה כדי לבטא היתוך GFP-IgG. רצפי חומצה גרעין נבדקו באמצעות כלי תרגום חלבון Expasy (https://web.expasy.org/translate/) כדי לקבוע רצפי חומצת אמינו.
לוח אגרובקטריום מייצג שהוכן באמצעות פרוטוקול זה מוצג באות 2. המושבות הרצויות אמורות להופיע עגולות ואחידות בצורתן ובצבען. למושבות קרובות יותר למרכז הצלחת יש סבירות גבוהה יותר להביע התנגדות kanamycin. התרבויות הנוזליות יהיו מוכנות ממושבה מבודדת אחת.
המראה הצפוי של מדיה המכילה תרבויות מוצג באות 3. עם החיסונים הראשוניים של מושבה מבודדת, מדיית LB תופיע צהובה ושקוף בהיר, כפי שמופיע באות 3A. לאחר דגירה של מושבה מבודדת לילה ב 30 מעלות צלזיוס, LB מדיה תופיע סוערת. כפי שניתן לראות באיון 3B, אובייקטים אינם יכולים עוד לראות דרך המדיה כאשר הצמיחה קיימת ב- LB. בעקבות צנטריפוגה, גלולה צריכה להיווצר בתחתית הצינור. הצינור יהיה הפרדה ברורה של LB מדיה מעל הכדור ויופיע צהוב בהיר ושקוף, כפי שמופיע איור 3C. והדגל נערך מחדש .במאגר החדירה ב OD600 של 0.2, התקשורת תופיע סוערת, כפי המוצג ב- איור 3D. יש למדוד את OD600 כמתואר בשיטות.
איור 4 מייצג את תהליך החדירה לעלים. דחיפה קלה של העלה עם מהדק נייר אמורה להניב הפסקה באפידרמיס העלה שאינו עובר לגמרי דרך העלה. השבר בקושי צריך לנקב את העלה כך מאגר החדירה ניתן להזריק לתוך העלה, המוצג איור 4A-C. ההשעיה של אגרובקטריום וחסם חדירה מוזרק ישירות לתוך השבר בעלה ומעט משנה את צבע העלה הסתנן; ראה איור 4D-F.
הופעת העלים המבטאים פיוז'ן IgG מיוצגת בדמות 5. הוא מציג עלים אקספרס asGFP-IgG פיוז'ן(איור 5A)ו GFP-IgG פיוז'ן(איור 5C)תחת אור לבן. אם המבנים בפרוטוקול זה משמשים, כאשר הסתננו ב 0.2 OD600, עלים צריכים להיראות בריאים בימים 1-5 עבור שני העלים המבטאים asGFP-IgG היתוך ועלים המבטאים היתוך GFP-IgG. ייתכן שיש מראה נמק קל באתרי הזרקה ביום 5, אשר בדרך כלל ניכר על ידי ברק של רקמת הצמח באזורים אלה. איור 5 מציג גם עלים המבטים היתוך asGFP-IgG(איור 5B)ו-GFP-IgG(איור 5D),בהתאמה, תחת אור UV ארוך מהנוף העליון של העלה. הפלואורססטיות מגבירה את עוצמתה ככל שהימים מתקדמים עבור שני המבנים המתבטאים. עלים המבטאים היתוך asGFP-IgG נוטים להיות פלואורסצנטיות מעט פחות אינטנסיבי מאשר עלים המבטאים היתוך GFP-IgG בכל הימים.
כאשר supernatant של תמצית asGFP-IgG מתווסף לעמודה חלבון G, הברסין יהפוך מעט ירוק תחת אור לבן בשל פיגמנטים כלורופיל צמח(איור 6A). התוספת של supernatant תחת אור UV גל קצר גורמת להצטברות של פלואורסצנטיות בחלבון G שריון, כפי שמצוין איור 6B. שים לב כי supernatant יהיה גם פלורסנט לבד תחת אור UV. עדיין, פלואורסצנס צפוי להיות הרבה יותר מרוכז כאשר ההיתוך asGFP-IgG מתחיל להיקשר לאשרף.
