Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in Nicotiana benthamiana

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

We beschrijven hier een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinant menselijke IgG versmolten tot GFP in Nicotiana benthamiana. Dit protocol kan worden uitgebreid tot zuivering en visualisatie van tal van eiwitten die kolomchromatografie gebruiken. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan het persoonlijke en virtuele college onderwijs laboratorium, het verstrekken van project-based exploratie.

Abstract

De grote vraag naar antilichamen als therapeutische interventies voor verschillende infectieuze, metabole, auto-immuun-, neoplastische en andere ziekten creëert een groeiende behoefte aan het ontwikkelen van efficiënte methoden voor recombinante antilichaamproductie. Vanaf 2019 waren er meer dan 70 door de FDA goedgekeurde monoklonale antilichamen en is er een exponentieel groeipotentieel. Ondanks hun belofte, beperkende factoren voor wijdverbreid gebruik zijn productiekosten en complexiteit. Mogelijk bieden fabrieken goedkope, veilige en gemakkelijk schaalbare eiwitproductiestrategieën. Planten zoals Nicotiana benthamiana kunnen niet alleen complexe zoogdiereiwitten correct vouwen en assembleren, maar kunnen ook kritische post-translationele wijzigingen toevoegen die vergelijkbaar zijn met die van celculturen van zoogdieren. In dit werk, met behulp van native GFP en een zuur-stabiele variant van groene fluorescerende eiwitten (GFP) versmolten met menselijke monoklonale antilichamen, waren we in staat om de gehele voorbijgaande antilichaam expressie en zuivering proces van N. benthamiana planten visualiseren. Afhankelijk van het doel van het experiment kan native GFP-fusie zorgen voor een eenvoudigere visualisatie tijdens de expressiefase in de planten, terwijl zuur-stabiele GFP-fusie visualisatie mogelijk maakt tijdens downstreamverwerking. Deze schaalbare en eenvoudige procedure kan worden uitgevoerd door een enkele onderzoeker om milligram hoeveelheden zeer zuivere antilichaam of antilichaam fusie eiwitten te produceren in een kwestie van dagen met behulp van slechts een paar kleine planten. Een dergelijke techniek kan worden uitgebreid tot de visualisatie van elk type antilichaam zuiveringsproces en mogelijk vele andere eiwitten, zowel in plantaardige als andere expressiesystemen. Bovendien kunnen deze technieken profiteren van virtuele instructies en worden uitgevoerd in een academisch laboratorium door undergraduate studenten met minimale eerdere ervaring met moleculaire biologie technieken, het verstrekken van een basis voor project-based exploratie met real-world toepassingen.

Introduction

Industrie rapporten geven aan dat dertien van de twintig meest brutowinst drugs in de Verenigde Staten waren biologische (eiwit-gebaseerde geneesmiddelen), waarvan negen waren antilichamen. Vanaf 2019 waren er meer dan 570 antilichaam (Ab) therapieën in verschillende klinische ontwikkelingsfasen1,2,3. De huidige wereldwijde ab-omzet bedraagt meer dan 100 miljard USD en de monoklonale ab (mAb) therapeutische markt zal naar verwachting tot 300 miljard USD genereren in 20251,4. Met zo'n hoge vraag en verwachte stijgingen van de inkomsten, onderzoekers hebben gewerkt aan manieren om Ab therapeutics te produceren op een steeds grotere schaal, met een hogere kwaliteit en lagere kosten te ontwikkelen. Plantaardige expressiesystemen hebben verschillende voordelen ten opzichte van traditionele zoogdiercellijnen voor de betaalbare en grootschalige productie van Ab therapeutics5,6. Voor de productie van eiwittherapeutisch in planten ("moleculair pharming") zijn geen dure bioreactoren of celkweekfaciliteiten nodig, net als traditionele zoogdiercelkweektechnieken7,8. Planten kunnen geen menselijke ziekteverwekkers oplopen, waardoor potentiële besmetting tot een minimalisering wordtgeminimaliseerd 9. Zowel voorbijgaande als transgene plantaardige eiwitexpressie kan worden gebruikt als goedkopere alternatieven voor zoogdier- of bacteriële productiesystemen10. Hoewel transgene planten de voorkeur hebben voor de productie van gewassen, kan recombinante eiwitproductie met behulp van deze methode weken tot maanden duren. Vooruitgang in tijdelijke expressie met behulp van virale vectoren door middel van spuit of vacuüm agroinfiltratie zorgen voor een kleine en grootschalige productie, respectievelijk, van het gewenste eiwit in de dagen11,12,13,14. De productie van mAbs tegen ebola, Dengue en Zika, en tal van andere recombinante eiwitten, zijn snel en efficiënt geproduceerd en gezuiverd met behulp van tijdelijke expressie in N. benthamiana planten15,16,17,18,19. Deze omstandigheden maken tijdelijke plantaardige expressie een aantrekkelijke optie voor het ontwikkelen van meerdere Ab therapeutica en de methoden die in dit protocol20 wordenaangetoond .

MAb's van de eerste generatie waren van murineafscheiding, wat resulteerde in niet-specifieke immunogeniciteit bij gebruik in menselijke proeven21. Na verloop van tijd, chimeric, gehumaniseerd, en uiteindelijk, volledig menselijke Abs werden geproduceerd om immunogeniciteit veroorzaakt door Ab therapeutica te verminderen. Helaas veroorzaken sommige van deze Abs nog steeds gastheer immunogeniciteit als gevolg van verschillen in glycosylation21. Ontwikkelingen in de installatietechniek hebben gezorgd voor de wijziging van Ab glycans, wat essentieel is omdat de stabiliteit en functie van een Ab aanzienlijk kunnen worden beïnvloed door zijn glycosylation staat22. De vooruitgang heeft de productie in plantaardige systemen van hoog-niveauuitdrukking van gehumaniseerde mAbs mogelijk gemaakt, die menselijke glycanen en resulterend de gewenste biologische eigenschappen van een massa-geproduceerde menselijk farmaceutisch19,21bevatten .

Naast recombinant Abs, Ab fusie moleculen (Ab fusies) zijn onderzocht voor verschillende doeleinden in de afgelopen decennia. Ab fusies bestaan vaak uit een Ab of Ab fragment gefuseerd tot een molecuul of eiwit en zijn ontworpen om reacties uit te lokken van immuun effector cellen23. Deze moleculen zijn gemaakt als potentiële therapeutische interventies voor de behandeling van verschillende pathologieën zoals kanker en auto-immuunziekten24,25,26,27. Recombinant immune complexs (RICs) zijn een andere klasse van Ab fusies die zijn gebruikt als vaccin kandidaten28. RICs maken gebruik van het vermogen van het immuunsysteem om de Fc-regio's van Ab-fusies te herkennen en blijken de immunogeniciteit te verbeteren in combinatie met andere vaccinplatforms29,30,31.

Green Fluorescent Protein (GFP) is een bioluminescent eiwit afkomstig van de kwal Aequorea Victoria, die groen licht uitzendt wanneer opgewonden door ultraviolet licht32,33. In de loop der jaren is het gebruik van GFP als visuele marker van genexpressie uitgebreid van expressie in Escherichia coli tot tal van eiwitexpressiesystemen, waaronder N. benthamiana-planten 34,35,36,37,38. Zichtbare markers, zoals GFP, hebben overvloedige implicaties in het onderwijzen en leren van wetenschappelijke concepten. Tal van instapstudenten beschrijven moeilijkheden bij het begrijpen van wetenschappelijke concepten wanneer het idee dat wordt onderwezen niet met het blote oog zichtbaar is, zoals de concepten van moleculaire biologie en aanverwante gebieden39. Visuele markers, zoals GFP, kunnen zo bijdragen aan de verwerking van informatie met betrekking tot de wetenschappelijke processen en kunnen helpen de moeilijkheden te verminderen die studenten rapporteren bij het leren van tal van wetenschappelijke concepten.

Hoewel GFP vaak wordt gebruikt als een marker om gen en expressie in vivoaan te geven, is het moeilijk om het te visualiseren in de downstream processen bij het gebruik van zure omstandigheden. Deze omstandigheid is voornamelijk omdat GFP zijn structuur en resulterende fluorescentie niet behoudt bij een lage pH40. Tijdelijke zure omgevingen zijn vaak nodig in verschillende zuiveringsprocessen, zoals eiwit G, eiwit A, en eiwit L chromatografie, vaak gebruikt voor Ab zuivering41,42,43,44. GFP-mutanten zijn gebruikt om fluorescentie onder zure omstandigheden45,46te behouden .

Hierin beschrijven we een eenvoudige methode voor expressie, extractie en zuivering van recombinante IgG fusie-eiwitten in N. benthamiana planten. We produceerden traditionele GFP gefuseerd naar de N-terminus van een gehumaniseerde IgG zware keten, het creëren van een GFP-IgG fusie. Tegelijkertijd ontwikkelden we de fusie van een plant codon-geoptimaliseerde sequentie voor een zuur-stabiele GFP (asGFP) naar de N-terminus van een gehumaniseerde IgG zware keten, het creëren van een asGFP-IgG fusie. De voordelen van het produceren van GFP-IgG omvatten de mogelijkheid om de aanwezigheid van een doeleiwit tijdens expressie te visualiseren, terwijl asGFP-IgG het mogelijk maakt om de aanwezigheid van recombinant eiwit te zien in niet alleen de expressie- en extractiestappen, maar ook in de zuiveringsstappen van het eiwit. Dit protocol kan worden aangepast voor de productie, zuivering en visualisatie van een reeks GFP-fusie-eiwitten geproduceerd in N. benthamiana en gezuiverd met behulp van chromatografietechnieken die een lage pH vereisen. Het proces kan ook worden afgestemd op verschillende hoeveelheden bladmateriaal. Terwijl Abs en fusie-eiwitten gelabeld met GFP of asGFP zijn niet bedoeld om te worden gebruikt voor therapieën, deze methoden kunnen nuttig zijn als controles tijdens experimenten en kan ook verder worden gebruikt als een leermiddel voor moleculaire en cellulaire biologie en biotechnologie, zowel in-persoon en vrijwel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cultiveren N. benthamiana planten

  1. Plaats grond turf pellets op een lade en giet eerder gekookt, nog warm (~ 40-45 °C), water over de turf pellets voor volledige expansie. Na pellets zijn volledig uitgebreid, plaats 2-3 N. benthamiana zaden op elke turf pellet met behulp van pincet.
  2. Giet ongeveer 0,5 in water om de bodem van de lade te bedekken. Label de lade met de opzaaidatum. Ga door met het water van de zaailingen dagelijks met de juiste hoeveelheden kunstmest. Meststof (water-oplosbare all-purpose plant food) concentratie is over het algemeen 2,5-2,8 g/L.
  3. Bedek de lade met een humidome top wanneer geplaatst in de groeikamer. Houd de ingezaaide turfkorrels in de groeikamer op 23-25 °C, met een fotoperiode van 16 uur en een relatieve luchtvochtigheid van 60%.
  4. Na een week, verwijder extra planten verlaten elke pellet met slechts een zaailing.
  5. Wanneer de planten 2-3 weken oud zijn, breng elke turfpellet over naar een individuele pot met vochtbeheersingsgrond. Deze demonstratie gebruikte Miracle-Gro vochtcontrole potgrond.
  6. Water dagelijks met 1 g/L meststof. Laat de grond nooit helemaal droog. Planten zijn klaar voor infiltratie wanneer ze 5-6 weken oud zijn.

2. Voorbereiding van agrobacterium tumefaciens voor infiltratie

OPMERKING: GFP-IgG fusieconstructies kunnen worden verkregen zoals beschreven in dit artikel31. Het asGFP-gen werd verkregen en plant-geoptimaliseerd uit deze studie45. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd naast een Bunsen-brander, en basisaseptische technieken moeten worden toegepast om besmetting te voorkomen.

  1. Streep A. tumefaciens EHA105 herbergen bonen gele dwerg virus (BeYDV)19 plant expressie vector voor elke constructie (asGFP-IgG, GFP-IgG, lichtketting) uit een glycerolvoorraad op LB agar (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g gistextract, 15 g/L agar, 50 μg/mL kanamycine) plaat.
  2. Kweek één dag in een 30 °C staande couveuse. Isoleer een enkele kolonie voor verificatie door standaard kolonie scherm PCR protocol.
  3. Gebruik geverifieerde kolonie voor elke constructie. Vul conische buis met 10 mL LB-media (10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g gistextract, 50 μg/mL). Voeg vervolgens 10 μL van 100 μg/mL kanamycine toe. Voeg 10 μL 2,5 μg/mL rifampicin toe om E. coli besmetting te voorkomen. Incubeer bij 30°C en 120-150 tpm 's nachts.
  4. De volgende dag, als de Agrobacterium cultuur wordt gegroeid tot OD600 = 0,6-0,9, kan het worden gebruikt voor infiltratie. Als het is overwoekerd (OD600 > 1), moet 1-2 mL worden overgebracht naar verse LB met antibiotica en worden geteeld tot de vereiste OD600. Afhankelijk van de concentratie van de oorspronkelijke cultuur kan het mogelijk twee dagen duren om te groeien tot OD600 = 0,6-0,9.
  5. Eenmaal op de juiste OD600, plaats de culturen in een centrifuge, en pellet de bacteriën door centrifugatie op 4.500 x g gedurende 20 min, kamertemperatuur (RT).
  6. Decanteer supernatant van beide monsters, en vervolgens resuspend elke pellet in 1x infiltratie buffer (10 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic zuur, 10 mM magnesiumsulfaat, aangepast aan pH 5.5 met KOH) om de definitieve OD600 = 0,4. Dit moet ongeveer 15-45 mL infiltratie buffer, afhankelijk van de oorspronkelijke cultuurdichtheid. Combineer gelijke volumes van elke IgG fusion construct met de lichtkettingconstructie om de uiteindelijke OD600 = 0,2 per constructie in elke buis te krijgen.

3. Naaldloze spuit agroinfiltratie

  1. Neem een rechtgetrokken paperclip en 5-6-weken oude N. benthamiana planten vanaf stap 1. Maak met behulp van de scherpe rand van de paperclip een kleine punctie in de eerste opperhuidlaag van het blad op het adaxiale oppervlak. Vermijd puncturing het helemaal door.
    LET OP: De onderste bladeren zijn gemakkelijker voor infiltratie, terwijl de bladeren aan de bovenkant van de plant zijn harder. Over het algemeen is de expressie van recombinante eiwitten het hoogst in de bladeren in het midden van een plant, en deze bladeren worden ook minder necrotisch.
  2. Vul een spuit van 1 mL, zonder naald, met de voorbereide Agrobacterium-oplossing vanaf stap 2. Bedek het gat gemaakt in de vorige stap met het einde van de spuit en langzaam duwen om de bacteriën te injecteren in het blad, terwijl het toepassen van zachte tegendruk van achter het blad. Let op het blad donkerder als de oplossing wordt geïnjecteerd zonder het toepassen van te veel druk op de spuit.
  3. Probeer het grootste deel van het blad gebied te infiltreren op een maximum van 3-4 keer – overmatige bladschade kan belemmeren eiwitopbrengst. Het geïnfiltreerde plantenblad zal meestal donker lijken vanuit het onderste zicht.
    OPMERKING: Deze bacteriële oplossing moet voldoende zijn voor ten minste 3-4 planten per constructie. Autoclave eventuele resterende bacteriële oplossing voor het weggooien.

4. Groeien en observeren van de geïnfiltreerde N. benthamiana

  1. Plaats geïnfiltreerde planten terug in de groeikamer en blijf dagelijks water geven.
  2. Observeer de bladeren voor chlorose en necrose in geïnfiltreerde gebieden. Observeer planten voor GFP fluorescentie (als GFP aanwezig is) onder een lange en korte golf UV-lamp.
  3. Dag 4-5 toont de hoogste fluorescentie van beide GFP constructies in de bladeren. Oogst alle bladeren op 4-5 dpi (dagen na infiltratie) en weeg het totale bladmateriaal.
  4. Gebruik het onmiddellijk voor downstream verwerking of opslaan op -80 °C tot klaar voor gebruik.

5. Eiwitextractie

  1. Houd buffers en blender cups op ijs of op 4 °C voor gebruik.
  2. Bereid 2-3 mL ijskoude extractiebuffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 met HCl) per 1 g plantaardig materiaal. Voeg vlak voor de extractiebuffer 2 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) uit voorraad (100 mM) en 50 mM natriumascorbaat toe aan de extractiebuffer.
  3. Plaats plantaardig weefsel van stap 4 in de gepekwicht blender cup. Voeg een gemeten hoeveelheid gekoelde extractiebuffer toe aan de blenderbeker (zoals aangegeven in stap 5.2). Leg de blenderbeker op de blender. Neem een voorgesneden vel parafilm en strek het over de bovenkant van de blender cup. Meng tot homogeniteit met intervallen van 20 seconden, goed roeren tussen de mengcycli als dat nodig is.
  4. Breng gemengd materiaal over naar een beker. Voeg een roerstaaf toe en roer 30 minuten door 4 °C om de oplosbaarheid van eiwitten te verbeteren en neerslag van vaste stoffen mogelijk te maken.
  5. Plaats 2 lagen Miracloth over een schone beker op ijs en giet het extract erdoorheen om grote bladresten te verwijderen. Nadat al het extract is gegoten, vouw de Miracloth om het restblad extract te knijpen. Het extract moet donkergroen lijken zonder zichtbare deeltjes.
  6. Breng 50 μL van dit monster over naar een nieuwe buis van 1,5 mL en label "totaal extract" voor latere analyse. Breng het extract over in centrifugebuizen. Centrifugeren de rest van het plantenextract op 16.000 x g gedurende 20 min, 4 °C en breng het supernatant over op een conische buis.
  7. Filter het oplosbare extract met een spuitfilter van 50 mL en spuitglasvezelfilter (0,75 μm).
  8. Verzamel 50 μL van een monster na centrifugatie, label "oplosbaar extract" voor latere analyse.

6. Eiwit G kolom chromatografie procedure

OPMERKING: Het protocol hier beschreven is voor zwaartekracht-flow chromatografie met behulp van Pierce Protein G agarose hars. Als u een andere hars gebruikt, raadpleegt u de instructies van de fabrikant voor aanpassingen. Laat de hars nooit droog lopen en voorkom dat alle vloeistof uitmondt. Recapituleren de uitlaat als dat nodig is.

  1. Stel een polypropyleenkolom in met een monster van 20 mL.
  2. Schat de hoeveelheid drijfmest die nodig is, afhankelijk van het doelimmunlinetype en de affiniteit met de hars. Over het algemeen is 3 mL van totale drijfmest met 1,5 mL bedvolume voldoende voor de zuivering van meerdere milligram Ab.
  3. Giet voorzichtig de vereiste hoeveelheid opgesuspend drijfmest in de afgetopte kolom. Open de kolomuitlaat vanaf de onderkant van de kolom en laat deze leeglopen totdat het grootste deel van de buffer is verdwenen.
  4. Giet onmiddellijk 10 mL wasbuffer 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4 met HCl) bovenop. Laat het uitlekken en herhaal deze wasstap 2x.
  5. Pas het gefilterde monster van stap 5 op de kolom toe en verzamel de doorstroom, 50 μL stroomdoor voor latere analyses. Sla de rest van de flowthrough op voor het geval de Ab zich niet aan de hars bindt.
    OPMERKING: Het opnieuw toepassen van de doorstroom naar een nieuwe kolom resulteert meestal niet in een goede opbrengst; daarom wordt geadviseerd om te beginnen met nieuw bladmateriaal.
  6. Was de hars twee maal met 10 mL 1x PBS om niet-specifieke binding te verminderen. Indien gewenst, aliquot 50 μL van wassen als de buffer afvoeren door de kolom om te controleren of het doel Ab niet is geëuterd met een wasbuffer.
  7. Stel vijf buizen op en label ze met 125 μL steriele 1 M Tris-HCl bij pH 8. Dit is om de Abs te neutraliseren in de zure elutie buffer om mogelijke structurele veranderingen te voorkomen. U ook 30 μL van 2 M Tris-basis toevoegen om een minder verdund monster te krijgen.
    LET OP: Tijdens elutie kan UV-licht worden gebruikt voor visualisatie. Dit hoeft niet te worden gedaan voor de duur van de elutie. Als UV wordt gebruikt, moet u de juiste BESCHERMINGsmiddelen dragen om schade aan ogen en huid te voorkomen. Een UV-licht hoeft niet te worden gebruikt tijdens de elutiestap.
  8. Elute de Abs door het toepassen van 5 mL elutie buffer (100 mM glycine, pH 2.5 met HCl) op de kolom en verzamel 1 mL fracties op elke aangewezen buis van de vorige stap.
  9. Regeneratie van de kolom onmiddellijk door 20 mL wasbuffer aan te brengen, gevolgd door 10 mL wasbuffer. Zorg ervoor dat de hars langere tijd niet in een zure omgeving wordt achtergelaten. Elutions moeten fluorescerend lijken, vaak wordt de hoogste fluorescentie gezien in de tweede elutie, maar kan variëren van extractie tot extractie.
  10. Voor opslag, was de hars met 10 mL van 20% ethanol in PBS en laat het halverwege uitlekken. Recapituleren de top, dan de onderkant van de kolom, en rechtop te houden op 4 °C.
    OPMERKING: Over het algemeen kunnen eiwit G-harsen tot 10 keer worden hergebruikt zonder significant verlies van efficiëntie. Raadpleeg de richtlijnen van de fabrikant voor specifieke details.
  11. Bepaal de Ab-concentratie met behulp van een spectrofotometer door absorptie op 280 nm te meten, met behulp van de elutiebuffer als blanco. Bewaar de eluates in -80 °C en aliquot 50 μL van elke fractie op een aparte buis voor verdere analyse.

7. SDS-PAGINA voor GFP-Ig fusiedetectie

  1. Maak alle voorbeelden voor het instellen van de SDS-PAGINA.
    1. Voeg 4 μL monsterbuffer toe (6x verminderende monsterbuffer: 3,0 mL glycerol, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 mL van 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg bromofolblauw); (6x niet-reducerende monsterbuffer: 3,0 mL glycerol, 1 g SDS, 7 mL van 4x Tris (pH 6.8) 0,5 M, 1,2 mg bromofenolblauw) tot 20 μL van elk monster (totaal extract, oplosbaar extract, flowthrough, wash, all elutions fractie) voor analyse. Zorg ervoor dat buisdoppen stevig worden vastgemaakt.
    2. Behandel alleen het verminderen van monsters gedurende 5 minuten in een kokend waterbad, en zet vervolgens monsters gedurende 5 minuten op ijs. Spin monsters in een microcentrifuge voor ~ 5 s en laad 20 μL van elk monster in de volgorde van de collectie in de gelputten. Laad 3 μL eiwitladder in een aparte put.
  2. Voer de SDS-PAGE gel uit op een constante 100 V op de gewenste eiwitbandscheiding; het duurt ongeveer 1,5 uur. Controleer de ladder als een indicator van eiwitscheiding.
  3. Visualiseer de gel onder de UV om GFP-fluorescentie te observeren.
  4. Bevlek desgewenst de gel met Coomassie-vlek om het totale eiwit in elk monster te beoordelen. U ook westerse vlekken uitvoeren om doeleiwit te evalueren met behulp van specifieke Abs.
    OPMERKING: Zowel Coomassie kleuring als westelijke vlek kunnen worden uitgevoerd door de standaardprotocollen47,48tevolgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze studie toont een eenvoudige en snelle methode aan om recombinante eiwitten te produceren en te visualiseren in downstream processen. Met behulp van N. benthamiana en volgens het meegeleverde protocol, recombinante eiwitproductie hier beschreven kan worden bereikt in minder dan een week. De algemene workflow van plantenexpressie, extractie en zuivering wordt weergegeven in figuur 1. De stadia van plantengroei van 2 weken oude zaailingen, 4 weken oude planten en 6 weken oude planten worden weergegeven in figuur 1A (1-3), terwijl figuur 1B bladmorfologische veranderingen als gevolg van necrose (figuur 1B-1) of chlorose (figuur 1B-2) weergeeft. Necrose kan optreden op de injectieplaats tussen dagen 3-5 na infiltratie. Deze veranderingen zijn vaak afhankelijk van de eigenschappen van het eiwit die worden uitgedrukt en de gezondheid van de geïnfiltreerde planten (verder onderzocht in discussie). Tegelijkertijd kan chlorose ook vertrouwen op de gezondheid van planten die worden gebruikt (verder onderzocht in discussie). Het proces van agrobacteriumgroei en voorbereiding op infiltratie wordt weergegeven in figuur 1C. Figuur 1C-1 toont geïsoleerde kolonies agrobacterium. Figuren 1C (2-5) tonen het verwachte uiterlijk van de media nadat het is ingeënt met een enkele geïsoleerde kolonie. Raadpleeg figuur 3 voor meer informatie over deze stappen. Het infiltratieproces van de installatie wordt weergegeven in figuur 1D en begint met een niet-geïnfiltreerde installatie en wordt gevolgd door het infiltratieproces. De expressie, extractie en verduidelijking van plantaardige eiwitten worden weergegeven in figuur 1E. Het bladmateriaal wordt in een blender geplaatst en gehomogeniseerd, zie in figuren 1E (1-3). Vervolgens wordt een monster genomen dat het totale homogenaat vertegenwoordigt. Het wordt vervolgens gefilterd door een Miracloth (gaas of zelfs een koffiefilter kan vervangen door lagere kosten), en de verduidelijkte suspensie wordt centrifuged. De centrifugatie maakt het mogelijk om het supernatant van de overige materialen te scheiden, zoals blijkt uit figuren 1E (4-6). De verduidelijkte supernatant wordt vervolgens geladen op een eiwit G affiniteit chromatografie kolom, Figuur 1F (1-3). Nadat het grootste deel van het eiwit is gebonden, figuur 1F-4, worden de eiwitten uit de hars figuur 1F(5,6)ontleed .

Tabel 1 toont de plant geoptimaliseerde nucleïnezuur sequenties die worden gebruikt om asGFP45 (bovenste rij) in de pBY te produceren! KEAM-GFPasH vector gebruikt in deze studie uit te drukken asGFP-IgG fusie en GFP33 (onderste rij) in de PBYEAM-GFPHgp vector gebruikt in deze studie om GFP-IgG fusie uit te drukken. Nucleïnezuur sequenties werden onderzocht met behulp van de Expasy eiwit translate tool (https://web.expasy.org/translate/) om aminozuur sequenties te bepalen.

Een representatieve Agrobacteriumplaat die met dit protocol is bereid, is opgenomen in figuur 2. Gewenste kolonies moeten rond en uniform in vorm en kleur verschijnen. Kolonies dichter bij het midden van de plaat hebben een hogere kans op het uitdrukken van kanamycine weerstand. De vloeibare culturen worden bereid vanuit een geïsoleerde kolonie.

De verwachte verschijning van media met culturen wordt weergegeven in figuur 3. Bij de eerste inenting van een geïsoleerde kolonie verschijnen LB-media lichtgeel en doorschijnend, zoals te zien is in figuur 3A. Na incubatie van een geïsoleerde kolonie 's nachts bij 30 °C, zullen LB-media troebel verschijnen. Zoals in figuur 3Bwordt weergegeven, kunnen objecten niet meer door de media worden gezien wanneer de groei aanwezig is in de LB. Na centrifugatie moet zich een pellet vormen aan de onderkant van de buis. De buis zal een duidelijke scheiding van LB media boven de pellet en zal verschijnen licht geel en doorschijnend, zoals weergegeven in figuur 3C. De LB media supernatant wordt verwijderd, en de pellet wordt opnieuw opsuspend in de infiltratie buffer. Bij een OD600 van 0.2 verschijnen de media troebel, zoals te zien is in figuur 3D. OD600 moet worden gemeten zoals beschreven in de methoden.

Figuur 4 staat voor het proces van bladinfiltratie. Een lichte prik van het blad met een paperclip moet een breuk in de bladopperhuid opleveren die niet volledig door het blad gaat. De breuk moet het blad nauwelijks doorboren, zodat de infiltratiebuffer in het blad kan worden geïnjecteerd, weergegeven in figuur 4A-C. De suspensie van Agrobacterium en infiltratie buffer wordt direct geïnjecteerd in de breuk in het blad en iets verandert de kleur van het geïnfiltreerde blad; zie figuur 4D-F.

Het uiterlijk van bladeren die IgG-fusies uitdrukken is vertegenwoordigd in figuur 5. Het toont bladeren die uitdrukken alsGFP-IgG fusies (Figuur 5A) en GFP-IgG fusies (Figuur 5C) onder wit licht. Als de constructies in dit protocol worden gebruikt, wanneer geïnfiltreerd op een 0,2 OD600, moeten bladeren gezond lijken op dagen 1-5 voor beide bladeren die asGFP-IgG-fusies uitdrukken en bladeren die GFP-IgG-fusies uitdrukken. Er kan een lichte necrotische verschijning op injectieplaatsen op dag 5, die meestal blijkt uit de verlichting van het plantweefsel in die gebieden. Figuur 5 toont ook bladeren die respectievelijk asGFP-IgG-fusies(figuur 5B) en GFP-IgG-fusies(figuur 5D)uitdrukken onder langgolf UV-licht van het bovenste blad. Fluorescentie neemt in intensiteit toe naarmate de dagen vorderen voor beide constructies uitgedrukt. Bladeren uitdrukken asGFP-IgG fusies hebben de neiging om iets minder intense fluorescentie dan bladeren uitdrukken GFP-IgG fusies op alle dagen.

Wanneer de supernatant van het asGFP-IgG-extract wordt toegevoegd aan de Protein G-kolom, wordt de hars licht groen onder wit licht als gevolg van chlorofylpigmenten(figuur 6A). De toevoeging van supernatant onder uv-licht met korte golf resulteert in de ophoping van fluorescentie in de EiwitG-hars, zoals weergegeven in figuur 6B. Merk op dat de supernatant zal ook fluorescerend alleen onder UV-licht. Toch zal fluorescentie naar verwachting veel meer geconcentreerd zijn wanneer de asGFP-IgG-fusie begint te binden aan de hars.

Na het passeren van supernatant van asGFP-IgG door het eiwit G hars, moet de hars verlichten onder korte golf UV-licht, zoals weergegeven in figuur 7A. Op dit punt, zal het grootste deel van IgG aan de hars worden gebonden. Bij het toevoegen van de elutiebuffer zal de fluorescentie in het eiwit G-hars nog steeds zichtbaar zijn onder uv-licht met korte golf en begint de intensiteit te verliezen naarmate er meer elutiebuffer van lage pH door de hars gaat. Fluorescentie zal zich beginnen op te hopen in de eluates(figuur 7B). Eluate fracties zullen variëren in fluorescentie. Zoals te zien is in figuur 8,fluorescentie is de laagste intensiteit in de eerste elutie en de hoogste intensiteit in de tweede en derde eluates. De resultaten kunnen variëren, omdat de fluorescentie zal afhangen van de expressie van het eiwit, geoogst bladmateriaal en andere omstandigheden die in het experiment worden gebruikt.

Na het beëindigen van het zuiveringsproces worden monsters geanalyseerd op de 10% SDS-PAGE gel onder reducerende omstandigheden (monsterbuffer bevat DTT en monsters werden 5 minuten gekookt) en niet-reducerende omstandigheden (monsterbuffer bevat geen DTT en monsters werden niet gekookt). Zoals blijkt uit figuur 9A,zullen alleen niet-reducerende monsters, zoals in Elution 2 NR lane, fluoresceren bij blootstelling aan uv-licht met korte golf. De eerste band van deze baan fluorescerend op de verwachte grootte van het volledige product ~ 200 kDa, wat aangeeft dat de asGFP nog steeds conformationeel correct is. De tl-banden in de buurt van de onderkant van de gel zijn kleurstof uit de reducerende buffer. Merk op dat asGFP gedurende 5 minuten fluorescentie verliest bij blootstelling aan temperaturen bij of boven 95 °C; dit is anders dan eGFP (enhanced GFP), dat onder dezelfde omstandigheden49,50een zekere fluorescentie zou handhaven . Twee banden van de ladder, 75 kDa en 25 kDa, ook fluoresceren. Figuur 9B vertegenwoordigt een Coomassie-vlek van dezelfde gel in figuur 9A. Elutions in rijstroken 6-9 zijn onder erfomstandigheden voorbereid. Wanneer deze monsters op een gel en met Coomassie-bevlekt worden uitgevoerd, moeten ze de asGFP-IgG-fusiecomponenten afzonderlijk weergeven. Deze componenten omvatten de zware ketting gefuseerd met GFP (~ 75 kDa), de zware ketting alleen (50 kDa), de lichtketting (25 kDa) en de asGFP zelf (27 kDa). Het niet-reducerende monster werd opgenomen in de laatste rijstrook van de gel voor vergelijkingsdoeleinden en moet één enkele grote band vertonen (~ 200 kDa), die moet bestaan uit twee zware kettingen die zijn gesmolten tot de asGFP en de respectieve lichtkettingen. Bovendien, kleinere bands worden waarschijnlijk veroorzaakt door inheemse proteases. Dit decolleté kan worden voorkomen met de toevoeging van proteaseremmers en door het eiwitextract te allen tijde koud te houden, ook bij het uitvoeren van de kolomzuivering. De afzonderlijke componenten van het IgG-fusieeiwit zijn niet te onderscheiden in de niet-reducerende monsters op de Coomassie gel.

Figure 1
Figuur 1: Workflow van plantenexpressie, extractie en zuiveringsprocessen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Nucleotide-reeks gebruikt Aminozuur sequentie
Sequenties
gebruikt voor
asGFP in
pBY! KEAM (KEAM)
-GFPasH
Vector
gebruikt in
De
Expressie
van de
asGFP-IgG
Fusion		 ATGGTGTCCAAGGGAGAGGAAGCTGGAAGAGAGCCTTTTTT
CAGTACCCTATGACTTCTAAAATCGAGTTGAATGGCGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTTGCTGGAGAGGGTTTCACCCCTTC
ATCTGGATATATATGCACGCTTACTACCGGAGAC
TTGCCTATGTCCTGGGGTGTTATAGCTTCCGCTTCAGTACGG
GTTTCACATGTTTGCCCACTACCCTGAGGATATCACTCACTTCTTTT
CCAAGAATTTTTTCGGGGGGGGCTTATACTCTCGACAGAACTTTGA
GGATGGGGGGGGGGTACTACTACTACTEACTCACCACGAGTACTC
CCTTGAGGACGGTTGCGTTACTTCCAAGACTTTGAACGCTT
CTGGATTCGACCAAGGGAGGGACTATGACTAAGTCTTTCGT
CAAACAGCTCCCAAACGAGGTCAAAATCACCACACGGCCA
AATGGTATTAGACTTACTTCCACTGTTCTACCTTAAGGAGAGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAAGACTGCGTTACCCCA
GTTGGCGGCAGAAAAGTTACTCAGACTAAG75TCACTTTCTTC
ATACTCAGATCATTCAGAAGAAGGAGAAACGACCAGAGAG
ATCACATCGTTCAGACTGAGCTTGCCGTTGCTGGAAATCTTTGG
GCACGGCATGGATGAGCTTTACAAGA		 MVSKGEEASGRALF
QYPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEGFTP
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
DRTLRMEGDGTLTT
HHEYSLEDGCVTSK
TTLNASGFDPKGAT
MTKSFVKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQIGTQD
CIVTPVGGRKVTQP
KAHFLHTQIIQKKDP
NDTRDHIVQTELAV
AGNLWHGMDELY
K
Sequenties
gebruikt voor
GFP in
pBYEAMGFPHgp
Vector
gebruikt in
De
Expressie
van GFP-IgG
Fusion		 ATGGCTAACAAGCACCTCTCTCTCTCTTCCTTGTGCTCCTT
GGTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGTATGGTGAGGGGGGGG
AGGAGCTGTTCAGGGGGGGGGGGGTGCCCATCCTGGTCGAGCGGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTGGGGGGGGGGGGGGGG
GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA
TCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGT
GACCACCTTCAGCTACGGGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCCCCC
GACCACATGAAGAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCG
AAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCTCTTCAAGGACGACGG
CAACTACAAGACCCGCGCCGAGAGGTGAAGTTCGAGGG5GACAC
CCTGGTGAACCGCATCGAGAGAGAGAAGGGCATCGACTTCAAGGA
GGACGGCAACATCCTGGGGCAAGCTGGAGTACAACTACAA
CAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGG
CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGC
AGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCACCACCAACACCCACCATCG
GCGACGGCCCCGTGCTGCTGCTGCGACAACCACTACCTGAGCAC
CCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCAACGAGAAGCGCGATCA
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCAC
GGCATGGACGAGCTGTACAAGA		 MANKHLSLSLFLVLL
GLSASLASGMVSKG
EELFTGVVPILVELD
GDVNGHKFSVSGE
GEGDATYGKLTLKFI
CTTGKLPVPWPTLV
TTFSYGVQCFSRYP
DHMKQHDFFKSA
MPEGYVQERTIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
KEDGNILGHKLEYN
YNSHNVYIMADKQ
KNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNH
YLSTQSALSKDPNEK
RDHMVLLEFVTAA
GITH (GITH)

Tabel 1: Sequenties die worden gebruikt om ASGFP en GFP te maken

Figure 2
Figuur 2: Agrobacteriumkolonies geteeld op LB-plaat met kanamycine. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Verschijning van media tijdens de groei en verwerking van Agrobacterium. (A) Het verschijnen van LB-media onmiddellijk na inenting van geïsoleerde Agrobacteriumkolonie. (B) De aanwezigheid van media na nachtelijke incubatie van een geïsoleerde kolonie bij 30°C. (C) Het verschijnen van media nadat culturen gedurende 20 minuten worden gesponnen bij 4.500 x g. (D) Pellet die in de infiltratiebuffer wordt geresususpended. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Proces van infiltratie van N. benthamiana planten. (A-B) Iets porren van het blad resulteert in een subtiel gat aan de bovenkant van het blad. (C-D) Injectie van Agrobacterium suspensie in blad. (E) Geïnfiltreerd plantblad vanaf het bovenste zicht. (F) Plant met meerdere bladeren geïnfiltreerd vanuit de bovenste weergave. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Visualisatie van bladeren met asGFP-IgG fusie en GFP-IgG fusie beginnen op dag 1 na infiltratie (dpi) in de eerste rij, in de aanloop naar dag 5 dpi in de laatste rij voor alle omstandigheden. A) asGFP-IgG fusie onder wit licht. B) asGFP-IgG fusie onder lange golf UV. C) GFP-IgG fusie onder wit licht. D) GFP-IgG fusie onder lange golf UV. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Supernatant van het asGFP-IgG-extract dat wordt toegevoegd aan de kolom Protein G. A) Toevoeging onder wit licht. B) Toevoeging onder korte golf UV-licht. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Eiwit G hars onder korte golf UV-licht na supernatant van de asGFP-IgG extract werd uitgevoerd door de kolom. A) Protein G hars onder korte golf UV-licht. B) Eiwit G hars bij elutie van eiwitten onder lage PH-omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Gezuiverde eluties van asGFP-IgG verkregen na blootstelling aan lage pH-omstandigheden door zuivering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: SDS-PAGINA van kolommonsters. Monsters met "R" zijn in reducerende omstandigheden, en monsters gelabeld met "NR" zijn in niet-reducerende omstandigheden. A) Onder UV-licht, alleen niet-reducerende monsters fluoresceren in de 10% polyacrylamide gel, zoals te zien in Elution 2 NR lane. De 75 kDa en 25 kDa ladderbanden fluoresceren ook. B) Coomassie kleuring van dezelfde gel onthult de aanwezigheid van alle eiwitten in het monster. In de verminderde elu ties, de IgG fusie zonder lichtketting, de zware ketting, lichte ketting, en eventueel gedegradeerde GFP zijn aanwezig op ~ 75 kDa, ~ 50 kDa, ~ 25 kDa, en ~ 10 kDa, respectievelijk. In tegenstelling, in de niet-gereduceerde elutions, een prominente band aanwezig is, in overeenstemming met de grootte van de gehele asGFP-IgG fusie (~ 200 kDa). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol kan worden gebruikt voor de visuele verificatie van alle recombinant Ab of recombinant eiwit geproduceerd in N. benthamiana planten, met inbegrip van die vereisen tijdelijke blootstelling aan zure omgevingen voor kolom zuivering doeleinden42,43,44. Bovendien kan de fusie van asGFP naar andere eiwitten in verschillende expressiesystemen een nuttig hulpmiddel zijn voor experimentele visualisatie en onderwijs. Het protocol hierin kan verder worden geschaald naar grotere en kleinere hoeveelheden bladmateriaal om de gewenste hoeveelheid recombinant eiwit te produceren. De beschreven methoden maken gebruik van eerdere studies die versies van GFP hebben geïdentificeerd en gemaakt die stabiel blijven onder zure omstandigheden46. Uitgebreide eerdere studies hebben gemaakt immunoglobuline domeinen versmolten tot een eiwit van belang, vaak genoemd IgG-fusies, die dit protocol kan ook geschikt voor28. Door het creëren en uitdrukken van een IgG-fusie bestaande uit een gehumaniseerde IgG1 gefuseerd tot een GFP en asGFP, waren we in staat om de aanwezigheid van het gewenste eiwit te visualiseren tijdens de expressie, extractie en zuiveringsprocessen.

Als een ervaren onderzoeker dit protocol volgt, zullen bladeren beginnen met het vertonen van necrosetekens op de infiltratielocaties tussen dagen 4-5. Echter, bij het gebruik van de beschreven vectoren, geïnfiltreerd gebieden van bladeren moet gezond lijken tot dag 5 met de juiste zorg. Het is belangrijk op te merken dat Agrobacterium-infectie op zichzelf uiteindelijk zal resulteren in necrose van de plantenbladeren als gevolg van de accumulatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) als onderdeel van de immuunrespons van de plantencel51,52. Deze immuunrespons en het daaruit voortvloeiende niveau van necrose kunnen variëren op basis van verschillende factoren51, waaronder de cellulaire targeting, de locatie van het eiwit, het type eiwit dat wordt geproduceerd, de expressievector en de stam agrobacterie die53,54wordt gebruikt . Ook variaties in de optische dichtheid (OD600) van de Agrobacterium die worden gebruikt voor infiltratie kunnen de niveaus van necrose55beïnvloeden. Veel expressievectoren maken gebruik van eiwitten die retinoblastoomeiwit binden om de plantencellen in de synthese (S)-fase te houden en celdeling en transformatiefrequentie56,57te verhogen . Verhogingen van de eiwitproductie, zoals die veroorzaakt door binding aan retinoblastoom eiwit, kan leiden tot necrose56,57. De vooruitgang in vectorontwerp, zoals die gebruikt in gewijzigde versies van geminivirus BeYDV replicons die in dit protocol worden gebruikt, hebben necrose geminimaliseerd met behoud van hoog eiwituitdrukkingsniveaus58. Ook BeYDV replicons zijn niet-concurrerend, het verstrekken van expressie van meerdere eiwitten op een enkele cassette zonder bekende grootte beperkingen53,59.

Verschillende factoren beïnvloeden de groei van planten voor en na infiltratie, wat uiteindelijk kan leiden tot een lage eiwitopbrengst. Bij het zaaien van planten, te veel zaden per plant pellet kan resulteren in veel kleine plantenspruiten leidt tot meer bescheiden plantengroei. Vandaar, het verminderen van het zaadnummer per turfpellet en het verwijderen van de extra spruiten na een week zal resulteren in een betere plantengroei. Het handhaven van een goede bodemvocht is een andere factor die de algehele gezondheid van planten beïnvloedt. Overbewatering, onder water, het toevoegen van te veel of te weinig kunstmest kan bijdragen aan chlorose en de fytosanitaire gezondheidbeïnvloeden 60,61,62. Necrose en chlorose kunnen bovendien worden veroorzaakt door de productie van een eiwit dat celstress veroorzaakt. Dit fenomeen is vele malen gezien met de expressie van recombinant immuuncomplexen (RIC)56. We hebben geconstateerd dat veranderingen in de eiwitstructuur en fusie van eiwitten kunnen helpen necrose te minimaliseren; sommige eiwitten kunnen echter giftig blijven voor planten, zelfs na verschillende modificaties. Bij gebruik van de hierin beschreven expressievectoren kan de extractie van eiwitten vroeg en vóór het begin van significante necrose worden uitgevoerd, wat resulteert in een hoge eiwitopbrengstvan 56.

Verschillende groeiomstandigheden kunnen de groei van Agrobacterium vertragen of zelfs remmen. Agrobacterium groeit optimaal bij 28 °C-30 °C en ervaart een hitteschok wanneer het boven de 30 °C wordt geïncubeerd, waardoor celdelingsfoutenontstaan 62. De groei kan ook worden belemmerd door de toevoeging van te veel rifampicine, omdat verschillende Agrobacteriumstammen min of meer van nature resistent zijn tegen dit antibioticum62. De bacteriële cultuur bereid voor infiltratie met aanzienlijk hogere OD600 dan aanbevolen zal waarschijnlijk leiden tot necrose55. Een iets hogere OD600 van de cultuur heeft meestal geen invloed op de opbrengst, maar als deze lager is dan 0,1, kan de eiwitopbrengst aanzienlijk worden verminderd. Accumulatie van dode cellen kan onder twee omstandigheden voorkomen; 1) de cultuur was overwoekerd, wat leidt tot een aanzienlijk deel van de OD wordt dode cellen, en 2) het beschadigen / doden van de Agrobacterium na de groei, zoals met chemische residu of hoge centrifuge snelheden. Infiltraties met behulp van een verhoogd aantal dode cellen in de cultuur zou kunnen verminderen eiwitexpressie. Bovendien kan het doorboren van de bladeren door het toepassen van te veel druk de bladeren beschadigen en dus leiden tot vroegtijdige necrose. Gezien deze mogelijke factoren bij het uitdrukken van recombinante eiwitten in Nicotiana benthamiana,kan leiden tot een verbeterde eiwitproductie.

Het verkrijgen van een lage eiwitopbrengst kan te wijten zijn aan een aantal problemen in de extractie- en zuiveringsstappen. Ten eerste kan de extractiebuffer optimalisatie nodig hebben, afhankelijk van het eiwit van belang. Tijdens het mengen moet plantaardig zijn zonder zichtbare bladstukken. Vervolgens vereisen sommige eiwitten wasmiddelen voor oplosmogelijkheden in de extractiebuffer, zoals Tween-20 of Triton. Andere eiwitten kunnen ureum bij hoge concentraties ~ 7.5 M voor oplosinrichting nodig hebben, terwijl wat met PBS slechts kunnen worden geëxtraheerd. Afbraak van eiwitten kan optreden als buffers, plantaardig weefsel, centrifuges, enz. Gebrek aan proteaseremmers en natriumascorbaat of soortgelijke chemicaliën in de extractiebuffer kan ook degradatie of aggregatie veroorzaken. Sommige protease remmers zoals PMSF degraderen snel, en natrium ascorbaat duurt enige tijd om waterig te worden. Over het algemeen moeten onderzoekers optimale omstandigheden bepalen voor hun eiwit van belang.

De zuivering van IgG-fusies omvat enkele stappen die mogelijk wijzigingen nodig hebben als een lage eiwitopbrengst wordt verkregen. Het analyseren van de steekproef aliquots verzameld tijdens het gehele proces door SDS-PAGE en Western zal helpen om de fout van de methoden te identificeren. Als de flowthrough bijvoorbeeld een aanzienlijke hoeveelheid eiwit bevat, kan de binding van het eiwit worden vergemakkelijkt door de pH van de buffer te veranderen. Het gebruik van hoge concentraties detergenten tijdens het extractieproces kan de bindingseigenschap van de hars beïnvloeden, vooral als de hars meerdere keren wordt hergebruikt. Een goede opslag van de hars, zoals beschreven in de methoden, is van vitaal belang voor de levensduur van de hars. Bovendien, als de wasstap het eiwit van belang uit de hars verwijdert, moeten de buffers mogelijk opnieuw worden gemaakt om dit probleem op te lossen. Andere problemen met eiwitzuivering kunnen te wijten zijn aan verkeerd gevouwen of gedegradeerde eiwitten, die verdere analyse van het algehele eiwitontwerp vereisen. Het verwijzen naar de beschreven probleemoplossing kan de efficiëntie van de zuivering met behulp van dit protocol verhogen.

De beschreven GFP-IgG fusie zuivering is nuttig in een onderwijsomgeving. Visualisatie is fundamenteel voor het wetenschappelijk onderwijs, omdat het leerlingen in staat stelt om concepten gemakkelijker te begrijpen39. Studenten melden vaak misverstanden naast moeite met het begrijpen van concepten op moleculair niveau39. In het bijzonder kunnen de experimenten die inzicht vereisen in de specifieke eiwitlocatie bij elke stap worden gewijzigd door het labelen van eiwit van belang met fluorescerende moleculen. Daarom kan GFP of asGFP, afhankelijk van de gebruikte pH-omgeving, worden gebruikt om hun fluorescentie te benutten om opheldering van de eiwitzuiveringstechniek voor studenten te vergemakkelijken.

Samengevat beschrijven we een eenvoudige methode voor expressie en zuivering van een recombinant Ab gefuseerd tot een GFP in N. benthamiana planten. Dit protocol kan worden gebruikt voor de zuivering van een Ab gefuseerd tot elk gewenst doeleiwit. Het proces kan worden bewerkt om verschillende hoeveelheden bladmateriaal aan te passen en maakt het mogelijk om de aanwezigheid van eiwitten visueel te kunnen bepalen vóór, tijdens en na de sluiting van het eiwitextractie- en zuiveringsproces. Deze methoden kunnen nuttig zijn als controles en kunnen worden gebruikt voor het onderwijzen van technieken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken Maria Pia DiPalma voor het bewerken van de video. We danken ook het Office of Educational Outreach and Student Services aan de Arizona State University voor hun genereuze publicatie vergoeding bijstand. Onderzoek voor dit protocol werd ondersteund door de School of Life Sciences, Arizona State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81 (2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Tags

Biologie antilichaam monoklonale antilichaam moleculaire farming agro-infiltratie voorbijgaande expressie Nicotiana benthamiana,groen fluorescerend eiwit zuur-stabiel groen fluorescerend eiwit antilichaamfusie IgG-fusie eiwit G-zuivering
Productie van IgG Fusion Proteins transiently uitgedrukt in <em>Nicotiana benthamiana</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P.,… More

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter