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Biology

Produktion von IgG-Fusionsproteinen transient exprimiert in Nicotiana benthamiana

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Wir beschreiben hier eine einfache Methode für die Expression, Extraktion und Reinigung von rekombinantem menschlichen IgG, das mit GFP in Nicotiana benthamianaverschmolzen wird. Dieses Protokoll kann auf die Reinigung und Visualisierung zahlreicher Proteine erweitert werden, die die Säulenchromatographie nutzen. Darüber hinaus ist das Protokoll an das persönlich und virtuelle College-Lehrlabor anpassbar und bietet projektbasierte Erkundungen.

Abstract

Die hohe Nachfrage nach Antikörpern als therapeutische Interventionen für verschiedene infektiöse, metabolische, autoimmune, neoplastische und andere Krankheiten erzeugt einen wachsenden Bedarf an der Entwicklung effizienter Methoden für die rekombinante Antikörperproduktion. Im Jahr 2019 gab es mehr als 70 FDA-zugelassene monoklonale Antikörper, und es gibt exponentielles Wachstumspotenzial. Trotz ihres Versprechens sind die Herstellungskosten und die Komplexität die Produktionskosten und die Komplexität begrenzend. Potenziell bieten Anlagen kostengünstige, sichere und leicht skalierbare Proteinherstellungsstrategien. Pflanzen wie Nicotiana benthamiana können nicht nur komplexe Säugetierproteine richtig falten und zusammenfügen, sondern auch kritische posttranslationale Modifikationen hinzufügen, die denen von Säugetierzellkulturen ähneln. In dieser Arbeit konnten wir mit nativem GFP und einer säurestabilen Variante des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP), die mit menschlichen monoklonalen Antikörpern verschmolzen ist, den gesamten transienten Antikörperexpression und -reinigungsprozess aus N. benthamiana-Pflanzen visualisieren. Je nach Zweck des Experiments kann die native GFP-Fusion eine einfachere Visualisierung während der Expressionsphase in den Pflanzen gewährleisten, während die säurestabile GFP-Fusion eine Visualisierung während der Nachverarbeitung ermöglicht. Dieses skalierbare und unkomplizierte Verfahren kann von einem einzelnen Forscher durchgeführt werden, um Milligramm-Mengen an hochreinen Antikörper- oder Antikörperfusionsproteinen innerhalb weniger Tage mit nur wenigen kleinen Pflanzen herzustellen. Eine solche Technik kann auf die Visualisierung jeder Art von Antikörper-Reinigungsprozess und potenziell viele andere Proteine erweitert werden, sowohl in pflanzlichen als auch in anderen Expressionssystemen. Darüber hinaus können diese Techniken virtuellen Anweisungen zugute kommen und in einem Lehrlabor von Studenten durchgeführt werden, die über minimale Vorkenntnisse mit molekularbiologischen Techniken verfügen und eine Grundlage für projektbasierte Sonnungen mit realen Anwendungen bieten.

Introduction

Branchenberichten zufolge handelte es sich bei dreizehn der zwanzig am höchsten einumsatzreichsten Arzneimittel in den Vereinigten Staaten um Biologika (Protein-basierte Arzneimittel), von denen neun Antikörper waren. Im Jahr 2019 gab es über 570 Antikörper (Ab) Therapeutika in verschiedenen klinischen Entwicklungsphasen1,2,3. Der aktuelle weltweite Ab-Umsatz übersteigt 100 Milliarden US-Dollar, und der monoklonale Ab (mAb) therapeutische Markt wird bis 2025 voraussichtlich bis zu 300 Milliarden US-Dollar generieren1,4. Angesichts der hohen Nachfrage und der prognostizierten Umsatzsteigerungen haben forscher daran gearbeitet, Wege zu entwickeln, Ab-Therapeutika in immer größerem Maßstab zu produzieren, mit höherer Qualität und niedrigeren Kosten. Pflanzenbasierte Expressionssysteme haben mehrere Vorteile gegenüber traditionellen Säugetierzelllinien für die erschwingliche und großflächige Herstellung von Ab-Therapeutika5,6. Die Herstellung von Proteintherapeutika in Pflanzen ("molekulares Pharming") erfordert keine teuren Bioreaktoren oder Zellkulturanlagen wie die traditionellen Säugetierzellkulturtechniken7,8. Pflanzen können sich keine menschlichen Krankheitserreger anstecken, wodurch eine mögliche Kontamination minimiert wird9. Sowohl die transiente als auch die transgene pflanzliche Proteinexpression können als kostengünstigere Alternativen zu Säugetier- oder Bakterienproduktionssystemen verwendet werden10. Obwohl transgene Pflanzen für die Pflanzenproduktion bevorzugt werden, kann die rekombinante Proteinproduktion mit dieser Methode Wochen bis Monate in Anspruch erfordern. Fortschritte in der transienten Expression mit viralen Vektoren durch Spritze oder Vakuum-Agroinfiltration ermöglichen eine kleine bzw. großflächige Produktion des gewünschten Proteins in Tagen11,12,13,14. Die Produktion von mAbs gegen Ebola, Dengue und, Zika und zahlreiche andere rekombinante Proteine wurden schnell und effizient mit transienter Expression in N. benthamiana Pflanzen15,16,17,18,19hergestellt und gereinigt. Diese Umstände machen vorübergehende pflanzenbasierte Expression zu einer attraktiven Option für die Entwicklung mehrerer Ab-Therapeutika und der in diesem Protokoll20demonstrierten Methoden.

MAbs der ersten Generation waren von muriner Ableitung, was zu einer unspezifischen Immunogenität führte, wenn sie in Studien am Menschen verwendet wurde21. Im Laufe der Zeit wurden chimäre, humanisierte und schließlich vollständig menschliche Abs produziert, um die durch Ab-Therapeutika induzierte Immunogenität zu mindern. Leider verursachen einige dieser Abs immer noch Wirtsimmunogenität aufgrund von Unterschieden in der Glykosylierung21. Entwicklungen im Anlagenbau haben die Modifikation von Abglycanen ermöglicht, was unerlässlich ist, da die Stabilität und Funktion eines Ab durch seinen Glykosylierungszustand erheblich beeinträchtigt werden kann22. Fortschritte haben die Produktion von hochgradig erdtämmigen Humangups, die menschliche Glykane und daraus resultierend die gewünschten biologischen Merkmale eines massenproduzierten Humanarzneimittels enthalten, in Pflanzensystemen ermöglicht19,21.

Neben rekombinanten Abs wurden in den letzten Jahrzehnten auch Ab-Fusionsmoleküle (Ab-Fusionen) für verschiedene Zwecke erforscht. Ab-Fusionen bestehen oft aus einem Ab- oder Ab-Fragment, das mit einem Molekül oder Protein verschmolzen ist, und sind so konzipiert, dass sie Reaktionen aus Immuneffektorzellen entlocken23. Diese Moleküle wurden als mögliche therapeutische Interventionen zur Behandlung verschiedener Pathologien wie Krebs und Autoimmunerkrankungen24,25,26,27geschaffen. Rekombinante Immunkomplexe (RICs) sind eine weitere Klasse von Ab-Fusionen, die als Impfstoffkandidaten eingesetzt wurden28. RICs nutzen die Fähigkeit des Immunsystems, Fc-Regionen von Ab-Fusionen zu erkennen und haben festgestellt, dass sie die Immunogenität verbessern, wenn sie mit anderen Impfstoffplattformen kombiniert werden29,30,31.

Green Fluorescent Protein (GFP) ist ein biolumineszierendes Protein aus der Qualle Aequorea Victoria, die grünes Licht aussendet, wenn sie von ultraviolettem Licht angeregt wird32,33. Im Laufe der Jahre hat sich die Verwendung von GFP als visueller Marker der Genexpression von der Expression in Escherichia coli auf zahlreiche Proteinexpressionssysteme ausgeweitet, darunter N. Benthamiana-Pflanzen 34,35,36,37,38. Sichtbare Marker wie GFP haben reichlich Auswirkungen auf das Lehren und Erlernen wissenschaftlicher Konzepte. Zahlreiche Einsteiger beschreiben Schwierigkeiten beim Verständnis wissenschaftlicher Konzepte, wenn die gelehrte Idee mit bloßem Auge nicht sichtbar ist, wie die Konzepte der Molekularbiologie und verwandter Felder39. Visuelle Marker, wie GFP, können somit zur Verarbeitung von Informationen im Zusammenhang mit den wissenschaftlichen Prozessen beitragen und dazu beitragen, die Schwierigkeiten zu lindern, die Studenten beim Erlernen zahlreicher wissenschaftlicher Konzepte melden.

Obwohl GFP oft als Marker verwendet wird, um Gen und Expression in vivoanzuzeigen, ist es schwierig, es in den nachgelagerten Prozessen zu visualisieren, wenn saure Bedingungen verwendet werden. Dieser Umstand liegt in erster Linie daran, dass das GFP seine Struktur und die resultierende Fluoreszenz bei einem niedrigenpH-Wert von 40nicht aufrechterhält. Vorübergehende saure Umgebungen sind oft in verschiedenen Reinigungsprozessen erforderlich, wie Protein G, Protein A und Protein L Chromatographie, oft für Ab-Reinigung41,42,43,44verwendet. GFP-Mutanten wurden verwendet, um Fluoreszenz unter sauren Bedingungen zu behalten45,46.

Hierin beschreiben wir eine einfache Methode zur Expression, Extraktion und Reinigung rekombinanter IgG-Fusionsproteine in N. benthamiana-Pflanzen. Wir produzierten traditionelle GFP, die mit dem N-Terminus einer humanisierten IgG-Schwerenkette verschmolzen wurde, wodurch eine GFP-IgG-Fusion entstand. Gleichzeitig entwickelten wir die Verschmelzung einer pflanzenkodonoptimierten Sequenz für ein säurestabiles GFP (asGFP) zum N-Terminus einer humanisierten IgG-Schwerkette, wodurch eine asGFP-IgG-Fusion entsteht. Zu den Vorteilen der Herstellung von GFP-IgG gehört die Möglichkeit, das Vorhandensein eines Zielproteins während der Expression zu visualisieren, während als GFP-IgG das Vorhandensein von rekombinantem Protein nicht nur in den Expressions- und Extraktionsschritten, sondern auch in den Reinigungsschritten des Proteins sieht. Dieses Protokoll kann für die Herstellung, Reinigung und Visualisierung einer Reihe von GFP-Fusionsproteinen angepasst werden, die in N. benthamiana hergestellt und mit Chromatographie-Techniken gereinigt werden, die einen niedrigen pH-Wert erfordern. Der Prozess kann auch auf verschiedene Mengen an Blattmaterial zugeschnitten werden. Während Abs und Fusionsproteine, die mit GFP oder asGFP markiert sind, nicht für Therapien verwendet werden sollen, können diese Methoden als Kontrollen während der Experimente nützlich sein und können auch als Lehrmittel für molekulare und zelluläre Biologie und Biotechnologie weiter genutzt werden, sowohl persönlich als auch virtuell.

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Protocol

1. Kultivieren N. benthamiana Pflanzen

  1. Bodentorfpellets auf eine Schale legen und zuvor gekochtes, noch heißes Wasser über die Torfpellets gießen, um sie vollständig auszupflanzen. Nachdem Pellets vollständig erweitert sind, legen Sie 2-3 N. Benthamiana Samen auf jedem Torfpellet mit Pinzette.
  2. Gießen Sie etwa 0,5 in Wasser, um den Boden des Tabletts zu bedecken. Beschriften Sie das Fach mit dem Aussaatdatum. Die Sämlinge täglich mit entsprechenden Mengen Dünger weiter gießen. Die Düngemittelkonzentration (wasserlösliche Allzweckpflanzennahrung) beträgt in der Regel 2,5-2,8 g/L.
  3. Bedecken Sie das Tablett mit einem Humidome-Top, wenn es in der Wachstumskammer platziert wird. Bewahren Sie die gesäten Torfpellets in der Wachstumskammer bei 23-25 °C auf, mit einer 16-stunden-Photoperiode und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 %.
  4. Nach einer Woche, entfernen Sie zusätzliche Pflanzen verlassen jedes Pellet mit nur einem Sämling.
  5. Wenn die Pflanzen 2-3 Wochen alt sind, übertragen Sie jedes Torfpellet in einen einzelnen Topf, der feuchtigkeitsbefangene Böden enthält. Diese Demonstration verwendet Miracle-Gro Feuchtigkeitskontrolle Blumenerde.
  6. Täglich mit 1 g/L Dünger gießen. Lassen Sie den Boden niemals völlig trocken. Pflanzen sind bereit für die Infiltration, wenn sie 5-6 Wochen alt sind.

2. Herstellung von Agrobacterium tumefaciens zur Infiltration

HINWEIS: GFP-IgG-Fusionskonstrukte können wie in dieser Zeitung31beschrieben erhalten werden. Das asGFP-Gen wurde aus dieser Studie gewonnen und pflanzenoptimiert45. Die folgenden Schritte müssen neben einem Bunsenbrenner durchgeführt werden, und grundlegende aseptische Techniken sollten angewendet werden, um eine Kontamination zu vermeiden.

  1. Streifen A. tumefaciens EHA105 mit Bohnen-Gelb-Zwergvirus (BeYDV)19 Pflanzenexpressionsvektor für jedes Konstrukt (asGFP-IgG, GFP-IgG, Lichtkette) aus einem Glycerinbestand auf LB-Agar (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g Hefeextrakt, 15 g/L Agar, 50 g/m Kanamik)
  2. Wachsen Sie für einen Tag in einem 30 °C stehenden Inkubator. Isolieren Sie eine einzelne Kolonie zur Überprüfung durch Standard-Kolonie-Bildschirm PCR-Protokoll.
  3. Verwenden Sie für jedes Konstrukt eine verifizierte Kolonie. Konusierrohr mit 10 ml LB-Medien (10 g/L Trypton, 10 g/L NaCl, 5 g Hefeextrakt, 50 g/ml) füllen. Als Nächstes fügen Sie 10 l von 100 g/ml Kanamycin hinzu. Fügen Sie 10 l von 2,5 g/ml Rifampicin hinzu, um eine E. coli-Kontamination zu verhindern. Bei 30°C und 120-150 Rpm über Nacht inkubieren.
  4. Am nächsten Tag, wenn die Agrobacterium-Kultur auf OD600 = 0,6-0,9 angebaut wird, kann sie zur Infiltration verwendet werden. Wenn es überwuchert ist (OD600 > 1), 1-2 ml sollten auf frischeLB mit Antibiotika übertragen und auf die erforderliche OD600angebaut werden. Je nach Konzentration der Anfangskultur kann es möglicherweise zwei Tage dauern, bis od600 = 0,6-0,9 anwachsen.
  5. Einmal bei entsprechendem OD600,legen Sie die Kulturen in eine Zentrifuge, und pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 4.500 x g für 20 min, Raumtemperatur (RT).
  6. Dekantischer Überstand aus beiden Proben und dann jedes Pellet im 1x Infiltrationspuffer (10 mM 2-(N-morpholino) Ethansulfonsäure, 10 mM Magnesiumsulfat, angepasst auf pH 5,5 mit KOH), um endgültige OD600 = 0,4 zu erhalten. Dies sollte je nach anfänglicher Kulturdichte etwa 15-45 ml Infiltrationspuffer in Anspruch nehmen. Kombinieren Sie gleiche Volumina jedes IgG-Fusionskonstrukts mit dem Lichtkettenkonstrukt, um endgültige OD600 = 0,2 pro Konstrukt in jedem Rohr zu erhalten.

3. Nadellose Spritzen-Agrofiltration

  1. Nehmen Sie eine begradigte Büroklammer und 5-6 Wochen alte N. benthamiana Pflanzen aus Schritt 1. Mit der scharfen Kante der Büroklammer, machen Sie eine kleine Punktion in der ersten epidermalen Schicht des Blattes auf der adaxialen Oberfläche. Vermeiden Sie es, es den ganzen Weg durch zu punktieren.
    HINWEIS: Die unteren Blätter sind leichter für die Infiltration, während die Blätter auf der Oberseite der Pflanze härter sind. Im Allgemeinen ist die Expression rekombinanter Proteine in den Blättern in der Mitte einer Pflanze am höchsten, und diese Blätter werden auch weniger nekrotisch.
  2. Füllen Sie eine 1 ml Spritze ohne Nadel, mit der vorbereiteten Agrobacterium-Lösung aus Schritt 2. Bedecken Sie das Loch, das im vorherigen Schritt gemacht wurde, mit dem Ende der Spritze und schieben Sie langsam, um die Bakterien in das Blatt zu injizieren, während Sie sanften Gegendruck von hinter dem Blatt anwenden. Beobachten Sie, wie sich das Blatt verdunkelt, während die Lösung injiziert wird, ohne zu viel Druck auf die Spritze auszuüben.
  3. Versuchen Sie, den größten Teil der Blattfläche maximal 3-4 Mal zu infiltrieren – übermäßige Blattschäden können die Proteinausbeute behindern. Das infiltrierte Pflanzenblatt erscheint von der unteren Ansicht meist dunkel.
    HINWEIS: Diese bakterielle Lösung sollte für mindestens 3-4 Pflanzen pro Konstrukt ausreichen. Autoklavjede verbleibende bakterielle Lösung vor dem Verwerfen.

4. Wachsen und beobachten Sie die infiltrierte N. benthamiana

  1. Infiltrierte Pflanzen wieder in die Wachstumskammer geben und täglich weiter wässern.
  2. Beobachten Sie die Blätter für Chlorose und Nekrose in infiltrierten Gebieten. Beobachten Sie Pflanzen zur GFP-Fluoreszenz (wenn GFP vorhanden ist) unter einer lang- und kurzwelligen UV-Lampe.
  3. Tag 4-5 zeigt die höchste Fluoreszenz beider GFP-Konstrukte in den Blättern. Ernten Sie alle Blätter bei 4-5 dpi (Tage nach der Infiltration) und wiegen Sie das gesamte Blattmaterial.
  4. Verwenden Sie es sofort für die Weiterverarbeitung oder lagern Sie bei -80 °C, bis sie einsatzbereit sind.

5. Proteinextraktion

  1. Puffer und Mixerbecher vor Gebrauch auf Eis oder bei 4 °C aufbewahren.
  2. 2-3 ml eiskalter Extraktionspuffer (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 mit HCl) pro 1 g Pflanzenmaterial vorbereiten. Fügen Sie 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) aus Lager (100 mM) und 50 mM Natriumascorbat kurz vor der Extraktion in den Extraktionspuffer.
  3. Pflanzengewebe aus Schritt 4 in den vorgekühlten Mixerbecher legen. Fügen Sie dem Mixerbecher eine gemessene Menge an gekühltem Extraktionspuffer hinzu (wie in Schritt 5.2 angegeben). Legen Sie den Mixerbecher auf den Mixer. Nehmen Sie ein vorgeschnittenes Blatt Parafilm und dehnen Sie es über die Oberseite des Mixer-Bechers. Mit 20-Sekunden-Intervallen zu Homogenität verschmelzen und bei Bedarf zwischen den Mischzyklen gut rühren.
  4. Übertragen Sie Mischmaterial auf einen Becher. Fügen Sie einen Rührstab hinzu und rühren Sie bei 4 °C für 30 min, um die Proteinlöslichkeit zu verbessern und die Ausfällung von Feststoffen zu ermöglichen.
  5. Legen Sie 2 Schichten Miracloth über einen sauberen Becher auf Eis und gießen Sie den Extrakt durch sie, um große Blattablagerungen zu entfernen. Nachdem der Extrakt gegossen ist, falten Sie das Miracloth, um den Restblattextrakt zu drücken. Der Extrakt sollte dunkelgrün ohne sichtbare Partikel erscheinen.
  6. Übertragen Sie 50 l dieser Probe in ein neues 1,5 ml-Rohr und etikettieren Sie "Gesamtextrakt" für eine spätere Analyse. Übertragen Sie den Extrakt in Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie den Rest des Pflanzenextrakts bei 16.000 x g für 20 min, 4 °C und übertragen Sie den Überstand in ein konisches Rohr.
  7. Filtern Sie den löslichen Extrakt mit einer 50 ml Spritze und einem Spritzenglasfaserfilter (0,75 m).
  8. Sammeln Sie 50 l einer Probe nach zentrifugieren, Etikett "löslicher Extrakt" für spätere Analyse.

6. Protein-G-Säulenchromatographie-Verfahren

HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll ist für die Schwerkraft-Flow-Chromatographie mit Pierce Protein G Agaroseharz. Wenn Sie ein anderes Harz verwenden, beachten Sie die Anweisungen des Herstellers für Anpassungen. Lassen Sie das Harz niemals trocken laufen und verhindern Sie, dass die gesamte Flüssigkeit abfließt. Recap den Ausgang nach Bedarf.

  1. Richten Sie eine Polypropylensäule ein, die 20 ml Proben enthält.
  2. Schätzen Sie die benötigte Güllemenge in Abhängigkeit vom Zielimmunglobulintyp und seiner Affinität zum Harz. Im Allgemeinen reichen 3 ml Gesamtgülle mit 1,5 ml Bettvolumen für die Reinigung mehrerer Milligramm Ab aus.
  3. Gießen Sie vorsichtig die erforderliche Menge an resuspendierter Gülle in die gekappte Säule. Öffnen Sie den Spaltenausgang vom unteren Rand der Spalte, und lassen Sie ihn abfließen, bis der größte Teil des Puffers weg ist.
  4. Sofort 10 ml Waschpuffer 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.4 mit HCl) oben drauf gießen. Lassen Sie es abtropfen und wiederholen Sie diesen Waschschritt 2x.
  5. Wenden Sie die gefilterte Probe aus Schritt 5 auf die Spalte an, und erfassen Sie den Durchfluss – aliquot 50 L Flowthrough für eine spätere Analyse. Speichern Sie den Rest des Durchflusses, falls das Ab nicht an das Harz bindet.
    ANMERKUNG: Das erneute Anwenden von Flowthrough auf eine neue Spalte führt in der Regel nicht zu einer guten Ausbeute. Daher wird empfohlen, mit neuem Blattmaterial zu beginnen.
  6. Waschen Sie das Harz zweimal mit 10 ml 1x PBS, um die unspezifische Bindung zu reduzieren. Falls gewünscht, wird aliquot 50 l waschen, wenn der Puffer durch die Spalte abfließt, um sicherzustellen, dass das Ziel Ab nicht mit einem Waschpuffer eluiert wird.
  7. 5 Tuben mit 125 l sterilem 1 M Tris-HCl bei pH 8 aufstellen und beschriften. Dies ist die Abs im sauren Elutionspuffer zu neutralisieren, um mögliche strukturelle Veränderungen zu vermeiden. Alternativ können Sie 30 L von 2 M Tris-Basis hinzufügen, um eine weniger verdünnte Probe zu erhalten.
    VORSICHT: Während der Elution kann UV-Licht zur Visualisierung verwendet werden. Dies muss nicht für die Dauer der Elution erfolgen. Wenn UV verwendet wird, achten Sie darauf, geeignete PSA zu tragen, um Schäden an Augen und Haut zu vermeiden. Ein UV-Licht muss während des Elutionsschritts nicht verwendet werden.
  8. Elute the Abs durch Auftragen von 5 ml Elutionspuffer (100 mM Glycin, pH 2,5 mit HCl) auf die Säule und sammeln Sie 1 ml Brüche auf jedes vorgesehene Rohr aus dem vorherigen Schritt.
  9. Regenerieren Sie die Säule sofort, indem Sie 20 ml Waschpuffer auftragen, gefolgt von 10 ml Waschpuffer. Stellen Sie sicher, dass das Harz nicht längere Zeit in einer sauren Umgebung zurückgelassen wird. Elutionen sollten fluoreszierend erscheinen, oft ist die höchste Fluoreszenz in der zweiten Elution zu sehen, kann aber von Extraktion zu Extraktion variieren.
  10. Zur Lagerung das Harz mit 10 ml 20% Ethanol in PBS waschen und halbabfließen lassen. Recap die Oberseite, dann die Unterseite der Säule, und halten Sie aufrecht bei 4 °C.
    HINWEIS: Im Allgemeinen können Protein-G-Harze bis zu 10-mal ohne signifikanten Effizienzverlust wiederverwendet werden. Spezifische Details finden Sie in den Herstellerrichtlinien.
  11. Bestimmen Sie die Ab-Konzentration mit einem Spektralphotometer, indem Sie die Absorption bei 280 nm messen, indem Sie den Elutionspuffer als Rohling verwenden. Bewahren Sie die Eluate in -80 °C und aliquot 50 l jeder Fraktion zur weiteren Analyse in einem separaten Rohr auf.

7. SDS-PAGE zur GFP-Ig-Fusionserkennung

  1. Bereiten Sie alle Beispiele vor, bevor Sie die SDS-PAGE einrichten.
    1. Fügen Sie 4 l Probenpuffer hinzu (6x reduzierender Probenpuffer: 3,0 ml Glycerin, 0,93 g DTT, 1 g SDS, 7 ml 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg Bromphenolblau); (6x nicht reduzierender Probenpuffer: 3,0 ml Glycerin, 1 g SDS, 7 ml 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg Bromphenolblau) bis 20 l jeder Probe (Gesamtextrakt, löslicher Extrakt, Durchfluss, Waschen, alle Elutionsfraktionen) für die Analyse. Stellen Sie sicher, dass Rohrkappen sicher befestigt sind.
    2. Nur 5 min in einem kochenden Wasserbad reduzierende Proben behandeln und dann proben für 5 min auf Eis legen. Spinnen Sie Proben in einer Mikrozentrifuge für 5 s und laden Sie 20 l jeder Probe in der Reihenfolge der Entnahme in die Gelbrunnen. Laden Sie 3 l dual-color Proteinleiter in einem separaten Brunnen.
  2. Führen Sie das SDS-PAGE Gel mit einer konstanten 100 V auf gewünschte Proteinbandtrennung; es dauert etwa 1,5 Stunden. Überwachen Sie die Leiter als Indikator für die Proteintrennung.
  3. Visualisieren Sie das Gel unter dem UV, um die GFP-Fluoreszenz zu beobachten.
  4. Auf Wunsch färben Sie das Gel mit Coomassie-Färbung, um das Gesamtprotein in jeder Probe zu bewerten. Alternativ können Sie einen westlichen Blot ausführen, um das Zielprotein mit bestimmten Abs zu bewerten.
    HINWEIS: Sowohl Coomassie Färbung und Western Blot kann durch die folgenden Standardprotokolle47,48durchgeführt werden.

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Representative Results

Diese Studie zeigt eine einfache und schnelle Methode zur Herstellung rekombinanter Proteine und deren Visualisierung in allen nachgelagerten Prozessen. Mit N. benthamiana und nach dem bereitgestellten Protokoll kann die hier beschriebene rekombinante Proteinproduktion in weniger als einer Woche erreicht werden. Der gesamte Arbeitsablauf von Pflanzenexpression, Extraktion und Reinigung ist in Abbildung 1dargestellt. Die Stadien des Pflanzenwachstums von 2 Wochen alten Sämlingen, 4 Wochen alten Pflanzen und 6 Wochen alten Pflanzen sind in Abbildung 1A (1-3) dargestellt, während Abbildung 1B morphologische Veränderungen aufgrund von Nekrose(Abbildung 1B-1) oder Chlorose (Abbildung 1B-2) darstellt. Nekrose kann an der Injektionsstelle zwischen den Tagen 3-5 nach der Infiltration auftreten. Diese Veränderungen hängen oft davon ab, ob die Eigenschaften des Proteins exprimiert werden und die Gesundheit der infiltrierten Pflanzen (weiter in der Diskussion untersucht). Gleichzeitig kann sich Chlorose auch auf die Gesundheit der verwendeten Pflanzen stützen (weitere im Gespräch untersucht). Der Prozess des Agrobacterium-Wachstums und der Vorbereitung auf die Infiltration ist in Abbildung 1Cdargestellt. Abbildung 1C-1 zeigt isolierte Kolonien von Agrobacterium. Die Abbildungen 1C (2-5) zeigen das erwartete Erscheinungsbild der Medien, nachdem es mit einer einzigen isolierten Kolonie geimpft wurde. Weitere Informationen zu diesen Schritten finden Sie in Abbildung 3. Der Pflanzeninfiltrationsprozess ist in Abbildung 1D dargestellt und beginnt mit einer nicht infiltrierten Anlage und wird von dem Infiltrationsprozess gefolgt. Die Expression, Extraktion und Klärung von pflanzlichen Proteinen sind in Abbildung 1Edargestellt. Das Blattmaterial wird in einen Mixer gelegt und homogenisiert, dargestellt in den Abbildungen 1E (1-3). Anschließend wird eine Probe entnommen, die das Gesamthomogenat darstellt. Es wird dann durch ein Miracloth gefiltert (Gaze oder sogar ein Kaffeefilter kann reduzierte Kosten ersetzen), und die geklärte Suspension wird zentrifugiert. Die Zentrifugation ermöglicht die Trennung des Überstandes von den übrigen Materialien, wie in den Abbildungen 1E (4-6)dargestellt. Der geklärte Überstand wird dann auf eine Protein-G-Affinitätschromatographiesäule geladen, Abbildung 1F (1-3). Nachdem der größte Teil des Proteins gebunden ist, Abbildung 1F-4, werden die Proteine aus dem Harz eluiert Abbildung 1F (5,6).

Tabelle 1 zeigt die pflanzenoptimierten Nukleinsäuresequenzen, die zur Herstellung von ASGFP45 (obere Reihe) im pBY verwendet werden! KEAM-GFPasH-Vektor, der in dieser Studie verwendet wird, um asGFP-IgG-Fusion und GFP33 (untere Reihe) im PBYEAM-GFPHgp-Vektor auszudrücken, der in dieser Studie verwendet wird, um die GFP-IgG-Fusion auszudrücken. Nukleinsäuresequenzen wurden mit dem Expasy Protein-Übersetzungswerkzeug (https://web.expasy.org/translate/) untersucht, um Aminosäuresequenzen zu bestimmen.

Eine repräsentative Agrobacterium-Platte, die mit diesem Protokoll hergestellt wurde, ist in Abbildung 2dargestellt. Gewünschte Kolonien sollten rund und einheitlich in Form und Farbe erscheinen. Kolonien, die näher an der Mitte der Platte sind, haben eine höhere Wahrscheinlichkeit, Kanamycin-Resistenz auszudrücken. Die flüssigen Kulturen werden aus einer einzigen isolierten Kolonie hergestellt.

Das erwartete Erscheinungsbild von Kulturmedien ist in Abbildung 3dargestellt. Nach der ersten Impfung einer isolierten Kolonie erscheinen LB-Medien hellgelb und durchscheinend, wie in Abbildung 3Adargestellt. Nach der Inkubation einer isolierten Kolonie über Nacht bei 30 °C erscheinen LB-Medien trüb. Wie in Abbildung 3Bdargestellt, können Objekte nicht mehr über die Medien gesehen werden, wenn Wachstum in der LB vorhanden ist. Nach der Zentrifugation sollte sich an der Unterseite des Rohres ein Pellet bilden. Das Rohr wird eine klare Trennung von LB-Medien über dem Pellet haben und hellgelb und durchscheinend erscheinen, wie in Abbildung 3Cdargestellt. Der LB-Medienüberstand wird entsorgt und das Pellet im Infiltrationspuffer resuspendiert. Bei einem OD600 von 0,2 erscheinen die Medien trüb, wie in Abbildung 3Ddargestellt. OD600 sollte wie in den Methoden beschrieben gemessen werden.

Abbildung 4 stellt den Prozess der Blattinfiltration dar. Ein leichtes Blatt mit einer Büroklammer sollte einen Bruch in der Blattepidermis ergeben, der nicht vollständig durch das Blatt geht. Der Bruch sollte das Blatt kaum durchbohren, so dass der Infiltrationspuffer in das Blatt injiziert werden kann, dargestellt in Abbildung 4A-C. Die Suspension von Agrobacterium und Infiltrationspuffer wird direkt in den Bruch im Blatt injiziert und verändert leicht die Farbe des infiltrierten Blattes; siehe Abbildung 4D-F.

Das Auftreten von Blättern, die IgG-Fusionen exdrücken, ist in Abbildung 5dargestellt. Es zeigt Blätter, die als GFP-IgG-Fusionen ausdrücken (Abbildung 5A) und GFP-IgG-Fusionen (Abbildung 5C) unter weißem Licht. Wenn die Konstrukte in diesem Protokoll verwendet werden, sollten Blätter bei einem Infiltriert bei 0,2 OD600an den Tagen 1-5 für beide Blätter, die als GFP-IgG-Fusionen und Blätter, die GFP-IgG-Fusionen exexzieren, gesund erscheinen. Es kann ein leichtes nekrotisches Aussehen an Deninjektionsstellen an Tag 5 sein, was in der Regel durch die Aufhellung des Pflanzengewebes in diesen Bereichen offensichtlich ist. Abbildung 5 zeigt auch Blätter, die als GFP-IgG-Fusionen exzieren (Abbildung 5B) und GFP-IgG-Fusionen (Abbildung 5D),bzw. unter langwelligem UV-Licht aus der Oberen Ansicht des Blattes. Fluoreszenz erhöht die Intensität, wenn die Tage für beide Konstrukte ausgedrückt werden. Blätter, die als GFP-IgG-Fusionen exezieren, haben in der Regel etwas weniger intensive Fluoreszenz als Blätter, die GFP-IgG-Fusionen an allen Tagen exezieren.

Wenn der Überstand des AsGFP-IgG-Extrakts der Protein-G-Säule zugesetzt wird, wird das Harz unter weißem Licht durch pflanzliche Chlorophyllpigmente leicht grün (Abbildung 6A). Die Zugabe von Überstand unter kurzwelligem UV-Licht führt zur Ansammlung von Fluoreszenz im Protein-G-Harz, wie in Abbildung 6Bdargestellt. Beachten Sie, dass der Überstand auch allein unter UV-Licht fluoreszierend sein wird. Dennoch wird erwartet, dass die Fluoreszenz viel konzentrierter ist, wenn die asGFP-IgG-Fusion an das Harz zu binden beginnt.

Nach dem Übergang von AsGFP-IgG durch das Protein G-Harz sollte das Harz unter Kurzwellen-UV-Licht erhellen, wie in Abbildung 7Adargestellt. An dieser Stelle wird der größte Teil des IgG an das Harz gebunden sein. Nach Zugabe des Elutionspuffers wird die im Protein-G-Harz enthaltene Fluoreszenz weiterhin unter kurzwelligem UV-Licht sichtbar sein und beginnt an Intensität zu verlieren, wenn mehr Elutionspuffer von niedrigem pH-Wert durch das Harz fließt. Fluoreszenz beginnt sich in den Eluaten anzusammeln (Abbildung 7B). Eluat-Fraktionen variieren in der Fluoreszenz. Wie in Abbildung 8dargestellt, ist die Fluoreszenz die niedrigste Intensität in der ersten Elution und die höchste Intensität in der zweiten und dritten Eluate. Die Ergebnisse können variieren, da die Fluoreszenz von der Expression des Proteins, dem geernteten Blattmaterial und anderen Bedingungen abhängt, die im Experiment verwendet werden.

Nach Abschluss des Reinigungsprozesses werden probenweise auf dem 10% SDS-PAGE Gel unter reduzierenden Bedingungen analysiert (Probenpuffer enthält DTT und Proben wurden 5 min gekocht) und nicht reduzierende Bedingungen (Probenpuffer enthält keine DTT und Proben wurden nicht gekocht). Wie in Abbildung 9Adargestellt, fluoreszieren nur nicht reduzierende Proben, wie z. B. in der Spur Elution 2 NR, wenn sie Kurzwellen-UV-Licht ausgesetzt sind. Das erste Band dieser Spur fluoresziert bei der erwarteten Gesamtgröße des Produkts von 200 kDa, was darauf hinweist, dass das AsGFP immer noch konform korrekt ist. Die Leuchtstoffbänder in der Nähe der Unterseite des Gels werden aus dem Reduktionspuffer gefärbt. Beachten Sie, dass GFP 5 Minuten lang fluoreszenz verliert, wenn es Temperaturen bei oder über 95 °C ausgesetzt ist; dies unterscheidet sich von eGFP (Enhanced GFP), die eine gewisse Fluoreszenz unter den gleichen Bedingungen beibehalten würde49,50. Zwei Bänder der Leiter, 75 kDa und 25 kDa, auch fluoreszierend. Abbildung 9B stellt einen Coomassie-Fleck desselben Gels in Abbildung 9A dar. Die Elutionen in den Bahnen 6-9 wurden unter reduzierten Bedingungen vorbereitet. Wenn sie auf einem Gel und Coomassie-gefärbt ausgeführt werden, sollten diese Proben die asGFP-IgG-Fusionskomponenten separat anzeigen. Zu diesen Komponenten gehören die schwere Kette, die mit GFP verschmolzen ist (ca. 75 kDa), die schwere Kette (50 kDa), die Lichtkette (25 kDa) und die asGFP selbst (27 kDa). Die nicht reduzierende Probe wurde zu Vergleichszwecken in die letzte Spur des Gels aufgenommen und sollte ein einziges großes Band (ca. 200 kDa) aufweisen, das aus zwei schweren Ketten bestehen sollte, die mit dem asGFP und den entsprechenden Lichtketten verschmolzen sind. Darüber hinaus werden kleinere Bänder wahrscheinlich durch native Proteasen verursacht. Diese Spaltung kann durch Zugabe von Proteasehemmern und durch Halten des Proteinextrakts jederzeit kalt verhindert werden, auch bei der Säulenreinigung. Die einzelnen Komponenten des IgG-Fusionsproteins sind in den nicht reduzierenden Proben des Coomassie-Gels nicht zu unterscheiden.

Figure 1
Abbildung 1: Workflow von Pflanzenexpressions-, Extraktions- und Reinigungsprozessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Nukleotid-Sequenz verwendet Aminosäuresequenz
Sequenzen
verwendet für
asGFP in
pBY! KEAM
-GFPasH
Vektor
verwendet in
das
Ausdruck
der
asGFP-IgG
Fusion		 ATGGTGTCCAGGGAGAGGAAGCTGGAAGAGCCTTGTTC
CAGTACCCTATGACTTCTAAAATCGAGTTGAATGGCGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTGCTGGAGAGGGTTTCCCTTC
ATCTGGAAGATTCAATGCACGCTTACTGTACTACTGGAGAC
TTGCCTATGTCCTGGGTTGTTATAGCTTCCCCGCTTCAGTACGG
GTTTCACATGTTTGCCCACTACCCTGAGGATATCACTCACTTCTT
CCAAGAATGTTTTCCTGGGTCTTATCTCTCGACAGAACTTTGA
GGATGGAGGGAGACGGTACTCTTACTACTCACCACKACTActC
CCTTGAGGACGGTTGCGTTACCAAGACTACTTTGAACGCTT
CTGGATTCGACCCCAAGGGAGCCACTATGACTAAGTCTTTCGT
CAAACAGCTCCCAAACGTCAAATCACCCCACACGGGCCA
AATGGTATTAGACTTACTACTGTGTCTACCTTAAGGAGGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAAGACTGCATCGTTACCCCA
GTTGGCGGGAGAAAAGTTACTCAGCGCGCAAGGCTCACTTTCTTC
ATACTCAGATCATTCAGAAGAAGGACCCAAACGACACCAGAG
ATCACATCGTTCAGACTGAGCTTGCCGTTGCTGGAAATCTTTG
GCACGGCATGGATGAGCTTTACAAGA		 MVSKGEEASGRALF
QYPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEGFTP
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
DRTLRMEGDGTLTT
HHEYSLEDGCVTSK
TTLNASGFDPKGAT
MTKSFVKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQIGTQD
CIVTPVGGRKVTQP
KAHFLHTQIIQKKDP
NDTRDHIVQTELAV
AGNLWHGMDELY
K
Sequenzen
verwendet für
GFP in
pBYEAMGFPHgp
Vektor
verwendet in
das
Ausdruck
gfP-IgG
Fusion		 ATGGCTAACACAKAVCTCTCTTGTCTCTCCTCTTGTGCTCCTT
GGTCTTTCTGCTCTCTTGCTTCTGGTATGGTGAGCAAGGGCG
AGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGG
GCGAGGGCGATGCCTACTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA
TCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGT
GACCACCTTCAGCTACGGCGTGCAGTGCGCGCAGCCGCTACCCC
GACCACATGAAGCAGCACGACTTCTCAAGTCCGCCATGCCCG
AAGGCTACGTCCAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGG
CAACTACACACAACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACAC
CCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAGGCATCGACTTCAAGGA
GGACGGCAACATCCTGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAA
CAGCCACAACCTCTATATCATGGCCGACAGAGAGAAGAACGG
CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGC
AGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCACCCAGAACACCCCCATCG
GCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCAC
CCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCA
CATGGTCCTGCTGGAGGTGACCGCCCGGGATCACTCAC
GGCATGGACGAGCTACAAGA		 MANKHLSLLVLL
GLSASLASGMVSKG
EELFTGVVPILVELD
GDVNGHKFSVSGE
GEGDATYGKLTLKFI
CTTGKLPVPWPTLV
TTFSYGVQCFSRYP
DHMKQHDFFKSA
MPEGYVQERTIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
KEDGNILGHKLEYN
YNSHNVYIMADKQ
KNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNH
YLSTQSALSKDPNEK
RDHMVLLEFVTAA
GITH

Tabelle 1: Sequenzen, die zum Erstellen von GFP und GFP verwendet werden

Figure 2
Abbildung 2: Agrobacterium-Kolonien, die auf LB-Platte mit Kanamycin angebaut werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Erscheinen von Medien während des gesamten Wachstums und der Verarbeitung von Agrobacterium. (A) Das Auftreten von LB-Medien unmittelbar nach der Impfung der isolierten Agrobacterium-Kolonie. (B) Das Vorhandensein von Medien nach nächtlicher Inkubation einer isolierten Kolonie bei 30°C. (C) Das Auftreten von Medien nach Kulturen wird 20 min bei 4.500 x g nach unten gesponnen. (D) Pellet wird im Infiltrationspuffer wieder ausgesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Prozess der Infiltration von N. benthamiana Pflanzen. (A-B) Etwas pochen das Blatt führt zu einem subtilen Loch an der Spitze des Blattes. (C-D) Injektion von Agrobacterium Suspension in Blatt. (E) Infiltriertes Pflanzenblatt von der Ansicht. (F) Pflanze mit mehreren Blättern, die von der Oberansicht infiltriert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Die Visualisierung von Blättern, die asGFP-IgG-Fusion und GFP-IgG-Fusion enthalten, beginnt am Tag 1 nach der Infiltration (dpi) in der ersten Reihe, was bis tag 5 dpi in der letzten Reihe für alle Bedingungen führt. A) als GFP-IgG-Fusion unter weißem Licht. B) als GFP-IgG-Fusion unter langwelligem UV. C) GFP-IgG-Fusion unter weißem Licht. D) GFP-IgG-Fusion unter langwelligem UV. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Supernatant des asGFP-IgG-Extrakts, der der Protein-G-Säule zugesetzt wird. A) Zugabe unter weißem Licht. B) Zugabe unter Kurzwellen-UV-Licht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Protein-G-Harz unter kurzwelligem UV-Licht nach Überstand des AsGFP-IgG-Extrakts wurde durch die Säule geführt. A) Protein-G-Harz unter kurzwelligem UV-Licht. B) Protein-G-Harz bei Elution von Proteinen unter niedrigen PH-Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Gereinigte Elutionen von asGFP-IgG, die nach Exposition bei niedrigen pH-Bedingungen durch Reinigung erhalten werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: SDS-PAGE von Spaltenbeispielen. Proben, die mit "R" gekennzeichnet sind, befinden sich unter reduzierenden Bedingungen, und Proben, die mit "NR" gekennzeichnet sind, befinden sich unter nicht reduzierenden Bedingungen. A) Bei UV-Licht fluoreszieren nur nicht reduzierende Proben im 10%igen Polyacrylamid-Gel, wie in der Spur Elution 2 NR zu sehen. Die 75 kDa und 25 kDa Leiterbänder fluoreszieren auch. B) Die Coomassie-Färbung desselben Gels zeigt das Vorhandensein aller Proteine in der Probe. In den reduzierten Elutionen sind die IgG-Fusion ohne Lichtkette, die schwere Kette, die leichte Kette und möglicherweise degradierte GFP bei 75 kDa, 50 kDa, 25 kDa bzw. 10 kDa vorhanden. Im Gegensatz dazu ist in den nicht reduzierten Elutionen ein prominentes Band vorhanden, das mit der Größe der gesamten asGFP-IgG-Fusion übereinstimmt (ca. 200 kDa). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Dieses Protokoll kann für die visuelle Überprüfung von rekombinanten Ab oder rekombinanten Protein enduden in N. benthamiana Pflanzen verwendet werden, einschließlich derjenigen, die vorübergehende Exposition gegenüber sauren Umgebungen für Säulenreinigung Zwecke42,43,44. Darüber hinaus kann die Fusion von asGFP mit anderen Proteinen in verschiedenen Expressionssystemen ein nützliches Werkzeug für experimentelle Visualisierung und Bildung sein. Das Protokoll hierin kann weiter auf immer größere und kleinere Mengen an Blattmaterial skaliert werden, um die gewünschte Menge an rekombinantem Protein zu produzieren. Die beschriebenen Methoden nutzen frühere Studien, die GFP-Versionen identifiziert und hergestellt haben, die unter sauren Bedingungen stabil bleiben46. Umfassende Vorstudien haben Immunglobulin-Domänen geschaffen, die zu einem Protein von Interesse verschmolzen sind, das oft als IgG-Fusionen bezeichnet wird und die in diesem Protokoll auch28aufnehmen können. Durch die Erstellung und Ausdrücke einer IgG-Fusion aus einem humanisierten IgG1, das zu einem GFP und als GFP verschmolzen ist, konnten wir das Vorhandensein des gewünschten Proteins während der Expressions-, Extraktions- und Reinigungsprozesse visualisieren.

Wenn ein erfahrener Forscher dieses Protokoll befolgt, werden Blätter beginnen, Nekrosezeichen an den Infiltrationsstellen zwischen den Tagen 4-5 anzuzeigen. Bei Verwendung der beschriebenen Vektoren sollten infiltrierte Blätterbereiche jedoch bis zum 5. Tag mit der richtigen Pflege gesund erscheinen. Es ist wichtig zu beachten, dass Agrobacterium-Infektion allein schließlich zu Nekrose der Pflanzenblätter aufgrund der Ansammlung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) als Teil der Pflanzenzelle Immunantwort führen wird51,52. Diese Immunantwort und das resultierende Niveau der Nekrose kann auf der Grundlage mehrerer Faktoren variieren51, einschließlich der zellulären Targeting, die Lage des Proteins, die Art des Proteins produziert, der Expressionsvektor, und der Stamm von Agrobacterium verwendet53,54. Auch Variationen in der optischen Dichte (OD600) des agrobacteriums, das für die Infiltration verwendet wird, können die Konzentrationen von Nekrose55beeinflussen. Viele Expressionsvektoren nutzen Proteine, die Retinoblastomprotein binden, um die Pflanzenzellen in der Synthesephase (S)-Phase zu halten und die Zellteilungs- und Transformationshäufigkeit56,57zu erhöhen. Erhöhungen der Proteinproduktion, z. B. durch Bindung an Retinoblastomprotein, können zu Nekrose56,57führen. Fortschritte im Vektordesign, wie sie in modifizierten Versionen des in diesem Protokoll verwendeten Geminivirus-BeYDV-Replicons verwendet werden, haben die Nekrose minimiert und gleichzeitig einen hohen Proteinexpressionsgehaltbeibehalten 58. Auch BeYDV-Replicons sind nicht konkurrierend und bieten die Expression mehrerer Proteine auf einer einzigen Kassette ohne bekannte Größenbeschränkungen53,59.

Mehrere Faktoren beeinflussen das Pflanzenwachstum vor und nach der Infiltration, was schließlich zu einer geringen Proteinausbeute führen könnte. Bei der Aussaat von Pflanzen können zu viele Samen pro Pflanzenpellet zu vielen kleinen Pflanzensprossen führen, was zu einem bescheideneren Pflanzenwachstum führt. Daher führt die Reduzierung der Samenzahl pro Torfpellet und das Entfernen der zusätzlichen Sprossen nach einer Woche zu einem besseren Pflanzenwachstum. Die Aufrechterhaltung der richtigen Bodenfeuchtigkeit ist ein weiterer Faktor, der die allgemeine Pflanzengesundheit beeinflusst. Überwässerung, Unterwasser, Zugabe von zu viel oder zu wenig Dünger kann zur Chlorose beitragen und die Pflanzengesundheit beeinträchtigen60,61,62. Nekrose und Chlorose können zusätzlich durch die Produktion eines Proteins verursacht werden, das Zellstress verursacht. Dieses Phänomen wurde oft mit der Expression rekombinanter Immunkomplexe (RIC)56beobachtet. Wir haben beobachtet, dass Veränderungen in der Proteinstruktur und der Fusion von Proteinen dazu beitragen können, Nekrose zu minimieren; einige Proteine können jedoch auch nach verschiedenen Modifikationen toxisch für Pflanzen bleiben. Bei Verwendung der hier in diesem Dokument beschriebenen Expressionsvektoren kann die Extraktion von Protein enthoben früh und vor dem Beginn einer signifikanten Nekrose erfolgen, was zu einem hohen Proteinertragvon 56führt.

Unterschiedliche Wachstumsbedingungen können das Agrobacterium-Wachstum verlangsamen oder sogar hemmen. Agrobacterium wächst optimal bei 28 °C-30 °C und erlebt einen Hitzeschock, wenn es über 30 °C inkubiert wird, wodurch Zellteilungsfehler62erzeugt werden. Das Wachstum kann auch durch die Zugabe von zu viel Rifampicin behindert werden, da verschiedene Agrobacterium-Stämme mehr oder weniger natürlich resistent gegen dieses Antibiotikumsind 62. Die für die Infiltration mit deutlich höherem OD600 als empfohlen vorbereitete Bakterienkultur wird wahrscheinlich Nekrose verursachen55. Eine etwas höhere OD600 der Kultur hat in der Regel keinen Einfluss auf den Ertrag, aber wenn sie unter 0,1 liegt, könnte der Proteinertrag erheblich reduziert werden. Die Akkumulation abgestorbener Zellen kann unter zwei Umständen erfolgen; 1) die Kultur war überwuchert, was dazu führte, dass ein erheblicher Teil der OD abgestorbene Zellen war, und 2) das Agrobacterium nach dem Wachstum beschädigte/tötete, z. B. mit chemischen Rückständen oder hohen Zentrifugengeschwindigkeiten. Infiltrationen mit einer erhöhten Anzahl von abgestorbenen Zellen in der Kultur könnten die Proteinexpression reduzieren. Darüber hinaus kann das Durchspielen der Blätter durch zu viel Druck die Blätter schädigen und somit zu vorzeitiger Nekrose führen. Unter Berücksichtigung dieser möglichen Faktoren bei der Expression rekombinanter Proteine in Nicotiana benthamiana, kann zu einer verbesserten Proteinproduktion führen.

Die Erzielung einer geringen Proteinausbeute könnte auf einige Probleme bei der Extraktion und Reinigung zurückzuführen sein. Erstens kann der Extraktionspuffer je nach Protein optimiert werden müssen. Während der Mischung sollte Pflanzenmaterial homogen sein, ohne sichtbare Blattstücke. Als nächstes benötigen einige Proteine Reinigungsmittel für die Löslichkeit im Extraktionspuffer, wie Z.B. Tween-20 oder Triton. Andere Proteine benötigen möglicherweise Harnstoff in hohen Konzentrationen von 7,5 M für die Löslichkeit, während einige nur mit PBS extrahiert werden können. Ein Abbau des Proteins kann auftreten, wenn Puffer, Pflanzengewebe, Zentrifugen usw. während des Extraktionsprozesses nicht kühl gehalten werden. Der Mangel an Proteasehemmern und Natriumascorbat oder ähnlichen Chemikalien im Extraktionspuffer kann ebenfalls zu Abbau oder Aggregation führen. Einige Proteasehemmer wie PMSF abbauen schnell, und Natriumascorbat braucht einige Zeit, um wässrig zu werden. Insgesamt sollten Forscher optimale Bedingungen für ihr Protein von Interesse bestimmen.

Die Reinigung von IgG-Fusionen umfasst nur wenige Schritte, die bei geringer Proteinausbeute möglicherweise Modifikationen erfordern. Die Analyse der Imbiss-Aliquots, die während des gesamten Prozesses von SDS-PAGE und Western gesammelt wurden, wird helfen, den Fehler der Methoden zu identifizieren. Wenn der Durchfluss beispielsweise eine erhebliche Menge an Protein enthält, kann die Bindung des Proteins durch Änderung des pH-Werts des Puffers erleichtert werden. Die Verwendung hoher Waschmittelkonzentrationen während des Extraktionsprozesses kann die Bindungseigenschaften des Harzes beeinträchtigen, insbesondere wenn das Harz mehrmals wiederverwendet wird. Die richtige Lagerung des Harzes, wie in den Verfahren beschrieben, ist entscheidend für die Lebensdauer des Harzes. Wenn der Waschschritt das von Interesse interessierte Protein aus dem Harz entfernt, müssen die Puffer möglicherweise neu hergestellt werden, um dieses Problem zu lösen. Andere Probleme mit der Proteinreinigung könnten auf falsch gefaltete oder degradierte Proteine zurückzuführen sein, die eine weitere Analyse des gesamten Proteindesigns erfordern könnten. Das Verweisen auf die beschriebene Fehlerbehebung kann die Effizienz der Reinigung mit diesem Protokoll erhöhen.

Die beschriebene GFP-IgG-Fusionsreinigung ist in einer Unterrichtsumgebung hilfreich. Visualisierung ist für die wissenschaftliche Bildung von grundlegender Bedeutung, da sie es den Lernenden ermöglicht, Konzepte leichter zu verstehen39. Die Studierenden berichten oft von Missverständnissen, zusätzlich zu den Schwierigkeiten, Konzepte auf molekularer Ebene zu verstehen39. Insbesondere können die Experimente, die ein Verständnis der spezifischen Proteinposition bei jedem Schritt erfordern, durch Kennzeichnung von Proteinen von Interesse mit fluoreszierenden Molekülen modifiziert werden. Daher kann GFP oder asGFP, je nach verwendeter pH-Umgebung, genutzt werden, um ihre Fluoreszenz zu nutzen, um die Aufklärung der Proteinreinigungstechnik für studentenweise zu erleichtern.

Zusammenfassend beschreiben wir eine einfache Methode zur Expression und Reinigung eines rekombinanten Ab, das in N. benthamiana-Pflanzen mit einem GFP verschmolzen wird. Dieses Protokoll kann zur Reinigung eines Ab-Verschmolzens zu jedem gewünschten Zielprotein verwendet werden. Der Prozess kann so bearbeitet werden, dass es verschiedene Mengen an Blattmaterial aufnehmen kann und ermöglicht die visuelle Bestimmung der Proteinpräsenz vor, während und nach Abschluss des Proteinextraktions- und -reinigungsprozesses. Diese Methoden können als Kontrollen nützlich sein und für Unterrichtstechniken verwendet werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Maria Pia DiPalma für die Bearbeitung des Videos. Wir danken auch dem Office of Educational Outreach and Student Services an der Arizona State University für die großzügige Unterstützung der Publikationsgebühren. Die Forschung für dieses Protokoll wurde von der School of Life Sciences, Arizona State University, unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biologie Ausgabe 167 Antikörper monoklonaler Antikörper molekulare Pharming Agroinfiltration transiente Expression Nicotiana benthamiana grünes fluoreszierendes Protein säurestabiles grünes fluoreszierendes Protein Antikörperfusion IgG-Fusion Protein G-Reinigung
Produktion von IgG-Fusionsproteinen transient exprimiert in <em>Nicotiana benthamiana</em>
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Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

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