בעקבות פטירתו של supernatant של asGFP-IgG דרך חלבון G שף, את רין צריך להאיר תחת אור UV גל קצר, כפי שמצג איור 7A. בשלב זה, רוב IgG יהיה קשור לארין. עם הוספת מאגר ההתחכך, הפלואורסצנס הכלול בחלבון G resin עדיין יהיה גלוי תחת אור UV גל קצר ויתחיל לאבד את העוצמה כמו מאגר חוצפה יותר של pH נמוך עובר דרך השריון. פלואורסצנס תתחיל להצטבר בהברשות(איור 7ב). השברים של ההתרה ישתנו בפלואורסטיסטיות. כפי שניתן לראות בדמות 8, פלואורסצנס הוא האינטנסיביות הנמוכה ביותר בהתנשאות הראשונה ובעוצמה הגבוהה ביותר בהתמהמה השנייה והשלישית. התוצאות עשויות להשתנות, כמו הפלואורסץ יהיה תלוי בביטוי של החלבון, חומר עלה שנקטפו, ותנאים אחרים המשמשים בניסוי.
לאחר סיום תהליך הטיהור, דגימות מנותחות על ג'ל SDS-PAGE 10% בתנאים הפחתת (מאגר לדוגמה מכיל DTT ודגימות היו מבושלות במשך 5 דקות) ותנאים ללא הפחתת (מאגר מדגם אינו מכיל DTT ודגימות לא היו מבושלות). כפי שמופנת באיור 9A, רק דגימות שאינן מפחיתות, כגון בנתיב Elution 2 NR, יהיו פלואורסצ'ה כאשר נחשפו לאור UV גל קצר. הלהקה הראשונה של נתיב זה היא פלואורסץ בגודל הצפוי של המוצר המלא ~ 200 kDa, המציין כי asGFP הוא עדיין נכון קונפורמציה. רצועות הפלורסנט ליד החלק התחתון של הג'ל הן צבע מהמאגר המפחית. שים לב כי asGFP מאבד פלואורססק כאשר הוא נחשף לטמפרטורות של או מעל 95 °C למשך 5 דקות; זה שונה eGFP (GFP משופר), אשר ישמור על פלואורסקט כלשהובאותם תנאים 49,50. שתי להקות של הסולם, 75 kDa ו 25 kDa, גם פלואורסצ'ה. איור 9B מייצג כתם Coomassie של אותו ג'ל בדמות 9A. פליטות בנתיבים 6-9 הוכנו בתנאים צמצום. כאשר פועלים על ג'ל וCoomassie מוכתם, דגימות אלה צריך להציג את רכיבי היתוך asGFP-IgG בנפרד. רכיבים אלה כוללים את השרשרת הכבדה התמזגה GFP (~ 75 kDa), השרשרת הכבדה לבד (50 kDa), שרשרת האור (25 kDa), ואת asGFP עצמו (27 kDa). המדגם שאינו מפחית נכלל בנתיב האחרון של הג'ל למטרות השוואה ואם להציג רצועה אחת גדולה (כ-200 kDa), שאמורה להיות מורכבת משתי שרשראות כבדות המותכות ל-asGFP ולשרשראות אור בהתאמה. בנוסף, להקות קטנות יותר נגרמות ככל הנראה על ידי proteases מקורי. מחשוף זה ניתן למנוע עם תוספת של מעכבי פרוטאז ועל ידי שמירה על תמצית החלבון קר בכל עת, כולל בעת ביצוע טיהור העמודה. הרכיבים הבודדים של חלבון ההיתוך IgG לא יהיו בולטים בדגימות שאינן מפחיתות על ג'ל Coomassie.
