Summary
ここでは、 ニコティアナベンタミアナでGFPに融合した組換えヒトIgGの発現、抽出、精製のための簡単な方法について説明します。このプロトコルはカラムクロマトグラフィーを利用する多数のタンパク質の精製および可視化に拡張することができる。さらに、このプロトコルは対人および仮想大学の教育研究所に適応可能であり、プロジェクトベースの探査を提供する。
Abstract
様々な感染性、代謝、自己免疫、新生物、および他の疾患の治療介入として抗体の需要が高く、組換え抗体産生のための効率的な方法を開発する必要性が高まっています。2019年現在、FDA承認モノクローナル抗体は70種類を超えており、指数関数的な成長の可能性があります。彼らの約束にもかかわらず、広範囲にわたる使用のための制限要因は、製造コストと複雑さです。潜在的に、植物は低コストで安全で、容易に拡張可能なタンパク質製造戦略を提供します。 ニコティアナベンタミアナ のような植物は、複雑な哺乳類タンパク質を正しく折りたたんで組み立てることができるだけでなく、哺乳類の細胞培養物と同様の重要な翻訳後修飾を追加することができます。本研究では、ヒトモノクローナル抗体に融合した天然GFPと酸性安定型の緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いることで 、N.ベンタミアナ 植物からの一過性抗体の発現および精製プロセス全体を可視化することができた。実験の目的に応じて、ネイティブGFP融合は植物の発現段階での可視化を容易にし、酸安定性のGFP融合は下流処理中の視覚化を可能にする。このスケーラブルで簡単な手順は、わずか数個の小さな植物を使用して数日のうちに非常に純粋な抗体または抗体融合タンパク質のミリグラム量を生成するために、単一の研究者によって行うことができます。このような技術は、植物および他の発現系の両方で、あらゆる種類の抗体精製プロセスおよび潜在的に他の多くのタンパク質の可視化に拡張することができる。さらに、これらの技術は、仮想命令に利益をもたらし、分子生物学技術の経験を最小限に抑えた学部生によって教育研究室で実行され、実際のアプリケーションでプロジェクトベースの探査の基盤を提供します。
Introduction
業界の報告によると、米国で最も高く評価されている20種類の医薬品のうち13種類が生物学的製剤(タンパク質ベースの医薬品)であり、そのうち9薬が抗体であった。2019年時点で、様々な臨床開発段階で570以上の抗体(Ab)治療薬が1、2、3であった。現在の世界のAbの売上高は1,000億米ドルを超え、モノクローナルAb(mAb)治療市場は2025年1、4.4年までに最大3,000億米ドルを生み出す見込みです。このような高い需要と収益の増加が見込まれる中、研究者は、より高品質で低コストで、これまで以上に大きな規模でAb治療薬を生産する方法の開発に取り組んできました。植物ベースの発現系は、Ab治療薬5,6の手頃な価格で大規模な製造のための伝統的な哺乳類細胞株に対していくつかの利点がある。植物におけるタンパク質治療の生産(「分子ファーミング」)は、伝統的な哺乳類細胞培養技術7,8のように高価なバイオリアクターまたは細胞培養施設を必要としない。植物は人間の病原体を収縮させることはできず、潜在的な汚染を最小限に抑える9.一過性およびトランスジェニック植物ベースのタンパク質発現はいずれも、哺乳動物または細菌産生系10に対する低コストの代替として利用することができる。トランスジェニック植物は作物の生産に好ましいが、この方法を用いた組換えタンパク質の生産には数週間から数カ月が必要となる。シリンジまたは真空アグロインフィルを介したウイルスベクターを用いた過渡発現の進歩により、それぞれ、11日目、12日、13日、14日目に所望のタンパク質の小規模および大規模な産生が可能になる。エボラ出血熱に対するmAbsの産生は、デング熱および、ジカ、および他の多くの組換えタンパク質が、N.ベンタミアナ植物15、16、17、18、19において一過性発現を用いて迅速かつ効率的に産生および精製された。これらの状況は、一過性植物ベースの発現を複数のAb治療薬を開発するための魅力的な選択肢と、このプロトコル20で示された方法を作る。
第1世代mAbsはマウス誘導であり、ヒト試験21で使用すると非特異的な免疫原性をもたらした。時間が経つにつれて、キメラ、ヒト化、そして最終的には、アブ療法によって誘発される免疫原性を低下させるために完全にヒト腹筋が産生された。残念ながら、これらの腹筋のいくつかは、グリコシル化21の違いのために宿主免疫原性を引き起こす。植物工学の発展は、Abの安定性と機能がそのグリコシル化状態22によって著しく影響を受ける可能性があるため不可欠であるAbグリカンの修飾を可能にした。進歩により、ヒト化mAbsの高レベル発現の植物系での生産が可能となり、ヒトグリカンを含み、結果的に大量生産されたヒト医薬19,21の所望の生物学的形質を含む。
組み換えAbsに加えて、Ab融合分子(Ab融合)は、ここ数十年で様々な目的のために探求されてきた。Ab融合は、しばしば分子またはタンパク質に融合したAbまたはAb断片から構成され、免疫エフェクター細胞23からの応答を引き出すために設計されている。これらの分子は、癌や自己免疫疾患24、25、26、27などの様々な病理を治療するための潜在的な治療介入として作成されています。組換え免疫複合体(IC)は、ワクチン候補28として採用されているAb融合の別のクラスである。ICは、Ab融合のFc領域を認識する免疫系の能力を利用し、他のワクチンプラットフォーム29、30、31と組み合わせると免疫原性を改善することが分かった。
緑色蛍光タンパク質(GFP)はクラゲエーコレアビクトリアに由来する生物発光タンパク質であり、紫外線32、33で励起すると緑色の光を発する。長年にわたり、GFPの遺伝子発現の視覚マーカーとしての使用は、大腸菌の発現から、N.ベンタミアナ植物34、35、36、37、38を含む多数のタンパク質発現系へと拡大してきた。GFPのような目に見えるマーカーは、科学的概念の教えと学習に豊富な意味を持っています。多くのエントリーレベルの学生は、分子生物学の概念や関連分野39など、教えられている考えが肉眼では見えない場合に科学的概念を把握することの難しさを説明する。GFPのような視覚マーカーは、科学的プロセスに関連する情報の処理に貢献することができ、学生が多くの科学的概念を学ぶ上で報告する困難を軽減するのに役立ちます。
GFPは生体内で遺伝子や発現を示すマーカーとしてよく用いられますが、酸性条件を使用する場合は下流工程で可視化することは困難です。この状況は主に、GFPが低pH40でその構造および結果蛍光を維持しないためである。一時的な酸性環境は、タンパク質G、プロテインA、およびプロテインLクロマトグラフィーなどの様々な精製プロセスにおいてしばしば必要とされ、Ab精製41、42、43、44にしばしば利用される。GFP変異体は、酸性条件下で蛍光を保持するために用いられてきた45,46.
ここで 、N.ベンタミアナ 植物における組換えIgG融合タンパク質の発現、抽出、精製のための簡単な方法について述べている。ヒト化IgG重鎖のN末流に融合した伝統的なGFPを製造し、GFP-IgG融合を生み出しました。同時に、酸安定性GFP(asGFP)の植物コドン最適化配列をヒト化IgG重鎖のN末流に融合させ、asGFP-IgG融合を生み出しました。GFP-IgGを製造する利点は、発現中に標的タンパク質の存在を可視化する能力を含むが、asGFP-IgGは、発現および抽出ステップだけでなく、タンパク質の精製ステップにおいても組換えタンパク質の存在を見ることができる。このプロトコルは 、N.ベンタミナ で産生されるGFP融合タンパク質の生産、精製、可視化に適応し、低pHを必要とするクロマトグラフィー技術を使用して精製することができます。プロセスはまた葉材料の様々な量に合わせることができる。GFPまたはasGFPでタグ付けされた腹筋および融合タンパク質は、治療に使用することを意図していませんが、これらの方法は実験中のコントロールとして有用であり、また、分子細胞生物学とバイオテクノロジーの教育ツールとしても、対人的にも仮想的にも利用することができます。
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Protocol
1. N.ベンタミアナ植物の 栽培
- トレイに土壌泥炭ペレットを置き、完全に膨張するために泥炭ペレットの上に熱い(〜40〜45°C)、以前に沸騰した水を注ぎます。ペレットを完全に拡張した後、ピンセットを使用して各泥炭ペレットに2-3 N.ベンタミアナ 種子を置きます。
- トレイの底を覆うために約0.5を水に注ぎます。トレイにシード日を付けます。適切な量の肥料で毎日苗に水を与え続けます。肥料(水溶性万能植物食品)濃度は、一般的に2.5〜2.8 g/Lです。
- 成長室に置かれたときにフミドームの上で皿を覆う。16時間の光周期と60%の相対湿度で、成長チャンバー内の播種泥のペレットを23〜25°Cに保ちます。
- 1週間後、1つの苗だけで各ペレットを残して余分な植物を取り除きます。
- 植物が2〜3週齢の場合は、各泥炭ペレットを水分制御土壌を含む個々のポットに移します。このデモンストレーションでは、ミラクルグロ水分制御ポッティング土壌を使用しました。
- 1 g/L 肥料で毎日水。土壌を完全に乾燥させたままにしないでください。植物は、5〜6週齢のときに浸潤の準備ができています。
2. 浸潤用アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの調製
注: GFP-IgG融合構造は、本論文31に記載されているように得ることができます。asGFP遺伝子を取得し、本研究45から植物最適化した。次の手順は、ブンゼンバーナーの隣に行う必要があり、基本的な無菌技術は、汚染を避けるために適用する必要があります。
- ストリーク A.ツメファシエンス EHA105は、LB寒天(10g/Lトリプトン、10g/L NaCl、5g/Lアガー、50g/Lアガー、50g/Lアガー、50グラム/カンク)のグリセロールストックから各コンストラクト(asGFP-IgG、GFP-IgG、軽鎖)に対する各構造 (asGFP-IgG、GFP-IgG、軽鎖)に対する植物発現ベクターを含む。
- 30°Cの立っているインキュベーターで1日成長させる。標準コロニースクリーンPCRプロトコルによる検証のために単一コロニーを分離します。
- 各構成体に検証済みコロニーを使用します。10 mLのLB培地(10 g/Lトリプトン、10 g/L NaCl、酵母エキス5g、50 μg/mL)を充填します。次に、100 μg/mL カナマイシンを10 μL加えます。大 腸菌 の汚染を防ぐために、2.5 μg/mL リフィンピシンを10 μL加えます。30°C、120~150rpmで一晩インキュベートします。
- 翌日、 アグロバクテリウム 培養物がOD600=0.6-0.9 に成長した場合、浸潤に用いることができる。それが生い茂っている場合(OD600 > 1)、1-2 mLは抗生物質で新鮮なLBに移され、必要なOD600に成長する必要があります。初期培養の濃度によっては、OD600 = 0.6-0.9に成長するのに2日かかる可能性があります。
- 適切なOD600に入ると、培養物を遠心分離機に入れ、20分間4,500xg、室温(RT)で遠心分離して細菌をペレット化する。
- 両方のサンプルからデカント上清を、次いで、各ペレットを1x浸潤バッファー(10 mM 2-(N-モルフォリノ)エタンレスルホン酸、10mM硫酸マグネシウム、PH 5.5に調整して最終的なOD600=0.4 を得る。これは、初期培養密度に応じて、浸潤バッファーの約15〜45 mLを取る必要があります。各IgG融合構造の等量を軽鎖構造と組み合わせて、各チューブの構築ごとに最終的なOD600 = 0.2を得ます。
3. 針なし注射器アグロインフィル
- ステップ1からまっすぐにしたペーパークリップと5-6週齢の N.ベンタミアナ 植物を取ります。クリップの鋭いエッジを使用して、大角面の葉の最初の表皮層に小さな穿刺を行います。ずっとそれを穿刺することは避けてください。
注:下の葉は浸潤が容易ですが、植物の上部の葉は難しいです。一般的に、組換えタンパク質の発現は植物の真ん中に位置する葉の中で最も高く、これらの葉も壊死性が低くなります。 - 1 mL シリンジを、針を取り付けずに、ステップ 2 から調製した アグロバクテリウム 溶液を充填する。前のステップで作られた穴をシリンジの端で覆い、葉の後ろから穏やかなカウンタープレッシャーを加えながらゆっくりと葉に細菌を注入するために押します。注射器にあまり圧力をかけることなく溶液を注入するので、葉が暗くなります。
- 最大3〜4倍の葉領域に浸潤してみてください - 過度の葉の損傷は、タンパク質の収率を妨げる可能性があります。浸潤した植物の葉は、下のビューからほとんど暗く表示されます。
注:この細菌溶液は、構成体ごとに少なくとも3〜4の植物のために十分である必要があります。廃棄する前に残りの細菌溶液をオートクレーブする。
4. 浸透したN.ベンタミアナを成長させ、観察する
- 浸潤した植物を成長室に戻し、毎日水を続けます。
- 浸潤した領域でクロロ症と壊死のための葉を観察します。長い短波 UV ランプの下で GFP 蛍光の植物を観察 (GFP が存在する場合) 。
- 4-5日目は、葉の両方のGFP構成体の中で最も高い蛍光を示す。4-5 dpi(浸潤後の日)ですべての葉を収穫し、総葉材料を計量します。
- 下流加工にすぐに使用するか、使用できる状態になるまで-80°Cで保管してください。
5. タンパク質抽出
- バッファーとブレンダーカップを氷の上または4 °Cで保管してから使用してください。
- 2-3 mLの氷冷抽出バッファー(100 mM Tris-HCl、50 mM NaCl、2 mM EDTA、PH 8、HCl)を植物材料1 gあたり準備します。抽出直前に、ストック(100mM)から2mMのフェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)と50mMアスコルビン酸ナトリウムを抽出バッファーに加えます。
- ステップ4から植物組織をプレチルブレンダーカップに入れる。測定量のチルド抽出バッファーをブレンダー カップに追加します(ステップ 5.2 で示すように)。ブレンダーカップをブレンダーの上に置きます。パラフィルムのプレカットシートを取り、ブレンダーカップの上にそれを伸ばします。20秒間隔で均質にブレンドし、必要に応じてブレンドサイクル間でよく攪拌します。
- ブレンドされた材料をビーカーに移します。攪拌棒を加え、4°Cで30分間かき混ぜてタンパク質の溶解性を高め、固形物の沈殿を可能にします。
- 氷の上にきれいなビーカーの上にミラクロスの2層を置き、大きな葉の破片を取り除くためにそれを通して抽出物を注ぎます。すべての抽出物を注いだ後、ミラクロスを折り畳んで残りの葉エキスを絞ります。抽出は、目に見える微粒子なしで濃い緑色に表示されるはずです。
- このサンプルの50 μLを新しい1.5 mLチューブに移し、後で分析するために「トータル抽出物」とラベルを付けます。抽出物を遠心管に移します。植物エキスの残りの部分を20分間、4°Cで16,000xgで遠心分離し、上清を円錐管に移します。
- 50 mL のシリンジとシリンジガラス繊維フィルター(0.75 μm)を使用して、可溶性抽出物をフィルター処理します。
- 遠心分離後に50μLのサンプルを採取し、後で分析するために「可溶性抽出物」をラベル付けします。
6. プロテインGカラムクロマトグラフィー法
注: ここで説明するプロトコルは、ピアースプロテインGアガロース樹脂を使用した重力流クロマトグラフィー用です。別の樹脂を使用する場合は、製造元の説明書を参照してください。樹脂を乾燥させ、すべての液体が排出されるのを防ぎます。必要に応じて、コンセントを元に変更します。
- 20 mLのサンプルを保持するポリプロピレンカラムを設置します。
- ターゲット免疫グロブリンの種類と樹脂に対する親和性に応じて必要なスラリーの量を推定します。一般的に、1.5 mLの床容積を有する総スラリーの3mLは、Abの数ミリグラムの精製に十分である。
- キャップされたカラムに必要な量の再懸濁ススラリーを慎重に注ぎます。列の下部から列の出口を開き、バッファーの大部分がなくなるまでドレインできるようにします。
- すぐに10 mLの洗浄バッファー1x PBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO 4、1.8 mM KH2PO4、HCl付きpH 7.4)を上に注ぎます。水気を切り、この洗浄ステップ2xを繰り返します。
- ステップ5からフィルター処理されたサンプルをカラムに適用し、フロースルー-アリコート50 μLのフロースルーを収集して、後で分析します。Abが樹脂に結合しなかった場合に備えて、フロースルーの残りの部分を保存します。
注: フロースルーを新しい列に再適用しても、通常は良好な歩留まりにはなりません。したがって、新しい葉材料で始めることをお勧めします。 - 樹脂を10mLの1x PBSで2回洗浄し、非特異的結合を低減します。必要に応じて、アリコート50 μLの洗浄は、バッファーがカラムを通ってドレインし、ターゲットAbが洗浄バッファで溶出していないことを確認する。
- pH 8で125 μLの無菌1 M Tris-HClを備えた5本のチューブを設置し、ラベルを付けます。これは、潜在的な構造変化を避けるために酸性溶出バッファー内の腹筋を中和することです。または、2 M Tris ベースの 30 μL を加えると、希釈量が少なくなります。
注意: 溶出中に、UV ライトをビジュアライゼーションに使用できます。これは溶出の間行われる必要はない。UV を使用している場合は、目や皮膚への損傷を避けるために適切な PPE を着用してください。UV ライトは溶出工程で使用する必要はありません。 - 5 mLの溶出バッファー(100 mM グリシン、HCl を使用した pH 2.5)をカラムに塗布し、前のステップから各指定チューブに 1 mL 分を集めて Abs をエルプルします。
- 20 mLの洗浄バッファーを塗布し、続いて10 mLの洗浄バッファーを塗布してカラムを直ちに再生します。樹脂が酸性環境に長期間放置されていないことを確認します。溶出は蛍光を現す必要があり、しばしば最も高い蛍光は第2溶出で見られるが、抽出から抽出まで変化する可能性がある。
- 保管のために、PBSで20%エタノールの10 mLで樹脂を洗浄し、中途半端に排水させます。上部を要約し、次に列の底を要約し、4 °Cで直立してください。
注:一般的に、プロテインG樹脂は、効率を大幅に低下させることなく10回まで再利用することができます。詳細については、製造元のガイドラインを参照してください。 - 分光光度計を用いて、280nmで吸光度を測定し、溶出バッファーをブランクとして用いてAb濃度を決定する。溶出液を-80°Cに保存し、各分画の50μLを別のチューブに保存して、さらなる分析を行います。
7. GFP-Ig融合検出のためのSDS-ページ
- SDS-PAGE を設定する前に、すべてのサンプルを準備してください。
- サンプルバッファーの 4 μL を追加します (6x 還元サンプル バッファー: 3.0 mL のグリセロール, 0.93 g の DTT, 1 g の SDS, 7 mL 4x トリス (pH 6.8) 0.5 M, 1.2 mgのブロモフェノールブルー);(6x非還元サンプルバッファー:グリセロール3.0 mL、SDSの1g、4xトリスの7 mL(pH 6.8)0.5M、1.2mgのブロモフェノールブルー)から各サンプルの20μL(全抽出物、可溶性抽出物、フロースルー、洗浄、全溶離画)を分析する。チューブキャップがしっかりと固定されていることを確認します。
- 沸騰した水浴で5分間だけサンプルを減らすのを扱い、氷の上に5分間サンプルを入れます。サンプルをマイクロ遠心分離機で~5秒回転し、各サンプルの20 μLをゲルウェルに集める順序でロードします。デュアルカラータンパク質ラダーの3 μLを別のウェルにロードします。
- SDS-PAGEゲルを一定の100 Vで実行し、目的のタンパク質バンド分離を行います。所要時間は約1.5時間です。タンパク質分離の指標としてはしごを監視します。
- UVの下でゲルを可視化し、GFP蛍光を観察します。
- 必要に応じて、クーマシー染色でゲルを染色し、各サンプル中の全タンパク質を評価する。あるいは、ウェスタンブロットを実行して、特定のAbsを用いて標的タンパク質を評価する。
注:クーマシー染色とウェスタンブロットの両方は、標準プロトコル47、48に従うことによって行うことができます。
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Representative Results
本研究は、組み換えタンパク質を作製し、下流プロセス全体にわたってそれらを可視化する簡単かつ迅速な方法を実証しています。N.ベンタミアナを用いて、規定されたプロトコルに従って、ここで説明する組換えタンパク質の産生は1週間以内に達成できる。植物の発現、抽出、精製の全体的なワークフローを図1に示します。2週齢の苗、4週齢の植物、および6週齢の植物からの植物の成長の段階は、それぞれ図1A(1-3)に示され、図1Bは壊死による葉形態学的変化を示している(図1B-1)またはクロロシス(図1B-2)。壊死は、浸潤後3〜5日目の注射部位で起こり得る。これらの変化は、多くの場合、タンパク質の発現特性と浸潤植物の健康に依存する(さらに議論で調べる)。同時に、クロロシスは、使用されている植物の健康に頼ることもできます(さらに議論で調べられます)。アグロバクテリウムの成長と浸潤の準備のプロセスを図1Cに示す。図 1C-1は、アグロバクテリウムの孤立したコロニーを示しています。図1C(2-5)は、単一の孤立したコロニーを接種した後のメディアの予想される外観を示す。これらの手順の詳細については、図 3を参照してください。植物の浸潤プロセスは図1Dに示され、浸潤していない植物から始まり、浸潤プロセスが続きます。植物タンパク質の発現、抽出、および明確化を図1Eに示す。葉材料はブレンダーに入れられ、図1E(1-3)に示すように均質化される。次に、総ホモジュネートを表すサンプルを採取する。その後、ミラクロス(ガーゼやコーヒーフィルターでさえ、経費の削減に代わる)を通して濾過され、明確化された懸濁液は遠心分離されます。遠心分離は図1E (4-6)に示すように、残りの材料から上清の分離を可能にする。次いで、明確化した上清をプロテインGアフィニティークロマトグラフィーカラム、図1F(1-3)にロードする。ほとんどのタンパク質が結合した後、図1F-4は、タンパク質が樹脂図1F(5,6)から溶出される。
表1 は、pBYでasGFP45( 上段)を生成するために使用される植物最適化核酸配列を示しています!本研究で使用したKEAM-GFPasHベクターは、GFP-IgG融合を発現するために本研究で使用されるPBYEAM-GFPHgpベクターにおいてGFP-IgG融合とGFP33( 下列)を発現するために用いられた。核酸配列をExpasyタンパク質翻訳ツール(https://web.expasy.org/translate/)を用いて調べ、アミノ酸配列を決定した。
このプロトコルを使用して調製された代表的 なアグロバクテリウム プレートを 図2に示します。望ましいコロニーは、形と色で丸く均一に表示する必要があります。プレートの中心に近いコロニーは、カナマイシン耐性を発現する可能性が高い。液体培養物は単一の孤立したコロニーから調製される。
カルチャを含むメディアの予想される外観を 図 3に示します。孤立したコロニーの最初の接種時に 、LB培地は、図3Aに示すように、薄い黄色と半透明に見えます。30°Cで一晩単離されたコロニーをインキュベートした後、LB培地は濁って現れます。 図 3Bに示すように、LB に拡張が存在する場合、オブジェクトはメディアを通して見ることができなくなります。遠心分離の後、ペレットは、チューブの下部に形成する必要があります。チューブは、ペレットの上にLB培地を明確に分離し、 図3Cに示すように、淡黄色と半透明に見えます。LB培地上清は、配置され、ペレットは浸潤緩衝液中に再懸濁される。OD600 の0.2では、 図3Dに示すように、メディアは濁って見えます。OD600 は、方法に記載されているように測定されるべきである。
図4 は、葉の浸潤のプロセスを表す。クリップを持つ葉のわずかなプロッドは、葉を完全に通過しない葉表皮に休憩を与える必要があります。 図 4A-Cに示すように、浸潤バッファーをリーフに注入できるように、ブレークはかろうじて葉を突き刺す必要があります。 アグロバクテリウム と浸潤バッファーの懸濁液は、葉の破断に直接注入され、浸潤した葉の色をわずかに変化させます; 図 4D-Fを参照してください。
IgG融合を表現する葉の外観を 図5に示す。これは、白色光下でGFP-IgG融合(図5A)およびGFP-IgG融合(図5C)を発現する葉を表示します。このプロトコルの構成体を使用する場合、0.2 OD600で浸潤すると、GFP-IgG融合を発現する葉とGFP-IgG融合を発現する葉の両方について、1~5日目に葉が健康に見えるはずです。5日目の注射部位にはわずかな壊死的な外観があり、通常はそれらの領域における植物組織の明るさによって明らかである。 図5 には、リーフの上面から長波UV光を使用して、それぞれGFP-IgG融合(図5B)とGFP-IgG融合(図5D)を表現するリーフが表示されています。両方の構成体の日が進行するにつれて、蛍光強度が増加する。AsGFP-IgG融合を発現する葉は、GFP-IgG融合を発現する葉よりも蛍光がわずかに少ない傾向にあります。
asGFP-IgG抽出物の上清をプロテインGカラムに添加すると、植物クロロフィル顔料による白色光下の樹脂はわずかに緑色になる(図6A)。短波UV光下に上澄を添加すると、 図6Bに示すようにプロテインG樹脂中の蛍光の蓄積が生じる。なお、上清はUV光下単独でも蛍光となります。それでも、asGFP-IgG融合が樹脂に結合し始めると、蛍光ははるかに濃縮されると予想されます。
プロテインG樹脂を介してasGFP-IgGの上清が通過した後、 図7Aに示すように、樹脂は短波UV光下で点灯する必要があります。この時点で、IgGのほとんどは樹脂に結合されます。溶出バッファーを追加すると、プロテイン G 樹脂に含まれる蛍光は、短波 UV 光下で見ることができ、低 pH の溶出バッファーが樹脂を通過するにつれて強度が失われ始めます。蛍光は溶出に蓄積し始めます(図7B)。蛍光分数は蛍光で変化する。 図8に示すように、蛍光は第1溶出で最も低い強度であり、第2および第3の溶出において最も高い強度である。蛍光はタンパク質の発現、収穫された葉材料、および実験で使用されるその他の条件に依存するので、結果は異なる場合があります。
精製プロセスを終了した後、サンプルを還元条件下で10%SDS-PAGEゲルで分析し(サンプルバッファーにはDTTが含まれ、サンプルは5分間沸騰した)、非還元条件(サンプルバッファーにはDTTが含まれおらず、サンプルは沸騰しなかった)図9Aに示すように、溶出2 NRレーンのような非還元サンプルのみが、短波UV光に曝露されると蛍光を発する。このレーンの最初のバンドは、フル製品の予想サイズ〜200kDaで蛍光を発し、asGFPがまだ立体的に正しいことを示しています。ゲルの底部付近の蛍光バンドは、還元バッファーからの染料です。asGFP は、95 °C 以上の温度に 5 分間曝露すると蛍光を失う点に注意してください。これは、同じ条件で蛍光を維持するeGFP(強化GFP)とは異なります49,50.はしごの2つのバンド、75 kDaと25 kDaも蛍光を発します。図9Bは、図9Aにおける同じゲルのクマシー染色を表す。車線6~9の溶出は、減らされた条件下で調製されている。ゲルとクマシー染色で実行すると、これらのサンプルはasGFP-IgG融合成分を別々に表示する必要があります。これらの成分は、GFP(〜75kDa)に融合した重鎖、重鎖単独(50kDa)、軽鎖(25kDa)、およびasGFP自体(27kDa)を含む。非還元サンプルは、比較目的のためにゲルの最後のレーンに含まれ、asGFPとそれぞれの軽鎖に融合した2つの重鎖で構成されるべき単一の大きなバンド(〜200 kDa)を表示する必要があります。さらに、より小さなバンドは、ネイティブプロテアーゼによって引き起こされる可能性が高い。この切断は、プロテアーゼ阻害剤を添加することで、またカラム精製を行う場合を含め、常にタンパク質抽出物を冷たく保つことによって防止することができる。IgG融合タンパク質の個々の成分は、クーマシーゲル上の非還元サンプルでは区別できません。
図1:植物の発現、抽出、精製プロセスのワークフローこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 使用されるヌクレオチド配列 | アミノ酸 | ||
| シーケンス に使用 での asGFP pBY!キーム -GFPasH ベクトル で使用 式 の アスグフ-イググ 融合 |
アッグクトクトカガグクトガクテクトクトガクツクト カグタクトアアックガクトガートガガッカ アッガガガーグッタッタグッタッグトッガガグッタクッタカッテクツ アトッチョガガタットカッテクカッテクタットタクトクトクタッカークガサック TTGCCTGTクトッタタグクトクトタック GTTTCACATGTTTGCCCクトクトガッグガクトカクトカクト カターガートクトカガアクティットガ ガッガッガガガガグCGグクトタクチャクカッカカッチャガクタクト CCTTGAGGACGGTTGTTACTTCCAACTTTGACGCTT CTGGATTCGACCCCCCCCCGAGGAGCCACTATATGACTAAGTTTTCGT カーアカチャクトゥカッカガッカガグクトカチャッカガッカッカ アトッタッタACTクトコッチャッガ CGGAACTATGCGCGCGCCCCCCCCA GTTGGCGGCAAAGTクトチャクトカGCCTAアグクトクチャクト アクトカガットカトカガガアッカッチャッカガッカガガグ アカカトクトガグクト グカッガッガグッタターカーガ |
ムシクギアスグラフ クイットスキエルンエイ ングククフクバゲグFTP スグルフンハイト グマムズフビアス クフフファ・ハイプディ スフケフプペグシトル DRTLRMEGGTLTT ヘイスレドGCVTSK トトルナスグプドクアット ムツフフク イットフップンガールツテレビ イルケドグティキクト シップププグルクVTQP カーフルトキイククデップ NDTRDHIVQTELAV アグルウィグデリック K |
|
| シーケンス に使用 GFP で プビエアムフト ベクトル で使用 式 GFP-IgGの 融合 |
アクトクターカアクテクト GGTCTTCTTTCTCTCTTTTTCTGGGGGGGGGCGCG アグガークトクトカックトカックグッググクトコッテクトクッグ アッグCGGTACGGCカカガクトカグットカグクトグックコッギンググッカグ GCGAGGGCGATGACCACCGGCTCTGACCCTGAGTTCA トクトGCACCGGGGCGCCCGTGTGTGTGTGCCCGCCCCCCACCCGT ガクトクトカチャクチャクトクガクトカクチャクタク ガッカカトガガグガグカッチャクガクトクチャクGCCATGCCCG アグアクツクチャガグCGカッカクトチャガガッカックッグ カアクタカーガACCCGCGCGCGCGGTGTTCGAGGGCGCGACAC CCTGGTGAACCGCATGCGCGCATCGACTTCAAGGA ガッチャッカカトッコッッグッカガクトクトガクガカアカ カグチャカアククトクトカッタルカッチャッカガグカガアッグ カサグトガークトチャガッチチャカパガガグ アクトGCGCCTCGCCGCACCACCACCACCACCACCAGCG GCGACGGCCCCGTGCTGCTCCCGACAACCACCACCACCACCCAC CCAGTCCCCCCCCTGAGAAGACCCCACGACGATCA カトクトクトコッガガグガクトクッチコッGCCGGGACTCAC グッカトゥガッカガグクトゥタカーガ |
マンフルスルスルル グラスラスグブスク エールフトグヴヴピルフェルト GDVNGHFSVSGE ゲグダティクルルクフィ CTTGKLPVプトルフ TTFSYGVQCFSRYP DHMKQHDFFKSA ムペギヴカーティフティフ DDGNYKTRAEVKFE GDTLVNRIELKGIDF ケズニルクライン インシュンヴィマドク クニクヴンフキルニー DGSVクラディヒクカン トピッグドグPVLLPDNH イルストクサルスクドプネク ルムフタア ギス |
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表 1: asGFP および GFP の作成に使用されるシーケンス
図2:カナマイシンを含むLBプレート上で成長したアグロバクテリウムコロニー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:アグロバクテリウムの成長と処理を通してメディアの外観 .(A)単離したアグロバクテリウムコロニーの接種直後にLB培地が出現した。(B)30°Cでの単離コロニーの一晩のインキュベーション後の培地の存在(C)浸潤緩衝液中に再懸濁された4,500xg(D)ペレットで培養後の培地の出現を20分間回転させた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: ベンタミアナ 植物の浸潤の過程(A-B) 葉を少し突いて、葉の上部に微妙な穴が開きます。 (C-D) 葉に アグロバクテリウム 懸濁液を注入する。 (E) 上方から植木葉を浸透。 (F) 上の視界から複数の葉が浸透している植物。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:AsGFP-IgG融合およびGFP-IgG融合を含む葉の可視化は、最初の行の1日目の浸潤後(dpi)から始まり、すべての条件の最終行で5日目まで続きます。A) asGFP-IgG は白色光下で融合します。B)長波UV下でのasGFP-IgG融合。C)白色光下でのGFP-IgG融合。D)長波UV下でのGFP-IgG融合。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:プロテインGカラムに添加されるasGFP-IgG抽出物の上清。A) 白色光の下での追加。 B) 短波UV光下での追加。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:asGFP-IgG抽出物の上清後の短波UV光下のプロテインG樹脂をカラムを通して実行した。A) 短波UV光下のプロテインG樹脂。 B) 低PH条件下でタンパク質を溶出した場合のプロテインG樹脂。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:精製を経て低pH条件に曝した後に得られたasGFP-IgGの精製溶出。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 9: 列サンプルの SDS-PAGE 「R」で標識されたサンプルは還元条件にあり、「NR」で標識されたサンプルは非還元条件である。 A)UV 光下では、溶出2NRレーンに見られるように、10%ポリアクリルアミドゲル中の非還元サンプルのみが蛍光を発する。75 kDaと25 kDaラダーバンドも蛍光を発します。 B) 同じゲルのクマシー染色は、サンプル中のすべてのタンパク質の存在を明らかにする。還元された溶出では、軽鎖のないIgG融合、重鎖、軽鎖、及び劣化したGFPがそれぞれ〜75kDa、〜50kDa、〜25kDa、および〜10kDaに存在する。これに対して、非還元溶出では、1つの顕著なバンドが存在し、GFP-IgG融合(〜200kDa)全体の大きさと一致する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、N.ベンタミアナ植物で産生される任意の組換えAbまたは組換えタンパク質の視覚的検証に利用することができ、カラム精製目的で酸性環境への一時的な暴露を必要とするものである42、43、44。さらに、異なる発現系における他のタンパク質へのasGFPの融合は、実験的な可視化および教育のための有用なツールとなり得る。本明細書中のプロトコルは、さらに、より大きく、より少量の葉材料にスケーリングすることができ、所望の量の組換えタンパク質を生成することができる。記載された方法は、酸性条件46の下で安定したGFPのバージョンを同定し、作った以前の研究を利用する。包括的な前の研究は、目的のタンパク質に融合した免疫グロブリンドメインを作成しました, 多くの場合、IgG融合と呼ばれます, このプロトコルも28を収容することができます.GFPとasGFPに融合したヒト化IgG1からなるIgG融合を作成・表現することで、発現、抽出、精製の過程で目的のタンパク質の存在を可視化することができました。
熟練した研究者がこのプロトコルに従えば、葉は4〜5日目の間に浸潤部位で壊死徴候を表示し始める。しかしながら、記載されたベクターを用いた場合、浸潤した葉の領域は、5日目まで適切な注意を払って健康に見えるべきである。アグロバクテリウム感染自体は、植物細胞免疫応答51,52の一部として活性酸素種(ROS)の蓄積による植物葉の壊死を引き起こし得る事に注意することが重要である。この免疫応答および壊死の結果として得られるレベルは、細胞標的化、タンパク質の位置、産生されるタンパク質の種類、発現ベクター、及び53,54を用いたアグロバクテリウムの株を含む、いくつかの因子51に基づいて変化し得る。また、浸潤に用いるアグロバクテリウムの光学密度(OD600)の変動は、壊死55のレベルに影響を与える可能性がある。多くの発現ベクターは、レティノ芽腫タンパク質と結合するタンパク質を利用して、植物細胞を合成(S)相に保ち、細胞分裂および変換頻度を56,57に増加させる。レチノ芽腫蛋白質との結合によって生じるようなタンパク質産生の増加は、壊死56、57を引き起こす可能性がある。ベクター設計の進歩は、このプロトコルで使用されるジェミニウイルスBeYDVレプレコンの改変版で使用されるものなど、高タンパク質発現レベル58を維持しながら壊死を最小限に抑えた。また、BeYDVレプレコンは競合せず、既知のサイズ制限がない単一カセット上で複数のタンパク質の発現を提供する53,59。
いくつかの要因は、浸潤の前後に植物の成長に影響を与えます, 最終的に低タンパク質収量につながる可能性があります.植物を播種するとき, 植物ペレット当たりのあまりにも多くの種子は、より控えめな植物の成長につながる多くの小さな植物の芽をもたらすことができます..したがって、泥炭ペレットあたりの種子数を減らし、1週間後に余分な芽を取り除くことは、より良い植物の成長をもたらすでしょう。適切な土壌水分を維持することは、植物全体の健康に影響を与えるもう一つの要因です。過剰に、水中に、あまりにも多くのまたは少なすぎる肥料を加えることはクロロシスに寄与し、植物の健康に影響を与える可能性があります60、61、62。壊死やクロローシスは、細胞ストレスを引き起こすタンパク質の産生によってさらに引き起こされる可能性があります。この現象は、組換え免疫複合体(RIC)56の発現に伴って何度も見られた。我々は、タンパク質の構造とタンパク質の融合の変化が壊死を最小限に抑えるのに役立つことを観察した。しかし、一部のタンパク質は、様々な変更後も植物に有毒なままである可能性があります。本明細書で概説する発現ベクターを用いれば、タンパク質の抽出は、重要な壊死の発症前に早期に行われ、結果として高いタンパク質収率56を生じる。
異なる成長条件は、アグ ロバクテリウム の成長を遅らせるか、あるいは阻害することができます。 アグロバクテリウム は28°C~30°Cで最適に成長し、30°C以上にインキュベートすると熱ショックを受け、細胞分裂誤差62を生じる。異なる アグロバクテリウム 株は、多かれ少なかれこの抗生物質62に対して自然に耐性であるように、成長はまた、あまりにも多くのリフィンピシンの添加によって妨げることができる。推奨よりも有意に高いOD600 で浸潤のために調製された細菌培養は、壊死55を引き起こす可能性が高い。培養物のわずかに高いOD600 は、通常、収量に影響を与えませんが、0.1より低い場合、タンパク質の収量はかなり減少する可能性があります。死んだ細胞の蓄積は、2つの状況下で発生する可能性があります。1)培養は生い茂り、死細胞であるODのかなりの割合、および2)化学残留物または高遠心分離速度など、成長後 のアグロバクテリウム を損傷/殺すことにつながった。培養中の死細胞数の増加を用いた浸潤は、タンパク質発現を低下させる可能性がある。さらに、圧力をかけ過ぎることによって葉を穿刺すると葉に損傷を与え、そのため早期の壊死につながる可能性があります。 ニコティアナベンタミアナで組換えタンパク質を発現する際にこれらの可能な要因を考慮すると、タンパク質産生の増強につながる可能性があります。
低タンパク質収量を得るは、抽出および精製ステップのいくつかの問題に起因する可能性があります。まず、抽出バッファーは、目的のタンパク質に応じて最適化が必要な場合があります。ブレンド中、植物材料は目に見える葉の部分なしで均質でなければなりません。次に、一部のタンパク質は、Tween-20やTritonなどの抽出バッファー内の可溶化に洗剤を必要とします。他のタンパク質は、可溶化のために高濃度〜7.5 Mで尿素を必要とするかもしれないが、一部はPBSのみで抽出することができる。抽出プロセス中にバッファー、植物組織、遠心分離機などが冷たく保たれていない場合、タンパク質の分解が起こり得ます。抽出バッファー内のプロテアーゼ阻害剤およびアスコルビン酸ナトリウムまたは類似の化学物質の不足はまた、分解または凝集を引き起こす可能性があります。PMSFのようなプロテアーゼ阻害剤は急速に分解し、アスコルビン酸ナトリウムは水性になるまでに時間がかかります。全体的に、研究者は関心のあるタンパク質に最適な条件を決定する必要があります。
IgG融合の精製には、低タンパク質収率が得られた場合に修正が必要なステップが少なからである。SDS-PAGEとWesternによる全工程中に収集されたサンプルアリコートを分析することは、メソッドの欠陥を特定するのに役立ちます。例えば、フロースルーが相当量のタンパク質を含む場合、そのタンパク質の結合は、バッファーのpHを変化させることによって容易にすることができる。抽出プロセス中に高濃度の洗剤を使用すると、樹脂の結合性に影響を与える可能性があります。方法に記載されているように、樹脂の適切な貯蔵は、樹脂の寿命のために不可欠です。さらに、洗浄工程が樹脂から目的のタンパク質を除去する場合、この問題を解決するためにバッファーをリメイクする必要があるかもしれません。タンパク質精製に関するその他の問題は、タンパク質の誤折や分解が原因である可能性があり、タンパク質の全体的な設計のさらなる分析が必要になる可能性があります。上記のトラブルシューティングを参照すると、このプロトコルを使用して精製の効率が向上する可能性があります。
記載されたGFP-IgG融合精製は、教育環境において有用である。視覚エフェクトは、学習者がより簡単に概念を理解することを可能にするので、科学教育の基本です39.学生は、分子レベル39で概念を理解するのが難しいだけでなく、誤解を報告することがよくあります。特に、各工程で特定のタンパク質の位置を理解する必要がある実験は、目的タンパク質を蛍光分子でタグ付けすることで修飾することができる。従って、GFPまたはasGFPは、使用されるpH環境に応じて、それらの蛍光を利用して、学生のためのタンパク質精製技術の解明を促進するために利用することができる。
要約すると 、N.ベンタミアナ 植物のGFPに融合した組換えAbの発現と精製のための簡単な方法を説明する。このプロトコルは、任意の所望の標的タンパク質に融合したAbの精製に使用することができる。このプロセスは、さまざまな量の葉材料に対応するように編集することができ、タンパク質抽出および精製プロセスの前、中、および終了後にタンパク質存在の視覚的な決定を可能にします。これらの方法は、コントロールとして有用であり、教育技術のために目的とすることができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
私たちは、ビデオを編集するためのマリアピアディパルマに感謝します.また、アリゾナ州立大学の教育アウトリーチと学生サービス局の寛大な出版料援助に感謝します。このプロトコルの研究は、生命科学の学校によってサポートされました, アリゾナ州立大学.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL syringe | any | N/A | |
| 50 mL syringe | any | N/A | |
| Agar | SIGMA-ALDRICH | A5306 | |
| Blender with cups | any | N/A | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | MP BIOMEDICALS | 219482101 | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid | SIGMA-ALDRICH | E-6760 | |
| Ethanol | any | N/A | |
| Glycerol | G-Biosciences | BTNM-0037 | |
| Glycine | SIGMA-ALDRICH | G7126-500G | |
| HCl (Hydrochloric acid) | EMD MILLIPORE CORPORATION | HX0603-4 | |
| Heating block | any reputable supplier | N/A | |
| Jiffy-7 727 w/hole peat pellets | Hummert International | 14237000 | |
| Kanamycin | Gold Biotechnology Inc | K-120-100 | |
| KCl (Potassium Chloride) | SIGMA-ALDRICH | P9541-500G | |
| KH2PO4 (Potassium Phosphate) | J.t.baker | 3248-05 | |
| KOH (Potassium Hydroxide) | VWR | BDH0262 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | SIGMA-ALDRICH | M2773 | |
| MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) | SIGMA-ALDRICH | M8250 | |
| Miracloth | Millipore | 4 75855-1R | |
| Moisture control potting mix | Miracle-Gro | 755783 | |
| Na2HPO4 (Sodium Phosphate) | J.t.baker | 3827-01 | |
| NaCl (Sodium Chloride) | Santa Cruz Biotechnology | sc-203274C | |
| Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | N/A | |
| PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) | G-Biosciences | 786-787 | |
| Polypropylene Column | any | N/A | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-Rad | 1610394 | |
| Protein G resin | Thermo Fisher Scientific | 20399 | |
| Rifampicin | Gold Biotechnology Inc | R-120-25 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | G-Biosciences | DG093 | |
| Sodium Ascorbate | SIGMA-ALDRICH | A7631-500G | |
| Spectrophotometer | any reputable supplier | N/A | |
| Titan3 0.75 µm glass fiber filter | ThermoScientific | 40725-GM | |
| Tray for peat pellets with dome | any | N/A | |
| TRIS Base | J.t.baker | 4109-02 | |
| Tris-HCl | Amresco | M108-1KG | |
| Tryptone | SIGMA-ALDRICH | 17221 | |
| UV lamp | any | N/A | |
| Water Soluble All Purpose Plant Food | Miracle-Gro | 2000992 | |
| Yeast extract | SIGMA-ALDRICH | 9182 |
References
- Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
- Kaplon, H., Reichert, J. M.
- The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
- Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
- Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
- Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R.
- Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
- Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
- Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
- Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
- Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
- Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
- Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
- Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
- Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
- Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
- Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
- Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
- Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
- Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
- Montero-Morales, L., Steinkellner, H.
- Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
- Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
- Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
- Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E.
- Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
- Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
- Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
- Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
- Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
- Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
- Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
- Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
- Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
- Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W.
- Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
- Andrew, S. M., Titus, J. A.
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
- Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
- Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
- Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
- Brunelle, J. L., Green, R.
- Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
- Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
- Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
- Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
- Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
- Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
- Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
- Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
- Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
- Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
- Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
- Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
- Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
- Brown, J. C.
- Morton, E. R., Fuqua, C.
