Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Produksjon av IgG Fusion Proteiner Forbigående Uttrykt i Nicotiana benthamiana

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver her en enkel metode for uttrykk, ekstraksjon og rensing av rekombinant human IgG smeltet til GFP i Nicotiana benthamiana. Denne protokollen kan utvides til rensing og visualisering av mange proteiner som benytter kolonnekromatografi. Videre er protokollen tilpasningsdyktig til personlig og virtuell høyskoleundervisningslaboratorium, som gir prosjektbasert utforskning.

Abstract

Høy etterspørsel etter antistoffer som terapeutiske intervensjoner for ulike smittsomme, metabolske, autoimmune, neoplastiske og andre sykdommer skaper et økende behov for å utvikle effektive metoder for rekombinant antistoffproduksjon. Per 2019 var det mer enn 70 FDA-godkjente monoklonale antistoffer, og det er eksponentielt vekstpotensial. Til tross for deres løfte, begrensende faktorer for utbredt bruk er produksjonskostnader og kompleksitet. Potensielt tilbyr planter rimelige, trygge og lett skalerbare proteinproduksjonsstrategier. Planter som Nicotiana benthamiana kan ikke bare riktig brette og montere komplekse pattedyrproteiner, men kan også legge til kritiske post-translasjonelle modifikasjoner som ligner på de som tilbys av pattedyrcellekulturer. I dette arbeidet, ved hjelp av innfødte GFP og en syre-stabil variant av grønt fluorescerende protein (GFP) smeltet til humane monoklonale antistoffer, var vi i stand til å visualisere hele forbigående antistoffuttrykk og rensingsprosess fra N. benthamiana planter. Avhengig av eksperimentets formål kan innfødt GFP-fusjon sikre enklere visualisering under uttrykksfasen i plantene, mens syrestabil GFP-fusjon gjør det mulig å visualisere under nedstrøms behandling. Denne skalerbare og enkle prosedyren kan utføres av en enkelt forsker for å produsere mg mengder svært rene antistoff- eller antistofffusjonsproteiner i løpet av få dager ved hjelp av bare noen få små planter. En slik teknikk kan utvides til visualisering av alle typer antistoffrensingsprosesser og potensielt mange andre proteiner, både i plante- og andre uttrykkssystemer. Videre kan disse teknikkene være til nytte for virtuelle instruksjoner og bli utført i et undervisningslaboratorium av lavere studenter som har minimal tidligere erfaring med molekylærbiologiteknikker, og gir grunnlag for prosjektbasert utforskning med virkelige applikasjoner.

Introduction

Bransjerapporter tyder på at tretten av de tjue mest innbringende stoffene i USA var biologiske (proteinbaserte legemidler), hvorav ni var antistoffer. Per 2019 var det over 570 antistoff (Ab) terapeutiske midler i ulike kliniske utviklingsfaser1,2,3. Nåværende globale Ab salg overstiger 100 milliarder USD, og monoklonale Ab (mAb) terapeutiske markedet forventes å generere opp til 300 milliarder USD innen 20251,4. Med så høy etterspørsel og forventede økninger i inntektene, har forskere jobbet med å utvikle måter å produsere Ab-terapeutiske midler i en stadig større skala, med høyere kvalitet og lavere kostnader. Plantebaserte uttrykkssystemer har flere fordeler fremfor tradisjonelle pattedyrcellelinjer for rimelig og storskala produksjon av Ab therapeutics5,6. Produksjon av proteinterapeutiske midler i planter ("molekylær pharming") krever ikke dyre bioreaktorer eller cellekulturfasiliteter som tradisjonelle pattedyrcellekulturteknikker7,8. Planter kan ikke kontrakt menneskelige patogener, minimere potensiell forurensning9. Både forbigående og transgent plantebasert proteinuttrykk kan benyttes som rimeligere alternativer til pattedyr- eller bakterieproduksjonssystemer10. Selv om transgene planter foretrekkes for avlingsproduksjon, kan rekombinant proteinproduksjon ved hjelp av denne metoden kreve uker til måneder. Fremskritt i forbigående uttrykk ved hjelp av virale vektorer gjennom enten sprøyte eller vakuum agroinfiltrasjon tillater henholdsvis små- og storskala produksjon av ønsket protein i dag11,12,13,14. Produksjon av mAbs mot Ebola, Dengue og Zika, og mange andre rekombinante proteiner, har blitt produsert og renset raskt og effektivt ved hjelp av forbigående uttrykk i N. benthamiana planter 15,16,17,18,19. Disse omstendighetene gjør forbigående plantebasert uttrykk et attraktivt alternativ for å utvikle flere Ab-terapeutiske midler og metodene som er demonstrert i denne protokollen20.

Førstegenerasjons mAbs var av murinavledning, noe som resulterte i ikke-spesifikk immunogenitet når de brukes i humane studier21. Over tid, chimeric, humanisert, og til slutt, fullt menneskelig Abs ble produsert for å redusere immunogenisitet indusert av Ab terapeutiske. Dessverre forårsaker noen av disse Abs fortsatt vertsimmunogenitet på grunn av forskjeller i glykosylering21. Utviklingen i anleggsteknikk har tillatt for modifisering av Ab glycans, noe som er viktig siden en Ab stabilitet og funksjon kan betydelig påvirkes av sin glykosylering tilstand22. Fremskritt har tillatt produksjon i plantesystemer av høyt nivå uttrykk for humaniserte mAbs, som inneholder menneskelige glykomaner og resulterende de ønskede biologiske egenskapene til en masseprodusert menneskelig farmasøytisk19,21.

I tillegg til rekombinante Abs, ab fusjonmolekyler (Ab fusjoner) har blitt utforsket for ulike formål de siste tiårene. Ab fusjoner består ofte av en Ab eller Ab fragment smeltet til et molekyl eller protein og er utformet for å fremkalle svar fra immuneffektorceller23. Disse molekylene har blitt opprettet som potensielle terapeutiske inngrep for å behandle ulike patologier som kreft og autoimmunesykdommer 24,25,26,27. Rekombinante immunkomplekser (IC) er en annen klasse av Ab fusjoner som har blitt ansatt som vaksinekandidater28. RICs dra nytte av immunsystemet evne til å gjenkjenne Fc regioner av Ab fusjoner og har blitt funnet å forbedre immunogenisitet når kombinert med andre vaksine plattformer29,30,31.

Green Fluorescent Protein (GFP) er et bioluminescerende protein avledet fra manetene Aequorea Victoria, som avgir grønt lys når begeistret av ultrafiolettlys 32,33. Gjennom årene har GFP bruk som en visuell markør for genuttrykk utvidet fra uttrykk i Escherichia coli til mange protein uttrykkssystemer, inkludert N. benthamiana planter 34,35,36,37,38. Synlige markører, som GFP, har rikelig implikasjoner i undervisning og læring av vitenskapelige begreper. Tallrike entry-level studenter beskriver vanskeligheter med å forstå vitenskapelige begreper når ideen blir undervist er ikke synlig for det blotte øye, for eksempel begrepene molekylærbiologi og relaterte felt39. Visuelle markører, som GFP, kan dermed bidra til behandling av informasjon knyttet til de vitenskapelige prosessene og kan bidra til å redusere vanskelighetene studentene rapporterer i å lære mange vitenskapelige konsepter.

Selv om GFP ofte brukes som markør for å indikere gen og uttrykk in vivo, er det vanskelig å visualisere det i nedstrømsprosessene hvis du bruker sure forhold. Denne situasjonen er først og fremst fordi GFP ikke opprettholder sin struktur og resulterende fluorescens ved lav pH40. Midlertidige sure miljøer er ofte nødvendig i ulike renseprosesser, for eksempel protein G, protein A og protein L kromatografi, ofte benyttet for Ab rensing41,42,43,44. GFP mutanter har blitt brukt til å beholde fluorescens under sureforhold 45,46.

Her beskriver vi en enkel metode for uttrykk, ekstraksjon og rensing av rekombinante IgG-fusjonsproteiner i N. benthamiana-planter. Vi produserte tradisjonell GFP smeltet til N-endestasjonen til en humanisert IgG tung kjede, og skapte en GFP-IgG-fusjon. Samtidig utviklet vi fusjonen av en plantekodonoptimalisert sekvens for en syrestabil GFP (asGFP) til N-endestasjonen til en humanisert IgG-tung kjede, noe som skaper en asGFP-IgG-fusjon. Fordelene ved å produsere GFP-IgG inkluderer evnen til å visualisere tilstedeværelsen av et målprotein under uttrykket, mens asGFP-IgG gjør det mulig å se tilstedeværelsen av rekombinant protein i ikke bare uttrykks- og ekstraksjonstrinnene, men også i proteinets rensetrinn. Denne protokollen kan tilpasses for produksjon, rensing og visualisering av en rekke GFP fusjonsproteiner produsert i N. benthamiana og renset ved hjelp av kromatografi teknikker som krever lav pH. Prosessen kan også skreddersys til ulike mengder bladmateriale. Mens Abs og fusjonsproteiner merket med GFP eller asGFP ikke er ment å brukes til terapi, kan disse metodene være nyttige som kontroller under eksperimenter og kan også videre benyttes som et undervisningsverktøy for molekylær og cellulær biologi og bioteknologi, både personlig og praktisk talt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dyrke N. benthamiana planter

  1. Legg jord torvpellets på et brett og hell tidligere kokt, fortsatt varmt (~ 40-45 ° C), vann over torvpellets for full ekspansjon. Etter pellets er fullt utvidet, plasser 2-3 N. benthamiana frø på hver torv pellet ved hjelp av pinsett.
  2. Hell ca 0,5 i vann for å dekke bunnen av brettet. Merk skuffen med såingsdatoen. Fortsett å vanne plantene daglig med passende mengder gjødsel. Gjødsel (vannløselig all-purpose plantemat) konsentrasjon er vanligvis 2,5-2,8 g / L.
  3. Dekk brettet med en humidom topp når den plasseres i vekstkammeret. Hold de seedede torvpellets i vekstkammeret ved 23-25 °C, med en 16 t fotoperiode og 60% relativ fuktighet.
  4. Etter en uke, fjern ekstra planter forlater hver pellet med bare en frøplante.
  5. Når plantene er 2-3 uker gamle, overfør hver torvpellet til en individuell gryte som inneholder fuktighetskontrolljord. Denne demonstrasjonen brukte Miracle-Gro fuktighetskontroll potting jord.
  6. Vann daglig med 1 g / L gjødsel. La aldri jorda være helt tørr. Planter er klare for infiltrasjon når de er 5-6 uker gamle.

2. Fremstilling av Agrobacterium tumefaciens for infiltrasjon

MERK: GFP-IgG fusjonskonstruksjoner kan oppnås som beskrevet i dette papiret31. AsGFP genet ble innhentet og planteoptimalisert fra denne studien45. Følgende trinn må gjøres ved siden av en Bunsen brenner, og grunnleggende aseptiske teknikker bør brukes for å unngå forurensning.

  1. Strek A. tumefaciens EHA105 husing bønne gul dverg virus (BeYDV)19 plante uttrykk vektor for hver konstruksjon (asGFP-IgG, GFP-IgG, lyskjede) fra en glyserol lager på LB agar (10 g / L Tryptone, 10 g / L NaCl, 5 g gjær ekstrakt, 15 g / L agar, 50 μg / ml kanamycin) plate.
  2. Vokse for en dag i en 30 ° C stående inkubator. Isoler en enkelt koloni for verifisering av standard koloniskjerm PCR-protokoll.
  3. Bruk verifisert koloni for hver konstruksjon. Fyll konisk rør med 10 ml LB-medier (10 g/l tryptone, 10 g/l NaCl, 5 g gjærekstrakt, 50 μg/ml). Deretter legger du til 10 μL på 100 μg /ml kanamycin. Tilsett 10 μL på 2,5 μg/ml rifampicin for å forhindre E. coli-kontaminering. Inkuber ved 30 °C og 120-150 omdr./min over natten.
  4. Neste dag, hvis Agrobacterium kulturen er vokst til OD600 = 0,6-0,9, kan den brukes til infiltrasjon. Hvis det er overgrodd (OD600 > 1), bør 1-2 ml overføres til frisk LB med antibiotika og dyrkes til ønsket OD600. Avhengig av den første kulturens konsentrasjon, kan det potensielt ta to dager å vokse til OD600 = 0,6-0,9.
  5. Når du har riktig OD600,plasser kulturene i en sentrifuge, og pellet bakteriene ved sentrifugering på 4500 x g i 20 min, romtemperatur (RT).
  6. Dekanter supernatant fra begge prøvene, og deretter resuspend hver pellet i 1x infiltrasjon buffer (10 mM 2-(N-morpholino) etanesulfonic syre, 10 mM magnesiumsulfat, justert til pH 5.5 med KOH) for å få endelig OD600 = 0,4. Dette bør ta ca 15-45 ml infiltrasjonsbuffer, avhengig av den første kulturtettheten. Kombiner like store volumer av hver IgG-fusjonskonstruksjon med lyskjedekonstruksjonen for å få endelig OD600 = 0,2 per konstruksjon i hvert rør.

3. Nåle-mindre sprøyte agroinfiltrasjon

  1. Ta en rettet binders og 5-6 uker gamle N. benthamiana planter fra trinn 1. Bruk bindersens skarpe kant til å lage en liten punktering i det første epidermale laget av bladet på adaxialoverflaten. Unngå å punktere det hele veien gjennom.
    MERK: De nedre bladene er lettere for infiltrasjon, mens bladene på toppen av planten er vanskeligere. Generelt er uttrykket av rekombinante proteiner høyest i bladene som ligger midt i en plante, og disse bladene blir også mindre nekrotiske.
  2. Fyll en 1 ml sprøyte, uten en nål festet, med den tilberedte Agrobacterium-løsningen fra trinn 2. Dekk hullet som er laget i forrige trinn med enden av sprøyten og trykk sakte for å injisere bakteriene i bladet mens du bruker mildt mottrykk fra bak bladet. Se bladet mørkere når oppløsningen injiseres uten å legge for mye press på sprøyten.
  3. Prøv å infiltrere det meste av bladområdet maksimalt 3-4 ganger – overdreven bladskade kan hindre proteinutbytte. Det infiltrerte plantebladet vil for det meste virke mørkt fra bunnen.
    MERK: Denne bakterielle løsningen skal være nok til minst 3-4 planter per konstruksjon. Autoklav eventuell gjenværende bakteriell oppløsning før kassering.

4. Vokse og observere infiltrert N. benthamiana

  1. Plasser infiltrerte planter tilbake i vekstkammeret og fortsett å vanne daglig.
  2. Vær oppmerksom på bladene for klorose og nekrose i infiltrerte områder. Vær oppmerksom på planter for GFP-fluorescens (hvis GFP er til stede) under en lang og kortbølge UV-lampe.
  3. Dag 4-5 viser den høyeste fluorescensen av begge GFP-konstruksjonene i bladene. Høst alle bladene på 4-5 dpi (dager etter infiltrasjon) og veie det totale bladmaterialet.
  4. Bruk den umiddelbart for nedstrøms behandling eller oppbevar ved -80 °C til den er klar til bruk.

5. Protein ekstraksjon

  1. Oppbevar buffere og blenderkopper på is eller ved 4 °C før bruk.
  2. Forbered 2-3 ml iskald ekstraksjonsbuffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 med HCl) per 1 g plantemateriale. Tilsett 2 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) fra lager (100 mM) og 50 mM natriumaskorbat til ekstraksjonsbufferen like før ekstraksjon.
  3. Plasser plantevev fra trinn 4 inn i den forkjølte blenderkoppen. Tilsett en målt mengde kjølt ekstraksjonsbuffer i blenderkoppen (som angitt i trinn 5.2). Sett hurtigmikserkoppen på blenderen. Ta et forhåndskuttet parafilmark og strekk det over toppen av blenderkoppen. Bland til homogenitet med 20-sekunders intervaller, rør godt mellom blandingssykluser etter behov.
  4. Overfør blandet materiale til et beger. Tilsett en rørestang og rør ved 4 °C i 30 min for å forbedre proteinløselighet og for å tillate utfelling av faste stoffer.
  5. Legg 2 lag Miracloth over et rent beger på is og hell ekstraktet gjennom det for å fjerne store bladrester. Etter at alt ekstraktet er helt, brett Miracloth for å klemme gjenværende bladekstrakt. Ekstraktet skal virke mørkegrønt uten synlige partikler.
  6. Overfør 50 μL av denne prøven til et nytt 1,5 ml rør og etikett "totalt ekstrakt" for senere analyse. Overfør ekstraktet til sentrifugerør. Sentrifuger resten av planteekstraktet ved 16 000 x g i 20 min, 4 °C og overfør supernatanten til et konisk rør.
  7. Filtrer det løselige ekstraktet med en 50 ml sprøyte og sprøyteglassfiberfilter (0,75 μm).
  8. Samle 50 μL av en prøve etter sentrifugering, merk "løselig ekstrakt" for senere analyse.

6. Protein G kolonne kromatografi prosedyre

MERK: Protokollen som er beskrevet her er for tyngdekraft-flow kromatografi ved hjelp av Pierce Protein G agarose harpiks. Hvis du bruker en annen harpiks, se produsentens anvisninger for justeringer. La aldri harpiksen gå tørr og forhindre at all væske dreneres ut. Sett på uttaket etter behov.

  1. Sett opp en polypropylenkolonne som inneholder 20 ml prøve.
  2. Anslå mengden slurry som trengs avhengig av målet immunoglobulin type og dens affinitet til harpiks. Vanligvis er 3 ml total slam med 1,5 ml sengevolum tilstrekkelig for rensing av flere milligram Ab.
  3. Hell forsiktig den nødvendige mengden av resuspended slurry i den avgrensede kolonnen. Åpne kolonneuttaket fra bunnen av kolonnen og la den tømmes til det meste av bufferen er borte.
  4. Hell umiddelbart 10 ml vaskebuffer 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4,pH 7,4 med HCl) på toppen. La det renne og gjenta dette vasketrinn 2x.
  5. Bruk det filtrerte utvalget fra trinn 5 til kolonnen og samle gjennom gjennomflyten – aliquot 50 μL gjennomstrømning for senere analyse. Lagre resten av gjennomstrømningen i tilfelle Ab ikke binder seg til harpiksen.
    MERK: Gjenbruk av gjennomstrømning til en ny kolonne fører vanligvis ikke til god avkastning. derfor anbefales det å starte med nytt bladmateriale.
  6. Vask harpiksen to ganger med 10 ml 1x PBS for å redusere ikke-spesifikk binding. Hvis ønskelig, aliquot 50 μL vask som bufferen drenerer gjennom kolonnen for å kontrollere at målet Ab ikke er eluted med en vaskebuffer.
  7. Sett opp og merk fem rør med 125 μL sterile 1 M Tris-HCl ved pH 8. Dette er for å nøytralisere Abs i den sure elution bufferen for å unngå potensielle strukturelle endringer. Alternativt kan du tilsette 30 μL 2 M Tris-base for å få en mindre fortynnet prøve.
    FORSIKTIG: Under elution kan UV-lys brukes til visualisering. Dette trenger ikke å gjøres i løpet av elution. Hvis UV brukes, må du ha på deg egnet PPE for å unngå øye- og hudskader. Et UV-lys trenger ikke å brukes under elution trinn.
  8. Elute Abs ved å bruke 5 ml elution buffer (100 mM glycin, pH 2.5 med HCl) til kolonnen og samle 1 ml fraksjoner til hvert utpekt rør fra forrige trinn.
  9. Generer umiddelbart kolonnen ved å bruke 20 ml vaskebuffer, etterfulgt av 10 ml vaskebuffer. Sørg for at harpiksen ikke er igjen i et surt miljø over lengre tid. Elutions bør virke fluorescerende, ofte den høyeste fluorescens er sett i den andre elution, men kan variere fra ekstraksjon til ekstraksjon.
  10. For lagring, vask harpiksen med 10 ml 20% etanol i PBS og la den renne halvveis. Sett toppen på igjen, deretter bunnen av kolonnen, og hold deg oppreist ved 4 °C.
    MERK: Vanligvis kan protein G-harpikser gjenbrukes opptil 10 ganger uten betydelig tap av effektivitet. Se produsentens retningslinjer for spesifikke detaljer.
  11. Bestem Ab konsentrasjon ved hjelp av et spektrofotometer ved å måle absorbans ved 280 nm, ved hjelp av elution bufferen som en tom. Oppbevar eluatene i -80 °C og aliquot 50 μL av hver brøk til et eget rør for videre analyse.

7. SDS-SIDE for GFP-Ig fusjonsdeteksjon

  1. Klargjør alle eksemplene før du konfigurerer SDS-PAGE.
    1. Tilsett 4 μL prøvebuffer (6x redusere prøvebuffer: 3,0 ml glyserol, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 ml 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg bromofenolblå); (6x ikke-reduserende prøvebuffer: 3,0 ml glyserol, 1 g SDS, 7 ml 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg bromofenolblå) til 20 μL av hver prøve (totalt ekstrakt, oppløselig ekstrakt, gjennomstrømning, vask, alle elutionfraksjoner) for analyse. Kontroller at rørhettene er godt festet.
    2. Behandle bare redusere prøver i 5 min i et kokende vannbad, og legg deretter prøver i 5 min på is. Spinn prøver i en mikrocentrifuge for ~ 5 s og last 20 μL av hver prøve i rekkefølgen av samlingen i gelbrønnene. Legg 3 μL av dual-color protein stige i en egen brønn.
  2. Kjør SDS-PAGE gel på en konstant 100 V til ønsket protein bånd separasjon; det tar ca 1,5 timer. Overvåk stigen som en indikator på proteinseparasjon.
  3. Visualiser gelen under UV for å observere GFP fluorescens.
  4. Hvis ønskelig, flekk gelen med Coomassie flekk for å vurdere totalt protein i hver prøve. Alternativt kan du utføre vestlig flekk for å evaluere målprotein ved hjelp av spesifikke Abs.
    MERK: Både Coomassie farging og vestlig flekk kan utføres ved å følge standardprotokoller47,48.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne studien viser en enkel og rask metode for å produsere rekombinante proteiner og visualisere dem gjennom nedstrøms prosesser. Ved hjelp av N. benthamiana og etter den medfølgende protokollen, kan rekombinant proteinproduksjon beskrevet her oppnås på mindre enn en uke. Den generelle arbeidsflyten for planteuttrykk, ekstraksjon og rensing vises i figur 1. Stadier av plantevekst fra 2-ukers gamle frøplanter, 4-ukers gamle planter og 6-ukers gamle planter vises i henholdsvis figur 1A (1-3), mens figur 1B viser bladmorfologiske endringer på grunn av nekrose (figur 1B-1) eller klorose (figur 1B-2). Nekrose kan forekomme på injeksjonsstedet mellom dag 3-5 etter infiltrasjon. Disse endringene avhenger ofte av proteinets egenskaper som uttrykkes og de infiltrerte plantenes helse (videre undersøkt i diskusjon). Samtidig kan klorose også stole på helsen til planter som brukes (videre undersøkt i diskusjon). Prosessen med Agrobacterium vekst og forberedelse til infiltrasjon er vist i figur 1C. Figur 1C-1 viser isolerte kolonier av Agrobacterium. Figur 1C (2-5) viser medienes forventede utseende etter at det er inokulert med en enkelt isolert koloni. Se figur 3 hvis du vil ha mer informasjon om disse trinnene. Planteinfiltrasjonsprosessen er vist i figur 1D og begynner med en ikke-infiltrert plante og etterfølges av infiltrasjonsprosessen. Uttrykket, ekstraksjonen og avklaringen av planteproteiner vises i figur 1E. Bladmaterialet er plassert i en blender og er homogenisert, vist i figur 1E (1-3). En prøve som representerer total homogenat blir deretter tatt. Det filtreres deretter gjennom en Miracloth (gasbind eller til og med et kaffefilter kan erstatte reduserte utgifter), og den avklarede suspensjonen sentrifugeres. Sentrifugeringen gjør det mulig å skille mellom de overnaturlige fra de resterende materialene, som vist i figur 1E (4-6). Den avklarte supernatanten lastes deretter på en protein G affinitet kromatografi kolonne, Figur 1F (1-3). Etter at det meste av proteinet er bundet, figur 1F-4, blir proteinene unnsluppet fra harpiksen figur 1F(5,6).

Tabell 1 viser planteoptimaliserte nukleinsyresekvenser som brukes til å produsere asGFP45 (øvre rad) i pBY! KEAM-GFPasH vektor som brukes i denne studien til å uttrykke asGFP-IgG fusjon og GFP33 (nedre rad) i PBYEAM-GFPHgp vektoren som brukes i denne studien for å uttrykke GFP-IgG fusjon. Nukleinsyresekvenser ble undersøkt ved hjelp av Expasy protein translate tool (https://web.expasy.org/translate/) for å bestemme aminosyresekvenser.

En representativ Agrobacterium plate utarbeidet ved hjelp av denne protokollen er vist i figur 2. Ønskede kolonier skal vises runde og ensartede i form og farge. Kolonier nærmere midten av platen har en høyere sannsynlighet for å uttrykke kanamycinresistens. De flytende kulturene vil bli utarbeidet fra en enkelt isolert koloni.

Det forventede utseendet på medier som inneholder kulturer er vist i figur 3. Ved innledende inokulasjon av en isolert koloni, lb media vil vises lys gul og gjennomskinnelig, som vist i figur 3A. Etter inkubasjon av en isolert koloni over natten ved 30 °C, lb media vil virke uklar. Som vist i figur 3Bkan objekter ikke lenger ses gjennom media når veksten er til stede i LB. Etter sentrifugering bør en pellet dannes på bunnen av røret. Røret vil ha en klar separasjon av LB media over pellet og vil vises lys gul og gjennomsiktig, som vist i figur 3C. LB media supernatant kastes, og pelleten brukes på nytt i infiltrasjonsbufferen. Ved en OD600 av 0,2 vil mediet virke uklart, som vist i figur 3D. OD600 bør måles som beskrevet i metodene.

Figur 4 representerer prosessen med bladinfiltrasjon. En liten prod av bladet med en binders bør gi en pause i bladepdermis som ikke passerer helt gjennom bladet. Bruddet skal knapt pierce bladet slik at infiltrasjonsbufferen kan injiseres i bladet, vist i figur 4A-C. Suspensjonen av Agrobacterium og infiltrasjonsbuffer injiseres direkte inn i bruddet i bladet og endrer det infiltrerte bladets farge litt; se figur 4D-F.

Utseendet til blader som uttrykker IgG-fusjoner er representert i figur 5. Den viser blader som uttrykker asGFP-IgG-fusjoner (figur 5A) og GFP-IgG-fusjoner (figur 5C) under hvitt lys. Hvis konstruksjonene i denne protokollen brukes, når infiltrert på en 0,2 OD600, blader skal vises sunt på dager 1-5 for begge blader uttrykker asGFP-IgG fusjoner og blader uttrykker GFP-IgG fusjoner. Det kan være et lite nekrotisk utseende på injeksjonssteder på dag 5, noe som vanligvis tydeligvis er tydelig ved lysning av plantevevet i disse områdene. Figur 5 viser også blader som uttrykker asGFP-IgG-fusjoner (figur 5B) og GFP-IgG-fusjoner (henholdsvis figur 5D), under langbølge UV-lys fra bladets øverste visning. Fluorescens øker i intensitet etter hvert som dagene utvikler seg for begge konstruksjonene uttrykt. Blader som uttrykker asGFP-IgG-fusjoner har en tendens til å ha litt mindre intens fluorescens enn blader som uttrykker GFP-IgG-fusjoner på alle dager.

Når supernatanten til asGFP-IgG-ekstraktet legges til Protein G-kolonnen, vil harpiksen bli litt grønn under hvitt lys på grunn av planteklorofyllpigmenter (figur 6A). Tilsetning av supernatant under kortbølge UV-lys resulterer i akkumulering av fluorescens i Protein G harpiks, som vist i figur 6B. Vær oppmerksom på at supernatanten også vil være fluorescerende alene under UV-lys. Likevel forventes fluorescens å være mye mer konsentrert når asGFP-IgG-fusjonen begynner å binde seg til harpiksen.

Etter passering av supernatant av asGFP-IgG gjennom proteinet G harpiks, skal harpiksen lyse under kortbølge UV-lys, som vist i figur 7A. På dette punktet vil det meste av IgG være bundet til harpiksen. Ved tilsetning av elutionbufferen vil fluorescensen i proteinet G-harpiks fortsatt være synlig under kortbølge-UV-lys og vil begynne å miste intensiteten etter hvert som mer eliminasjonsbuffer med lav pH passerer gjennom harpiksen. Fluorescens vil begynne å samle seg i eluatene (figur 7B). Eluate fraksjoner vil variere i fluorescens. Som vist i figur 8 er fluorescens den laveste intensiteteni første elitasjon og høyeste intensitet i andre og tredje eluates. Resultatene kan variere, da fluorescensen vil avhenge av proteinets uttrykk, høstet bladmateriale og andre forhold som brukes i forsøket.

Etter å ha fullført renseprosessen analyseres prøver på 10% SDS-PAGE gel under reduserte forhold (prøvebuffer inneholder DTT og prøver ble kokt i 5 min) og ikke-reduserende forhold (prøvebuffer inneholder ikke DTT og prøver ble ikke kokt). Som vist i figur 9A,vil bare ikke-reduserende prøver, for eksempel i Elution 2 NR-kjørefelt, fluorisere når de utsettes for kortbølge-UV-lys. Dette kjørefeltets første bånd fluorescing på hele produktets forventede størrelse ~ 200 kDa, noe som indikerer at asGFP fortsatt er konformi riktig. De fluorescerende båndene nær bunnen av gelen er fargestoff fra den reduserende bufferen. Vær oppmerksom på at asGFP mister fluorescens når den utsettes for temperaturer ved eller over 95 °C i 5 minutter; Dette er forskjellig fra eGFP (forbedret GFP), som ville opprettholde noen fluorescens under samme forhold49,50. To bånd av stigen, 75 kDa og 25 kDa, også fluoresce. Figur 9B representerer en Coomassie flekk av samme gel i figur 9A. Elutions i kjørefelt 6-9 er utarbeidet under reduserte forhold. Når de kjøres på en gel og Coomassie-farget, bør disse prøvene vise asGFP-IgG-fusjonskomponentene separat. Disse komponentene inkluderer den tunge kjeden smeltet til GFP (~ 75 kDa), den tunge kjeden alene (50 kDa), lyskjeden (25 kDa) og selve asGFP (27 kDa). Den ikke-reduserende prøven ble inkludert i den siste banen av gelen for sammenligningsformål og bør vise et enkelt stort bånd (~ 200 kDa), som skal bestå av to tunge kjeder smeltet til asGFP og respektive lyskjeder. I tillegg er mindre band sannsynligvis forårsaket av innfødte proteaser. Denne spalting kan forebygges med tilsetning av proteasehemmere og ved å holde proteinekstraktet kaldt til enhver tid, inkludert når du utfører kolonnerensingen. IgG-fusjonsproteinets individuelle komponenter vil ikke skilles i de ikke-reduserende prøvene på Coomassie gel.

Figure 1
Figur 1: Arbeidsflyt for planteuttrykk, ekstraksjon og rensingsprosesser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Nukleotid sekvens brukt Aminosyre Sekvens
Sekvenser
brukes til
asGFP i
PBY! KEAM
-GFPash
Vektor
brukes i
i
Uttrykk
av
asGFP-IgG
Fusion		 ATGGTGTCCAAGGGAGAGGAAGCTTCTGGAAGAGCCTTGTTC
CAGTACCCTATGACTTCTAAAATCGAGTTGAATGGCGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTTGCTGGAGAGGGTTTCACCCCTTC
ATCTGGAAGATTCAATATGCACGCTTACTGTACTACCGGAGAC
TTGCCTATGTCCTGGGTTGTTATAGCTTCCCCGCTTCAGTACGG
GTTTCACATGTTTGCCCACTACCCTGAGGATATCACTCACTTCTT
CCAAGAATGTTTTCCTGGGTCTTATACTCTCGACAGAACTTTGA
GGATGGAGGGAGACGGTACTCTTACTACTCACCACGAGTACTC
CCTTGAGGACGGTTGCGTTACTTCCAAGACTACTTTGAACGCTT
CTGGATTCGACCCCAAGGGAGCCACTATGACTAAGTCTTTCGT
CAAACAGCTCCCAAACGAGGTCAAAATCACCCCACACGGGCCA
AATGGTATTAGACTTACTTCCACTGTTCTACCTTAAGGAGGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAAGACTGCATCGTTACCCCA
GTTGGCGGCAGAAAAGTTACTCAGCCTAAGGCTCACTTTCTTC
ATACTCAGATCATTCAGAAGAAGGACCCAAACGACACCAGAG
ATCACATCGTTCAGACTGAGCTTGCCGTTGCTGGAAATCTTTG
GCACGGCATGGATGAGCTTTACAAGA		 MVSKGEEASGRALF
QYPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEGFTP
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
DRTLRMEGDGTLTT
HHEYSLEDGCVTSK
TTLNASGFDPKGAT
MTKSFVKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQIGTQD
CIVTPVGGRKVTQP
KAHFLHTQIIQKKDP
NDTRDHIVQTELAV
AGNLWHGMDELY
K
Sekvenser
brukes til
GFP i
PBYEAMGFPHgp
Vektor
brukes i
i
Uttrykk
av GFP-IgG
Fusion		 ATGGCTAACAAGCACCTCTCATTGTCTCTCTTCCTTGTGCTCCTT
GGTCTTTCTGCTTCTCTTGCTTCTGGTATGGTGAGCAAGGGCG
AGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTCCGGCGAGG
GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA
TCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGT
GACCACCTTCAGCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCC
GACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCG
AAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGG
CAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACAC
CCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGA
GGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAA
CAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGG
KATAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGC
AGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCG
GCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCAC
CCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCA LEILIGHET
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCAC
GGCATGGACGAGCTGTACAAGA		 MANKHLSLSLFLVLL
GLSASLASGMVSKG
EELFTGVVPILVELD
GDVNGHKFSVSGE
GEGDATYGKLTLKFI
2007: 100 000 000 000 000 00
TFSYGVQCFSRYP
DhmkQHDFFKSA
MPEGYVQERTIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
KEDGNILGHKLEYN
YNSHNVYIMADKQ
KNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNH
YLSTQSALSKDPNEK
RDHMVLLEFVTAA
GITH

Tabell 1: Sekvenser som brukes til å opprette asGFP og GFP

Figure 2
Figur 2: Agrobacterium kolonier dyrket på LB plate som inneholder kanamycin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Utseende av media gjennom vekst og behandling av Agrobacterium. (A) Utseendet til LB media umiddelbart etter inokulasjon av isolert Agrobacterium koloni. (B) Tilstedeværelsen av media etter overnatting inkubasjon av en isolert koloni ved 30 ° C. (C) Utseendet til media etter kulturer er spunnet ned i 20 min på 4500 x g. (D) Pellet resuspended i infiltrasjonbufferen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Prosess med infiltrasjon av N. benthamiana planter. (A-B) Litt poking bladet resulterer i et subtilt hull på toppen av bladet. (C-D) Injeksjon av Agrobacterium suspensjon i blad. (E) Infiltrert Planteblad fra toppvisningen. (F) Plant med flere blader infiltrert fra toppvisningen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Visualisering av blader som inneholder asGFP-IgG fusion og GFP-IgG fusion begynner på dag 1 post infiltrasjon (ppt) i første rad, som fører opp til dag 5 dpi i den siste raden for alle forhold. A) asGFP-IgG fusjon under hvitt lys. B) asGFP-IgG fusjon under langbølge UV. C) GFP-IgG fusjon under hvitt lys. D) GFP-IgG fusjon under langbølge UV. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Supernatant av asGFP-IgG-ekstraktet som legges til Protein G-kolonnen. A) Tillegg under hvitt lys. B) Tillegg under kortbølge UV-lys. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Protein G harpiks under kortbølge UV-lys etter supernatant av asGFP-IgG ekstrakt ble kjørt gjennom kolonnen. A) Protein G harpiks under kortbølge UV-lys. B) Protein G harpiks ved elution av proteiner under lave PH-forhold. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Rensede elitning av asGFP-IgG oppnådd etter eksponering for lave pH-forhold gjennom rensing. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: SDS-SIDE med kolonneeksempler. Eksempler merket med "R" er i reduserende forhold, og prøver merket med "NR" er i ikke-reduserende forhold. A) Under UV-lys, bare ikke-reduserende prøver fluoresce i 10% polyakrylamid gel, sett i Elution 2 NR lane. 75 kDa og 25 kDa stigebåndene fluorescerer også. B) Coomassie farging av samme gel avslører tilstedeværelsen av alle proteiner i prøven. I de reduserte elutions, IgG fusjon uten lys kjede, tung kjede, lys kjede, og muligens degradert GFP er til stede på ~ 75 kDa, ~ 50 kDa, ~ 25 kDa, og ~ 10 kDa, henholdsvis. I motsetning, i de ikke-reduserte elutions, er ett fremtredende bånd til stede, i samsvar med størrelsen på hele asGFP-IgG-fusjonen (~ 200 kDa). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen kan benyttes for visuell verifisering av eventuelle rekombinante Ab eller rekombinant protein produsert i N. benthamiana planter, inkludert de som krever midlertidig eksponering for sure miljøer for kolonnerensing formål42,43,44. Videre kan fusjonen av asGFP til andre proteiner i forskjellige uttrykkssystemer være et nyttig verktøy for eksperimentell visualisering og utdanning. Protokollen heri kan videre skaleres til større og mindre mengder bladmateriale for å produsere ønsket mengde rekombinant protein. De beskrevne metodene drar nytte av tidligere studier som har identifisert og laget versjoner av GFP som forblir stabile under sure forhold46. Omfattende tidligere studier har skapt immunglobulindomener smeltet sammen til et protein av interesse, ofte kalt IgG-fusjoner, som denne protokollen også kan romme28. Ved å skape og uttrykke en IgG-fusjon bestående av en humanisert IgG1 smeltet til en GFP og asGFP, var vi i stand til å visualisere tilstedeværelsen av ønsket protein under uttrykk, ekstraksjon og rensingsprosesser.

Hvis en dyktig forsker følger denne protokollen, vil bladene begynne å vise nekrosetegn på infiltrasjonsstedene mellom dag 4-5. Men når du bruker de beskrevne vektorene, bør infiltrerte områder av blader virke sunne frem til dag 5 med riktig forsiktighet. Det er viktig å merke seg at Agrobacterium infeksjon alene til slutt vil resultere i nekrose av plantebladene på grunn av akkumulering av reaktive oksygenarter (ROS) som en del av plantecellens immunrespons51,52. Denne immunresponsen og det resulterende nivået av nekrose kan variere basert påflere faktorer 51, inkludert cellulær målretting, proteinets plassering, proteintypen som produseres, uttrykksvektoren og belastningen av Agrobacterium brukt 53,54. Variasjoner i den optiske tettheten (OD600) av Agrobacterium som brukes til infiltrasjon, kan også påvirke nivåene av nekrose55. Mange uttrykksvektorer benytter proteiner som binder retinoblastomprotein for å holde plantecellene i syntese (S)-fase og øke celledeling ogtransformasjonsfrekvens 56,57. Økninger i proteinproduksjon, slik som de som er forårsaket av binding til retinoblastomprotein, kan føre til nekrose56,57. Fremskritt i vektordesign, for eksempel de som brukes i modifiserte versjoner av geminiviruset BeYDV-replicons som brukes i denne protokollen, har minimert nekrose samtidig som høye proteinuttrykknivåer58. BeyDV-repliker er også ikke-konkurrerende, noe som gir uttrykk for flere proteiner på en enkelt kassett uten kjente størrelsesbegrensninger53,59.

Flere faktorer påvirker plantevekst før og etter infiltrasjon, noe som til slutt kan føre til lavt proteinutbytte. Når såing planter, for mange frø per plantepellet kan resultere i mange små plante spirer fører til mer beskjeden plantevekst. Derfor vil reduksjon av frønummeret per torvpellet og fjerne de ekstra spirene etter en uke føre til bedre plantevekst. Opprettholde riktig jord fuktighet er en annen faktor som påvirker generelle anlegget helse. Overvanning, under vann, legge for mye eller for lite gjødsel kan bidra til klorose og påvirke anlegget helse60,61,62. Nekrose og klorose kan i tillegg skyldes produksjon av et protein som forårsaker cellestress. Dette fenomenet har blitt sett mange ganger med uttrykk for rekombinante immunkomplekser (RIC)56. Vi har observert at endringer i proteinstruktur og fusjon av proteiner kan bidra til å minimere nekrose; Noen proteiner kan imidlertid forbli giftige for planter selv etter ulike modifikasjoner. Hvis du bruker uttrykksvektorene som er skissert her, kan ekstraksjon av protein utføres tidlig og før utbruddet av betydelig nekrose, noe som resulterer i høyt proteinutbytte56.

Ulike vekstforhold kan bremse eller til og med hemme Agrobacterium vekst. Agrobacterium vokser optimalt ved 28 °C-30 °C og opplever et varmesjokk når det ruges over 30 °C, og produserer celledelingsfeil62. Vekst kan også hindres ved tillegg av for mye rifampicin, da forskjellige Agrobacterium-stammer er mer eller mindre naturlig motstandsdyktige mot dette antibiotika62. Bakteriekulturen forberedt for infiltrasjon med signifikant høyere OD600 enn anbefalt vil sannsynligvis forårsake nekrose55. En litt høyere OD600 av kulturen påvirker vanligvis ikke utbyttet, men hvis det er lavere enn 0,1, kan proteinutbyttet bli betydelig redusert. Akkumulering av døde celler kan oppstå under to omstendigheter; 1) kulturen ble overgrodd, noe som førte til en betydelig brøkdel av OD å være døde celler, og 2) skade / drepe Agrobacterium etter vekst, for eksempel med kjemiske rester eller høye sentrifuge hastigheter. Infiltrasjoner ved hjelp av et økt antall døde celler i kulturen kan redusere proteinuttrykket. Videre kan punktering av bladene ved å bruke for mye trykk skade bladene og dermed føre til for tidlig nekrose. Tatt i tanke på disse mulige faktorene når du uttrykker rekombinante proteiner i Nicotiana benthamiana, kan føre til forbedret proteinproduksjon.

Oppnå lav protein utbytte kan skyldes noen problemer i utvinning og rensing trinn. For det første kan ekstraksjonsbufferen trenge optimalisering avhengig av protein av interesse. Under blanding bør plantemateriale være homogent uten synlige bladbiter. Deretter krever noen proteiner vaskemidler for solubilisering i ekstraksjonsbufferen, for eksempel Tween-20 eller Triton. Andre proteiner kan trenge urea ved høye konsentrasjoner ~ 7,5 M for solubilisering, mens noen bare kan ekstraheres med PBS. Nedbrytning av protein kan oppstå hvis buffere, plantevev, sentrifuger, etc. ikke holdes kjølig under ekstraksjonsprosessen. Mangel på proteasehemmere og natriumaskorbat eller lignende kjemikalier i ekstraksjonsbufferen kan også forårsake nedbrytning eller aggregering. Noen proteasehemmere som PMSF forringes raskt, og natriumascorbate tar litt tid å bli vandige. Samlet sett bør forskerne bestemme optimale forhold for deres protein av interesse.

Rensingen av IgG-fusjoner inneholder få trinn som kan trenge modifikasjoner hvis lavt proteinutbytte oppnås. Analysere eksempel aliquots samlet under hele prosessen av SDS-PAGE og Western vil bidra til å identifisere feilen av metodene. For eksempel, hvis gjennomstrømningen inneholder en betydelig mengde protein, kan bindingen av proteinet lettes ved å endre bufferens pH. Bruk av høye konsentrasjoner av vaskemidler under ekstraksjonsprosessen kan påvirke harpiksens bindingsegenskap, spesielt hvis harpiksen brukes på nytt flere ganger. Riktig lagring av harpiksen, som beskrevet i metodene, er avgjørende for harpiksens levetid. Videre, hvis vasketrinnet fjerner proteinet av interesse fra harpiksen, kan bufferne måtte gjenskapes for å løse dette problemet. Andre problemer med proteinrensing kan skyldes feilfoldet eller degradert proteiner, noe som kan kreve ytterligere analyse av den generelle proteindesignen. Referanse til den beskrevne feilsøkingen kan øke effektiviteten til rensingen ved hjelp av denne protokollen.

Den beskrevne GFP-IgG-fusjonsrensingen er nyttig i et undervisningsmiljø. Visualisering er grunnleggende for vitenskapsutdanning fordi det gjør det mulig for elevene å forstå begreper lettere39. Studentene rapporterer ofte misforståelser i tillegg til vanskeligheter med å forstå begreper på molekylærtnivå 39. Spesielt kan eksperimentene som krever forståelse av den spesifikke proteinplasseringen på hvert trinn, endres ved å merke protein av interesse med fluorescerende molekyler. Derfor kan GFP eller asGFP, avhengig av pH-miljøet som brukes, brukes til å utnytte fluorescensen for å lette belysningen av proteinrensingsteknikken for studenter.

Oppsummert beskriver vi en enkel metode for uttrykk og rensing av en rekombinant Ab smeltet til en GFP i N. benthamiana planter. Denne protokollen kan brukes til rensing av en Ab smeltet til ethvert ønsket målprotein. Prosessen kan redigeres for å imøtekomme ulike mengder bladmateriale og muliggjør visuell bestemmelse av proteintilstedeværelse før, under og etter avslutningen av proteinutvinning og rensingsprosessen. Disse metodene kan være nyttige som kontroller og kan være målrettet for undervisningsteknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Maria Pia DiPalma for redigering av videoen. Vi takker også Office of Educational Outreach and Student Services ved Arizona State University for deres sjenerøse publikasjonsavgiftshjelp. Forskning for denne protokollen ble støttet av School of Life Sciences, Arizona State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lu, R. M., et al. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases. Journal of Biomedical Science. 27 (1), (2020).
  2. Kaplon, H., Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2019. mAbs. 11 (2), 219-238 (2019).
  3. The top 20 drugs by U.S. sales. FiercePharma. , Available from: https://www.fiercepharma.com/special-report/top-20-drugs-by-2018-u-s-sales (2018).
  4. Grilo, A. L., Mantalaris, A. The Increasingly Human and Profitable Monoclonal Antibody Market. Trends in Biotechnology. 37 (1), 9-16 (2019).
  5. Kim, M. -Y., et al. Novel vaccination approach for dengue infection based on recombinant immune complex universal platform. Vaccine. 33 (15), 1830-1838 (2015).
  6. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Transgenic plants in the biopharmaceutical market. Expert Opinion on Emerging Drugs. 10 (1), 185-218 (2005).
  7. Stoger, E., Fischer, R., Moloney, M., Ma, J. K. -C. Plant Molecular Pharming for the Treatment of Chronic and Infectious Diseases. Annual Review of Plant Biology. 65 (1), 743-768 (2014).
  8. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and Bioengineering. 109 (10), 2575-2588 (2012).
  9. Yao, J., Weng, Y., Dickey, A., Wang, K. Y. Plants as factories for human pharmaceuticals: Applications and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28549-28565 (2015).
  10. Mor, T. S., Moon, Y. -S., Palmer, K. E., Mason, H. S. Geminivirus vectors for high-level expression of foreign proteins in plant cells. Biotechnology and Bioengineering. 81 (4), 430-437 (2003).
  11. Hefferon, K. L. Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins. Virology. 433 (1), 1-6 (2012).
  12. Yamamoto, T., et al. Improvement of the transient expression system for production of recombinant proteins in plants. Scientific Reports. 8 (1), 4755 (2018).
  13. Zhong, G. Y., et al. Commercial production of aprotinin in transgenic maize seeds. Molecular Breeding. 5 (4), 345-356 (1999).
  14. Giddings, G., Allison, G., Brooks, D., Carter, A. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals. Nature Biotechnology. 18 (11), 1151-1155 (2000).
  15. Fulton, A., Lai, H., Chen, Q., Zhang, C. Purification of monoclonal antibody against Ebola GP1 protein expressed in Nicotiana benthamiana. Journal of Chromatography A. 1389, 128-132 (2015).
  16. Diamos, A., et al. A highly expressing, soluble, and stable plant-made IgG fusion carrying Zika virus envelope domain III elicits potent immunogenic responses in mice without adjuvant. Frontiers in immunology. 3140 (11), (2020).
  17. Hunter, J. G. L., et al. Evaluation of a toxoid fusion protein vaccine produced in plants to protect poultry against necrotic enteritis. PeerJ. 2019 (3), 6600 (2019).
  18. Dent, M., et al. Plant-produced anti-dengue virus monoclonal antibodies exhibit reduced antibody-dependent enhancement of infection activity. Journal of General Virology. 97 (12), 3280-3290 (2016).
  19. Diamos, A. G., et al. High Level Production of Monoclonal Antibodies Using an Optimized Plant Expression System. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 472 (2020).
  20. Olinger, G. G., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant-derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 18030-18035 (2012).
  21. Mastrangeli, R., Palinsky, W., Bierau, H. Glycoengineered antibodies: towards the next-generation of immunotherapeutics. Glycobiology. 29 (3), 199-210 (2019).
  22. Montero-Morales, L., Steinkellner, H. Advanced Plant-Based Glycan Engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 81 (2018).
  23. Joosten, V., Lokman, C., vanden Hondel, C. A. M. J. J., Punt, P. J. The production of antibody fragments and antibody fusion proteins by yeasts and filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 2 (1), 1-15 (2003).
  24. Müller, D. Antibody fusions with immunomodulatory proteins for cancer therapy. Pharmacology and Therapeutics. 154, 57-66 (2015).
  25. Bootz, F., Neri, D. Immunocytokines: A novel class of products for the treatment of chronic inflammation and autoimmune conditions. Drug Discovery Today. 21 (1), 180-189 (2016).
  26. Jafari, R., Zolbanin, N. M., Rafatpanah, H., Majidi, J., Kazemi, T. Fc-fusion Proteins in Therapy: An Updated View. Current Medicinal Chemistry. 24 (12), (2017).
  27. Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. mAbs. 9 (2), 182-212 (2017).
  28. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  29. Mason, H. S. Recombinant immune complexes as versatile and potent vaccines. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 12 (4), 988-989 (2016).
  30. Diamos, A. G., et al. Vaccine synergy with virus-like particle and immune complex platforms for delivery of human papillomavirus L2 antigen. Vaccine. 37 (1), 137-144 (2019).
  31. Diamos, A. G., et al. Codelivery of improved immune complex and virus-like particle vaccines containing Zika virus envelope domain III synergistically enhances immunogenicity. Vaccine. 38 (18), 3455-3463 (2020).
  32. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  33. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  34. Palm, M., Baumstark-Khan, C., Horneck, G. Green Fluorescent Protein (GFP) Expression in Mammalian Cells After UV-Irradiation. Fundamentals for the Assessment of Risks from Environmental Radiation. , 311-316 (1999).
  35. Paemeleire, K., et al. Intercellular calcium waves in HeLa cells expressing GFP-labeled connexin 43, 32, or 26. Molecular Biology of the Cell. 11 (5), 1815-1827 (2000).
  36. Harper, B. K., Stewart, C. N. Patterns of Green Fluorescent Protein Expression in Transgenic Plants. Plant Molecular Biology Reporter. 18 (2), 141 (2000).
  37. Kaishima, M., Ishii, J., Matsuno, T., Fukuda, N., Kondo, A. Expression of varied GFPs in Saccharomyces cerevisiae: Codon optimization yields stronger than expected expression and fluorescence intensity. Scientific Reports. 6, (2016).
  38. Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21772029/ (2020).
  39. Mnguni, L. E. The theoretical cognitive process of visualization for science education. SpringerPlus. 3 (1), 1-9 (2014).
  40. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  41. Bjorck, L., Kronvall, G. Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-Binding reagent. The Journal of Immunology. 133 (2), (1984).
  42. Andrew, S. M., Titus, J. A. Purification of Immunoglobulin G. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 1-12 (2001).
  43. Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 848 (1), 40-47 (2007).
  44. Vola, R., Lombardi, A., Tarditi, L., Björck, L., Mariani, M. Recombinant proteins L and LG: efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 668 (2), 209-218 (1995).
  45. Shinoda, H., Ma, Y., Nakashima, R., Sakurai, K., Matsuda, T., Nagai, T. Acid-Tolerant Monomeric GFP from Olindias formosa. Cell Chemical Biology. 25 (3), 330-338 (2018).
  46. Roberts, T. M., et al. Identification and Characterisation of a pH-stable GFP. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  47. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods in Enzymology. 541, 161-167 (2014).
  48. Mahmood, T., Western Yang, P. C. Western blot: Technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  49. Vessoni Penna, T. C., Ishii, M., Cholewa, O., de Souza, L. C. Thermal characteristics of recombinant green fluorescent protein (GFPuv) extracted from Escherichia coli. Letters in Applied Microbiology. 38 (2), 135-139 (2004).
  50. Kang, S. J., Park, E. A., Lee, D. H., Hong, K. W. Comparison of the stability of eGFP displayed on the Bacillus subtilis spore surface using CotB and C-terminally truncated CotB proteins as an anchoring motif under extreme conditions. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 41 (2019).
  51. Kuta, D. D., Tripathi, L. Agrobacterium-induced hypersensitive necrotic reaction in plant cells: a resistance response against Agrobacterium-mediated DNA transfer. African Journal of Biotechnology. 4 (8), 752-757 (2005).
  52. Qiusheng, Z., Bao, J., Likun, L., Xianhua, X. Effects of antioxidants on the plant regeneration and GUS expressive frequency of peanut (Arachis hypogaea) explants by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 81 (1), 83-90 (2005).
  53. Diamos, A. G., Rosenthal, S. H., Mason, H. S. H.S. 5' and 3' Untranslated Regions Strongly Enhance Performance of Geminiviral Replicons in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 7, 200 (2016).
  54. Huang, Z., Chen, Q., Hjelm, B., Arntzen, C., Mason, H. A DNA replicon system for rapid high-level production of virus-like particles in plants. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 706-714 (2009).
  55. Diamos, A. G., Mason, H. S. Modifying the Replication of Geminiviral Vectors Reduces Cell Death and Enhances Expression of Biopharmaceutical Proteins in Nicotiana benthamiana Leaves. Frontiers in Plant Science. 9, 1974 (2019).
  56. Gordon-Kamm, W., et al. Stimulation of the cell cycle and maize transformation by disruption of the plant retinoblastoma pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11975-11980 (2002).
  57. Villemont, E., Dubois, F., Sangwan, R. S., Vasseur, G., Bourgeois, Y., Sangwan-Norreel, B. S. Role of the host cell cycle in the Agrobacterium-mediated genetic transformation of Petunia: Evidence of an S-phase control mechanism for T-DNA transfer. Planta. 201 (2), 160-172 (1997).
  58. Regnard, G. L., Halley-Stott, R. P., Tanzer, F. L., Hitzeroth, I. I., Rybicki, E. P. High level protein expression in plants through the use of a novel autonomously replicating geminivirus shuttle vector. Plant Biotechnology Journal. 8 (1), 38-46 (2010).
  59. Chen, Q., He, J., Phoolcharoen, W., Mason, H. S. Geminiviral vectors based on bean yellow dwarf virus for production of vaccine antigens and monoclonal antibodies in plants. Human Vaccines. 7 (3), 331-338 (2011).
  60. Morton, T. G., Gold, A. J., Sullivan, W. M. Influence of Overwatering and Fertilization on Nitrogen Losses from Home Lawns. Journal of Environmental Quality. 17 (1), 124-130 (1988).
  61. Brown, J. C. Iron Chlorosis in Plants. Advances in Agronomy. 13, 329-369 (1961).
  62. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory Maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. , CHAPTER, Unit3D.1 (2012).

Tags

Biologi antistoff monoklonalt antistoff molekylær pharming agroinfiltrasjon forbigående uttrykk Nicotiana benthamiana,grønt fluorescerende protein syrestabilt grønt fluorescerende protein antistofffusjon IgG-fusjon protein G rensing
Produksjon av IgG Fusion Proteiner Forbigående Uttrykt i <em>Nicotiana benthamiana</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P.,… More

Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter