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Biology

Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en Nicotiana benthamiana

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Aquí describimos un método simple para la expresión, extracción y purificación de IgG humano recombinante fusionado con GFP en Nicotiana benthamiana. Este protocolo se puede extender a la purificación y visualización de numerosas proteínas que utilizan cromatografía de columna. Además, el protocolo es adaptable al laboratorio de enseñanza en persona y en la universidad virtual, proporcionando una exploración basada en proyectos.

Abstract

La alta demanda de anticuerpos como intervenciones terapéuticas para diversas enfermedades infecciosas, metabólicas, autoinmunes, neoplásicas y otras factores crea una creciente necesidad en el desarrollo de métodos eficientes para la producción de anticuerpos recombinantes. A partir de 2019, había más de 70 anticuerpos monoclonales aprobados por la FDA, y hay un potencial de crecimiento exponencial. A pesar de su promesa, los factores limitantes para un uso generalizado son los costos de fabricación y la complejidad. Potencialmente, las plantas ofrecen estrategias de fabricación de proteínas de bajo costo, seguras y fácilmente escalables. Plantas como Nicotiana benthamiana no sólo pueden plegar y ensamblar correctamente proteínas complejas de mamíferos, sino que también pueden añadir modificaciones post-traduccionales críticas similares a las ofrecidas por los cultivos celulares de mamíferos. En este trabajo, mediante el uso de GFP nativa y una variante ácida estable de proteína fluorescente verde (GFP) fusionada con anticuerpos monoclonales humanos, pudimos visualizar todo el proceso transitorio de expresión y purificación de anticuerpos de plantas N. benthamiana. Dependiendo del propósito del experimento, la fusión nativa de GFP puede garantizar una visualización más fácil durante la fase de expresión en las plantas, mientras que la fusión de PFN estable en ácido permite la visualización durante el procesamiento posterior. Este procedimiento escalable y directo puede ser realizado por un solo investigador para producir cantidades de miligramos de proteínas de fusión de anticuerpos o anticuerpos altamente puras en cuestión de días utilizando sólo unas pocas plantas pequeñas. Tal técnica puede extenderse a la visualización de cualquier tipo de proceso de purificación de anticuerpos y potencialmente muchas otras proteínas, tanto en plantas como en otros sistemas de expresión. Además, estas técnicas pueden beneficiar instrucciones virtuales y ser ejecutadas en un laboratorio de enseñanza por estudiantes de pregrado que poseen una experiencia previa mínima con técnicas de biología molecular, proporcionando una base para la exploración basada en proyectos con aplicaciones del mundo real.

Introduction

Los informes de la industria indican que trece de los veinte medicamentos más graves de los Estados Unidos eran biológicos (productos farmacéuticos a base de proteínas), de los cuales nueve eran anticuerpos. En 2019, había más de 570 terapias de anticuerpos (Ab) en varias fases de desarrollo clínico1,2,3. Las ventas globales actuales de Ab superan los 100 mil millones de dólares, y se espera que el mercado terapéutico monoclonal Ab (mAb) genere hasta 300 mil millones de USD para 20251,4. Con una demanda tan alta y aumentos proyectados de los ingresos, los investigadores han estado trabajando para desarrollar formas de producir terapias Ab a una escala cada vez mayor, con mayor calidad y menores costos. Los sistemas de expresión a base de plantas tienen varias ventajas sobre las líneas celulares tradicionales de mamíferos para la fabricación asequible y a gran escala de Ab therapeutics5,6. La producción de terapias proteicas en plantas ("pharming molecular") no requiere costosos biorreactores o instalaciones de cultivo celular como lo hacen las técnicas tradicionales de cultivo celular de mamíferos7,8. Las plantas no pueden contraer patógenos humanos, minimizando la contaminación potencial9. Tanto la expresión de proteínas de origen vegetal transitoria como la transgénica pueden utilizarse como alternativas de menor costo a los sistemas de producción de mamíferos o bacterias10. Aunque las plantas transgénicas son preferidas para la producción de cultivos, la producción de proteína recombinante utilizando este método puede requerir semanas o meses. Los avances en la expresión transitoria utilizando vectores virales a través de jeringa o agroinfiltración al vacío permiten la producción a pequeña y gran escala, respectivamente, de la proteína deseada en los días11,12,13,14. La producción de mAbs contra el ébola, el dengue y el zika, y muchas otras proteínas recombinantes, se han producido y purificado rápida y eficientemente utilizando la expresión transitoria en las plantas de N. benthamiana 15,16,17,18,19. Estas circunstancias hacen de la expresión transitoria a base de plantas una opción atractiva para el desarrollo de múltiples terapias Ab y los métodos demostrados en este protocolo20.

Los mAbs de primera generación eran de derivación murina, lo que dio lugar a una inmunogenicidad no específica cuando se utiliza en ensayos en humanos21. Con el tiempo, los Abs quiméricos, humanizados y, finalmente, totalmente humanos, se produjeron para disminuir la inmunogenicidad inducida por las terapias Ab. Desafortunadamente, algunos de estos Abdominales todavía causan inmunogenicidad del huésped debido a diferencias en la glicosilación21. Los desarrollos en la ingeniería de plantas han permitido la modificación de los glicanos Ab, lo que es esencial ya que la estabilidad y la función de un Ab pueden verse significativamente afectadas por su estado de glicosilación22. Los avances han permitido la producción en sistemas vegetales de expresión de alto nivel de mAbs humanizados, que contienen glicanos humanos y, como resultado, los rasgos biológicos deseados de un fármaco humano producido en masa19,21.

Además de Abs recombinante, las moléculas de fusión Ab (Ab fusiones) se han explorado para varios propósitos en las últimas décadas. Las fusiones Ab a menudo consisten en un fragmento de Ab o Ab fusionado con una molécula o proteína y están diseñadas para provocar respuestas de las células efectoras inmunitarias23. Estas moléculas han sido creadas como posibles intervenciones terapéuticas para tratar diversas patologías como el cáncer y las enfermedades autoinmunes24,25,26,27. Los complejos inmunes recombinantes (RC) son otra clase de fusiones Ab que se han empleado como candidatos a vacunas28. Los RC aprovechan la capacidad del sistema inmunitario para reconocer las regiones Fc de las fusiones Ab y se ha encontrado para mejorar la inmunogenicidad cuando se combina con otras plataformas de vacunas29,30,31.

Green Fluorescent Protein (GFP) es una proteína bioluminiscente derivada de la medusa Aequorea Victoria, que emite luz verde cuando se excita por la luz ultravioleta32,33. A lo largo de los años, el uso de GFP como marcador visual de expresión génica se ha expandido de la expresión en Escherichia coli a numerosos sistemas de expresión de proteínas, incluyendo plantas N. benthamiana 34,35,36,37,38. Los marcadores visibles, como la GFP, tienen abundantes implicaciones en la enseñanza y el aprendizaje de conceptos científicos. Numerosos estudiantes de nivel básico describen dificultades para captar conceptos científicos cuando la idea que se enseña no es visible a simple vista, como los conceptos de biología molecular y campos relacionados39. Por lo tanto, los marcadores visuales, como la GFP, pueden contribuir al procesamiento de la información relacionada con los procesos científicos y podrían ayudar a reducir las dificultades que los estudiantes reportan para aprender numerosos conceptos científicos.

Aunque la GFP se utiliza a menudo como un marcador para indicar el gen y la expresión in vivo,es difícil visualizarlo en los procesos posteriores si se utilizan condiciones ácidas. Esta circunstancia se debe principalmente a que la GFP no mantiene su estructura y la fluorescencia resultante a un pH bajo40. Los ambientes ácidos temporales a menudo son necesarios en varios procesos de purificación, tales como proteína G, proteína A, y cromatografía de proteína L, a menudo utilizado para la purificación Ab41,42,43,44. Los mutantes GFP se han utilizado para retener la fluorescencia en condiciones ácidas45,46.

Aquí describimos un método simple para la expresión, extracción y purificación de proteínas de fusión IgG recombinantes en plantas N. benthamiana. Producimos GFP tradicional fusionado con el N-terminus de una cadena pesada IgG humanizada, creando una fusión GFP-IgG. Simultáneamente, desarrollamos la fusión de una secuencia optimizada para codón de planta para un GFP estable en ácido (asGFP) al N-terminus de una cadena pesada IgG humanizada, creando una fusión asGFP-IgG. Las ventajas de producir GFP-IgG incluyen la capacidad de visualizar la presencia de una proteína diana durante la expresión, mientras que asGFP-IgG permite ver la presencia de proteína recombinante no sólo en los pasos de expresión y extracción, sino también en los pasos de purificación de la proteína. Este protocolo se puede adaptar para la producción, purificación y visualización de una gama de proteínas de fusión GFP producidas en N. benthamiana y purificadas mediante técnicas de cromatografía que requieren un pH bajo. El proceso también se puede adaptar a varias cantidades de material de hoja. Si bien el abs y las proteínas de fusión etiquetadas con GFP o asGFP no están destinadas a ser utilizadas para terapias, estos métodos pueden ser útiles como controles durante los experimentos y también pueden utilizarse como una herramienta de enseñanza para la biología molecular y celular y la biotecnología, tanto en persona como virtualmente.

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Protocol

1. Cultivar plantas N. benthamiana

  1. Coloque los pellets de turba de tierra en una bandeja y vierta previamente hervido, todavía caliente (40-45 oC), agua sobre los pellets de turba para una expansión completa. Después de que los pellets se expanden por completo, colocar 2-3 N. benthamiana semillas en cada pellet de turba utilizando pinzas.
  2. Vierta aproximadamente 0.5 en agua para cubrir la parte inferior de la bandeja. Etiquete la bandeja con la fecha de siembra. Continúe regando las plántulas diariamente con cantidades apropiadas de fertilizante. La concentración de fertilizantes (alimentos vegetales solubles en agua) es generalmente de 2,5-2,8 g/L.
  3. Cubra la bandeja con una tapa de humidomo cuando se coloque en la cámara de crecimiento. Mantener los pellets de turba de semillas en la cámara de crecimiento a 23-25 oC, con un fotoperiodo de 16 h y un 60% de humedad relativa.
  4. Después de una semana, retire las plantas adicionales dejando cada pellet con una sola plántula.
  5. Cuando las plantas tienen 2-3 semanas de edad, transferir cada pellet de turba a una olla individual que contiene el suelo de control de humedad. Esta demostración utilizó el suelo de maceta de control de humedad Miracle-Gro.
  6. Agua diaria con 1 g/L de fertilizante. Nunca deje el suelo completamente seco. Las plantas están listas para la infiltración cuando tienen 5-6 semanas de edad.

2. Preparación de Agrobacterium tumefaciens para infiltración

NOTA: Las construcciones de fusión GFP-IgG se pueden obtener como se describe en este documento31. El gen asGFP se obtuvo y se optimizó la planta de este estudio45. Los siguientes pasos deben realizarse junto a un quemador Bunsen, y se deben aplicar técnicas asépticas básicas para evitar la contaminación.

  1. Racha A. tumefaciens EHA105 que alberga el virus enano amarillo del frijol (BeYDV)19 vector de expresión vegetal para cada construcción (asGFP-IgG, GFP-IgG, cadena ligera) de una población de glicerol en agar LB (10 g/L triptona, 10 g/L NaCl, extracto de levadura de 5 g, 15 g/L agar, placa de kanamicina de 50 g/l).
  2. Crecer durante un día en una incubadora de pie de 30oC. Aísle una sola colonia para su verificación por protocolo PCR de pantalla de colonia estándar.
  3. Utilice colonia verificada para cada construcción. Llenar el tubo cónico con 10 ml de soporte LB (10 g/L de triptona, 10 g/L NaCl, 5 g de extracto de levadura, 50 g/ml). A continuación, agregue 10 l de kanamicina de 100 g/ml. Añadir 10 l de rifampina de 2,5 g/ml para evitar la contaminación por E. coli. Incubar a 30oC y 120-150 rpm durante la noche.
  4. Al día siguiente, si la cultura Agrobacterium se cultiva aOD 600 a 0,6-0,9, se puede utilizar para la infiltración. Si está cubierto (OD600 > 1), 1-2 ml debe transferirse a LB fresco con antibióticos y cultivarse a la OD600requerida. Dependiendo de la concentración del cultivo inicial, puede tomar potencialmente dos días para crecer aOD 600 a 0.6-0.9.
  5. Una vez en el OD600apropiado, colocar los cultivos en una centrífuga, y peletizar las bacterias por centrifugación a 4.500 x g durante 20 min, temperatura ambiente (RT).
  6. Decantar sobrenadante de ambas muestras, y luego resuspender cada pellet en tampón de infiltración 1x (10 mM 2-(N-morpholino) ácido etanoesulfónico, sulfato de magnesio de 10 mM, ajustado a pH 5.5 con KOH) para obtener OD final600 a 0,4. Esto debe tomar aproximadamente 15-45 mL de búfer de infiltración, dependiendo de la densidad de cultivo inicial. Combine volúmenes iguales de cada construcción de fusión De IgG con la construcción de la cadena ligera para obtener el OD final600 x 0,2 por construcción en cada tubo.

3. Agroinfiltración de jeringa sin aguja

  1. Tome un clip de papel enderezado y plantas de N. benthamiana de 5-6 semanas de edad en el paso 1. Usando el borde afilado del clip de papel, haga una pequeña punción en la primera capa epidérmica de la hoja en la superficie adaxial. Evita perforarlo hasta el final.
    NOTA: Las hojas inferiores son más fáciles de infiltrar, mientras que las hojas en la parte superior de la planta son más duras. Generalmente, la expresión de proteínas recombinantes es más alta en las hojas ubicadas en el medio de una planta, y estas hojas también se vuelven menos necróticas.
  2. Llene una jeringa de 1 ml, sin una aguja conectada, con la solución de Agrobacterium preparada del paso 2. Cubra el orificio hecho en el paso anterior con el extremo de la jeringa y empuje lentamente para inyectar las bacterias en la hoja mientras aplica una contrapresión suave desde detrás de la hoja. Observe cómo la hoja se oscurece mientras se inyecta la solución sin aplicar demasiada presión sobre la jeringa.
  3. Trate de infiltrarse en la mayor parte del área de la hoja en un máximo de 3-4 veces – el daño excesivo de la hoja puede obstaculizar el rendimiento proteico. La hoja de la planta infiltrada aparecerá en su mayoría oscura desde la vista inferior.
    NOTA: Esta solución bacteriana debe ser suficiente para al menos 3-4 plantas por construcción. Autoclave cualquier solución bacteriana restante antes de desecharla.

4. Crecer y observar el N. benthamiana infiltrado

  1. Colocar las plantas infiltradas de nuevo en la cámara de crecimiento y continuar regando diariamente.
  2. Observar las hojas para la clorosis y la necrosis en áreas infiltradas. Observe las plantas para la fluorescencia GFP (si la GFP está presente) bajo una lámpara UV de onda larga y corta.
  3. El día 4-5 muestra la fluorescencia más alta de ambas construcciones GFP en las hojas. Cosecha todas las hojas a 4-5 ppp (días después de la infiltración) y pesa el material total de la hoja.
  4. Utilícelo inmediatamente para el procesamiento posterior o guárdelo a -80 oC hasta que esté listo para usar.

5. Extracción de proteínas

  1. Mantenga los tampones y las tazas de la licuadora sobre hielo o a 4 oC antes de usarlos.
  2. Preparar 2-3 mL de tampón de extracción en frío (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 con HCl) por 1 g de material vegetal. Añadir 2 mM de fluoruro de fenimetilsulfonil (PMSF) de stock (100 mM) y ascorbato de sodio de 50 mM al tampón de extracción justo antes de la extracción.
  3. Coloque el tejido vegetal del paso 4 en la taza de licuadora prechilled. Agregue una cantidad medida de tampón de extracción refrigerada a la taza de la licuadora (como se indica en el paso 5.2). Coloque la taza de la licuadora en la licuadora. Tome una hoja precortada de parafilm y estírela sobre la parte superior de la taza de la licuadora. Licúe a la homogeneidad con intervalos de 20 segundos, revolviendo bien entre ciclos de mezcla según sea necesario.
  4. Transfiera material mezclado a un vaso de precipitados. Agregue una barra de agitación y revuelva a 4 oC durante 30 minutos para mejorar la solubilidad proteica y permitir la precipitación de sólidos.
  5. Coloque 2 capas de Miracloth sobre un vaso de precipitados limpio sobre hielo y vierta el extracto a través de él para eliminar los restos de hojas grandes. Después de que todo el extracto se vierta, doblar el Miracloth para exprimir el extracto de hoja residual. El extracto debe aparecer de color verde oscuro sin partículas visibles.
  6. Transfiera 50 l de esta muestra a un nuevo tubo de 1,5 ml y etiquete "extracto total" para su posterior análisis. Transfiera el extracto a tubos centrífugos. Centrifugar el resto del extracto de la planta a 16.000 x g durante 20 min, 4 oC y transferir el sobrenadante a un tubo cónico.
  7. Filtrar el extracto soluble con una jeringa de 50 ml y un filtro de fibra de vidrio de jeringa (0,75 m).
  8. Recoger 50 l de una muestra después de la centrifugación, etiqueta "extracto soluble" para su posterior análisis.

6. Procedimiento de cromatografía de columnas de proteína G

NOTA: El protocolo descrito aquí es para cromatografía de flujo de gravedad utilizando resina de agarosa Pierce Protein G. Si utiliza una resina diferente, consulte las instrucciones del fabricante para los ajustes. Nunca deje que la resina se seque y evite que todo el líquido se drene. Vuelva a tapar la toma de corriente según sea necesario.

  1. Configure una columna de polipropileno con 20 ml de muestra.
  2. Estimar la cantidad de lodos necesarios dependiendo del tipo de inmunoglobulina objetivo y su afinidad con la resina. Generalmente, 3 ml de lodo total con 1,5 ml de volumen de lecho es suficiente para la purificación de varios miligramos de Ab.
  3. Vierta cuidadosamente la cantidad necesaria de lodos resuspendidos en la columna tapada. Abra la salida de columna desde la parte inferior de la columna y permita que drene hasta que la mayor parte del búfer haya desaparecido.
  4. Verter inmediatamente 10 mL de tampón de lavado 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4,pH 7.4 con HCl) en la parte superior. Dejar drenar y repetir este paso de lavado 2x.
  5. Aplique la muestra filtrada del paso 5 a la columna y recoja el flujo continuo: alícuota de 50 ml de flujo para su posterior análisis. Guarde el resto del flujo en caso de que el Ab no se uniera a la resina.
    NOTA: Volver a aplicar flowthrough a una nueva columna no suele dar lugar a un buen rendimiento; por lo tanto, se aconseja comenzar con nuevo material de hoja.
  6. Lave la resina dos veces con 10 ml de 1x PBS para reducir la unión no específica. Si lo desea, alícuota de 50 ml de lavado a medida que el tampón drena a través de la columna para verificar que el Ab de destino no se eluía con un tampón de lavado.
  7. Configurar y etiquetar cinco tubos con 125 l de estéril 1 M Tris-HCl a pH 8. Esto es para neutralizar el Abs en el tampón de elución ácida para evitar posibles cambios estructurales. Alternativamente, agregue 30 l de base de 2 M Tris para obtener una muestra menos diluida.
    ADVERTENCIA: Durante la elución, se puede utilizar luz UV para la visualización. Esto no necesita hacerse durante la duración de la elución. Si se está utilizando UV, asegúrese de usar un EPP adecuado para evitar daños en los ojos y la piel. No es necesario utilizar una luz UV durante el paso de elución.
  8. Eluir el Abs aplicando 5 ml de tampón de elución (100 mM de glicina, pH 2.5 con HCl) a la columna y recoger 1 fracciones de ml a cada tubo designado desde el paso anterior.
  9. Regenere inmediatamente la columna aplicando 20 ml de tampón de lavado, seguido de 10 ml de tampón de lavado. Asegúrese de que la resina no se deja en un ambiente ácido durante un tiempo prolongado. Las eluciones deben aparecer fluorescentes, a menudo la fluorescencia más alta se ve en la segunda elución, pero puede variar de la extracción a la extracción.
  10. Para su almacenamiento, lave la resina con 10 ml de etanol al 20% en PBS y déjela drenar hasta la mitad. Recapitula la parte superior, luego la parte inferior de la columna, y manténgalo erguido a 4 oC.
    NOTA: Generalmente, las resinas de proteína G se pueden reutilizar hasta 10 veces sin pérdida significativa de eficiencia. Consulte las directrices del fabricante para obtener detalles específicos.
  11. Determinar la concentración de Ab utilizando un espectrofotómetro midiendo la absorbancia a 280 nm, utilizando el búfer de elución en blanco. Conservar los eluidos en -80 oC y alícuota 50 ml de cada fracción en un tubo separado para su posterior análisis.

7. SDS-PAGE para la detección de fusión GFP-Ig

  1. Prepare todas las muestras antes de configurar SDS-PAGE.
    1. Añadir 4 l de tampón de muestra (6x tampón de muestra reductor: 3,0 ml de glicerol, 0,93 g de TDT, 1 g de SDS, 7 ml de 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg de bromofenol azul); (6x tampón de muestra no reductor: 3,0 ml de glicerol, 1 g de SDS, 7 ml de 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg de azul bromofenol) a 20 l de cada muestra (extracto total, extracto soluble, flujo a través, lavado, todas las fracciones de elución) para su análisis. Asegúrese de que las tapas del tubo estén bien sujetas.
    2. Tratar sólo la reducción de muestras durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo, y luego poner las muestras durante 5 minutos en hielo. Gire las muestras en una microcentrífuga durante 5 s y cargue 20 ml de cada muestra en el orden de recogida en los pomos de gel. Cargue 3 ml de escalera de proteína de doble color en un pozo separado.
  2. Ejecute el gel SDS-PAGE a una separación constante de 100 V a la banda de proteína deseada; toma alrededor de 1,5 horas. Monitoree la escalera como un indicador de separación de proteínas.
  3. Visualice el gel bajo los rayos UV para observar la fluorescencia de la GFP.
  4. Si lo desea, manche el gel con la mancha de Coomassie para evaluar la proteína total en cada muestra. Alternativamente, realizar la mancha occidental para evaluar la proteína objetivo utilizando Abs específico.
    NOTA: Tanto la tinción de Coomassie como la mancha occidental se pueden realizar siguiendo los protocolos estándar47,48.

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Representative Results

Este estudio demuestra un método fácil y rápido para producir proteínas recombinantes y visualizarlas a través de procesos posteriores. Usando N. benthamiana y siguiendo el protocolo proporcionado, la producción de proteína recombinante descrita aquí se puede lograr en menos de una semana. El flujo de trabajo general de expresión, extracción y purificación de la planta se muestra en la Figura 1. Las etapas de crecimiento de la planta a partir de plántulas viejas de 2 semanas, plantas viejas de 4 semanas y plantas antiguas de 6 semanas se muestran en la Figura 1A (1-3), respectivamente, mientras que la Figura 1B representa los cambios morfológicos de las hojas debido a la necrosis (Figura 1B-1) o clorosis (Figura 1B-2). La necrosis puede ocurrir en el lugar de la inyección entre los días 3-5 después de la infiltración. Estos cambios a menudo dependen de las propiedades de la proteína que se expresan y la salud de las plantas infiltradas (más examinado en la discusión). Simultáneamente, la clorosis también puede confiar en la salud de las plantas que se utilizan (más examinadas en la discusión). El proceso de crecimiento de Agrobacterium y preparación para la infiltración se muestra en la Figura 1C. La Figura 1C-1 muestra colonias aisladas de Agrobacterium. Las figuras 1C (2-5) muestran la apariencia esperada del medio después de que se inocula con una sola colonia aislada. Refiera al cuadro 3 para más detalles sobre estos pasos. El proceso de infiltración de la planta se muestra en la Figura 1D y comienza con una planta no infiltrada y es seguido por el proceso de infiltración. La expresión, extracción y clarificación de las proteínas vegetales se muestran en la Figura 1E. El material de la hoja se coloca en una licuadora y se homogeneiza, se muestra en las figuras 1E (1-3). A continuación, se toma una muestra que representa el homogeneato total. Luego se filtra a través de un Miracloth (gauze o incluso un filtro de café puede sustituir a gastos reducidos), y la suspensión clarificada se centrifuga. La centrifugación permite la separación del sobrenadante de los materiales restantes, como se muestra en las figuras 1E (4-6). El sobrenadante clarificado se carga en una columna de cromatografía de afinidad de proteína G, Figura 1F (1-3). Después de que la mayor parte de la proteína se une, Figura 1F-4, las proteínas se eluyen de la resina Figura 1F(5,6).

La Tabla 1 muestra las secuencias de ácido nucleico optimizadas para la planta utilizadas para producir asGFP45 (fila superior) en el pBY! El vector KEAM-GFPasH utilizado en este estudio para expresar la fusión asGFP-IgG y la GFP33 (fila inferior) en el vector PBYEAM-GFPHgp utilizado en este estudio para expresar la fusión GFP-IgG. Las secuencias de ácido nucleico se examinaron utilizando la herramienta de traducción de proteínas Expasy (https://web.expasy.org/translate/) para determinar las secuencias de aminoácidos.

En la Figura 2se muestra una placa Agrobacterium representativa preparada con este protocolo. Las colonias deseadas deben aparecer redondas y uniformes en forma y color. Las colonias más cercanas al centro de la placa tienen una mayor probabilidad de expresar resistencia a la kanamicina. Los cultivos líquidos se prepararán a partir de una sola colonia aislada.

La apariencia esperada de los medios que contienen referencias culturales se muestra en la Figura 3. Tras la inoculación inicial de una colonia aislada, los medios LB aparecerán de color amarillo claro y translúcido, como se muestra en la Figura 3A. Después de la incubación de una colonia aislada durante la noche a 30 oC, los medios LB aparecerán turbios. Tal y como se muestra en del cuadro 3B,los objetos no se pueden ver más a través de los medios cuando el crecimiento está presente en el LB. Después de la centrifugación, se debe formar un pellet en la parte inferior del tubo. El tubo tendrá una separación clara de los medios LB por encima del pellet y aparecerá de color amarillo claro y translúcido, como se muestra en la Figura 3C. El sobrenadante de medios LB se elimina, y el pellet se resuspended en el búfer de infiltración. En un OD600 de 0.2, los medios aparecerán turbios, como se muestra en la Figura 3D. OD600 debe medirse como se describe en los métodos.

La Figura 4 representa el proceso de infiltración de hojas. Una ligera prod de la hoja con un clip de papel debe producir una rotura en la epidermis de la hoja que no pasa completamente a través de la hoja. La rotura apenas debe perforar la hoja por lo que el búfer de infiltración se puede inyectar en la hoja, que se muestra en la figura 4A-C. La suspensión de Agrobacterium y el tampón de infiltración se inyecta directamente en la rotura en la hoja y altera ligeramente el color de la hoja infiltrada; ver Figura 4D-F.

La aparición de hojas que expresan fusiones IgG se representa en la Figura 5. Muestra hojas que expresan fusiones asGFP-IgG (Figura 5A) y fusiones GFP-IgG (Figura 5C) bajo luz blanca. Si se utilizan las construcciones en este protocolo, cuando se infiltran en un 0.2 OD600, las hojas deben parecer saludables en los días 1-5 para ambas hojas que expresan fusiones asGFP-IgG y hojas que expresan fusiones GFP-IgG. Puede haber una ligera apariencia necrótica en los sitios de inyección en el día 5, que generalmente es evidente por el aclaramiento del tejido vegetal en esas áreas. La Figura 5 también muestra hojas que expresan fusiones asGFP-IgG (Figura 5B) y fusiones GFP-IgG (Figura 5D), respectivamente, bajo luz UV de onda larga desde la vista superior de la hoja. La fluorescencia aumenta en intensidad a medida que avanzan los días para ambas construcciones expresadas. Las hojas que expresan fusiones asGFP-IgG tienden a tener fluorescencia ligeramente menos intensa que las hojas que expresan fusiones GFP-IgG en todos los días.

Cuando se añade el sobrenadante del extracto asGFP-IgG a la columna Proteína G, la resina se volverá ligeramente verde bajo la luz blanca debido a los pigmentos de clorofila vegetal (Figura 6A). La adición de sobrenadante bajo luz UV de onda corta da como resultado la acumulación de fluorescencia en la resina de la proteína G, como se muestra en la Figura 6B. Tenga en cuenta que el sobrenadante también será fluorescente solo bajo la luz UV. Aún así, se espera que la fluorescencia esté mucho más concentrada cuando la fusión asGFP-IgG comience a unirse a la resina.

Tras el paso del sobrenadante de asGFP-IgG a través de la resina de proteína G, la resina debe iluminarse bajo la luz UV de onda corta, como se muestra en la Figura 7A. En este punto, la mayor parte del IgG estará unido a la resina. Al añadir el tampón de elución, la fluorescencia contenida en la resina de proteína G seguirá siendo visible bajo la luz UV de onda corta y comenzará a perder intensidad a medida que más tampón de elución de pH bajo pase a través de la resina. La fluorescencia comenzará a acumularse en los eluidos(Figura 7B). Las fracciones de eluido variarán en fluorescencia. Como se ve en la Figura 8,la fluorescencia es la intensidad más baja en la primera elución y la intensidad más alta en el segundo y tercer eluido. Los resultados pueden variar, ya que la fluorescencia dependerá de la expresión de la proteína, el material de hoja cosechada y otras condiciones utilizadas en el experimento.

Después de terminar el proceso de purificación, las muestras se analizan en el gel 10% SDS-PAGE en condiciones de reducción (el tampón de muestra contiene TDT y las muestras se hierven durante 5 minutos) y las condiciones de no reducción (el tampón de la muestra no contiene TDT y las muestras no se hierve). Como se muestra en la Figura 9A,solo las muestras no reductoras, como en el carril de Elution 2 NR, se fluoresce cuando se exponen a la luz UV de onda corta. La primera banda de este carril es fluorestando en el tamaño esperado del producto completo 200 kDa, lo que indica que el asGFP sigue siendo correcto. Las bandas fluorescentes cerca de la parte inferior del gel son tinte del tampón reductor. Tenga en cuenta que asGFP pierde fluorescencia cuando se expone a temperaturas a o por encima de 95 oC durante 5 minutos; esto es diferente de eGFP (GFP mejorado), que mantendría cierta fluorescencia en las mismas condiciones49,50. Dos bandas de la escalera, 75 kDa y 25 kDa, también fluoresce. La Figura 9B representa una mancha Coomassie del mismo gel en la Figura 9A. Las eluciones en los carriles 6-9 se han preparado en condiciones de reducción. Cuando se ejecutan en un gel y Coomassie-stained, estas muestras deben mostrar los componentes de fusión asGFP-IgG por separado. Estos componentes incluyen la cadena pesada fusionada con GFP (75 kDa), la cadena pesada sola (50 kDa), la cadena ligera (25 kDa) y el propio asGFP (27 kDa). La muestra no reductora se incluyó en el último carril del gel para fines de comparación y debe mostrar una sola banda grande (200 kDa), que debe estar compuesta por dos cadenas pesadas fusionadas con el asGFP y las respectivas cadenas ligeras. Además, las bandas más pequeñas probablemente son causadas por proteasas nativas. Este escote se puede prevenir con la adición de inhibidores de la proteasa y manteniendo el extracto de proteína frío en todo momento, incluso al realizar la purificación de la columna. Los componentes individuales de la proteína de fusión IgG no serán distinguibles en las muestras no reductoras del gel Coomassie.

Figure 1
Figura 1: Flujo de trabajo de los procesos de expresión, extracción y purificación de la planta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Secuencia de nucleótidos utilizada Secuencia de aminoácidos
Secuencias
utilizado para
asGFP en
¡Pby! KEAM
-GFPasH
Vector
utilizado en
el
Expresión
Dela
asGFP-IgG
Fusión		 ATGGTGTCCAAGGGAGAGGAGCTTCTGGAAGAGCCTTGTTC
CAGTACCCTATGACTTCTAAAATCGAGTTGAATGGCGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTTGCTGGAGAGGGTTTCACCCCTTC
ATCTGGAAGATTCAATATGCACGCTTACTGTACTACCGGAGAC
TTGCCTATGTCGGGGTTGTTATAGCTTCCCCGCTTCAGTACGG
GTTTCACATGTTTGCCTACTACTACTACTGAGGATATCACTCACTTTTT
CCAAGAATGTTCCTGGGTCTTATCTCGACAGAGAACTTTGA
GGATGGAGGGAGACGGTACTCTTACTACTCACCACGAGTACTC
CCTTGAGGACGGTTGCGTTACTTCCAAGACTACTTTGAACGCTT
CTGGATTCGACCCCAAGGGAGCCACTATGACTAAGTCTTGT
CAAACAGCTCCCAAACGAGGTCAAACACACCCACGGGCCA
AATGGTATTAGACTTACTTCCACTTTCTCTACTACCTTAAGGAGGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAAGACTGCATCGTTACCCCA
GTTGGCGGCAGAAAAGTTACTCAGCCTAAGGCTCACTTTCTTC
ATACTCAGATCATTCAGAAGAAGGACCCAAACGACACAGAG
ATCACATCGTTCAGACTGAGCTTGGTTGCTGGAAATCTTTGG
GCACGGCATGGATGAGCTTTACAAGA		 MVSKGEEASGRALF
QYPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEGFTP
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
DRTLRMEGDGTLTT
HHEYSLEDGCVTSK
TTLNASGFDPKGAT
MTKSFVKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQIGTQD
CIVTPVGGRKVTQP
KAHFLHTQIKKDP
NDTRDHIVQTELAV
AGNLWHGMDELY
K
Secuencias
utilizado para
GFP en
pBYEAMGFPHgp
Vector
utilizado en
el
Expresión
de GFP-IgG
Fusión		 ATGGCTAACAAGCATCTCATTCTCTCTCTCTCTTTGTGTGCTCCTT
GGTCTTTCTGCTTCTCTTGCTTCTCTGGTATGGTGAGCAAGGGCG
AGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACACACACAGCGTGTGTCCGGGGAGG
GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA
TCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACTCGTGT
GACCACCTTCAGCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCCTACCCCCC
GACCACATGAAGCAGCGCACGACTCTTCAAGTCCGCGCCCG
AAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGG
CAACTACAAGACGCGCGGAGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACAC
CCTGGTGAACCGCATGAGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGA
GGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAA
CAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACACAGAGAAGAACGG
CATCAAGGTGAACTTCACAGATGCCACAACATCGAGGACGGC
AGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCG
GCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACACACTACTACCTGAGCAC
CCAGTCCGCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGATCA
CATGGTCCTGCTGGGTTCGTGACCGGGCCGGGATCACTCAC
GGCATGGGAGAGCTGTACAAGA		 MANKHLSLSLFLVLL
GLSASLASGMVSKG
EELFTGVVPILVELD
GDVNGHKFSVSGE
GEGDATYGKLTLKFI
CTTGKLPVPWPTLV
TTFSYGVQCFSRYP
DHMKQHDFFKSA
MPEGYVQERTIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
KEDGNILGHKLEYN
YNSHNVYIMADKQ
KNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNH
YLSTQSALSKDPNEK
RDHMVLLEFVTAA
GITH

Tabla 1: Secuencias utilizadas para crear asGFP y GFP

Figure 2
Figura 2: Colonias de agrobacterium cultivadas en placa LB que contiene kanamicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Aparición de medios a lo largo del crecimiento y procesamiento de Agrobacterium. (A) La aparición de los medios LB inmediatamente después de la inoculación de la colonia aislada de Agrobacterium. (B) La presencia de medios después de la incubación durante la noche de una colonia aislada a 30oC. (C) La aparición de medios después de los cultivos se hila durante 20 min a 4.500 x g. (D) Pellet resuspended en el buffer de infiltración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Proceso de infiltración de plantas N. benthamiana. (A-B) Un poco de poking la hoja resulta en un agujero sutil en la parte superior de la hoja. (C-D) Inyección de agrobacterium suspensión en la hoja. (E) Hoja de planta infiltrada desde la vista superior. (F) Planta con múltiples hojas infiltradas desde la vista superior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: La visualización de las hojas que contienen la fusión asGFP-IgG y la fusión GFP-IgG comienzan el día 1 después de la infiltración (dpi) en la primera fila, lo que lleva hasta el día 5 dpi en la última fila para todas las condiciones. A) fusión asGFP-IgG bajo luz blanca. B) fusión asGFP-IgG bajo UV de onda larga. C) Fusión GFP-IgG bajo luz blanca. D) Fusión GFP-IgG bajo UV de onda larga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Sobrenadante del extracto asGFP-IgG que se añade a la columna Proteína G. A) Adición bajo luz blanca. B) Adición bajo luz UV de onda corta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Resina de proteína G bajo luz UV de onda corta después de sobrenadante del extracto asGFP-IgG se ejecutó a través de la columna. A) Resina de proteína G bajo luz UV de onda corta. B) Resina de proteína G tras la elución de proteínas en condiciones bajas de PH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Eluciones purificadas de asGFP-IgG obtenidas después de la exposición a condiciones de pH bajas a través de la purificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: SDS-PAGE de ejemplos de columna. Las muestras etiquetadas con "R" están en condiciones reductoras, y las muestras etiquetadas con "NR" se encuentran en condiciones de no reducción. A) Bajo luz UV, sólo muestras no reductoras de fluoresce en el gel de poliacrilamida 10%, como se ve en el carril Deution 2 NR. Las bandas de escalera de 75 kDa y 25 kDa también fluoresce. B) La tinción de Coomassie del mismo gel revela la presencia de todas las proteínas en la muestra. En las eluciones reducidas, la fusión IgG sin cadena ligera, la cadena pesada, la cadena ligera y la GFP posiblemente degradada están presentes en 75 kDa, 50 kDa, 25 kDa y 10 kDa, respectivamente. Por el contrario, en las eluciones no reducidas, una banda prominente está presente, consistente con el tamaño de toda la fusión asGFP-IgG (200 kDa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo se puede utilizar para la verificación visual de cualquier proteína recombinante Ab o recombinante producida en plantas N. benthamiana, incluidas aquellas que requieren exposición temporal a ambientes ácidos para fines de purificación decolumnas 42,43,44. Además, la fusión de asGFP a otras proteínas en diferentes sistemas de expresión puede ser una herramienta útil para la visualización y educación experimentales. El protocolo del presente documento se puede escalar a cantidades más grandes y pequeñas de material de hoja para producir la cantidad deseada de proteína recombinante. Los métodos descritos aprovechan estudios anteriores que han identificado y realizado versiones de GFP que permanecen estables en condiciones ácidas46. Estudios previos completos han creado dominios de inmunoglobulina fusionados con una proteína de interés, a menudo llamadas IgG-fusiones, que este protocolo también puede acomodar28. Al crear y expresar una fusión IgG compuesta por un IgG1 humanizado fusionado con un GFP y asGFP, pudimos visualizar la presencia de la proteína deseada durante los procesos de expresión, extracción y purificación.

Si un investigador experto sigue este protocolo, las hojas comenzarán a mostrar signos de necrosis en los sitios de infiltración entre los días 4-5. Sin embargo, cuando se utilizan los vectores descritos, las áreas infiltradas de las hojas deben aparecer saludables hasta el día 5 con el cuidado adecuado. Es importante tener en cuenta que la infección por Agrobacterium por sí sola eventualmente dará lugar a necrosis de las hojas de la planta debido a la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS) como parte de la respuesta inmune de la célula vegetal51,52. Esta respuesta inmunitaria y el nivel resultante de necrosis pueden variar en función de varios factores51,entre ellos la focalización celular, la ubicación de la proteína, el tipo de proteína que se produce, el vector de expresión y la cepa de Agrobacterium utilizada53,54. Además, las variaciones en la densidad óptica (OD600)del Agrobacterium utilizados para la infiltración pueden afectar a los niveles de necrosis55. Muchos vectores de expresión utilizan proteínas que unen la proteína del retinoblastoma para mantener las células de la planta en la fase de síntesis (S) y aumentar la división celular y la frecuencia de transformación56,57. El aumento de la producción de proteínas, como los causados por la unión a la proteína de retinoblastoma, puede conducir a la necrosis56,57. Los avances en el diseño vectorial, como los utilizados en versiones modificadas de los replicons de geminivirus BeYDV utilizados en este protocolo, han minimizado la necrosis manteniendo altos niveles de expresión deproteínas 58. Además, los replicons de BeYDV no compiten, proporcionando la expresión de múltiples proteínas en un solo casete sin limitaciones de tamaño conocidas53,59.

Varios factores afectan el crecimiento de la planta antes y después de la infiltración, que eventualmente podría conducir a un bajo rendimiento proteico. Al sembrar plantas, demasiadas semillas por pellet de planta puede resultar en muchos brotes de plantas pequeñas que conducen a un crecimiento más modesto de la planta. Por lo tanto, reducir el número de semillas por pellet de turba y eliminar los brotes adicionales después de una semana resultará en un mejor crecimiento de la planta. Mantener la humedad adecuada del suelo es otro factor que afecta la salud general de la planta. El exceso de agua, el subacuático, la adición de demasiado o muy poco fertilizante podría contribuir a la clorosis y afectar la salud de la planta60,61,62. La necrosis y la clorosis pueden ser causadas además por la producción de una proteína que causa estrés celular. Este fenómeno se ha visto muchas veces con la expresión de complejos inmunes recombinantes (RIC)56. Hemos observado que los cambios en la estructura proteica y la fusión de proteínas pueden ayudar a minimizar la necrosis; sin embargo, algunas proteínas pueden seguir siendo tóxicas para las plantas incluso después de varias modificaciones. Si se utilizan los vectores de expresión descritos en el presente documento, la extracción de proteínas puede realizarse antes y antes de la aparición de necrosis significativa, lo que resulta en un alto rendimiento proteico56.

Diferentes condiciones de crecimiento pueden ralentizar o incluso inhibir el crecimiento de Agrobacterium. Agrobacterium crece de forma óptima a 28 oC-30 oC y experimenta un choque térmico cuando se incuba por encima de 30 oC, produciendo errores de división celular62. El crecimiento también puede verse obstaculizado por la adición de demasiada rifampicina, ya que las diferentes cepas de Agrobacterium son más o menos naturalmente resistentes a este antibiótico62. El cultivo bacteriano preparado para la infiltración con OD600 significativamente más alto de lo recomendado probablemente causará necrosis55. Un OD600 ligeramente superior del cultivo generalmente no afecta al rendimiento, pero si es inferior a 0,1, el rendimiento de la proteína podría reducirse considerablemente. La acumulación de células muertas puede ocurrir en dos circunstancias; 1) el cultivo fue cubierto, lo que llevó a una fracción significativa de la DS siendo células muertas, y 2) dañando / matando el Agrobacterium después del crecimiento, como con residuos químicos o altas velocidades de centrífuga. Las infiltraciones que utilizan un mayor número de células muertas en el cultivo podrían reducir la expresión de proteínas. Por otra parte, perforar las hojas mediante la aplicación de demasiada presión puede dañar las hojas y por lo tanto podría conducir a necrosis prematura. Teniendo en cuenta estos posibles factores al expresar proteínas recombinantes en Nicotiana benthamiana,puede conducir a una mayor producción de proteínas.

La obtención de un bajo rendimiento proteico podría deberse a algunos problemas en los pasos de extracción y purificación. En primer lugar, el búfer de extracción podría necesitar optimización dependiendo de la proteína de interés. Durante la mezcla, el material vegetal debe ser homogéneo sin piezas de hoja visibles. A continuación, algunas proteínas requieren detergentes para la solubilización en el tampón de extracción, como Tween-20 o Triton. Otras proteínas pueden necesitar urea a altas concentraciones de 7,5 M para la solubilización, mientras que algunas solo se pueden extraer con PBS. La degradación de la proteína puede ocurrir si los tampones, el tejido vegetal, las centrífugas, etc. no se mantienen frescos durante el proceso de extracción. La falta de inhibidores de la proteasa y ascorbato sódico o sustancias químicas similares en el tampón de extracción también pueden causar degradación o agregación. Algunos inhibidores de la proteasa como el síndrome premenstrual se degradan rápidamente, y el ascorbato sódico tarda algún tiempo en volverse acuoso. En general, los investigadores deben determinar las condiciones óptimas para su proteína de interés.

La purificación de las fusiones IgG incluye pocos pasos que podrían necesitar modificaciones si se obtiene un bajo rendimiento proteico. El análisis de las alícuotas de muestra recogidas durante todo el proceso por SDS-PAGE y Western ayudará a identificar la falla de los métodos. Por ejemplo, si el flujo contiene una cantidad sustancial de proteína, entonces la unión de la proteína se puede facilitar cambiando el pH del tampón. El uso de altas concentraciones de detergentes durante el proceso de extracción puede afectar a la propiedad de unión de la resina, especialmente si la resina se reutiliza varias veces. El almacenamiento adecuado de la resina, como se describe en los métodos, es vital para la vida útil de la resina. Además, si la etapa de lavado elimina la proteína de interés de la resina, es posible que sea necesario rehecho los tampones para resolver este problema. Otros problemas con la purificación de proteínas pueden deberse a proteínas mal pleidas o degradadas, que podrían requerir un análisis adicional del diseño general de proteínas. Hacer referencia a la solución de problemas descrita puede aumentar la eficiencia de la purificación utilizando este protocolo.

La purificación de fusión GFP-IgG descrita es útil en un entorno de enseñanza. La visualización es fundamental para la educación científica porque permite a los estudiantes comprender conceptos más fácilmente39. Los estudiantes a menudo reportan malentendidos además de dificultad para entender conceptos en el nivel molecular39. En particular, los experimentos que requieren una comprensión de la ubicación específica de la proteína en cada paso se pueden modificar etiquetando proteínas de interés con moléculas fluorescentes. Por lo tanto, GFP o asGFP, dependiendo del entorno de pH utilizado, se pueden utilizar para aprovechar su fluorescencia para facilitar la elucidación de la técnica de purificación de proteínas para los estudiantes.

En resumen, describimos un método simple para la expresión y purificación de un Ab recombinante fusionado con una GFP en plantas N. benthamiana. Este protocolo se puede utilizar para la purificación de un Ab fusionado con cualquier proteína diana deseada. El proceso se puede editar para acomodar varias cantidades de material de hoja y permite la determinación visual de la presencia de proteínas antes, durante y después de la conclusión del proceso de extracción y purificación de proteínas. Estos métodos pueden ser útiles como controles y pueden ser diseñados para técnicas de enseñanza.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Maria Pia DiPalma por editar el vídeo. También agradecemos a la Oficina de Alcance Educativo y Servicios Estudiantiles de la Universidad Estatal de Arizona por su generosa asistencia de cuota de publicación. La investigación para este protocolo fue apoyada por la Escuela de Ciencias de la Vida de la Universidad Estatal de Arizona.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biología Número 167 anticuerpos anticuerpos monoclonales pharming molecular agroinfiltración expresión transitoria Nicotiana benthamiana,proteína fluorescente verde proteína fluorescente verde ácida-estable fusión de anticuerpos igG-fusión purificación de proteína G
Producción de proteínas de fusión IgG expresada transitoriamente en <em>Nicotiana benthamiana</em>
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Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

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