איור 1: זרימת עבודה של תהליכי ביטוי, חילוץ וטיהור של הצמח. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
| רצף נוקלאוטיד בשימוש | רצף חומצות אמינו | ||
| רצפים משמש עבור asGFP ב פי.בי.בי.בי. קים (קים) -ג'י.פי.פאס וקטור משמש ב- את ה ביטוי של asGFP-IgG היתוך |
אני לא יודע אם אני יכול לעשות את זה, אבל אני יכול לעשות את זה. קגטקאטקטטאאטגגטקה ליאור הירש אנטגטגטאטקטאקגאגאגאק TTGCCTATGCTGGTTGTTATAGCTCCCCGCTTCAGTACGG GTTTCACATGTGCCCACTACTACCCGAGAGAGAGATAACTACTרקטרקט דרגתאתה תקטגג'קטיקטקטאקטגה גטגאגקט ג'אגגטגטג'קט גלקטקטקטאגאגאקקט קאקהקטקטאקאגאגטקהאקהג'קהג'קה אתאגטטטגאקטקטטגאגגה ת.ג.ק GTTGGCGGAAGAAGCTCAGCAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGATACTCTTC אטאקטאקאטקטטגאגאצ'אקאגאג טאקהקטטגגט ג'ורג'יה גלקטאקאגה |
מ.ס.ק.ג'י.גרלף תפריט: נוי אלון נג'פקואג'ף ליאור הנוי ג'י.די.פי.או.פי.או.פי.די.אם. תפריט: אה לה 4, 100 ת.פ.ק.פ. ג'י.טי.איי. דרמטגג'יט ליאור הלל ת.ב.א.ג. 10000 דולר תפוצתוע תסב,תסב לילקאדג'טיקטיק (ג'ירקוב, 2000) קפלהטקייק-ק-ד ת.ד. היבקוטלב ליאור הלל ק' |
|
| רצפים משמש עבור GFP ב פי.אי.די.ג'י.פי וקטור משמש ב- את ה ביטוי של GFP-IgG היתוך |
תותיק TCTCTCCTGGCTCTCCT ג'י.טי.ג'י.ג'י. ג'אגגטגטטגג'קטקטגטג ג'אגגגהגהאגגג'קהאגגגטגטגגאג ג'אגגגטגג'קהקטגטגטקה ת.ק.ג.קאקאקאגאגג'יגגטקטג'סקהקטקט גקטאגגג'יגה-ג'אגגטגטקאג'קקט גקטקטאגאגקאקטקטקהאג'קג'קקטקטג'קטי ג'ורג'יה קאקאקאגאקאגאסגמגאגאק קטגטגגאגה לקטאגקטאגגה גאגקהקטגגאקה קג'קהאקאקטקטטקטגאג קטאגאטגאטקטקטגטקאקאגאגגה ראגטקהמגהאקקט ג'אג'אצ'סקג'גטג'סקאקקטקטגאגאק קגטקצ'קטיקטגהאגאגאסאקאגגגאטקה קטגטגאגהגאגה GCCCCCGGGATקטקטקטגגטגאגטגגהגאקגמגהקט גלקטאגאגקטגטאקאגה |
מנקלסלפבלבל גלסלסגמבסג ארמון הון ג'ינגקפשבגה גדגקלקלפי ת.פ. 00001777 תפריט: מזנון ו'-לה-לה-לה מ.מ.ס.ק. ת.ד. ג'י.די.אל.די קדגנילגקליין תוסתרר גניף ,אני לא יודע מה זה אומר .אבל אני יודע ג'י.ג.ב.מ. ת.ד. 00017 אילסט קיוסלסקדנק מדן (110) גית(גית) |
|
טבלה 1: רצפים המשמשים ליצירת asGFP ו- GFP
איור 2: מושבות אגרובקטריום גדל על צלחת LB המכיל kanamycin. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הופעת מדיה לאורך כל הצמיחה והעיבוד של אגרובקטריום. (א) הופעתה של תקשורת LB מיד לאחר ההסתה של מושבת אגרובקטריום מבודדת. (ב) הנוכחות של אמצעי התקשורת לאחר דגירה לילית של מושבה מבודדת ב 30 מעלות צלזיוס (ג) המראה של מדיה לאחר תרבויות הם הסתחררו במשך 20 דקות ב 4,500 x g. (ד) גלולה מחדש במאגר החדירה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: תהליך החדירה של צמחי נ. בנת'אמיאנה. (א-ב) מה אתה עושה? דקירה קלה של העלה גורמת לחור עדין בראש העלה. (C-D) מה אתה עושה? הזרקת מתלה אגרובקטריום לעלה. (ה) חדר עלה צמח מהנוף העליון. (ו) צמח עם עלים מרובים חדרו מהנוף העליון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הדמיה של עלים המכילים היתוך asGFP-IgG והיתוך GFP-IgG מתחיל ביום 1 חדירה פוסט (dpi) בשורה הראשונה, המוביל עד יום 5 dpi בשורה האחרונה עבור כל התנאים. א) אסג'י-פיוז'ן-איג'י תחת אור לבן. ב) היתוך ASGFP-IgG תחת UV גל ארוך. ג) היתוך GFP-IgG תחת אור לבן. ד) היתוך GFP-IgG תחת UV גל ארוך. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: Supernatant של תמצית asGFP-IgG הנוספת לעמודה חלבון G. א) תוספת תחת אור לבן. ב) תוספת תחת אור UV גל קצר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: חלבון G שרין תחת אור UV גל קצר לאחר supernatant של תמצית asGFP-IgG היה לרוץ דרך העמודה. א) שרף חלבון G תחת אור UV בגל קצר. ב) שרף חלבון G על התחכך של חלבונים בתנאים PH נמוכים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: אלגנטיות מטוהרות של asGFP-IgG שהושגו לאחר חשיפה לתנאים נמוכים של pH באמצעות טיהור. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 9: דף SDS של דוגמאות עמודות. דוגמאות המסויגות ב- "R" נמצאות בתנאי צמצום, ודוגמאות המסויגות ב-"NR" נמצאות בתנאים של אי-צמצום. א) תחת אור UV, רק דגימות שאינן מפחיתות פלואורסה בג'ל פוליאקרילאמיד 10%, כפי שניתן לראות בנתיב Elution 2 NR. 75 kDa ו 25 kDa סולם להקות גם fluoresce. ב) כתמי קומזי של אותו ג'ל מגלה את הנוכחות של כל החלבונים בדגימה. בהתפחתות מופחתות, היתוך IgG ללא שרשרת אור, שרשרת כבדה, שרשרת אור, ואולי השפלה GFP נמצאים ~ 75 kDa, ~ 50 kDa, ~ 25 kDa, ו ~ 10 kDa, בהתאמה. לעומת זאת, בהבלטות הלא מופחתות, להקה בולטת אחת נוכחת, העולה בקנה אחד עם הגודל של ההיתוך כולו asGFP-IgG (~ 200 kDa). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה יכול לשמש לאימות חזותי של כל Ab רקומביננטי או חלבון רקומביננטי המיוצר בצמחים N. benthamiana, כולל אלה הדורשים חשיפה זמנית לסביבות חומציות למטרותטיהור עמודה 42,43,44. יתר על כן, ההיתוך של asGFP לחלבונים אחרים במערכות ביטוי שונות יכול להיות כלי שימושי עבור הדמיה ניסיונית וחינוך. הפרוטוקול בכאן ניתן גם קנה מידה לכמויות גדולות יותר וקטנות יותר של חומר עלה כדי לייצר את הכמות הרצויה של חלבון רקומביננטי. השיטות המתוארות לנצל מחקרים קודמים שזיהו והפכו גירסאות של GFP להישאר יציב בתנאים חומציים46. מחקרים קודמים מקיפים יצרו תחומים אימונוגלובולין התמזגו לחלבון של עניין, המכונה לעתים קרובות IgG-היתוך, אשר פרוטוקול זה יכוללהכיל גם 28. על ידי יצירה והבעה של IgG-fusion המורכב מ-IgG1 אנושי המותך ל-GFP ו-asGFP, הצלחנו לדמיין את הנוכחות של החלבון הרצוי במהלך תהליך הביטוי, החילוץ והטיהור.
אם חוקר מיומן פועל על פי פרוטוקול זה, עלים יתחילו להציג סימני נמק באתרי החדירה בין ימים 4-5. עם זאת, בעת שימוש בוקטורים המתוארים, אזורים מסתננים של עלים צריך להיראות בריא עד היום 5 עם טיפול נאות. חשוב לציין כי זיהום אגרובקטריום בכוחות עצמו בסופו של דבר יגרום נמק של עלי הצמח בשל הצטברות של מינים חמצן תגובתי (ROS) כחלק מהתגובה החיסונית של תא הצמח51,52. תגובה חיסונית זו ורמת הנמק התוצאה יכולה להשתנות בהתאם למספרגורמים 51, כולל פילוח התא, מיקום החלבון, סוג החלבון המיוצר, וקטור הביטוי, ואת הזן של אגרובקטריום בשימוש 53,54. כמו כן, וריאציות בצפיפות האופטית (OD600) של אגרובקטריום המשמש לחדירה יכול להשפיע על רמות הנמק55. וקטורים ביטוי רבים להשתמש חלבונים לאגד חלבון רטינובלסטומה כדי לשמור על תאי הצמח בסינתזה (S)-שלב ולהגדיל את חלוקת התאותדירות טרנספורמציה 56,57. עליות בייצור חלבון, כגון אלה הנגרמות על ידי קשירה לחלבון רטינובלסטומה, יכול להובילנמק 56,57. התקדמות בעיצוב וקטורי, כגון אלה המשמשים בגרסאות שונה של geminivirus BeYDV replicons בשימוש בפרוטוקול זה, יש למזער את הנמק תוך שמירה על רמות ביטוי חלבוןגבוהות 58. כמו כן, תשובות BeYDV אינן מתחרות, ומספקות ביטוי של חלבונים מרובים על קלטת אחת ללא מגבלות גודלידועות 53,59.
מספר גורמים משפיעים על צמיחת הצמח לפני ואחרי הסתננות, מה שעלול להוביל בסופו של דבר לתפוקת חלבון נמוכה. כאשר זריעת צמחים, יותר מדי זרעים לכל גלולה צמח יכול לגרום נבטי צמח קטנים רבים המוביל לצמיחת צמח צנוע יותר. לפיכך, הפחתת מספר הזרעים לכל גלולת כבול והסרת הנבטים הנוספים לאחר שבוע תגרום לצמיחה טובה יותר של הצמח. שמירה על לחות קרקע נכונה היא גורם נוסף המשפיע על בריאות הצמח הכללית. עודף תיאבון, מתחת למים, הוספת דשן יותר מדי או מעט מדי עשוי לתרום כלורוזיס ולהשפיע על בריאות הצמח60,61,62. נמק וכלורוזיס יכול להיגרם בנוסף על ידי ייצור של חלבון שגורם ללחץ תאים. תופעה זו נצפתה פעמים רבות עם הביטוי של תסביך חיסוני רקומביננטי (RIC)56. הבחנו כי שינויים במבנה החלבון והיתוך של חלבונים יכולים לעזור למזער את הנמק; עם זאת, חלבונים מסוימים יכולים להישאר רעילים לצמחים גם לאחר שינויים שונים. אם באמצעות וקטורים הביטוי המתוארים בכך, חילוץ של חלבון עשוי להתבצע מוקדם ולפני תחילתו של נמק משמעותי, וכתוצאה מכך תשואה גבוהה של חלבון56.
תנאי צמיחה שונים יכולים להאט או אפילו לעכב את צמיחת אגרובקטריום. אגרובקטריום גדל בצורה אופטימלית ב 28 °C-30 °C וחוות הלם חום כאשר דגירה מעל 30 מעלות צלזיוס, ייצור שגיאות חלוקת תאים62. צמיחה יכולה גם להיות מרוסנת על ידי תוספת של יותר מדי rifampicin, כמו זנים אגרובקטריום שונים הם פחות או יותר עמידיםבאופן טבעי זה אנטיביוטיקה 62. התרבות החיידקית מוכנה לחדירה עם OD גבוה באופן משמעותי600 ממה שמומלץ סביר לגרום נמק55. OD מעט גבוה יותר600 של התרבות בדרך כלל אינו משפיע על התשואה, אבל אם הוא נמוך מ 0.1, תפוקת החלבון עשוי להיות מופחת באופן משמעותי. הצטברות של תאים מתים יכולה להתרחש בשתי נסיבות; 1) התרבות הייתה מגודלת יתר על המידה, מה שהוביל לחלק משמעותי של OD להיות תאים מתים, ו 2) מזיק / הרג אגרובקטריום לאחר צמיחה, כגון עם שאריות כימיות או מהירויות צנטריפוגה גבוהה. הסתננות באמצעות מספר גדל והולך של תאים מתים בתרבות עשויה להפחית את ביטוי החלבון. יתר על כן, ניקוב העלים על ידי הפעלת לחץ רב מדי יכול לגרום נזק עלים ולכן עלול להוביל נמק מוקדם. בהתחשב בגורמים אפשריים אלה בעת הבעת חלבונים רקומביננטיים בניקוטיאנה בנת'מיאנה, יכול להוביל לייצור חלבון משופר.
השגת תפוקת חלבון נמוכה יכולה להיות בשל כמה בעיות בשלבי החילוץ והטיהור. ראשית, מאגר החילוץ עשוי להזדקק למיטוב בהתאם לחלבון של עניין. במהלך המיזוג, חומר הצמח צריך להיות הומוגני ללא כל חתיכות עלה גלוי. לאחר מכן, חלבונים מסוימים דורשים חומרי ניקוי עבור solubilization במאגר החילוץ, כגון Tween-20 או Triton. חלבונים אחרים עשויים להזדקק אוריאה בריכוזים גבוהים ~ 7.5 M עבור solubilization, בעוד כמה ניתן לחלץ עם PBS בלבד. השפלה של חלבון יכול להתרחש אם מאגרים, רקמת הצמח, צנטריפוגות, וכו 'אינם נשמרים קריר במהלך תהליך החילוץ. חוסר מעכבי פרוטאז ואסקורבט נתרן או כימיקלים דומים במאגר החילוץ יכול גם לגרום להשפלה או צבירה. כמה מעכבי פרוטאז כמו PMSF להתדרדר במהירות, נתרן ascorbate לוקח קצת זמן כדי להפוך למים. בסך הכל, החוקרים צריכים לקבוע תנאים אופטימליים עבור חלבון העניין שלהם.
הטיהור של IgG-fusions כולל כמה צעדים שעשויים להזדקק לשינויים אם תשואה נמוכה של חלבון מושגת. ניתוח האליציטוטים לדוגמה שנאספו במהלך כל התהליך על ידי SDS-PAGE ו-Western יסייע לזהות את התקלה בשיטות. לדוגמה, אם הזרימה מכילה כמות משמעותית של חלבון, ניתן להקל על כריכת החלבון על ידי שינוי ה-pH של המאגר. שימוש בריכוזים גבוהים של חומרי ניקוי במהלך תהליך החילוץ עשוי להשפיע על המאפיין המחייב של בשרף, במיוחד אם בשרף יהיה שימוש חוזר מספר פעמים. אחסון נכון של שף, כמתואר בשיטות, חיוני לתווך החיים של רין. יתר על כן, אם שלב הכביסה מסיר את החלבון של עניין מהברף, ייתכן שיהיה צורך לשדור את המאגרים כדי לפתור בעיה זו. בעיות אחרות עם טיהור חלבונים עשויות להיות בשל חלבונים לא מנוצלים או מושפלים, אשר עשוי לדרוש ניתוח נוסף של עיצוב החלבון הכולל. הפניה לפתרון הבעיות המתואר עשויה להגביר את יעילות הטיהור באמצעות פרוטוקול זה.
טיהור ההיתוך המתואר GFP-IgG מועיל בסביבת הוראה. הדמיה היא בסיסית לחינוך מדעי כי היא מאפשרת ללומדים להבין מושגים בקלות רבה יותר39. תלמידים מדווחים לעתים קרובות על אי הבנות בנוסף לרעיוןים של קושי בהבנת מושגים ברמההמולקולרית 39. בפרט, הניסויים הדורשים הבנה של מיקום החלבון הספציפי בכל שלב ניתן לשנות על ידי תיוג חלבון של עניין עם מולקולות פלורסנט. לכן, GFP או asGFP, בהתאם לסביבת ה-pH בשימוש, ניתן להשתמש כדי לרתום את הפלואורסצסצנה שלהם כדי להקל על הבהרה של טכניקת טיהור החלבון עבור התלמידים.
לסיכום, אנו מתארים שיטה פשוטה לביטוי וטיהור של Ab רקומביננטי התמזגו GFP בצמחים N. benthamiana. פרוטוקול זה יכול לשמש לטיהור של Ab התמזג לכל חלבון היעד הרצוי. ניתן לערוך את התהליך כך שיכיל כמויות שונות של חומר עלה ומאפשר קביעת ראייה של נוכחות חלבון לפני, במהלך ואחרי סיום תהליך הפקת החלבון והטיהור. שיטות אלה יכולות להיות שימושיות כפקדים ותוכלות לטכניקות הוראה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים למריה פיה דיפאלמה על עריכת הסרטון. אנו מודים גם למשרד לסיוע חינוכי ושירותי סטודנטים באוניברסיטת אריזונה על הסיוע הנדיב שלהם בדמי פרסום. מחקר עבור פרוטוקול זה נתמך על ידי בית הספר למדעי החיים, אוניברסיטת אריזונה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringe | any | N/A | |
| 50 mL syringe | any | N/A | |
| Agar | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
| Blender with cups | any | N/A | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Glycerol | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
| Glycine | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
| HCl (Hydrochloric acid) | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
| Heating block | any reputable supplier | N/A | |
| Jiffy-7 727 w/hole peat pellets | Hummert International | 14237000 | |
| Kanamycin | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
| KCl (Potassium Chloride) | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
| KH2PO4 (Potassium Phosphate) | J.t.baker | 3248-05 | |
| KOH (Potassium Hydroxide) | VWR | BDH0262 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
| MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
| Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
| Moisture control potting mix | Miracle-Gro | 755783 | |
| Na2HPO4 (Sodium Phosphate) | J.t.baker | 3827-01 | |
| NaCl (Sodium Chloride) | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | N/A | |
| PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) | G-Biosciences | 786-787 | |
| Polypropylene Column | any | N/A | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610394 | |
| Protein G resin | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | G-Biosciences | DG093 | |
| Sodium Ascorbate | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
| Spectrophotometer | any reputable supplier | N/A | |
| Titan3 0.75 µm glass fiber filter | ThermoScientific | 40725-GM | |
| Tray for peat pellets with dome | any | N/A | |
| TRIS Base | J.t.baker | 4109-02 | |
| Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
| Tryptone | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
| UV lamp | any | N/A | |
| Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2000992 | |
| Yeast extract | SIGMA-ALDRICH | 9182 |
References
- Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
- Kaplon, H., Reichert, J. M.
- The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
- Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
- Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
- Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R.
- Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
- Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
- Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
- Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
- Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
- Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
- Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
- Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
- Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
- Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
- Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
- Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
- Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
- Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
- Montero-Morales, L., Steinkellner, H.
- Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
- Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
- Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
- Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E.
- Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
- Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
- Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
- Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
- Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
- Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
- Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
- Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
- Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
- Andrew, S. M., Titus, J. A.
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
- Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
- Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
- Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Brunelle, J. L., Green, R.
- Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
- Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
- Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
- Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
- Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
- Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
- Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
- Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
- Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
- Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
- Brown, J. C.
- Morton, E. R., Fuqua, C.
