Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Производство белков IgG Fusion, постоянно выраженных в Никотиана бентамиана

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Мы описываем здесь простой метод выражения, извлечения и очистки рекомбинантных человека IgG сливается с GFP в Никотиана benthamiana. Этот протокол может быть распространен на очистку и визуализацию многочисленных белков, использующих колонку хроматографии. Кроме того, протокол адаптируется к личной и виртуальной учебной лаборатории колледжа, обеспечивая проектную разведку.

Abstract

Высокий спрос на антитела в качестве терапевтических вмешательств для различных инфекционных, метаболических, аутоиммунных, неопластических и других заболеваний создает растущую потребность в разработке эффективных методов рекомбинантного производства антител. По 2019 году было более 70 одобренных FDA моноклональных антител, и есть экспоненциальный потенциал роста. Несмотря на свои обещания, ограничивающими факторами широкого использования являются производственные издержки и сложность. Потенциально заводы предлагают недорогие, безопасные и легко масштабируемые стратегии производства белка. Такие растения, как Nicotiana benthamiana, могут не только правильно складывать и собирать сложные белки млекопитающих, но и добавлять критические пост-трансляционные модификации, аналогичные тем, которые предлагаются культурами клеток млекопитающих. В этой работе, используя родной GFP и кислотно-стабильный вариант зеленого флуоресцентного белка (GFP), слитого с моноклональными антителами человека, мы смогли визуализировать весь переходный процесс экспрессии антител и очистки растений N. benthamiana. В зависимости от цели эксперимента, родной синтез GFP может обеспечить более легкую визуализацию на этапе экспрессии растений, в то время как кислотно-стабильный синтез GFP позволяет визуализировать во время обработки вниз по течению. Эта масштабируемая и простая процедура может быть выполнена одним исследователем для производства миллиграммовых количеств высоко чистых белков антител или антител в течение нескольких дней, используя только несколько небольших растений. Такая методика может быть распространена на визуализацию любого типа процесса очистки антител и, возможно, многих других белков, как в растительных, так и в других системах экспрессии. Кроме того, эти методы могут принести пользу виртуальным инструкциям и быть выполнены в учебной лаборатории студентами, обладающими минимальным опытом работы с методами молекулярной биологии, обеспечивая основу для исследования на основе проектов с реальными приложениями.

Introduction

Отраслевые отчеты показывают, что тринадцать из двадцати наиболее кассовых препаратов в Соединенных Штатах были биопрепараты (белковые фармацевтические препараты), из которых девять были антителами. По данным на 2019 год, на различных стадиях клинического развития1,2, 3было более 570 антител (Ab)терапевтических средств. Текущие мировые продажи Ab превышают 100 миллиардов долларов США, а моноклональный ab (mAb) терапевтический рынок, как ожидается, будет генерировать до 300 миллиардов долларов США к 2025году 1,4. С таким высоким спросом и прогнозируемым увеличением доходов, исследователи работают над разработкой способов производства терапии Ab в все больших масштабах, с более высоким качеством и более низкими затратами. Системы экспрессии на растительной основе имеют ряд преимуществ по сравнению с традиционными линиями клеток млекопитающих для доступного и крупномасштабного производства Ab therapeutics5,6. Производство белковой терапии в растениях ("молекулярная фармация") не требует дорогостоящих биореакторов или объектов клеточной культуры, как это делают традиционные методыкультуры клеток млекопитающих 7,8. Растения не могут за заразились человеческими патогенами, минимизируяпотенциальное загрязнение 9. Как переходные, так и трансгенные растительные белковые экспрессии могут быть использованы в качестве более низкой стоимости альтернатив млекопитающих или бактериальных производственныхсистем 10. Хотя трансгенные растения являются предпочтительными для производства сельскохозяйственных культур, рекомбинантное производство белка с использованием этого метода может потребовать от нескольких недель до нескольких месяцев. Достижения в переходной экспрессии с использованием вирусных векторов через шприц или вакуумную агроинфильтрацию позволяют для мелкого и крупномасштабного производства, соответственно,желаемого белка в дни 11,12,13,14. Производство mAbs против Эболы, Денге и, Зика, и многие другие рекомбинантные белки, были произведены и очищены быстро и эффективно с использованием преходящей экспрессии в N. benthamiana растений 15,16,17,18,19. Эти обстоятельства делают переходное растительное выражение привлекательным вариантом для разработки нескольких терапевтических средств Ab и методов, продемонстрированных в этомпротоколе 20.

Мабы первого поколения были получены из мурина, что привело к неспецифической иммуногенности при использовании в испытаниях на людях21. Со временем, химерные, гуманизированные, и в конечном итоге, полностью человека Abs были произведены для уменьшения иммуногенности, вызванной Ab терапии. К сожалению, некоторые из этих Абс до сих пор вызывают хозяина иммуногенности из-за различий в гликозиляции21. Разработки в области машиностроения позволили модификации Ab гликанов, что имеет важное значение, поскольку стабильность Ab и функции могут значительно зависеть от его гликозилированиягосударства 22. Достижения позволили производить в растительных системах высокоуровневое выражение гуманизированных мабов, содержащих человеческие гликаны и, как следствие, желаемые биологические черты массовогопроизводства человеческой фармацевтической 19,21.

В дополнение к рекомбинантным Абс, Ab синтеза молекул (Ab слияний) были изучены для различных целей в последние десятилетия. Ab слияния часто состоят из Ab или Ab фрагмент сливается с молекулой или белком и предназначены для получения ответов от иммунных клеток-эффекторов23. Эти молекулы были созданы в качестве потенциальных терапевтических мероприятий для лечения различных патологий, таких как рак и аутоиммунные заболевания24,25,26,27. Рекомбинантные иммунные комплексы (РИК) являются еще одним классом Аб синтезов, которые были использованы в качестве вакциныкандидатов 28. РИК воспользоваться способностью иммунной системы распознавать Fc регионов Ab слияний и были найдены для улучшения иммуногенности в сочетании с другими платформамивакцины 29,30,31.

Зеленый флуоресцентный белок (GFP) является биолюминесцентный белок, полученный из медузы Aequorea Виктория, которая излучает зеленый свет, когда возбужденных ультрафиолетовымсветом 32,33. На протяжении многих лет, использование GFP в качестве визуального маркера экспрессии генов расширилась от экспрессии в кишечной палочке до многочисленных систем экспрессии белка, в том числе N. benthamiana растений 34,35,36,37,38. Видимые маркеры, такие как GFP, имеют обильные последствия в преподавании и изучении научных концепций. Многочисленные студенты начального уровня описывают трудности с пониманием научных концепций, когда идея преподается не видна невооруженным глазом, такие как понятия молекулярной биологии и смежныхобластях 39. Таким образом, визуальные маркеры, такие как GFP, могут способствовать обработке информации, связанной с научными процессами, и могут помочь уменьшить трудности, с которыми сталкиваются учащиеся при изучении многочисленных научных концепций.

Хотя GFP часто используется в качестве маркера для обозначения гена и экспрессии in vivo,трудно визуализировать его в процессах ниже по течению при использовании кислых условий. Это обстоятельство в первую очередь потому, что GFP не поддерживает свою структуру и в результате флуоресценции при низкомрН 40. Временные кислые среды часто требуются в различных процессах очистки, таких как белок G, белок А и белок L хроматографии, часто используется для очистки Ab41,42,43,44. Мутанты GFP были использованы для сохранения флуоресценции в кислыхусловиях 45,46.

В этом примере мы описываем простой метод выражения, экстракции и очистки рекомбинантных белков синтеза IgG в растениях N. benthamiana. Мы произвели традиционный GFP, слитый с N-термином гуманизированной тяжелой цепи IgG, создавая синтез GFP-IgG. Параллельно мы разработали слияние оптимизированной заводом последовательности для кислотно-стабильной GFP (asGFP) с N-термином гуманизированной тяжелой цепи IgG, создавая синтез asGFP-IgG. Преимущества производства GFP-IgG включают в себя способность визуализировать наличие целевого белка во время экспрессии, в то время как ASGFP-IgG позволяет видеть наличие рекомбинантного белка не только в этапах экспрессии и экстракции, но и в этапах очистки белка. Этот протокол может быть адаптирован для производства, очистки и визуализации ряда белков синтеза GFP, производимых в N. benthamiana и очищенных с использованием методов хроматографии, которые требуют низкого рН. Этот процесс также может быть адаптирован к различным количествам листового материала. Хотя Абс и синтез белков помечены GFP или asGFP не предназначены для использования для терапии, эти методы могут быть полезны в качестве контроля во время экспериментов, а также могут быть дополнительно использованы в качестве учебного пособия для молекулярной и клеточной биологии и биотехнологии, как лично, так и виртуально.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Культивировать растения N. benthamiana

  1. Поместите торфяные гранулы почвы на поднос и залейте предварительно вареную, еще горячую (40-45 градусов по Цельсию), воду над торфяными гранулами для полного расширения. После того, как гранулы будут полностью расширены, поместите 2-3 N. benthamiana семена на каждую торфяную гранулу с помощью пинцета.
  2. Налейте около 0,5 в воде, чтобы покрыть дно лотка. Этикетка лоток с датой посева. Продолжайте поливать саженцы ежедневно соответствующим количеством удобрений. Концентрация удобрений (водорастворимых цельных растительных продуктов) составляет, как правило, 2,5-2,8 г/л.
  3. Обложка лоток с влажным верхом при размещении в камере роста. Храните семенные торфяные гранулы в камере роста при 23-25 градусов по Цельсию, с фотопериодом 16 ч и 60% относительной влажностью.
  4. Через неделю удалите дополнительные растения, оставляя каждую гранулу только с одной рассадой.
  5. Когда растениям 2-3 недели, перенесите каждую торфяную гранулу в отдельный горшок, содержащий почву, ехаю за влагой. Эта демонстрация использовала Чудо-Gro влаги контроля заливки почвы.
  6. Вода ежедневно с удобрениями 1 г/л. Никогда не оставляйте почву полностью сухой. Растения готовы к проникновению, когда им 5-6 недель.

2. Подготовка агробактерий tumefaciens для инфильтрации

ПРИМЕЧАНИЕ: GFP-IgG термоядерные конструкции могут быть получены, как описано в этой статье31. Ген asGFP был получен и оптимизирован растением из этого исследования45. Следующие шаги должны быть сделаны рядом с горелкой Bunsen, и основные асептические методы должны быть применены, чтобы избежать загрязнения.

  1. Полоса A. tumefaciens EHA105 укрывательство фасоли желтый карликовый вирус (BeYDV)19 вектор выражения растений для каждой конструкции (asGFP-IgG, GFP-IgG, световая цепь) из запасов глицерола на пластине LB agar (10 г/л триптона, 10 г/л NaCl, 5 г дрожжевого экстракта, 15 г/л агара, 50 мкг/мл канамицина).
  2. Расти в течение одного дня в 30 градусов по Цельсию стоя инкубатор. Изолировать единую колонию для проверки стандартным протоколом ПЦР экрана колонии.
  3. Используйте проверенную колонию для каждой конструкции. Заполните коническую трубку 10 мл ЛБ-медиа (10 г/л триптона, 10 г/л NaCl, 5 г дрожжевого экстракта, 50 мкг/мл). Затем добавьте 10 МКЛ из 100 мкг/мл канамицина. Добавьте 10 мкл 2,5 мкг/мл рифампицина, чтобы предотвратить заражение кишечной палочкой. Инкубация при 30 градусах Цельсия и 120-150 об/мин за ночь.
  4. На следующий день, если культура агробактерий выросла доOD 600 и 0,6-0,9, она может быть использована для инфильтрации. Если он заросший (OD600 йgt; 1), 1-2 мл должны быть переведены на свежие LB с антибиотиками и выросли до требуемого OD600. В зависимости от концентрации начальной культуры, потенциально может потребоваться два дня, чтобы вырасти доOD 600 и 0,6-0,9.
  5. После того, как в соответствующих OD600, место культур в центрифуге, и гранулы бактерий центрифугации на 4500 х г в течение 20 мин, комнатная температура (RT).
  6. Декант супернатант из обоих образцов, а затем повторно каждой гранулы в 1x инфильтрации буфера (10 мМ 2-(N-morpholino) этанесульфоновой кислоты, 10 мМ сульфат магния, скорректированный до рН 5,5 с KOH), чтобы получить окончательный OD600 и 0,4. Это должно занять примерно 15-45 мл буфера инфильтрации, в зависимости от первоначальной плотности культуры. Объедините равные объемы каждой конструкции синтеза IgG с конструкцией световой цепи, чтобы получить окончательный OD600 и 0,2 на конструкцию в каждой трубе.

3. Игла-менее шприц агроинфильтрации

  1. Возьмите выпрямленную окопку и 5-6-недельные растения N. benthamiana из шага 1. Используя острый край опки, сделайте небольшой прокол в первом эпидермальной слое листа на адаксиальной поверхности. Избегайте проколов все это путь до конца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нижние листья легче для инфильтрации, в то время как листья на верхней части растения сложнее. Как правило, экспрессия рекомбинантных белков является самым высоким в листьях, расположенных в середине растения, и эти листья также получить менее некротических.
  2. Заполните шприц 1 мл, без иглы прилагается, с подготовленным раствором Agrobacterium от шага 2. Обложка отверстие, сделанное в предыдущем шаге с конца шприца и медленно нажмите, чтобы ввести бактерии в лист при применении нежной контрпрессуры из-за листа. Смотреть лист темнее, как раствор вводится без применения слишком большого давления на шприц.
  3. Попробуйте проникнуть большую часть области листьев максимум в 3-4 раза - чрезмерное повреждение листьев может помешать выходу белка. Проникший растительный лист будет казаться в основном темным снизу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот бактериальный раствор должен быть достаточно, по крайней мере 3-4 растений на конструкцию. Автоклав любого оставшегося бактериального раствора перед отбрасывание.

4. Расти и наблюдать проникли Н. benthamiana

  1. Поместите проникшие растения обратно в камеру роста и продолжайте поливать ежедневно.
  2. Наблюдайте за листьями от хлороза и некроза в инфильтраторных областях. Наблюдайте растения для флуоресценции GFP (если GFP присутствует) под длинной и коротковолной УФ-лампой.
  3. День 4-5 показывает самую высокую флуоресценцию обеих конструкций GFP в листьях. Урожай всех листьев на 4-5 dpi (дней после инфильтрации) и взвесить общий материал листьев.
  4. Используйте его немедленно для обработки вниз по течению или хранить при -80 градусов по Цельсию до готовности к использованию.

5. Извлечение белка

  1. Храните буферы и блендер чашки на льду или при 4 градусов по Цельсию перед использованием.
  2. Подготовка 2-3 мл ледяного буфера добычи (100 мМ Трис-ХКл, 50 мМ НаКл, 2 мМ ЭДТА, рН 8 с HCl) на 1 г растительного материала. Добавьте 2 мМ фенилметилсульфонилового фтора (PMSF) из запаса (100 мМ) и 50 м натрия аскорбат в буфер экстракции незадолго до извлечения.
  3. Поместите растительную ткань из шага 4 в предварительно облицованную чашку блендера. Добавьте измеренное количество охлажденного буфера экстракции в чашку блендера (как указано в шаге 5.2). Поместите чашку блендера на блендер. Возьмите предварительно вырезать лист парафильма и растянуть его поверх блендера чашку. Смешайте однородность с интервалом в 20 секунд, хорошо помешивая между циклами смешивания по мере необходимости.
  4. Перенесите смешанный материал в стакан. Добавить бар перемешать и перемешать при 4 градусов по Цельсию в течение 30 минут для повышения белка solubility и для того, чтобы осадки твердых веществ.
  5. Поместите 2 слоя Miracloth над чистым стаканом на льду и залить экстракт через него, чтобы удалить большой лист мусора. После того, как все экстракт налил, сложить Miracloth сжать остаточный экстракт листьев. Экстракт должен выглядеть темно-зеленым без видимых частиц.
  6. Перенесите 50 мкл этого образца на новую трубку объемом 1,5 мл и помекаете «полный экстракт» для более длительного анализа. Перенесите экстракт в центрифуговые трубки. Центрифуга оставшейся части растительного экстракта при 16 000 х г в течение 20 мин, 4 градусов по Цельсию и перенесите супернатант в коническую трубку.
  7. Фильтр растворимый экстракт с помощью шприца 50 мл и шприца стекловолокна фильтр (0,75 мкм).
  8. Соберите 50 МКЛ образца после центрифугации, наклеив ярлык «растворимый экстракт» для более длительного анализа.

6. Процедура хроматографии колонки белка G

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный здесь для гравитационного потока хроматографии с использованием пирс белка G агарозы смолы. При использовании другой смолы, обратитесь к инструкциям производителя для корректировки. Никогда не позволяйте смолы иссякнуть и предотвратить все жидкости от слива. Повторите розетку по мере необходимости.

  1. Настройка полипропиленовой колонки, которая содержит 20 мл образца.
  2. Оцените количество суспензии, необходимой в зависимости от целевого типа иммуноглобулина и его сродства к смоле. Как правило, 3 мл общей суспензии с объемом кровати 1,5 мл достаточно для очистки нескольких миллиграммов Ab.
  3. Аккуратно налейте необходимое количество повторного суспензии в ограниченную колонку. Откройте розетку столбца из нижней части столбца и позвольте ей стечь до тех пор, пока большая часть буфера не исчезнет.
  4. Сразу же залить 10 мл мыть буфера 1x PBS (137 мММ NaCl, 2,7 мМ ККл, 10 мм На2HPO4, 1,8 мМХ2PO4, рН 7,4 с HCl) на вершине. Пусть это стечь и повторить этот шаг мыть 2x.
  5. Примените отфильтрованный образец от шага 5 к столбецу и соберите flowthrough-aliquot 50 йл потока для более последнего анализа. Сохраните остальную часть потока в случае, если Ab не привязывается к смоле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное применение потока в новую колонку обычно не приводит к хорошей урожайности; поэтому рекомендуется начинать с нового листового материала.
  6. Вымойте смолу дважды с 10 мл 1x PBS, чтобы уменьшить неспецифические связывания. При желании, aliquot 50 йл мытья, как буфер стекает через столбец, чтобы убедиться, что цель Ab не элайт с буфером мытья.
  7. Настройка и маркировка пяти трубок с 125 МЛ стерильных 1 M Tris-HCl при рН 8. Это необходимо для нейтрализации абс в кислотном буфере элюции, чтобы избежать потенциальных структурных изменений. Кроме того, добавьте 30 МКЛ из 2 M Tris базы, чтобы получить менее разбавленный образец.
    ВНИМАНИЕ: Во время элюции, УФ-излучение может быть использовано для визуализации. Это не нужно делать в течение всего периода элюции. Если УФ используется, не забудьте носить соответствующие СИЗ, чтобы избежать повреждения глаз и кожи. УФ-излучение не нужно использовать во время шага элюции.
  8. Уберите абс, применив 5 мл буфера элюции (100 мМглицин, рН 2,5 с HCl) к колонке и соберите 1 мл фракций к каждой назначенной трубке с предыдущего шага.
  9. Немедленно регенерировать столбец, применяя 20 мл буфера мытья, а затем 10 мл буфера мытья. Убедитесь, что смола не остается в кислой среде в течение длительного времени. Elutions должны появиться флуоресцентные, часто самый высокий флуоресценции наблюдается во втором elution, но может варьироваться от экстракции до извлечения.
  10. Для хранения, мыть смолы с 10 мл 20% этанола в PBS и дайте ему процедить на полпути. Повторите верхнюю часть, затем нижнюю часть столбца и держитесь в вертикальном положении при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, белки G смолы могут быть повторно использованы до 10 раз без значительной потери эффективности. Обратитесь к руководящим принципам производителя для конкретных деталей.
  11. Определите концентрацию Ab с помощью спектрофотометра, измерив абсорбцию на уровне 280 нм, используя буфер элюции в качестве пробела. Храните элуаты в -80 градусов по Цельсию и aliquot 50 йл каждой фракции в отдельную трубку для дальнейшего анализа.

7. SDS-PAGE для обнаружения синтеза GFP-Ig

  1. Подготовь все образцы перед созданием SDS-PAGE.
    1. Добавить 4 л буфера выборки (6x уменьшая буфер выборки: 3,0 мл глицерола, 0,93 г DTT, 1 г SDS, 7 мл 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 мг бромофено-голубого); (6x не уменьшая буфер выборки: 3.0 mL глицерола, 1 g SDS, 7 mL 4x Tris (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 мг голубого бромофенола) до 20 qL каждого образца (общий экстракт, растворимый экстракт, flowthrough, мыть, все фракции elution) для анализа. Убедитесь, что крышки трубки надежно закреплены.
    2. Лечить только снижение образцов в течение 5 мин в кипящей водяной бане, а затем положить образцы в течение 5 мин на льду. Образцы спина в микроцентрифуге на 5 с и загружают по 20 мкл каждого образца в порядке сбора в гелеобразные скважины. Загрузите 3 МКЛ двухцветной белковой лестницы в отдельный колодец.
  2. Вы запустите гель SDS-PAGE при постоянном разделении белковой полосы 100 V до желаемого разделения белковой полосы; это занимает около 1,5 часов. Мониторинг лестницы как индикатор разделения белка.
  3. Визуализуйте гель под УФ для наблюдения за флуоресценцией GFP.
  4. При желании, пятно гель с пятном Кумасси для оценки общего белка в каждом образце. Кроме того, выполнять западные пятно для оценки целевого белка с использованием конкретных Abs.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оба Coomassie окрашивания и западной пятно может быть выполнено, следуя стандартнымпротоколам 47,48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Это исследование демонстрирует простой и быстрый метод производства рекомбинантных белков и визуализации их во всех процессах вниз по течению. Используя N. benthamiana и следуя предоставленного протокола, рекомбинантное производство белка, описанное здесь, может быть достигнуто менее чем за неделю. Общий рабочий процесс экспрессии, экстракции и очистки растений показан на рисунке 1. Стадии роста растений из 2-недельных саженцев, 4-недельных растений и 6-недельных растений отображаются на рисунке 1A (1-3), соответственно, в то время как рисунок 1B изображает морфологические изменения листьевиз-за некроза (рисунок 1 B-1) илихлороза (рисунок 1B-2). Некроз может возникнуть в месте инъекции между днями 3-5 после инфильтрации. Эти изменения часто зависят от свойств белка выражается и проникли растений здоровья (дальнейшее обследование в обсуждении). Одновременно хлороз может также полагаться на здоровье используемых растений (дальнейшее обследование в ходе обсуждения). Процесс роста и подготовки Агробактерия к инфильтрации показан на рисунке 1С. На рисунке 1C-1 отображаются изолированные колонии Агробактерий. Цифры 1C (2-5) отображают ожидаемый внешний вид средств массовой информации после того, как он прививален одной изолированной колонией. Для получения более подробной информации об этих шагах обратитесь к рисунку 3. Процесс инфильтрации растений показан на рисунке 1D и начинается с непровереного растения, за которым следует процесс инфильтрации. Выражение, экстракция и уточнение растительных белков отображаются на рисунке 1E. Материал листа помещается в блендер и гомогенизируется, показано на рисунках 1E (1-3). Затем взята выборка, представляющая общий гомогенат. Затем он фильтруется через Miracloth (марля или даже фильтр кофе может заменить снижение расходов), и уточненная подвеска центрифугирована. Центрифуга допускает отделение супернатанта от оставшихся материалов, как показано на рисунках 1E (4-6). Уточненный супернатант затем загружается на белковую колонку хроматографии Сродства G, рисунок 1F (1-3). После того, как большая часть белка связана,Рисунок 1 F-4, белки элайт из смолы Рисунок 1F (5,6).

Таблица 1 отображает завод оптимизированных нуклеиновой кислоты последовательности, используемые для производства asGFP45 (верхний ряд) в pBY! Вектор KEAM-GFPasH, используемый в данном исследовании для выражения синтеза ASGFP-IgG и GFP33 (нижний ряд) в векторе PBYEAM-GFPHgp, используемом в данном исследовании для выражения синтеза GFP-IgG. Нуклеиновой кислоты последовательности были рассмотрены с помощью белка Expasy перевести инструмент (https://web.expasy.org/translate/) для определения аминокислотных последовательностей.

Представитель Agrobacterium пластины подготовлены с помощью этого протокола показано на рисунке 2. Нужные колонии должны казаться круглыми и однородными по форме и цвету. Колонии ближе к центру пластины имеют более высокую вероятность выражения сопротивления канамицина. Ликвидные культуры будут подготовлены из одной изолированной колонии.

Ожидаемое появление средств массовой информации, содержащих культуры показано на рисунке 3. После первоначальной прививки изолированной колонии, LB сми будут появляться светло-желтый и полупрозрачный, как показано на рисунке 3A. После инкубации изолированной колонии в одночасье при 30 градусов по Цельсию, LB СМИ будут казаться мутной. Как показано на рисунке 3B, объекты больше не могут быть видны через средства массовой информации, когда рост присутствует в LB. После центрифугации, гранулы должны образовываться в нижней части трубки. Трубка будет иметь четкое разделение LB-медиа над гранулами и будет отображаться светло-желтый и полупрозрачный, как показано на рисунке 3C. Супернатант ЛБ-медиа удаляется, а гранулы повторно использованы в буфере инфильтрации. На OD600 из 0,2, средства массовой информации будут появляться мутные, как показано на рисунке 3D. OD600 следует измерять, как описано в методах.

Рисунок 4 представляет процесс инфильтрации листьев. Небольшое подталкивать лист с скрепкой должно дать перерыв в листе эпидермиса, который не проходит полностью через лист. Перерыв должен едва проколоть лист, так что буфер инфильтрации может быть введен в лист, показанный на рисунке 4A-C. Подвеска буфера Agrobacterium и инфильтрации вводится непосредственно в пролом листа и слегка изменяет цвет листа; см. Рисунок 4D-F.

Появление листьев, выражаюющих слияние IgG, представлено на рисунке 5. Он отображает листья, которые выражают какGFP-IgG слияний (Рисунок 5A) и GFP-IgG слияний (Рисунок 5C) под белым светом. Если конструкции в этом протоколе используются, при проникновении на 0,2 OD600, листья должны появиться здоровыми в дни 1-5 для обоих листьев, выражаюющих как GFP-IgG слияний и листьев, выражаюющих GFP-IgG слияний. Там может быть небольшой некротический вид в местах инъекций на день 5, который, как правило, проявляется в осветления растительной ткани в этих областях. На рисунке 5 также отображаются листья, выражают какGFP-IgG слияний (Рисунок 5B) и GFP-IgG слияний (Рисунок 5D), соответственно, под длинноволновым ультрафиолетовым светом с верхнего вида листа. Флуоресценция увеличивается в интенсивности, как дни прогресса для обеих конструкций выразил. Листья, выражаюющие слияние ASGFP-IgG, как правило, имеют несколько менее интенсивную флуоресценцию, чем листья, выражаюющие синтез GFP-IgG во все дни.

Когда супернатант экстракта asGFP-IgG добавляется в колонку Protein G, смола станет слегка зеленой под белым светом из-за пигментов хлорофилла растений(рисунок 6A). Добавление супернатанта под коротковолновым ультрафиолетовым светом приводит к накоплению флуоресценции в смоле белка G, как показано на рисунке 6B. Обратите внимание, что супернатант также будет флуоресцентным только под ультрафиолетовым светом. Тем не менее, флуоресценция, как ожидается, будет гораздо более концентрированным, когда слияние asGFP-IgG начинает связываться с смолой.

После прохождения супернатанта asGFP-IgG через белок G смолы, смола должна освещать под коротковолновым ультрафиолетовым светом, как показано на рисунке 7A. На данный момент, большая часть IgG будет привязан к смоле. После добавления elution буфера, флуоресценция, содержащаяся в белке G смолы будет по-прежнему видны под коротковолновым ультрафиолетовым светом и начнет терять интенсивность, как более elution буфер низкой рН проходит через смолу. Флуоресценция начнет накапливаться в элуате(рисунок 7B). Фракции элуата будут варьироваться при флуоресценции. Как видно на рисунке 8, флуоресценция является самой низкой интенсивностью в первом elution и высокой интенсивности во втором и третьем eluates. Результаты могут варьироваться, так как флуоресценция будет зависеть от экспрессии белка, собранного материала листьев и других условий, используемых в эксперименте.

После завершения процесса очистки, образцы анализируются на 10% SDS-PAGE гель в условиях снижения (образец буфера содержит DTT и образцы были вареные в течение 5 мин) и не уменьшая условия (образец буфера не содержит DTT и образцы не варили). Как показано на рисунке 9A, только не уменьшая образцы, такие как в Elution 2 NR переулок, будет флуоресцета при воздействии коротковолного УФ-излучения. Первая полоса этой полосы флуоресцирует на ожидаемый размер продукта 200 кДа, указывая, что asGFP по-прежнему конформации правильно. Флуоресцентные полосы в нижней части геля являются красителем из уменьшаемого буфера. Обратите внимание, что asGFP теряет флуоресценцию при воздействии температуры при температуре или выше 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут; это отличается от eGFP (улучшенный GFP), который будет поддерживать некоторые флуоресценции в тех жеусловиях 49,50. Две полосы лестницы, 75 kDa и 25 kDa, также флуоресц. Рисунок 9B представляет собой пятно Кумасси того же геля на рисунке 9A. В условиях сокращения подготовлены элюционы в полосах 6-9. При запуске на гель и Coomassie окрашенных, эти образцы должны отображать asGFP-IgG синтеза компонентов отдельно. Эти компоненты включают тяжелую цепь, слитую с GFP (75 кДа), только тяжелую цепь (50 кДа), световую цепь (25 кДа) и сам ASGFP (27 кДа). Не уменьшаемая выборка была включена в последнюю полосу геля для целей сравнения и должна отображать одну большую полосу (200 кДа), которая должна быть состоит из двух тяжелых цепей, слитых с asGFP и соответствующими световыми цепями. Кроме того, меньшие полосы, вероятно, вызваны родной протеас. Это расщепление можно предотвратить с добавлением ингибиторов протеазы и путем поддержания экстракта белка холодным во все времена, в том числе при выполнении очистки колонки. Отдельные компоненты белка синтеза IgG не будут различимы в не уменьшая образцах на гель Кумасси.

Figure 1
Рисунок 1: Рабочий процесс экспрессии, экстракции и очистки растений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Используется нуклеотидная последовательность Аминокислотная последовательность
Последовательности
используется для
asGFP в
pBY! КИМ
-GFPasH
Вектор
используется в
Teh
Выражение
из
asGFP-IgG
Фьюжн		 ATGGTGTCCAAGGGAGAGGAAGCCTCTGGAAGAGCCGTTT
CAGTACCCTATGACTTCTAAAATCGAGTTGAATGGGGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTTGGGGAGAGGGTCACCCCTTC
ATCTGGAAGATTCAATATGCACGCTTACTGTACTACCAGAC
TTGCCTATGTCCTGGGTTATAGCCCCCGTTCAGTACGG
ГТТКАКАТТТГККТАКТАКЦКТГГАТАТАКТАКТКТТКТТТТ
CCAAGAATGTTTCTCTGGCTTATACTCTCGACAACTTTGATTGA
GGATGGAGGGAGACGGTACTCTTACTACTCACGAGTACTC
CCTTGAGGACGGTTGTTACTTCCAAGACTTTGAACGCTT
CTGGATTCGACCCCAAGGGAGCCACTATGACTAAGTCTTTTGT
CAAACAGCTCCCAAACGAGGTCAAAATCACCCCACACGGCCA
AATGGTATTAGACTTACTTCCACTGTTCTCTACCTTAAGGAGGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAAGACTGCATCTTACCCCA
GTTGGCGGGAAAAGTTACTCAGCCTAAGGCTCACTCTCTTC
ATACTCAGATCATTCAGAAGAAGGACCCAAACGACACCAGAG
ATCACATCGTTCAGACTGAGCTTGCCGTTGGGGGGGGAAATCTTTG
ГКАКГГКАТГАТГАГКТТАКААГА		 MVSKGEEASGRALF
YPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEGFTP
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
КИГФХМФАХИПЕДИ
ФФЗЕКФПГИТЛ
ДРТЛМЕГДТЛТ
ХЕЙСЛЕДГКВСК
ТТЛНАСГФПКГАТ
МТКСФВКЗЛПНЕВК
ITPHGPNGIRLTSTV
ЛИЛКЕДГТИГТЗД
CIVTPVGGRKVT-P
КАХФЛХТИИКДП
НДТРДХИВТЕЛАВ
AGNLWHGMDELY
K
Последовательности
используется для
GFP в
pBYEAMGFPHgp
Вектор
используется в
Teh
Выражение
GFP-IgG
Фьюжн		 ATGGCCAAGCACCTCTCATTGTCTCTCTTTTGTGCCTTCCTTCCTTTT
GGTCTCTCTGCTTCTCTTCTCTGGTGAGAAGGG
AGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGGGAGCTGG
ACGGCGACGTAAACCCACAAGTTCAGCGTCCGGGAGG
GCGAGGGGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA
TCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACTCGT
GACCACCTTCAGCTACGGCGTGCAGTGGCAGCCTACCCCCC
ГАККАКАТГААГКАГКТАКТАКТТКТТКААГТКККАТГКАКХГ
AAGGCTACGTCCAGGAGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGG
CAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGACAC
CCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGA
GGACGGCAACATCCTGGCAAGCTGGAGTACAACTACAA
CAGCCACAACGTCTACATGGCCGACAAGCAGAAGAACGG
CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACATCGAGGGGGGC
AGCGTGCAGCTCGCCGACCACCAGAGACACACACCCATCG
GCGACGGCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCAC
CCAGTCCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGATCA
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGGGGATCACTCAC
GGCATGGACGAGCTGTACAAGA		 МАНХЛСЛСЛЛВЛЛ
ГВСЛАСГЛАСГМВСКГ
EELFTGVVPILVELD
ГДВНГХКФСВСГЕ
ГЕГДАТЫГКЛЛКФИ
CTTGKLPVPWPTLV
ТТФСИГВКФСРИП
ДХМКЗХДФФКСА
МПЕГИВЕРТИФФК
ДДГНИКТРАЕВКФЕ
GDTLVNRIELKGIDF
КЕДЛХКЛЯЙН
YNSHNVYIMADK
КНГИКВНФКИРХНИ
ДГСВЗЛАДХИЗН
TPIGDGPVLLPDNH
ИЛСТЗСАЛСКПНЕК
RDHMVLLEFVTAA
GITH

Таблица 1: Последовательности, используемые для создания asGFP и GFP

Figure 2
Рисунок 2: Колонии агробактерий, выращенные на пластине LB, содержащей канамицин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Появление средств массовой информации на протяжении всего роста и обработки Agrobacterium. a) появление средств массовой информации LB сразу же после прививки изолированной колонии Агробактерий. b) наличие средств массовой информации после ночной инкубации изолированной колонии при 30 градусов по Цельсию (C) Появление средств массовой информации после того, как культуры вращаются вниз в течение 20 минут при 4500 х г. (D) Пеллет повторно используются в буфере проникновения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Процесс проникновения растений N. benthamiana. (A-B) Слегка тыкать лист приводит к тонкое отверстие в верхней части листа. (C-D) Инъекция суспензии Agrobacterium в лист. (E) Проникли листья растений с верхнего вида. (F) Завод с несколькими листьями проникли сверху. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Визуализация листьев, содержащих слияние ASGFP-IgG и слияние GFP-IgG, начинается на первый день после инфильтрации (dpi) в первом ряду, что приводит к 5-му дню в последнем ряду для всех условий. A) слияние asGFP-IgG под белым светом. Б) слияние ASGFP-IgG под длинноволновым УФ. C) слияние GFP-IgG при белом свете. D) слияние GFP-IgG под длинноволновым УФ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Супернатант экстракта asGFP-IgG добавляется в колонку Protein G. A) Добавление при белом свете. B) Добавление под коротковолновым ультрафиолетовым светом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Белок G смолы под коротковолновым ультрафиолетовым светом после supernatant экстракта asGFP-IgG был запущен через колонку. A) Белок G смолы под коротковолновым ультрафиолетовым светом. B) Белок G смолы при элюции белков при низких условиях PH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Очищенные элюции asGFP-IgG, полученные после воздействия низких условий рН путем очистки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: SDS-PAGE образцов столбца. Образцы с пометкой "R" находятся в условиях снижения, а образцы с пометкой "NR" находятся в условиях, не снижая. A) Под ультрафиолетовым светом, только не уменьшая образцы fluoresce в гель 10% polyacrylamide, как увидено в майне Elution 2 NR. 75 kDa и 25 kDa полосы лестницы также флуоресц. B) Coomassie окрашивание одного и того же геля показывает наличие всех белков в образце. В уменьшенных элюциях слияние IgG без световой цепи, тяжелая цепь, световая цепь и, возможно, деградированные GFP присутствуют на уровне 75 кДа, 50 кДа, 25 кДа и 10 кДа, соответственно. В отличие от этого, в не-уменьшенных elutions, одна видная полоса присутствует, в соответствии с размером всего asGFP-IgG слияния (200 кДа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол может быть использован для визуальной проверки любого рекомбинантного Ab или рекомбинантного белка, произведенного в растениях N. benthamiana, включая те, которые требуют временного воздействия кислой средыдля целей очистки столбца 42,43,44. Кроме того, слияние asGFP с другими белками в различных системах выражения может быть полезным инструментом для экспериментальной визуализации и образования. Протокол в этом можно далее масштабировать на большее и меньшее количество листового материала для получения желаемого количества рекомбинантного белка. Описанные методы воспользоваться предыдущими исследованиями, которые определили и сделали версии GFP, которые остаются стабильными в кислыхусловиях 46. Всеобъемлющие предыдущие исследования создали иммуноглобулин доменов сливается с белка интереса, часто называют IgG-фьюжн, которые этот протокол может такжевместить 28. Создавая и выражая IgG-слияние, состоящее из гуманизированного IgG1, слитого с GFP и asGFP, мы смогли визуализировать наличие желаемого белка во время процессов экспрессии, экстракции и очистки.

Если опытный исследователь следует этому протоколу, листья начнут отображать признаки некроза на местах проникновения между днями 4-5. Однако при использовании описанных переносчиков проникаемые участки листьев должны казаться здоровыми до 5-го дня при надлежащем уходе. Важно отметить, что агробактерии инфекции сами по себе в конечном итоге приведет к некрозу листьев растений из-за накопления реактивных видов кислорода (ROS) в рамках иммунного ответаклеток растений 51,52. Этот иммунный ответ и связанный с этим уровень некрозаможет варьироваться в зависимости от нескольких факторов 51,в том числе клеточной ориентации, расположение белка, тип белка производится, экспрессия вектор, и штамм Agrobacterium используется 53,54. Кроме того, изменения в оптической плотности (OD600) агробактерий, используемых для инфильтрации может повлиять на уровни некроза55. Многие векторы экспрессии используют белки, которые связывают белок ретинобластомы, чтобы держать клетки растений в синтезе (S)-фазы и увеличить делениеклеток и частоту трансформации 56,57. Увеличение производства белка, например, вызванное связыванием белка ретинобластомы, может привести кнекрозу 56,57. Достижения в области векторной конструкции, такие как те, которые используются в модифицированных версиях геминивируса BeYDV replicons, используемых в этом протоколе, свели к минимуму некроз при сохранении высокогоуровня экспрессии белка 58. Кроме того, Replicons BeYDV не конкурируют, обеспечивая экспрессию нескольких белков на одной кассете без известныхограничений размера 53,59.

Несколько факторов влияют на рост растений до и после инфильтрации, что в конечном итоге может привести к низкой урожайности белка. При посевной растений, слишком много семян на гранулы растений может привести к много мелких ростков растений, ведущих к более скромному росту растений. Таким образом, уменьшение количества семян на торфяные гранулы и удаление дополнительных ростков через неделю приведет к лучшему росту растений. Поддержание надлежащей влажности почвы является еще одним фактором, влияющим на общее состояние здоровья растений. Переводка, подводка, добавление слишком много или слишком мало удобрений может способствовать хлороз и повлиятьна здоровье растений 60,61,62. Некроз и хлороз могут быть дополнительно вызваны производством белка, который вызывает клеточный стресс. Это явление было замечено много раз с выражением рекомбинантных иммунных комплексов (RIC)56. Мы заметили, что изменения в структуре белка и слияние белков могут помочь свести к минимуму некроз; однако, некоторые протеины могут остать токсическими к заводам даже после различных изменений. При использовании векторов экспрессии, изложенных в настоящем, экстракция белка может быть выполнена на ранних стадиях и до начала значительного некроза, что приводит к высокойурожайности белка 56.

Различные условия роста могут замедлить или даже препятствовать росту агробактерий. Agrobacterium растет оптимально при температуре 28 градусов по Цельсию и испытывает тепловой удар при инкубации выше 30 градусов по Цельсию, производя ошибкиделения клеток 62. Росту также может препятствовать добавление слишком большого числа рифампицина, так как различные штаммы агробактерий более или менее естественно устойчивы к этому антибиотику62. Бактериальная культура, подготовленная к инфильтрации со значительно более высоким OD600, чем рекомендуется, скорее всего, вызоветнекроз 55. Чуть выше OD600 культуры, как правило, не влияет на урожайность, но если она ниже, чем 0,1, выход белка может быть значительно снижена. Накопление мертвых клеток может произойти при двух обстоятельствах; 1) культура была заросла, что привело к значительной части OD быть мертвыми клетками, и 2) повреждения / убийства Agrobacterium после роста, например, с химическими остатками или высокой скорости центрифуги. Инфильтрации с использованием большего числа мертвых клеток в культуре может уменьшить экспрессию белка. Кроме того, прокол листьев, применяя слишком большое давление может повредить листья и, следовательно, может привести к преждевременному некрозу. Учитывая эти возможные факторы при выражении рекомбинантных белков в Nicotiana benthamiana, может привести к повышению производства белка.

Получение низкой урожайности белка может быть связано с некоторыми проблемами в извлечении и очистке шаги. Во-первых, буфер экстракции может потребовать оптимизации в зависимости от белка интереса. Во время смешивания растительный материал должен быть однородным без видимых кусочков листьев. Далее, некоторые белки требуют моющих средств для solubilization в буфере экстракции, таких как Tween-20 или Triton. Другие белки, возможно, потребуется мочевина в высоких концентрациях 7,5 М для solubilization, в то время как некоторые из них могут быть извлечены только с PBS. Деградация белка может произойти, если буферы, ткани растений, центрифуги и т.д. не охлаждаются в процессе экстракции. Отсутствие ингибиторов протеазы и аскорбата натрия или аналогичных химических веществ в буфере экстракции также может привести к деградации или агрегации. Некоторые ингибиторы протеазы, такие как PMSF быстро деградируют, и аскорбат натрия занимает некоторое время, чтобы стать aqueous. В целом, исследователи должны определить оптимальные условия для их белка интереса.

Очистка IgG-фьюжн включает в себя несколько шагов, которые могут потребоваться изменения, если низкий выход белка получен. Анализ примерных алицитов, собранных в течение всего процесса SDS-PAGE и Western, поможет выявить неисправность методов. Например, если поток содержит значительное количество белка, то связыванию белка можно облегчить путем изменения рН буфера. Использование высоких концентраций моющих средств в процессе экстракции может повлиять на связывающее свойство смолы, особенно если смола используется повторно несколько раз. Правильное хранение смолы, как описано в методах, имеет жизненно важное значение для срока службы смолы. Кроме того, если стиральный шаг удаляет белок интереса из смолы, буферы, возможно, потребуется переработать, чтобы решить эту проблему. Другие проблемы с очисткой белка могут быть вызваны неправильно сфоланными или деградированными белками, что может потребовать дальнейшего анализа общей конструкции белка. Ссылка на описанное устранение неполадок может повысить эффективность очистки с помощью этого протокола.

Описанная очистка синтеза GFP-IgG полезна в учебной среде. Визуализация имеет основополагающее значение для научного образования, поскольку она позволяет учащимся понять понятиялегче 39. Студенты часто сообщают о недоразумениях в дополнение к затруднению понимания концепций на молекулярном уровне39. В частности, эксперименты, которые требуют понимания конкретного расположения белка на каждом шагу, могут быть изменены путем пометки белка интереса с флуоресцентными молекулами. Таким образом, GFP или asGFP, в зависимости от используемой среды рН, могут быть использованы для использования их флуоресценции для облегчения выяснения метода очистки белка для студентов.

Таким образом, мы описываем простой метод выражения и очистки рекомбинантных Ab сливается с GFP в N. benthamiana растений. Этот протокол может быть использован для очистки Ab сливается с любой желаемой целевой белок. Процесс может быть отредактирован для размещения различных количеств листового материала и позволяет визуально определить присутствие белка до, во время и после завершения процесса извлечения и очистки белка. Эти методы могут быть полезны в качестве элементов управления и могут быть специально для обучения методам.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы благодарим Марию Пиа ДиПалма за редактирование видео. Мы также благодарим Управление по вопросам информационно-пропагандистской работы и студенческих услуг в Университете штата Аризона за их щедрую помощь в публикации. Исследование этого протокола было поддержано Школой наук о жизни, Университет штата Аризона.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81 (2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Tags

Биология Выпуск 167 антитела моноклональные антитела молекулярная фармация агроинфильтрация преходящая экспрессия Никотиана бентамиана,зеленый флуоресцентный белок кислотно-стабильный зеленый флуоресцентный белок синтез антител IgG-фьюжн очищение белка G
Производство белков IgG Fusion, постоянно выраженных в <em>Никотиана бентамиана</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P.,… More

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter