Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Produktion av IgG Fusion Proteiner Övergående Uttryckt i Nicotiana benthamiana

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver här en enkel metod för uttryck, extraktion, och rening av rekombinanta mänskliga IgG smält till GFP i Nicotiana benthamiana. Detta protokoll kan utvidgas till rening och visualisering av ett flertal proteiner som utnyttjar kolumnkromatografi. Dessutom är protokollet anpassningsbart till det personrelaterade och virtuella collegeundervisningslaboratoriet, vilket ger projektbaserad utforskning.

Abstract

Hög efterfrågan på antikroppar som terapeutiska ingrepp för olika infektiösa, metabola, autoimmuna, neoplastiska, och andra sjukdomar skapar ett växande behov av att utveckla effektiva metoder för rekombinant antikroppsproduktion. Från och med 2019 fanns det mer än 70 FDA-godkända monoklonala antikroppar, och det finns exponentiell tillväxtpotential. Trots deras löfte, begränsande faktorer för utbredd användning är tillverkningskostnader och komplexitet. Potentiellt, växter erbjuder billiga, säkra och lätt skalbara strategier proteintillverkning. Växter som Nicotiana benthamiana inte bara kan korrekt vika och montera komplexa däggdjurproteiner men också kan lägga till kritiska post-translationella ändringar liknande dem som erbjuds av däggdjurscellkulturer. I detta arbete, genom att använda inhemska GFP och en syra-stabil variant av gröna fluorescerande protein (GFP) smält till mänskliga monoklonala antikroppar, kunde vi visualisera hela övergående antikropp uttryck och rening process från N. benthamiana växter. Beroende på experimentets syfte kan inhemsk GFP-fusion säkerställa enklare visualisering under uttrycksfasen i växterna, medan syrastabil GFP-fusion möjliggör visualisering under nedströmsbearbetning. Denna skalbara och okomplicerade förfarande kan utföras av en enda forskare för att producera milligram mängder av mycket ren antikropp eller antikroppar fusion proteiner på några dagar med bara några små växter. En sådan teknik kan utvidgas till visualisering av någon typ av antikroppsreningsprocess och potentiellt många andra proteiner, både i växt- och andra uttryckssystem. Dessutom kan dessa tekniker gynna virtuella instruktioner och utföras i ett undervisningslaboratorium av studenter som har minimal tidigare erfarenhet av molekylärbiologiska tekniker, vilket ger en grund för projektbaserad utforskning med verkliga tillämpningar.

Introduction

Branschrapporter visar att tretton av de tjugo mest högt inkomstbringande läkemedel i USA var biologiska läkemedel (proteinbaserade läkemedel), varav nio var antikroppar. Från och med 2019 fanns det över 570 antikropps -(Ab) therapeutics vid olika kliniskautvecklingsfaser 1,2,3. Nuvarande globala Ab försäljning överstiger 100 miljarder USD, och monoklonala Ab (mAb) terapeutiska marknaden förväntas generera upp till 300 miljarder USD 20251,4. Med så hög efterfrågan och beräknade ökningar av intäkterna, forskare har arbetat för att utveckla sätt att producera Ab therapeutics på en allt större skala, med högre kvalitet och lägre kostnader. Växtbaserade uttryckssystem har flera fördelar jämfört med traditionella däggdjurscelllinjer för prisvärd och storskalig tillverkning av Ab therapeutics5,6. Produktion av protein therapeutics i växter ("molekylär pharming") kräver inte dyra bioreaktorer eller cellodlingsanläggningar som gör traditionella tekniker för däggdjurscellodling7,8. Växter kan inte kontrakt mänskliga patogener, minimera potentiella kontaminering9. Både övergående och transgent växtbaserat proteinuttryck kan utnyttjas som billigare alternativ till system för produktion av däggdjur eller bakteriell produktion10. Även om transgena växter är att föredra för växtodling, kan rekombinant proteinproduktion med denna metod kräva veckor till månader. Framsteg i transienta uttryck med hjälp av virala vektorer genom antingen spruta eller vakuum agroinfiltration möjliggör små- och storskalig produktion, respektive, av det önskade proteinet idagar 11,12,13,14. Produktion av mAbs mot ebola, Dengue och, Zika, och många andra rekombinanta proteiner, har producerats och renats snabbt och effektivt med hjälp av övergående uttryck i N. benthamiana växter15,16,17,18,19. Dessa omständigheter gör övergående växtbaserat uttryck ett attraktivt alternativ för att utveckla flera Ab-therapeutics och de metoder som visas i detta protokoll20.

Första generationens mAbs var av murin härledning, vilket resulterade i icke-specifik immunogenicitet när den används i mänskliga försök21. Med tiden, chimeric, humaniserade, och så småningom, helt mänskliga Abs producerades för att minska immunogenicitet inducerad av Ab therapeutics. Tyvärr, några av dessa Abs orsakar fortfarande värd immunogenicitet på grund av skillnader i glycosylation21. Utvecklingen inom anläggningsbyggnad har möjlig gjort det möjligt för modifiering av Ab-glyknaner, vilket är väsentligt eftersom en Ab:s stabilitet och funktion avsevärt kan påverkas av dess glykosyleringstillstånd22. Framsteg har möjlig gjort produktion i växtsystem av hög nivå uttryck för humaniserade mAbs, som innehåller mänskliga glykaner och resultantly de önskade biologiska drag av en massproducerad humana läkemedel19,21.

Förutom rekombinanta Abs, Ab fusion molekyler (Ab fusioner) har undersökts för olika ändamål under de senaste decennierna. Ab fusioner består ofta av en Ab eller Ab fragment smält till en molekyl eller protein och är utformade för att framkalla svar från immun effektor celler23. Dessa molekyler har skapats som potentiella terapeutiska ingrepp för att behandla olika patologier som cancer och autoimmuna sjukdomar24,25,26,27. Rekombinanta immunkomplex (RI) är en annan klass av Ab-fusioner som har anställts som vaccinkandidater28. RIC dra nytta av immunsystemets förmåga att känna igen Fc regioner av Ab fusioner och har befunnits förbättra immunogenicitet när de kombineras med andra vaccin plattformar29,30,31.

Green Fluorescent Protein (GFP) är ett bioluminescerande protein som härrör från maneter Aequorea Victoria, som avger grönt ljus när upphetsad av ultraviolettljus 32,33. Under årens lopp har GFP: s användning som en visuell markör för genuttryck expanderat från uttryck i Escherichia coli till ett flertal proteinuttryck system, inklusive N. benthamiana växter34,35,36,37,38. Synliga markörer, såsom GFP, har rikliga konsekvenser i undervisningen och inlärningen av vetenskapliga begrepp. Många nybörjarstudenter beskriver svårigheter att förstå vetenskapliga begrepp när idén som lärs ut inte är synlig för blotta ögat, såsom begreppen molekylärbiologi och relaterade områden39. Visuella markörer, som GFP, kan alltså bidra till bearbetning av information som rör de vetenskapliga processerna och skulle kunna bidra till att minska de svårigheter som eleverna rapporterar att lära sig många vetenskapliga begrepp.

Även om GFP ofta används som en markör för att indikera gen och uttryck in vivo, är det svårt att visualisera det i nedströmsprocesserna om du använder sura förhållanden. Denna omständighet beror främst på att GFP inte upprätthåller sin struktur och resulterande fluorescens vid ett lågt pH40. Tillfälliga sura miljöer krävs ofta i olika reningsprocesser, såsom protein G, protein A, och protein L kromatografi, ofta utnyttjas för Ab rening41,42,43,44. GFP mutanter har använts för att behålla fluorescens under sura förhållanden45,46.

Häri beskriver vi en enkel metod för uttryck, extraktion, och rening av rekombinanta IgG fusion proteiner i N. benthamiana växter. Vi producerade traditionella GFP smält till N-ändstationen av en humaniserad IgG tung kedja, skapa en GFP-IgG fusion. Samtidigt utvecklade vi fusionen av en växt kodonoptimerad sekvens för en syra-stabil GFP (asGFP) till N-ändstationen av en humaniserad IgG tung kedja, skapa en asGFP-IgG fusion. Fördelarna med att producera GFP-IgG inkluderar möjligheten att visualisera förekomsten av ett målprotein under uttryck, medan asGFP-IgG tillåter att se förekomsten av rekombinant protein i inte bara uttrycket och extraktionsstegen utan också i reningsstegen av proteinet. Detta protokoll kan anpassas för produktion, rening, och visualisering av en rad GFP fusion proteiner som produceras i N. benthamiana och renas med hjälp av kromatografi tekniker som kräver lågt pH. Processen kan också skräddarsys för olika mängder bladmaterial. Medan Abs och fusion proteiner taggade med GFP eller asGFP inte är avsedda att användas för terapier, dessa metoder kan vara användbara som kontroller under experiment och kan också ytterligare utnyttjas som ett pedagogiskt verktyg för molekylär och cellbiologi och bioteknik, både i-person och praktiskt taget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Odla N. benthamiana växter

  1. Placera jord torv pellets på en bricka och häll tidigare kokt, fortfarande varm (~ 40-45 °C), vatten över torv pellets för full expansion. Efter pellets är helt expanderade, placera 2-3 N. benthamiana frön på varje torv pellet med hjälp av pincett.
  2. Häll ca 0,5 i vatten för att täcka botten av facket. Märk brickan med sådatumet. Fortsätt att vattna plantorna dagligen med lämpliga mängder gödningsmedel. Gödselmedel (vattenlösliga allren användningsändamål växtmat) koncentrationen är i allmänhet 2,5-2,8 g / L.
  3. Täck brickan med en humidome topp när den placeras i tillväxtkammaren. Förvara de seedade torvpelletsen i tillväxtkammaren vid 23-25 °C, med en 16 h fotoperiod och 60% relativ luftfuktighet.
  4. Efter en vecka, ta bort extra växter lämnar varje pellet med endast en planta.
  5. När växterna är 2-3 veckor gamla, överför varje torvpellet till en individuell kruka som innehåller fuktkontrolljord. Denna demonstration används Miracle-Gro fuktkontroll krukväxtjord.
  6. Vatten dagligen med 1 g/L gödselmedel. Lämna aldrig jorden helt torr. Växter är redo för infiltration när de är 5-6 veckor gamla.

2. Beredning av Agrobacterium tumefaciens för infiltration

OBS: GFP-IgG fusionskonstruktioner kan erhållas enligt beskrivningen i detta dokument31. Den asGFP genen erhölls och växt-optimerade från denna studie45. Följande steg måste göras bredvid en Bunsen brännare, och grundläggande aseptiska tekniker bör tillämpas för att undvika kontaminering.

  1. Streak A. tumefaciens EHA105 hyser böngul dvärg virus (BeYDV)19 växt uttryck vektor för varje konstruktion (asGFP-IgG, GFP-IgG, lätt kedja) från ett glycerollager på LB-agar (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g jästextrakt, 15 g/L-agar, 50 μg/mL kanamycin) platta.
  2. Odla för en dag i en 30 °C stående inkubator. Isolera en enda koloni för verifiering av standard koloniskärm PCR-protokoll.
  3. Använd verifierad koloni för varje konstruktion. Fyll koniskt rör med 10 mL LB-media (10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g jästextrakt, 50 μg/mL). Därefter tillsätts 10 μL av 100 μg/mL kanamycin. Tillsätt 10 μL på 2,5 μg/mL rifampicin för att förhindra E. coli-kontaminering. Inkubera vid 30°C och 120-150 rpm över natten.
  4. Nästa dag, om Agrobacteriumkulturen odlas till OD600 = 0,6-0,9, kan den användas för infiltration. Om den är övervuxen (OD600 > 1) ska 1-2 mL överföras till färskt LB med antibiotika och odlas till den OD600 som krävs. Beroende på den initiala kulturens koncentration kan det potentiellt ta två dagar att växa till OD600 = 0,6-0,9.
  5. En gång på anslå od600, förlägga kulturerna i en centrifug, och pellet bakterierna vid centrifugering på 4.500 x g för 20 min, rumstemperatur (RT).
  6. Dekantera supernatant från båda proverna, och sedan resuspend varje pellet i 1x infiltration buffert (10 mM 2-(N-morpholino) etanesulfonic syra, 10 mM magnesiumsulfat, justeras till pH 5,5 med KOH) för att få slutlig OD600 = 0,4. Detta bör ta ungefär 15-45 mL infiltrationsbuffert, beroende på den initiala odlingstätheten. Kombinera lika stora volymer av varje IgG fusion konstruera med ljuset kedjan konstruera för att få slutliga OD600 = 0,2 per konstruktion i varje rör.

3. Nål-mindre spruta agroinfiltration

  1. Ta ett uträtat gem och 5-6 veckor gamla N. benthamiana växter från steg 1. Använd gemens skarpa kant, gör en liten punktering i det första epidermala lagret av bladet på adaxialytan. Undvik att punktera det hela vägen igenom.
    OBS: De nedre bladen är lättare för infiltration, medan bladen på toppen av anläggningen är svårare. Generellt är uttrycket av rekombinanta proteiner högst i bladen som ligger i mitten av en växt, och dessa blad får också mindre nekrotisk.
  2. Fyll en 1 mL spruta, utan en nål fastsatt, med den beredda Agrobacterium-lösningen från steg 2. Täck hålet som gjorts i föregående steg med slutet av sprutan och långsamt tryck för att injicera bakterierna i bladet samtidigt som man applicerar skonsamt mottryck från bakom bladet. Se när lövet mörknar när lösningen injiceras utan att för mycket tryck appliceras på sprutan.
  3. Försök att infiltrera större delen av lövområdet på maximalt 3-4 gånger – alltför stora bladskador kan hindra proteinutbytet. Den infiltrerade växtblad kommer att visas mestadels mörkt från botten vyn.
    OBS: Denna bakterielösning bör räcka till minst 3-4 växter per konstruktion. Autoklavera eventuell kvarvarande bakterielösning innan du kasserar.

4. Väx och observera den infiltrerade N. benthamiana

  1. Placera infiltrerade växter tillbaka i tillväxtkammaren och fortsätta att vattna dagligen.
  2. Observera bladen för kloros och nekros i infiltrerade områden. Observera växter för GFP fluorescens (om GFP är närvarande) under en lång och kortvågig UV-lampa.
  3. Dag 4-5 visar den högsta fluorescensen av båda GFP-konstruktionerna i bladen. Skörda alla bladen vid 4-5 dpi (dagar efter infiltration) och väg det totala bladmaterialet.
  4. Använd den omedelbart för nedströms bearbetning eller förvara vid -80 °C tills den är klar att användas.

5. Utvinning av proteiner

  1. Förvara buffertar och mixerkoppar på is eller vid 4 °C före användning.
  2. Förbered 2-3 mL iskall extraktionsbuffert (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 med HCl) per 1 g växtmaterial. Tillsätt 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) från lager (100 mM) och 50 mM natriumaskorbat till extraktionsbufferten strax före extraktion.
  3. Placera växtvävnad från steg 4 in i den prechilled mixerkoppen. Tillsätt en uppmätt mängd kyld extraktionsbuffert till mixerkoppen (enligt vad som anges i steg 5.2). Placera mixerkoppen på mixern. Ta en färdigskuren plåt av parafilm och sträck den över toppen av mixerkoppen. Blanda till homogenitet med 20-sek intervall, rör om väl mellan blandningscykler efter behov.
  4. Överför blandat material till en bägare. Tillsätt en omrörningsstång och rör om i 4 °C i 30 min för att förstärka proteinlösligheten och för att tillåta utfällning av fasta ämnen.
  5. Placera 2 lager Miracloth över en ren bägare på is och häll extraktet genom den för att avlägsna stora lövskräp. Efter allt extrakt hälls, vik Miracloth att pressa restblad extrakt. Extraktet ska verka mörkgrönt utan synliga partiklar.
  6. Överför 50 μL av detta prov till ett nytt 1,5 mL-rör och etikett "totalextrakt" för senare analys. Överför extraktet till centrifugrör. Centrifugera återstoden av växtextrakt vid 16 000 x g i 20 min, 4 °C och överför supernatanten till ett koniskt rör.
  7. Filtrera det lösliga extraktet med hjälp av en 50 mL spruta och spruta glasfiberfilter (0,75 μm).
  8. Samla in 50 μL av ett prov efter centrifugeringen, etikett "lösligt extrakt" för senare analys.

6. Protein G kolonnkromatografi förfarande

OBS: Det protokoll som beskrivs här är för gravitation-flöde kromatografi med hjälp av Pierce Protein G agarose harts. Om du använder ett annat harts, se tillverkarens anvisningar för justeringar. Låt aldrig hartsen torka och förhindra att all vätska rinner ut. Recap uttaget efter behov.

  1. Ställ in en polypropylenkolumn som rymmer 20 mL prov.
  2. Uppskatta mängden flytgödsel som behövs beroende på målimglobulintyp och dess affinitet till hartset. Generellt är 3 mL av total slam med 1,5 mL säng volym tillräcklig för rening av flera milligram av Ab.
  3. Häll försiktigt den erforderliga mängden återsuspendd slurry i den utjämnade kolonnen. Öppna kolonnutloppet från botten av kolonnen och låt den rinna av tills det mesta av bufferten är borta.
  4. Häll omedelbart 10 mL tvättbuffert 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4 med HCl) ovanpå. Låt det rinna av och upprepa detta tvätta steg 2x.
  5. Applicera det filtrerade provet från steg 5 till kolonnen och samla in flödetgenom-aliquot 50 μL av flowthrough för senare analys. Spara resten av genomströmningen ifall Ab inte binder sig till hartset.
    OBS: Åter tillämpa flöde genom att en ny kolumn inte brukar resultera i en god avkastning; därav rekommenderas det att börja med nytt bladmaterial.
  6. Tvätta hartset två gånger med 10 mL på 1x PBS för att minska icke-specifik bindning. Om så önskas, alikvot 50 μL tvätt eftersom bufferten rinner genom kolonnen för att verifiera att målet Ab inte elumeras med tvättbuffert.
  7. Ställ in och märk fem rör med 125 μL steril 1 M Tris-HCl vid pH 8. Detta för att neutralisera Abs i den sura elueringsbufferten för att undvika potentiella strukturförändringar. Alternativt, tillsätt 30 μL av 2 M Tris bas för att få ett mindre utspädd prov.
    FÖRSIKTIGHET: Vid eluering kan UV-ljus användas för visualisering. Detta behöver inte göras under den tid som elueringen pågår. Om UV används, se till att bära lämplig PPE för att undvika skador på ögon och hud. En UV-belysning behöver inte användas under eulutionssteget.
  8. Elute the Abs genom att applicera 5 mL ellutionsbuffert (100 mM glycin, pH 2,5 med HCl) på kolonnen och samla in 1 mL-fraktioner på varje anvisat rör från föregående steg.
  9. Omedelbart regenerera kolonnen genom att applicera 20 mL tvättbuffert, följt av 10 mL tvättbuffert. Se till att hartset inte lämnas i en sur miljö under en längre tid. Eluering bör verka fluorescerande, ofta ses den högsta fluorescensen i den andra elueringen men kan variera från extraktion till extraktion.
  10. För förvaring, tvätta hartset med 10 mL av 20% etanol i PBS och låt den rinna halvvägs. Recap toppen, sedan botten av kolumnen, och hålla upprätt vid 4 °C .
    OBS: Generellt kan protein G-hartser återanvändas upp till 10 gånger utan betydande effektivitetsförlust. Se tillverkarens riktlinjer för specifika detaljer.
  11. Bestäm Ab-koncentrationen med hjälp av en spektrofotometer genom att mäta absorbans vid 280 nm, med elueringsbufferten som blindskriv. Förvara eluaterna i -80 °C och alikvot 50 μL av varje fraktion till ett separat rör för vidare analys.

7. SDS-PAGE för GFP-Ig fusion upptäckt

  1. Förbered alla prover innan du ställer in SDS-PAGE.
    1. Tillsätt 4 μL provbuffert (6x reducerande provbuffert: 3,0 mL glycerol, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 mL 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg bromofenolblått); (6x icke-reducerande provbuffert: 3,0 mL glycerol, 1 g SDS, 7 mL 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg bromofenolblått) till 20 μL av varje prov (totalt extrakt, lösligt extrakt, flödesöverstärning, tvätt, alla elueringsfraktioner) för analys. Se till att rörlocken är ordentligt fastsnad.
    2. Behandla endast minska prover i 5 min i ett kokande vattenbad, och sedan lägga prover i 5 min på is. Spinnprover i en mikrocentrifug för ~5 s och ladda 20 μL av varje prov i samlingsordningen in i gelvälarna. Ladda 3 μL av proteinstege med dubbla färger i en separat brunn.
  2. Kör SDS-PAGE gel vid en konstant 100 V till önskad proteinbandsseparation; det tar cirka 1,5 timmar. Övervaka stegen som en indikator på proteinseparation.
  3. Visualisera gelen under UV:en för att observera GFP-fluorescens.
  4. Om så önskas, fläck gel med Coomassie fläcken att bedöma totalt protein i varje prov. Alternativt, utföra västra blot att utvärdera mål protein med hjälp av specifika Abs.
    OBS: Både Coomassie färgning och västra blot kan utföras genom att följa standardprotokoll47,48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna studie visar en enkel och snabb metod för att producera rekombinanta proteiner och visualisera dem i hela nedströms processer. Med hjälp av N. benthamiana och efter det föreskrivna protokollet kan rekombinant proteinproduktion som beskrivs här uppnås på mindre än en vecka. Det övergripande arbetsflödet för växtuttryck, extraktion och rening visas i figur 1. Stadierna av växttillväxt från 2 veckor gamla plantor, 4 veckor gamla växter, och 6 veckor gamla växter visas i figur 1A (1-3), respektive, medan figur 1B skildrar blad morfologiska förändringar på grund av nekros (Figur 1B-1) eller kloros (figur 1B-2). Nekros kan förekomma vid injektionsstället mellan dag 3-5 efter infiltration. Dessa förändringar beror ofta på att proteinets egenskaper uttrycks och de infiltrerade växternas hälsa (undersöks vidare i diskussion). Samtidigt kan kloros också förlita sig på hälsan hos växter som används (ytterligare granskas i diskussion). Processen för Agrobacterium tillväxt och förberedelse för infiltration visas i figur 1C. Bild 1C-1 visar isolerade kolonier av Agrobacterium. Figurerna 1C (2-5) visar medias förväntade utseende efter att det inokuleras med en enda isolerad koloni. Se bild 3 för mer detaljer om dessa steg. Anläggningens infiltrationsprocess visas i figur 1D och börjar med en oinfilterad växt och följs av infiltrationsprocessen. Uttrycket, extraktion, och förtydligande av växtproteiner visas i figur 1E. Bladmaterialet placeras i en mixer och homogeniseras, visas i figur 1E (1-3). Därefter tas ett prov som representerar total homogenate. Det filtreras sedan genom en Miracloth (gasväv eller ens ett kaffefilter kan ersätta minskade utgifter), och den förtydligade suspensionen centrifugeras. Centrifugeringen möjliggör separering av supernatanten från de återstående materialen, enligt figur 1E (4-6). Den förtydligade supernatanten laddas sedan på en protein G-affinitetskromatografikolumn, figur 1F (1-3). Efter att större delen av proteinet är bundet, figur 1F-4, elues proteinerna från hartset Figur 1F(5,6).

I tabell 1 visas de växtoptimerade nukleinsyrasekvenser som används för att framställa asGFP45 (övre raden) i pBY! KEAM-GFPasH-vektor som används i denna studie för att uttrycka asGFP-IgG fusion och GFP33 (nedre raden) i PBYEAM-GFPHgp-vektorn som används i denna studie för att uttrycka GFP-IgG fusion. Nukleinsyra sekvenser undersöktes med hjälp av Expasy protein översätta verktyget (https://web.expasy.org/translate/) för att bestämma aminosyra sekvenser.

En representativ Agrobacteriumplatta som bereds med hjälp av detta protokoll visas i figur 2. Önskade kolonier ska framträda runda och enhetliga i form och färg. Kolonier närmare plattans mitt har en högre sannolikhet att uttrycka kanamycinresistens. De flytande kulturerna kommer att förberedas från en enda isolerad koloni.

Det förväntade utseendet på medier som innehåller kulturer visas i figur 3. Vid inledande inympning av en isolerad koloni kommer LB-media att framstå som ljusgult och genomskinligt, vilket visas i figur 3A. Efter inkubation av en isolerad koloni över natten vid 30 °C, kommer LB media visas grumlig. Som framgår av figur 3B, kan objekt inte längre ses genom media när tillväxten är närvarande i LB. Efter centrifugeringen ska en pellet bildas i botten av röret. Röret kommer att ha en tydlig separation av LB-media ovanför pelleten och kommer att visas ljusgul och genomskinlig, som visas i figur 3C. LB-mediesupnatanten kasseras, och pelleten återanvänds i infiltrationsbufferten. Vid en OD600 av 0,2 kommer media att framstå som grumligt, som visas i figur 3D. OD600 ska mätas enligt vad som beskrivs i metoderna.

Bild 4 representerar processen för bladinfiltration. En lätt prod av bladet med ett gem bör ge ett avbrott i blad epidermis som inte passerar helt genom bladet. Brytningen ska nätt och jämnt tränga hål på bladet så infiltrationsbufferten kan injiceras i bladet, som visas i figur 4A-C. Suspensionen av Agrobacterium och infiltrationsbuffert injiceras direkt i avbrottet i bladet och förändrar något det infiltrerade bladets färg; se figur 4D-F.

Utseendet på blad som uttrycker IgG fusioner är representerade i figur 5. Den visar blad som uttrycker asGFP-IgG fusioner (Figur 5A) och GFP-IgG fusioner (Figur 5C) under vitt ljus. Om konstruktionerna i detta protokoll används, när infiltreras på en 0,2 OD600, blad ska visas friska på dagar 1-5 för båda bladen uttrycker asGFP-IgG fusioner och blad uttrycka GFP-IgG fusioner. Det kan finnas ett lätt nekrotiskt utseende vid injektionsställen dag 5, vilket vanligtvis framgår av ljusning av växtvävnaden i dessa områden. Bild 5 visar också blad som uttrycker asGFP-IgG fusioner (Figur 5B) och GFP-IgG fusioner (Figur 5D), respektive, under långvågig UV-ljus från bladets toppvy. Fluorescens ökar i intensitet som dagarna framsteg för båda konstruktioner uttryckta. Blad uttrycker asGFP-IgG fusioner tenderar att ha något mindre intensiv fluorescens än blad uttrycka GFP-IgG fusioner på alla dagar.

När supernatanten för asGFP-IgG-extraktet tillsätts till Protein G-kolonnen kommer hartset att bli något grönt under vitt ljus på grund av växtklorofyllpigment (Figur 6A). Tillsats av supernatant under kortvågs UV-ljus resulterar i ackumulering av fluorescens i Protein G-hartset, som visas i figur 6B. Observera att supernatanten också kommer att vara fluorescerande ensam i UV-belysning. Ändå förväntas fluorescens vara mycket mer koncentrerad när asGFP-IgG fusion börjar binda till hartset.

Efter bortgången av supernatant av asGFP-IgG genom proteinet G harts, bör hartset belysa under kort våg UV-ljus, som visas i figur 7A. Vid denna punkt, kommer de flesta av IgG vara bunden till harts. Vid tillsats av elueringsbufferten kommer fluorescensen i proteinet G-harts fortfarande att vara synlig under kortvågs UV-ljus och kommer att börja förlora intensitet när mer elueringsbuffert av lågt pH-värde passerar genom hartset. Fluorescens kommer att börja ansamlas i eluaterna (Figur 7B). Eluat fraktioner kommer att variera i fluorescens. Som ses i figur 8, fluorescens är den lägsta intensiteten i den första elueringen och högsta intensiteten i den andra och tredje eluat. Resultaten kan variera, eftersom fluorescensen kommer att bero på proteinets uttryck, skördat bladmaterial och andra tillstånd som används i experimentet.

Efter avslutad reningsprocessen, prover analyseras på 10% SDS-PAGE gel under reducerande förhållanden (prov buffert innehåller DTT och prover kokades i 5 min) och icke-reducerande villkor (provbuffert innehåller inte DTT och prover var inte kokt). Som visas i figur 9A, endast icke-reducerande prover, såsom i Elution 2 NR körfält, kommer fluorescerande när de utsätts för kort våg UV-ljus. Detta körfält första bandet fluorescing på full produktens förväntade storlek ~ 200 kDa, vilket tyder på att asGFP fortfarande är konformationellt korrekt. De fluorescerande banden nära gelens botten är färgämne från den reducerande bufferten. Observera att asGFP förlorar fluorescens när den utsätts för temperaturer vid eller över 95 °C i 5 minuter; detta skiljer sig från eGFP (förstärkt GFP), som skulle upprätthålla vissa fluorescens under samma villkor49,50. Två band av stegen, 75 kDa och 25 kDa, fluorescerande också. Bild 9B representerar en Coomassie fläck av samma gel i figur 9A. Eluering i körfält 6-9 har förberetts under reducerande förhållanden. När de körs på en gel och Coomassie-färgade, bör dessa prover visa asGFP-IgG fusion komponenter separat. Dessa komponenter inkluderar den tunga kedjan smält till GFP (~ 75 kDa), den tunga kedjan ensam (50 kDa), den lätta kedjan (25 kDa), och asGFP själv (27 kDa). Det icke-reducerande provet ingick i den sista körfält av gelen för jämförelse ändamål och bör visa ett enda stort band (~ 200 kDa), som bör göras upp av två tunga kedjor smält till asGFP och respektive ljus kedjor. Dessutom är mindre band sannolikt orsakas av inhemska proteaser. Denna klyvning kan förebyggas med tillsats av proteashämmare och genom att hålla proteinextraktet kallt hela tiden, inklusive när du utför kolonnen rening. IgG fusionsproteinets enskilda komponenter kommer inte att kunna särskiljas i de icke-reducerande proverna på Coomassie-gelen.

Figure 1
Bild 1: Arbetsflöde av växtuttryck, extraktion, och reningsprocesser. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Nukleotidsekvens används Aminosyra Sekvens
Sekvenser
används för
asGFP i
pBY! KEAM
-GFPasH
Vektor
används i
Den
Uttryck
av de
asGFP-IgG
Fusion		 ATGGTGTCCAAGGGAGAGGAAGCTGGAAGAGTGTT
CAGTACCCTATGACTTCTAAATCGAGTTGAATGGCGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTTGCTGGAGAGGGTTTCACCCCTTC
ATCTGGAAGATTKAATKAATGCACGTTAGTACTACCGGAGAC
TTGCCTATGTST.KGGTTG SVARTCTCCCCKCTTCAGTACGG
GTTTKATTENKTKNACCAKTACCCTGAGGATATCACTCACTTCTTKT
CCAAGAATGTTTTCCTGGGTCTTATACTCTCGACAGAACTTTGAGA
GGATGGAGGGAGACGGTACTCTACTCACCACGAGTACTC
CCTTGAGGACGGTTGCGTTACTCCAAGACTACTTTGAACGCTT
CTGGATTCGACCCCAAGGGAGCCACTATGACTAAGKTTTCGT
CAAACAGCTCCCAAACGAGGTCAAAATCACCCCACACGGGCCA
AATGGTATACTTACTTCCKTKTTKTCTACCAGGAGGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAAGACTGCATCGTTACCCCA
GTTGGCGGCAGAAAAGTTACTCAGCCTAAGGCTCACTTTCTTCC
ATACTCAGATCATTCADAJAKAJAKACCAKDAKACCAGAG
ATCACATCGTTKKKK.
GCACGGCATGGATGAGCTTTACAAGA		 MVSKGEEASGRALF
QYPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEGFTP
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
DRTLRMEGDGTLTT
HHEYSLEDGCVTSK
TTLNASGFDPKGAT
MTKSFVKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQIGTQD
CIVTPVGGRKVTQP
KAHFLHTQIIQKKDP
NDTRDHIVQTELAV
AGNLWHGMDELY
K
Sekvenser
används för
GFP i
pBYEAMGFPHgp
Vektor
används i
Den
Uttryck
av GFP-IgG
Fusion		 ATGGCTACACADACACATATT KAVLAKTCTCT.KT.K. SKATTERAST.K.
GGTCTTTCTGCTTCTCTCTTGCTTCTGGTATGGTGAGCAAGGGCG
AGGAGGTTCACCGGGGGGTGGTSTSKUGGATSTGGTCGAGJÄGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTKAGCGTGTCCGGCGAGG
GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA
TCTGCACCACCGGCAAGYKTHETSSNACKACCT.K.CCCCKTCGT
GACCACCTTCAGCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCCC
GACCACATGAAGKAKAKGAKTTCTCCAAGTCCGCCATGCCCG
AAGGCTACGTCCAGGASKKLAKTTCLAKAGGK.
CAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACAC
CCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGA
GGACGGCAACATCCTGGGGCACACAAGCTGGAGTACAACTACAACAA
CAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGG
CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGC
AGCGTGCAGCCCCCCCCACCACCAKACCACCCCCATCG
GCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCAC
CCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCA
CATGGTCCTGCTGGAGTTGTGACCGCCGCCGGGATCACTCAC
GGCATGGACGAGCTGTACAAGA		 MANKHLSLSLFLVLL
GLSASLASGMVSKG
EELFTGVVPILVELD
GDVNGHKFSVSGE
GEGDATYGKLTLKFI
CTTGKLPVPWPTLV
TTFSYGVQCFSRYP
DHMKQHDFFKSA
MPEGYVQERTIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
KEDGNILGHKLEYN
YNSHNVYIMADKQ
KNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNH
YLSTQSALSKDPNEK
RDHMVLLEFVTAA
GITH

Tabell 1: Sekvenser som används för att skapa asGFP och GFP

Figure 2
Figur 2: Agrobacterium kolonier som odlas på LB-platta som innehåller kanamycin. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Mediernas utseende i hela tillväxten och bearbetningen av Agrobacterium. (A) Utseendet på LB-media omedelbart efter inokulering av isolerade Agrobacterium koloni. (B) Förekomsten av media efter natten inkubation av en isolerad koloni vid 30 ° C. (C) Utseendet på media efter kulturer snurras ner för 20 min vid 4.500 x g. (D) Pellet återanvänds i infiltration buffert. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Process av infiltration av N. benthamiana växter. (A-B) Något peta bladet resulterar i en subtil hål på toppen av bladet. (C-D) Injektion av Agrobacterium suspension i blad. (E) Infiltrerade Plant blad från den översta vyn. (F) Växt med flera blad infiltrerade från den översta vyn. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 5
Bild 5: Visualisering av blad som innehåller asGFP-IgG fusion och GFP-IgG fusion börjar dag 1 post infiltration (dpi) i första raden, som leder fram till dag 5 dpi i sista raden för alla förhållanden. A) asGFP-IgG fusion under vitt ljus. B) asGFP-IgG fusion under långvågig UV. C) GFP-IgG fusion under vitt ljus. D) GFP-IgG fusion under långvågig UV. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 6
Bild 6: Supernatant av asGFP-IgG-extraktet som läggs till i Protein G-kolonnen. A) Tillägg under vitt ljus. B) Tillägg under kort våg UV-ljus. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Protein G harts under kortvågs UV-ljus efter att supernatant av asGFP-IgG-extraktet körts genom kolonnen. A) Protein G harts under kortvågs UV-ljus. B) Protein G harts vid eluering av proteiner under låga PH-förhållanden. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 8
Figur 8: Renad eluering av asGFP-IgG som erhållits efter exponering för låga pH-förhållanden genom rening. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figure 9
Bild 9: SDS-SIDA av Kolumnprover. Prover märkta med "R" är i reducerande förhållanden, och prover märkta med "NR" är i icke-reducerande förhållanden. A) Under UV-ljus fluorescerade endast icke-reducerande prover i 10% polyakrylamid gel, som ses i Elution 2 NR körfält. De 75 kDa och 25 kDa stege band också fluoresce. B) Coomassie färgning av samma gel avslöjar närvaron av alla proteiner i provet. I de reducerade elueringarna finns IgG-fusionen utan lätt kedja, den tunga kedjan, lätt kedja, och eventuellt försämrade GFP närvarande vid ~75 kDa, ~50 kDa, ~25 kDa, respektive ~10 kDa. I de icke-reducerade elueringarna är däremot ett framträdande band närvarande, som överensstämmer med storleken på hela asGFP-IgG-fusionen (~200 kDa). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll kan utnyttjas för visuell verifiering av alla rekombinanta Ab eller rekombinant protein som produceras i N. benthamiana växter, inklusive de som kräver tillfällig exponering för sura miljöer för kolonnrening ändamål42,43,44. Vidare kan sammansmältningen av asGFP till andra proteiner i olika uttryckssystem vara ett användbart verktyg för experimentell visualisering och utbildning. Protokollet häri kan vidare skalas till större och mindre mängder bladmaterial för att producera den önskade mängden rekombinant protein. De beskrivna metoderna utnyttjar tidigare studier som har identifierat och gjort versioner av GFP som förblir stabila under sura förhållanden46. Omfattande tidigare studier har skapat immunglobulin domäner smält till ett protein av intresse, ofta kallas IgG-fusioner, som detta protokoll kan också rymma28. Genom att skapa och uttrycka en IgG-fusion som består av en humaniserad IgG1 smält till en GFP och asGFP, kunde vi visualisera förekomsten av det önskade proteinet under uttrycket, extraktion och reningsprocesser.

Om en skicklig forskare följer detta protokoll, kommer bladen att börja visa nekros tecken på infiltrationsplatserna mellan dag 4-5. Men när du använder de beskrivna vektorerna, infiltrated områden av bladen ska visas friska fram till dag 5 med rätt vård. Det är viktigt att notera att Agrobacterium infektion på egen hand kommer så småningom att resultera i nekros av växtbladen på grund av ansamling av reaktiva syrearter (ROS) som en del av växtcellen immunsvar51,52. Detta immunsvar och den resulterande nivån av nekros kan variera baserat på flera faktorer51, inklusive cellulära inriktning, proteinets plats, vilken typ av protein som produceras, uttrycket vektor, och stammen av Agrobacterium används53,54. Också, variationer i den optiska densiteten (OD600) av Agrobacterium används för infiltration kan påverka nivåerna av nekros55. Många uttryck vektorer utnyttja proteiner som binder retinoblastom protein för att hålla växtcellerna i syntes (S)-fas och öka celldelningoch omvandlingsfrekvens 56,57. Ökningar i proteinproduktionen, såsom de som orsakas av bindning till retinoblastomprotein, kan leda till nekros56,57. Framsteg inom vektordesign, såsom de som används i modifierade versioner av geminiviruset BeYDV replicons som används i detta protokoll, har minimerat nekros samtidigt som höga proteinuttryck nivåer58. Också, BeYDV replikons är icke-konkurrerande, ger uttryck för flera proteiner på en enda kassett utan kända storleksbegränsningar53,59.

Flera faktorer påverkar växttillväxt före och efter infiltration, vilket så småningom kan leda till låg proteinavkastning. När sådd växter, alltför många frön per växt pellet kan resultera i många små växt groddar leder till mer blygsam växttillväxt. Därför, minska utsädet antalet per torv pellet och ta bort de extra groddar efter en vecka kommer att resultera i bättre växttillväxt. Att upprätthålla korrekt markfuktighet är en annan faktor som påverkar den totala växtskydd. Övervattning, undervattensvatten, lägga till för mycket eller för lite gödselmedel kan bidra till kloros och påverka växtskydd60,61,62. Nekros och kloros kan dessutom orsakas av produktionen av ett protein som orsakar cell stress. Detta fenomen har setts många gånger med uttrycket av rekombinanta immunkomplex (RIC)56. Vi har observerat att förändringar i proteinstruktur och fusion av proteiner kan hjälpa till att minimera nekros; dock, vissa proteiner kan förbli giftiga för växter även efter olika modifieringar. Om användning av uttrycket vektorer som beskrivs häri, extraktion av protein kan utföras tidigt och innan början av betydande nekros, vilket resulterar i hög proteinutbyte56.

Olika tillväxtförhållanden kan bromsa eller till och med hämma Agrobacteriumtillväxten. Agrobacterium växer optimalt vid 28 °C-30 °C och får en värmechock vid inkuberas över 30 °C, vilket ger fel i celldelning62. Tillväxten kan också hindras genom tillsats av för mycket rifampicin, eftersom olika Agrobacterium stammar är mer eller mindre naturligt resistenta mot denna antibiotika62. Den bakteriekultur som förberetts för infiltration med betydligt högre OD600 än rekommenderat kommer sannolikt att orsaka nekros55. En något högre OD600 av kulturen påverkar vanligt inte avkastningen, men om den är lägre än 0.1, proteinavkastningen kan vara betydligt förminskad. Ackumulering av döda celler kan ske under två omständigheter; 1) kulturen var övervuxen, vilket leder till en betydande del av OD är döda celler, och 2) skadar / dödar Agrobacterium efter tillväxt, såsom med kemisk restsubstans eller höga centrifughastigheter. Infiltrationer med hjälp av ett ökat antal döda celler i kulturen kan minska proteinuttryck. Dessutom kan punktering bladen genom att tillämpa för mycket tryck skada bladen och därmed kan leda till för tidig nekros. Med tanke på dessa möjliga faktorer när de uttrycker rekombinanta proteiner i Nicotiana benthamiana, kan leda till förstärkt proteinproduktion.

Erhålla låg proteinavkastning kan bero på vissa frågor i extraktion och rening steg. För det första kan extraktionsbufferten behöva optimering beroende på intressets protein. Under blandning, bör växtmaterial vara homogen utan några synliga blad bitar. Därefter kräver vissa proteiner rengöringsmedel för solubilisering i extraktionsbufferten, såsom Tween-20 eller Triton. Andra proteiner kan behöva urea vid höga koncentrationer ~ 7,5 M för solubilisering, medan vissa kan extraheras med PBS bara. Nedbrytning av protein kan uppstå om buffertar, växtvävnad, centrifuger etc. inte hålls svala under extraktionsprocessen. Brist på proteashämmare och natriumaskorbat eller liknande kemikalier i extraktionsbufferten kan också orsaka nedbrytning eller aggregering. Vissa proteashämmare som PMSF bryts ned snabbt, och natriumaskorbat tar lite tid att bli vattenhaltig. Sammantaget bör forskare bestämma optimala förhållanden för deras protein av intresse.

Reningen av IgG-fusioner innehåller få steg som kan behöva ändringar om låg proteinutbyte erhålls. Analysera provet alikvoter som samlats in under hela processen av SDS-PAGE och Western kommer att bidra till att identifiera fel av metoderna. Till exempel, om genomströmningen innehåller en väsentlig mängd protein, då kan bindningen av proteinet underlättas genom att ändra buffertens pH., om man inte kan använda ett stort värde. Om man använder höga koncentrationer av rengöringsmedel under extraktionsprocessen kan det påverka hartsens bindande egenskap, särskilt om hartset återanvänds flera gånger. Korrekt lagring av hartset, som beskrivs i metoderna, är avgörande för hartsens livslängd. Dessutom, om tvättsteget tar bort proteinet av intresse från hartset, kan buffertarna behöva göras om för att lösa detta problem. Andra problem med proteinrening kan bero på felvikta eller försämrade proteiner, vilket kan kräva ytterligare analys av den övergripande proteindesignen. Att referera till den beskrivna felsökningen kan öka reningens effektivitet med hjälp av detta protokoll.

Den beskrivna GFP-IgG fusionsrening är till hjälp i en undervisningsmiljö. Visualisering är grundläggande för naturvetenskaplig utbildning eftersom det gör det möjligt för elever att förstå begrepp lättare39. Eleverna rapporterar ofta missförstånd förutom svårigheter att förstå begrepp på molekylär nivå39. I synnerhet de experiment som kräver en förståelse av den specifika proteinplatsen vid varje steg kan modifieras genom att märka protein av intresse med fluorescerande molekyler. Därför kan GFP eller asGFP, beroende på pH-miljö som används, utnyttjas för att utnyttja sin fluorescens för att underlätta klarering av tekniken proteinrening för studenter.

Sammanfattningsvis beskriver vi en enkel metod för uttryck och rening av en rekombinant Ab smält till en GFP i N. benthamiana växter. Detta protokoll kan användas för rening av en Ab smält till någon önskad målprotein. Processen kan redigeras för att rymma olika mängder bladmaterial och möjliggör visuell bestämning av protein närvaro före, under, och efter ingåendet av proteinet extraktion och reningsprocessen. Dessa metoder kan vara användbara som kontroller och kan vara av ändamål för undervisningsteknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Maria Pia DiPalma för att ha redigerat videon. Vi tackar också Office of Educational Outreach och Student Services vid Arizona State University för deras generösa offentliggörande avgift bistånd. Forskning för detta protokoll stöddes av School of Life Sciences, Arizona State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81 (2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Tags

Biologi antikropp monoklonal antikropp molekylär pharming agroinfiltration transientuttryck Nicotiana benthamiana grönt fluorescerande protein syra-stabilt grönt fluorescerande protein antikroppsfusion IgG-fusion protein G rening
Produktion av IgG Fusion Proteiner Övergående Uttryckt i <em>Nicotiana benthamiana</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P.,… More

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter