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Biology

Produção de Proteínas IgG Fusion Transitóriamente Expressa em Nicotiana benthamiana

Published: January 16, 2021 doi: 10.3791/61774
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,4, 2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Center for Immunotherapy, Vaccines and Virotherapy, The Biodesign Institute, Arizona State University, 2School of Life Sciences, Arizona State University, 3Molecular Biosciences/Biotechnology Undergraduate Program, Arizona State University, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Descrevemos aqui um método simples de expressão, extração e purificação de IgG humano recombinante fundido ao GFP em Nicotiana benthamiana. Este protocolo pode ser estendido à purificação e visualização de inúmeras proteínas que utilizam cromatografia de coluna. Além disso, o protocolo é adaptável ao laboratório de ensino presencial e virtual universitário, proporcionando exploração baseada em projetos.

Abstract

A alta demanda por anticorpos como intervenções terapêuticas para várias doenças infecciosas, metabólicas, autoimunes, neoplásicas e outras doenças cria uma necessidade crescente de desenvolver métodos eficientes para a produção de anticorpos recombinantes. Em 2019, havia mais de 70 anticorpos monoclonais aprovados pela FDA, e há um potencial de crescimento exponencial. Apesar de sua promessa, fatores limitantes para o uso generalizado são os custos de fabricação e a complexidade. Potencialmente, as plantas oferecem estratégias de fabricação de proteínas de baixo custo, seguras e facilmente escaláveis. Plantas como Nicotiana benthamiana não só podem dobrar e montar proteínas mamíferas complexas, mas também podem adicionar modificações pós-translacionais críticas semelhantes às oferecidas pelas culturas de células mamíferas. Neste trabalho, utilizando GFP nativo e uma variante ácido-estável de proteína fluorescente verde (GFP) fundida a anticorpos monoclonais humanos, pudemos visualizar todo o processo de expressão e purificação de anticorpos transitórios das plantas N. benthamiana. Dependendo do propósito do experimento, a fusão GFP nativa pode garantir uma visualização mais fácil durante a fase de expressão nas plantas, enquanto a fusão GFP ácido-estável permite a visualização durante o processamento a jusante. Este procedimento escalável e simples pode ser realizado por um único pesquisador para produzir quantidades miligramas de proteínas de fusão de anticorpos ou anticorpos altamente puros em questão de dias usando apenas algumas pequenas plantas. Tal técnica pode ser estendida à visualização de qualquer tipo de processo de purificação de anticorpos e potencialmente muitas outras proteínas, tanto em sistemas de vegetação quanto em outros sistemas de expressão. Além disso, essas técnicas podem beneficiar instruções virtuais e serem executadas em um laboratório de ensino por estudantes de graduação que possuem experiência mínima prévia com técnicas de biologia molecular, fornecendo uma base para a exploração baseada em projetos com aplicações reais.

Introduction

Relatórios da indústria indicam que treze dos vinte medicamentos de maior bilheteria nos Estados Unidos eram biológicos (medicamentos à base de proteína), dos quais nove eram anticorpos. Em 2019, foram mais de 570 terapêuticas de anticorpos (Ab) em várias fases de desenvolvimento clínico1,2,3. As vendas globais globais da Ab excedem 100 bilhões de USD, e o mercado terapêutico monoclonal Ab (mAb) deve gerar até 300 bilhões de USD até 20251,4. Com uma demanda tão alta e aumentos projetados na receita, pesquisadores têm trabalhado para desenvolver maneiras de produzir a terapêutica Ab em uma escala cada vez maior, com maior qualidade e custos mais baixos. Os sistemas de expressão à base de plantas têm várias vantagens sobre as linhas tradicionais de células mamíferas para a fabricação acessível e em larga escala da terapêutica Ab5,6. A produção de terapêutica proteica em plantas ("pharming molecular") não requer bioreatores caros ou instalações de cultura celular, assim como as técnicas tradicionais de cultura celular de mamíferos7,8. As plantas não podem contrair patógenos humanos, minimizando a contaminação potencial9. Tanto a expressão proteica transitória quanto transgênica à base de plantas pode ser utilizada como alternativas de menor custo aos sistemas de produção de mamíferos ou bacterianos10. Embora as plantas transgênicas sejam preferidas para a produção de culturas, a produção de proteínas recombinantes usando este método pode exigir de semanas a meses. Os avanços na expressão transitória utilizando vetores virais através da seringa ou da agroinfiltração a vácuo permitem a produção em pequena e grande escala, respectivamente, da proteína desejada nos dias11,12,13,14. A produção de mAbs contra o Ebola, a Dengue e o Zika, e inúmeras outras proteínas recombinantes, foram produzidas e purificadas de forma rápida e eficiente utilizando expressão transitória nas plantas de N. benthamiana 15,16,17,18,19. Essas circunstâncias tornam a expressão transitória baseada em plantas uma opção atraente para o desenvolvimento de múltiplas terapêuticas Ab e os métodos demonstrados neste protocolo20.

Os mAbs de primeira geração eram de derivação de murina, o que resultou em imunogenicidade não específica quando utilizados em testes em humanos21. Com o tempo, quiméricos, humanizados e, eventualmente, abs totalmente humanos foram produzidos para diminuir a imunogenicidade induzida pela terapêutica ab. Infelizmente, alguns desses Abs ainda causam imunogenicidade hospedeira devido a diferenças na glicossylation21. A evolução da engenharia vegetal permitiu a modificação dos glicos ab, o que é essencial, uma vez que a estabilidade e a função de um Ab podem ser significativamente afetadas pelo seu estado de glicosylation22. Os avanços permitiram a produção em sistemas vegetais de expressão de alto nível de mAbs humanizados, contendo glicanos humanos e, consequentemente, os traços biológicos desejados de um farmacêutico humano produzido em massa19,21.

Além do Abs recombinante, as moléculas de fusão Ab (fusões Ab) têm sido exploradas para vários propósitos nas últimas décadas. As fusões abs geralmente consistem em um fragmento ab ou ab fundido a uma molécula ou proteína e são projetadas para obter respostas de células efeitos imunológicos23. Essas moléculas foram criadas como potenciais intervenções terapêuticas para tratar diversas patologias, como câncer e doenças autoimunes24,25,26,27. Os complexos imunológicos recombinantes (RICs) são outra classe de fusões Ab que têm sido empregadas como candidatos à vacina28. Os RICs aproveitam a capacidade do sistema imunológico de reconhecer regiões de fusões ab e têm sido encontrados para melhorar a imunogenicidade quando combinados com outras plataformas de vacinas29,30,31.

Proteína Fluorescente Verde (GFP) é uma proteína bioluminescente derivada da água-viva Aequorea Victoria, que emite luz verde quando excitada pela luz ultravioleta32,33. Ao longo dos anos, o uso do GFP como marcador visual da expressão genética expandiu-se da expressão em Escherichia coli para numerosos sistemas de expressão proteica, incluindo as plantas N. benthamiana 34,35,36,37,38. Marcadores visíveis, como o GFP, têm implicações abundantes no ensino e aprendizagem de conceitos científicos. Inúmeros alunos de nível básico descrevem dificuldades para compreender conceitos científicos quando a ideia que está sendo ensinada não é visível a olho nu, como os conceitos de biologia molecular e campos relacionados39. Marcadores visuais, como o GFP, podem, assim, contribuir para o processamento de informações relacionadas aos processos científicos e podem ajudar a diminuir as dificuldades que os alunos relatam na aprendizagem de inúmeros conceitos científicos.

Embora o GFP seja frequentemente usado como marcador para indicar gene e expressão in vivo,é difícil visualizá-lo nos processos a jusante se usar condições ácidas. Esta circunstância é principalmente porque a GFP não mantém sua estrutura e fluorescência resultante a um pH40baixo . Ambientes ácidos temporários são frequentemente necessários em diversos processos de purificação, como proteína G, proteína A e cromatografia proteica L, muitas vezes utilizada para purificação de Ab41,42,43,44. Mutantes GFP têm sido usados para reter fluorescência sob condições ácidas45,46.

Aqui descrevemos um método simples de expressão, extração e purificação de proteínas de fusão IgG recombinantes em plantas N. benthamiana. Produzimos gfp tradicional fundido ao N-terminus de uma cadeia pesada IgG humanizada, criando uma fusão GFP-IgG. Simultaneamente, desenvolvemos a fusão de uma sequência otimizada por don de plantas para um GFP ácido-estável (asGFP) para o N-terminus de uma cadeia pesada IgG humanizada, criando uma fusão asGFP-IgG. As vantagens da produção de GFP-IgG incluem a capacidade de visualizar a presença de uma proteína alvo durante a expressão, enquanto asgFP-IgG permite ver a presença de proteína recombinante não apenas nas etapas de expressão e extração, mas também nas etapas de purificação da proteína. Este protocolo pode ser adaptado para a produção, purificação e visualização de uma gama de proteínas de fusão GFP produzidas em N. benthamiana e purificadas usando técnicas de cromatografia que requerem baixo pH. O processo também pode ser adaptado a várias quantidades de material de folha. Embora as proteínas abs e de fusão marcadas com GFP ou asGFP não sejam destinadas a ser usadas para terapias, esses métodos podem ser úteis como controles durante experimentos e também podem ser utilizados como uma ferramenta de ensino para biologia molecular e celular e biotecnologia, tanto presencialmente quanto virtualmente.

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Protocol

1. Cultivar plantas N. benthamiana

  1. Coloque as pelotas de turfa do solo em uma bandeja e despeje previamente fervida, ainda quente (~40-45 °C), água sobre as pelotas de turfa para expansão total. Depois que as pelotas forem totalmente expandidas, coloque 2-3 sementes de N. benthamiana em cada pelota de turfa usando pinças.
  2. Despeje cerca de 0,5 em água para cobrir o fundo da bandeja. Rotule a bandeja com a data de semeadura. Continue regando as mudas diariamente com quantidades adequadas de fertilizante. A concentração de fertilizantes (alimentos vegetais solúveis em água) é geralmente de 2,5-2,8 g/L.
  3. Cubra a bandeja com um topo de humidome quando colocado na câmara de crescimento. Mantenha as pelotas de turfa semeadas na câmara de crescimento a 23-25 °C, com um fotoperíodo de 16 horas e 60% de umidade relativa.
  4. Após uma semana, remova plantas extras deixando cada pelota com apenas uma muda.
  5. Quando as plantas estiverem com 2-3 semanas de idade, transfira cada pelota de turfa para um pote individual contendo o solo de controle de umidade. Esta demonstração usou o controle de umidade Miracle-Gro em vasos de solo.
  6. Água diariamente com fertilizante 1 g/L. Nunca deixe o solo completamente seco. As plantas estão prontas para infiltração quando tiverem de 5 a 6 semanas.

2. Preparação de tumefaciens de agrobacterium para infiltração

NOTA: Os construtos de fusão GFP-IgG podem ser obtidos conforme descrito neste artigo31. O gene asGFP foi obtido e otimizado a partir deste estudo45. As etapas a seguir devem ser feitas ao lado de um queimador Bunsen, e técnicas assépticas básicas devem ser aplicadas para evitar contaminação.

  1. Streak A. tumefaciens EHA105 abrigando vírus anã amarelo-feijão (BeYDV)19 vetor de expressão vegetal para cada construção (asGFP-IgG, GFP-IgG, cadeia leve) de um estoque de glicerol no ágar LB (10 g/L Tryptone, 10 g/L NaCl, extrato de levedura de 5 g, 15 g/L agar, 50 μg/mL kanamycin).
  2. Cresça por um dia em uma incubadora em pé de 30 °C. Isole uma única colônia para verificação pelo protocolo PCR de tela colônia padrão.
  3. Use colônia verificada para cada construção. Encha o tubo cônico com 10 mL de mídia LB (10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g de extrato de levedura, 50 μg/mL). Em seguida, adicione 10 μL de 100 μg/mL kanamycin. Adicione 10 μL de 2,5 μg/mL rifampicina para evitar a contaminação de E. coli. Incubar a 30°C e 120-150 rpm durante a noite.
  4. No dia seguinte, se a cultura Agrobacterium for cultivada para OD600 = 0,6-0,9, ela poderá ser usada para infiltração. Se for overgrown (OD600 > 1), 1-2 mL deve ser transferido para LB fresco com antibióticos e cultivado para o OD600necessário . Dependendo da concentração da cultura inicial, pode levar dois dias para crescer até OD600 = 0,6-0,9.
  5. Uma vez no apropriado OD600, coloque as culturas em uma centrífuga, e pelota as bactérias por centrifugação a 4.500 x g por 20 min, temperatura ambiente (RT).
  6. Supernante decante de ambas as amostras, e então resuspenda cada pelota em 1x tampão de infiltração (10 mM 2-(N-morpholino) ácido esulfônico, 10 mM sulfato de magnésio, ajustado para pH 5,5 com KOH) para obter o LMfinal 600 = 0,4. Isso deve levar aproximadamente 15-45 mL de tampão de infiltração, dependendo da densidade da cultura inicial. Combine volumes iguais de cada construção de fusão IgG com a construção da cadeia de luz para obter ODfinal 600 = 0,2 por construção em cada tubo.

3. Agroinfiltração de seringas sem agulha

  1. Pegue um clipe de papel endireitado e plantas N. benthamiana de 5-6 semanas de idade a partir do passo 1. Usando a borda afiada do clipe de papel, faça uma pequena punção na primeira camada epidérmica da folha na superfície adaxial. Evite perfurar o tempo todo.
    NOTA: As folhas inferiores são mais fáceis de infiltrar, enquanto as folhas na parte superior da planta são mais duras. Geralmente, a expressão de proteínas recombinantes é mais alta nas folhas localizadas no meio de uma planta, e essas folhas também ficam menos necróticas.
  2. Encha uma seringa de 1 mL, sem agulha presa, com a solução agrobacterium preparada a partir do passo 2. Cubra o orifício feito na etapa anterior com a extremidade da seringa e empurre lentamente para injetar as bactérias na folha enquanto aplica contrapressão suave por trás da folha. Observe a folha escurecer à medida que a solução é injetada sem aplicar muita pressão sobre a seringa.
  3. Tente se infiltrar na maior parte da área da folha em um máximo de 3-4 vezes – danos excessivos nas folhas podem dificultar o rendimento da proteína. A folha de plantas infiltrada aparecerá na maior parte escura da vista inferior.
    NOTA: Esta solução bacteriana deve ser suficiente para pelo menos 3-4 plantas por construção. Autoclave qualquer solução bacteriana restante antes de descartar.

4. Cresça e observe a N. benthamiana infiltrada

  1. Coloque plantas infiltradas de volta na câmara de crescimento e continue a regar diariamente.
  2. Observe as folhas para clorose e necrose em áreas infiltradas. Observe as plantas para fluorescência GFP (se o GFP estiver presente) sob uma lâmpada UV de ondas longas e curtas.
  3. O dia 4-5 mostra a maior fluorescência de ambas as construções de GFP nas folhas. Colher todas as folhas em 4-5 dpi (dias pós-infiltração) e pesar o material total da folha.
  4. Use-o imediatamente para processamento a jusante ou armazene a -80 °C até estar pronto para uso.

5. Extração de proteína

  1. Mantenha tampões e copos de liquidificador no gelo ou a 4 °C antes de usar.
  2. Prepare 2-3 mL de tampão de extração gelada (100 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 com HCl) por 1 g de material vegetal. Adicione 2 mM de flúor de fenilmetilsulfonil (PMSF) do estoque (100 mM) e 50 mM de sódio ascorbate ao tampão de extração pouco antes da extração.
  3. Coloque o tecido vegetal do passo 4 no copo do liquidificador pré-ciclimado. Adicione uma quantidade medida de tampão de extração refrigerado ao copo do liquidificador (conforme indicado na etapa 5.2). Coloque o copo do liquidificador no liquidificador. Pegue uma folha pré-cortada de parafilm e estique-a sobre a parte superior do copo do liquidificador. Misture à homogeneidade com intervalos de 20 segundos, mexendo bem entre os ciclos de mistura conforme necessário.
  4. Transfira material misturado para um béquer. Adicione uma barra de mexida e mexa a 4 °C por 30 minutos para aumentar a solubilidade da proteína e permitir a precipitação de sólidos.
  5. Coloque 2 camadas de Miracloth sobre um béquer limpo no gelo e despeje o extrato através dele para remover grandes detritos de folhas. Depois de todo o extrato ser derramado, dobre o Pano de Mira para espremer o extrato residual da folha. O extrato deve parecer verde escuro sem partículas visíveis.
  6. Transfira 50 μL desta amostra para um novo tubo de 1,5 mL e rotule "extrato total" para análise posterior. Transfira o extrato para tubos de centrífuga. Centrifugar o restante do extrato vegetal a 16.000 x g por 20 min, 4 °C e transferir o sobrenante para um tubo cônico.
  7. Filtre o extrato solúvel utilizando uma seringa de 50 mL e filtro de fibra de vidro de seringa (0,75 μm).
  8. Colete 50 μL de uma amostra após a centrifugação, rotular "extrato solúvel" para análise posterior.

6. Procedimento de cromatografia da coluna proteína G

NOTA: O protocolo descrito aqui é para cromatografia de fluxo de gravidade usando resina de agarose Pierce Protein G. Se usar uma resina diferente, consulte as instruções do fabricante para ajustes. Nunca deixe a resina secar e evite que todo o líquido se escorra. Recapitulando a tomada conforme necessário.

  1. Configure uma coluna de polipropileno que contém 20 mL de amostra.
  2. Estimar a quantidade de chorume necessária dependendo do tipo de imunoglobulina alvo e sua afinidade com a resina. Geralmente, 3 mL de chorume total com volume de cama de 1,5 mL é suficiente para a purificação de vários miligramas de Ab.
  3. Despeje cuidadosamente a quantidade necessária de chorume resuspended na coluna tampada. Abra a saída da coluna a partir da parte inferior da coluna e deixe-a drenar até que a maior parte do buffer se vá.
  4. Despeje imediatamente 10 mL de tampão de lavagem 1x PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7.4 com HCl) na parte superior. Deixe escorrer e repita esta etapa de lavagem 2x.
  5. Aplique a amostra filtrada da etapa 5 para a coluna e colete o fluxo — aliquot 50 μL de fluxo para análise posterior. Guarde o resto do fluxo no caso de o Ab não se ligar à resina.
    NOTA: Reaplicar fluxo através de uma nova coluna geralmente não resulta em um bom rendimento; por isso é aconselhável começar com novo material de folha.
  6. Lave a resina duas vezes com 10 mL de 1x PBS para reduzir a ligação não específica. Se desejar, alíquota de 50 μL de lavagem à medida que o buffer escorre pela coluna para verificar se o ab alvo não está elucido com um tampão de lavagem.
  7. Configurar e rotular cinco tubos com 125 μL de estéril 1 M Tris-HCl em pH 8. Isto é para neutralizar o Abs no tampão de eluição ácida para evitar possíveis mudanças estruturais. Alternativamente, adicione 30 μL de base de 2 M Tris para obter uma amostra menos diluída.
    ATENÇÃO: Durante a eluição, a luz UV pode ser usada para visualização. Isso não precisa ser feito durante a elução. Se o UV estiver sendo usado, certifique-se de usar EPI apropriado para evitar danos aos olhos e à pele. Uma luz UV não precisa ser usada durante a etapa de eluição.
  8. Elute o Abs aplicando 5 mL de tampão de elução (100 mM de glicina, pH 2.5 com HCl) na coluna e coletar frações de 1 mL a cada tubo designado da etapa anterior.
  9. Regenere imediatamente a coluna aplicando 20 mL de tampão de lavagem, seguido por 10 mL de tampão de lavagem. Certifique-se de que a resina não seja deixada em um ambiente ácido por um tempo prolongado. As eluções devem parecer fluorescentes, muitas vezes a maior fluorescência é vista na segunda elução, mas pode variar de extração para extração.
  10. Para armazenamento, lave a resina com 10 mL de 20% de etanol no PBS e deixe escorrer no meio do caminho. Recapitule a parte superior, depois a parte inferior da coluna, e mantenha-se ereto a 4 °C.
    NOTA: Geralmente, as resinas G da proteína podem ser reutilizadas até 10 vezes sem perda significativa de eficiência. Consulte as diretrizes do fabricante para obter detalhes específicos.
  11. Determine a concentração de Ab usando um espectrofotômetro medindo a absorvância a 280 nm, usando o tampão de elução como um branco. Armazene os eluatos em -80 °C e aliquot 50 μL de cada fração a um tubo separado para análise posterior.

7. SDS-PAGE para detecção de fusão GFP-Ig

  1. Prepare todas as amostras antes de configurar o SDS-PAGE.
    1. Adicionar 4 μL de tampão de amostra (6x reduzindo o tampão amostra: 3,0 mL de glicerol, 0,93 g de DTT, 1 g de SDS, 7 mL de 4x Tris (pH 6.8) 0,5 M, 1,2 mg de azul bromofenol); (6x tampão amostral não redutor: 3,0 mL de glicerol, 1 g de SDS, 7 mL de 4x Tris (pH 6,8) 0,5 M, 1,2 mg de azul bromofenol) a 20 μL de cada amostra (extrato total, extrato solúvel, fluxo de fluxo, lavagem, todas as frações de elução) para análise. Certifique-se de que as tampas do tubo estão bem fixadas.
    2. Trate apenas amostras redutoras por 5 minutos em um banho de água fervente, e depois coloque amostras por 5 minutos no gelo. Gire amostras em um microcentrifuge para ~5 s e carregue 20 μL de cada amostra na ordem de coleta nos poços de gel. Carregue 3 μL de escada de proteína de cor dupla em um poço separado.
  2. Execute o gel SDS-PAGE a 100 V constantes até a separação desejada da banda de proteína; leva cerca de 1,5 horas. Monitore a escada como um indicador de separação de proteínas.
  3. Visualize o gel sob o UV para observar a fluorescência GFP.
  4. Se desejar, manche o gel com a mancha de Coomassie para avaliar a proteína total em cada amostra. Alternativamente, realize a mancha ocidental para avaliar a proteína alvo usando abdominais específicos.
    NOTA: Tanto a coloração coomassie quanto a mancha ocidental podem ser realizadas seguindo os protocolos padrão47,48.

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Representative Results

Este estudo demonstra um método fácil e rápido para produzir proteínas recombinantes e visualizá-las em todos os processos a jusante. Usando N. benthamiana e seguindo o protocolo fornecido, a produção de proteína recombinante descrita aqui pode ser alcançada em menos de uma semana. O fluxo de trabalho global da expressão, extração e purificação da planta é mostrado na Figura 1. Os estágios de crescimento vegetal de mudas de 2 semanas, plantas de 4 semanas de idade e plantas de 6 semanas de idade são exibidos na Figura 1A (1-3), respectivamente, enquanto a Figura 1B retrata alterações morfológicas de folhas devido à necrose(Figura 1B-1) orros chlois(Figura 1B-2). A necrose pode ocorrer no local da injeção entre os dias 3-5 após a infiltração. Essas mudanças muitas vezes dependem das propriedades da proteína sendo expressas e da saúde das plantas infiltradas (ainda mais examinadas em discussão). Simultaneamente, a clorose também pode contar com a saúde das plantas que estão sendo utilizadas (ainda mais examinadas em discussão). O processo de crescimento agrobacterium e preparação para infiltração é mostrado na Figura 1C. Figura 1C-1 exibe colônias isoladas de Agrobacterium. As figuras 1C (2-5) exibem a aparência esperada da mídia depois de inoculada com uma única colônia isolada. Consulte a Figura 3 para obter mais detalhes sobre essas etapas. O processo de infiltração da planta é mostrado na Figura 1D e começa com uma planta não infiltrada e é seguido pelo processo de infiltração. A expressão, extração e esclarecimento das proteínas vegetais são exibidas na Figura 1E. O material da folha é colocado em um liquidificador e é homogeneizado, mostrado nas Figuras 1E (1-3). Em seguida, é colhida uma amostra representando homogenate total. Em seguida, é filtrado através de um Miracloth (gaze ou até mesmo um filtro de café pode substituir por despesas reduzidas), e a suspensão clarificada é centrifuada. A centrifugação permite a separação do supernascedor dos demais materiais, conforme mostrado nas Figuras 1E (4-6). O supernaspeso clarificado é então carregado em uma coluna de cromatografia de afinidade proteína G, Figura 1F (1-3). Após a maior parte da proteína ser ligada, Figura 1F-4, as proteínas são elucidadas a partir da resina Figura 1F(5,6).

A Tabela 1 exibe as sequências de ácido nucleico otimizados da planta usadas para produzir asGFP45 (linha superior) no pBY! O vetor KEAM-GFPasH utilizado neste estudo para expressar a fusão asGFP-IgG e o GFP33 (linha inferior) no vetor PBYEAM-GFPHgp utilizado neste estudo para expressar a fusão GFP-IgG. As sequências de ácido nucleico foram examinadas utilizando a ferramenta de tradução de proteína expasy (https://web.expasy.org/translate/) para determinar sequências de aminoácidos.

Uma placa de Agrobacterium representativa preparada usando este protocolo é mostrada na Figura 2. As colônias desejadas devem aparecer em forma e cor redondas e uniformes. Colônias mais próximas ao centro da placa têm maior probabilidade de expressar resistência à kanamicina. As culturas líquidas serão preparadas a partir de uma única colônia isolada.

O esperado aparecimento de mídias contendo culturas é mostrado na Figura 3. Após a inoculação inicial de uma colônia isolada, a mídia LB aparecerá amarelo claro e translúcido, como mostrado na Figura 3A. Após a incubação de uma colônia isolada durante a noite a 30 °C, a mídia LB aparecerá turva. Como mostrado na Figura 3B,os objetos não podem mais ser vistos através da mídia quando o crescimento está presente na LB. Após a centrifugação, uma pelota deve se formar na parte inferior do tubo. O tubo terá uma clara separação da mídia LB acima da pelota e aparecerá amarelo claro e translúcido, como mostrado na Figura 3C. O supernasciente de mídia LB é eliminado, e a pelota é resuspendida no tampão de infiltração. Em um OD600 de 0.2, a mídia aparecerá turva, como mostrado na Figura 3D. OD600 deve ser medido conforme descrito nos métodos.

A Figura 4 representa o processo de infiltração de folhas. Um leve prod da folha com um clipe de papel deve produzir uma ruptura na epiderme da folha que não passa inteiramente através da folha. A quebra mal deve perfurar a folha para que o tampão de infiltração possa ser injetado na folha, mostrado na Figura 4A-C. A suspensão do agrobacterium e do tampão de infiltração é injetada diretamente na quebra da folha e altera ligeiramente a cor da folha infiltrada; ver Figura 4D-F.

O aparecimento de folhas expressando fusões IgG está representado na Figura 5. Ele exibe folhas que expressam fusões asGFP-IgG(Figura 5A) e fusões GFP-IgG(Figura 5C) sob luz branca. Se os construtos neste protocolo forem utilizados, quando infiltrados em um 0.2 OD600,as folhas devem parecer saudáveis nos dias 1-5 para ambas as folhas expressando fusões asGFP-IgG e folhas expressando fusões GFP-IgG. Pode haver uma leve aparência necrosa nos locais de injeção no dia 5, o que geralmente é aparente pelo clareamento do tecido vegetal nessas áreas. A Figura 5 também exibe folhas expressando fusões asGFP-IgG(Figura 5B) e fusões GFP-IgG(Figura 5D), respectivamente,sob luz UV de ondas longas da vista superior da folha. A fluorescência aumenta de intensidade à medida que os dias avançam para ambas as construções expressas. Folhas expressando fusões asGFP-IgG tendem a ter fluorescência ligeiramente menos intensa do que folhas expressando fusões GFP-IgG em todos os dias.

Quando o supernatário do extrato asGFP-IgG for adicionado à coluna Proteína G, a resina ficará ligeiramente verde sob luz branca devido aos pigmentos de clorofila vegetal(Figura 6A). A adição de supernasciante sob luz UV de ondas curtas resulta no acúmulo de fluorescência na resina protein G, como mostrado na Figura 6B. Note que o supernante também será fluorescente sozinho sob luz UV. Ainda assim, espera-se que a fluorescência seja muito mais concentrada quando a fusão asGFP-IgG começar a se ligar à resina.

Após a passagem de supernascimento de asGFP-IgG através da proteína G resina, a resina deve iluminar sob luz UV de ondas curtas, como mostrado na Figura 7A. Neste ponto, a maior parte do IgG será vinculada à resina. Ao adicionar o tampão de elução, a fluorescência contida na resina G proteica ainda será visível sob luz UV de ondas curtas e começará a perder intensidade à medida que mais tampão de elução de pH baixo passar pela resina. A fluorescência começará a se acumular nos eluatos(Figura 7B). Frações eluadas variam em fluorescência. Como visto na Figura 8,a fluorescência é a menor intensidade na primeira elução e maior intensidade no segundo e terceiro elunatos. Os resultados podem variar, pois a fluorescência dependerá da expressão da proteína, do material da folha colhida e de outras condições utilizadas no experimento.

Após o término do processo de purificação, as amostras são analisadas no gel SDS-PAGE de 10% em condições de redução (o buffer de amostra contém DTT e as amostras foram fervidas por 5 minutos) e condições não redutoras (o tampão amostral não contém DTT e as amostras não foram fervidas). Como mostrado na Figura 9A, apenas amostras não redutoras, como na pista de Elução 2 NR, fluorescerão quando expostas à luz UV de ondas curtas. A primeira banda desta pista está fluorescing no tamanho esperado do produto ~200 kDa, indicando que o asGFP ainda está conformamente correto. As bandas fluorescentes próximas à parte inferior do gel são corantes do buffer redutor. Note que asgFP perde fluorescência quando exposto a temperaturas acima de 95 °C por 5 minutos; isso é diferente do eGFP (GFP aprimorado), que manteria alguma fluorescência nas mesmas condições49,50. Duas bandas da escada, 75 kDa e 25 kDa, também fluoresce. Figura 9B representa uma mancha coomassie do mesmo gel na Figura 9A. As eluções nas faixas 6-9 foram preparadas em condições de redução. Quando executadas em um gel e corroído por Coomassie, essas amostras devem exibir os componentes de fusão asGFP-IgG separadamente. Esses componentes incluem a corrente pesada fundida ao GFP (~75 kDa), a cadeia pesada sozinha (50 kDa), a cadeia leve (25 kDa) e a própria asGFP (27 kDa). A amostra não redutor foi incluída na última faixa do gel para fins de comparação e deve exibir uma única banda grande (~200 kDa), que deve ser composta por duas correntes pesadas fundidas ao asGFP e respectivas cadeias leves. Além disso, bandas menores são provavelmente causadas por proteases nativas. Este decote pode ser prevenido com a adição de inibidores de protease e mantendo o extrato de proteína frio o tempo todo, inclusive na realização da purificação da coluna. Os componentes individuais da proteína de fusão IgG não serão distinguíveis nas amostras não redutoras do gel Coomassie.

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho dos processos de expressão, extração e purificação da planta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Sequência de nucleotídeos utilizada Sequência de aminoácidos
Seqüências
usado para
asGFP em
pBY! RIO KEAM
-GFPasH
Vetor
usado em
O
Expressão
do
asGFP-IgG
Fusão		 ATGGTGTCCAAGGGAGAGGAAGCTTCTGGAAGAGCCTTGTTC
CAGTACCCTATGACTACTTAAATCGAGAATGGCGAGATCA
ACGGAAAGAAGTTTAAGGTTGCTGGGGGGTTCACCCCTTCCC
ATCTGGAAGATTCAATATGCACACTTACTGTACTACCGGAGAC
TTGCCTATATGTCCTGGGTTGTTACTTCCCCCCGCTTCAGTACGG
GTTTCACATGTTTGCCCACTACCCTGATCACTCACTTCTT
CCAAGAATGTTTCTGGGTCTTATACTCTCGACAGAACTTTGA
GGATGGAGGGGGCGGTACTCACTACTCACCACGAGTACTC
CCTTGAGGACGGTTGCGTTACTTCCAAGACTTTGAACACGCTT
CTGGATTCGACCCCAAGAGAGAGAGACTATAAGATCTTTCGT
CAAACAGCTCCCAAACGAGGTCAAAATCACCCCACACGGGCCA
AATGGTATTAGACTTACTTCCACTTCTCTACCTTAAGGAGGA
CGGAACTATCCAGATCGGAACTCAACTGCATCTTACCCCA
GTTGGCGGCAGAAAAGTTACTCAGCCTAAGGCTCACTCTTC
ATACTCAGATCATTCAGAAGGACCCAAACGACACCAGAGAGAG
ATCACATCGTTCAGACTGAGCGCCGTTGCTGGAAATCTTTTTG
GCACGGGGATGAGCTTTACAAGA		 MVSKGEEASGRALF
QYPMTSKIELNGEI
NGKKFKVAGEGFTP
SSGRFNMHAYCTT
GDLPMSWVVIASPL
QYGFHMFAHYPEDI
THFFQECFPGSYTL
DRTLRMEGDGTLTT
HHEYSLEDGCVTSK
TTLNASGFDPKGAT
MTKSFVKQLPNEVK
ITPHGPNGIRLTSTV
LYLKEDGTIQIGTQD
CIVTPGGRKVTQP
KAHFLHTQIIQKKDP
NDTRDHIVQTELAV
AGNLWHGMDELY
K
Seqüências
usado para
GFP em
pBYEAMGFPHgp
Vetor
usado em
O
Expressão
de GFP-IgG
Fusão		 ATGGCTAACAAGCACCTCTCATTGTCTCTCCTTCCTTGTGCTCCCCTT
GGTCTTTCTGCTTCTCTTCTGGTATGAGCAAGGGCGG
AGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGGTGCCCACTGGTCGAGCTGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGG
GCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCA
TCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCCCCCCCCTGGCCCACCCTCGT
GACCACCTTCAGCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCCCGCTACCCCCCCC
GACCACATGAAGAGACACACACTTCTTCATCCGCCATGCCCCCG
AAGGCTACGTCCAGGAGCACACCATCTTCCAAGGACGACGG
CAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGGACGAGGGCGACAC
CCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCACTTCAAGAGGA
GGACGGCAACATCCTGGGGCAAGAGCTGGAGTACAACTACAA
CAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAGAACGG
CATCAAGGTGAACTTCAAGATCCCCCCACAACATCGAGGACGGC
AGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCG
GCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACACACACACACACACACACACAC
CCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGATCA
CATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCCCGGGATCACTCAC
GGCATGGACGAGCTGTACAAGA		 MANKHLSLFLVLL
GLSASLASGMVSKG
EELFTGVVPILVELD
GDVNGHKFSVSGE
GEGDATYGKLTLKFI
CTTGKLPVPWPTLV
TTFSYGVQCFSRYP
DHMKQHDFFKSA
MPEGYVQERTIFFK
DDGNYKTRAEVKFE
GDTLVNRIELKGIDF
KEDGNILGHKLEYN
YNSHNVYIMADKQ
KNGIKVNFKIRHNIE
DGSVQLADHYQQN
TPIGDGPVLLPDNH
YLSTQSALSKDPNEK
RDHMVLLEFVTAA
GITH

Tabela 1: Sequências usadas para criar asGFP e GFP

Figure 2
Figura 2: Colônias de agrobacterium cultivadas em placa LB contendo kanamicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Aparecimento de mídia durante todo o crescimento e processamento da Agrobacterium. (A) O aparecimento da mídia LB imediatamente após a inoculação da colônia isolada agrobacterium. (B) A presença de mídia após a incubação noturna de uma colônia isolada a 30°C. (C) O aparecimento da mídia após as culturas é girado para baixo por 20 minutos a 4.500 x g. (D) Pelota resuspendida no tampão de infiltração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Processo de infiltração de plantas de N. benthamiana. (A-B) Cutucar ligeiramente a folha resulta em um buraco sutil na parte superior da folha. (C-D) Injeção de suspensão agrobacterium em folha. (E) Folha de planta infiltrada da vista superior. (F) Planta com múltiplas folhas infiltradas a partir da vista superior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Visualização de folhas contendo fusão asGFP-IgG e fusão GFP-IgG começam no dia 1 pós infiltração (dpi) na primeira linha, levando até o dia 5 dpi na última linha para todas as condições. A) fusão asGFP-IgG sob luz branca. B) fusão asGFP-IgG sob UV de ondas longas. C) Fusão GFP-IgG sob luz branca. D) Fusão GFP-IgG sob UV de ondas longas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Supernatante do extrato asGFP-IgG sendo adicionado à coluna Proteína G. A) Adição sob luz branca. B) Adição sob luz UV de ondas curtas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Resina Proteica G sob luz UV de ondas curtas após supernaspendo do extrato asGFP-IgG foi executado através da coluna. A) Resina proteica G sob luz UV de ondas curtas. B) Resina proteica G após elução de proteínas em baixas condições de PH. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: Eluções purificadas de asGFP-IgG obtidas após exposição a baixas condições de pH através da purificação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: SDS-PAGE de Amostras de Coluna. As amostras rotuladas com "R" estão em condições de redução, e as amostras rotuladas com "NR" estão em condições não redutoras. A) Sob luz UV, apenas amostras não redutoras fluorescem no gel de poliacrilamida de 10%, como visto na pista de Elução 2 NR. As bandas de escada de 75 kDa e 25 kDa também fluorescem. B) A coloração coomassie do mesmo gel revela a presença de todas as proteínas na amostra. Nas eluções reduzidas, a fusão IgG sem corrente leve, a corrente pesada, a corrente leve e possivelmente a GFP degradada estão presentes em ~75 kDa, ~50 kDa, ~25 kDa e ~10 kDa, respectivamente. Em contraste, nas eluções não reduzidas, uma banda proeminente está presente, consistente com o tamanho de toda a fusão asGFP-IgG (~200 kDa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo pode ser utilizado para a verificação visual de qualquer ab recombinante ou proteína recombinante produzida em plantas N. benthamiana, incluindo aquelas que requerem exposição temporária a ambientes ácidos para fins de purificação decolunas 42,43,44. Além disso, a fusão do asGFP para outras proteínas em diferentes sistemas de expressão pode ser uma ferramenta útil para visualização experimental e educação. O protocolo aqui pode ser dimensionado para quantidades maiores e menores de material de folha para produzir a quantidade desejada de proteína recombinante. Os métodos descritos aproveitam estudos anteriores que identificaram e fizeram versões de GFP que permanecem estáveis sob condições ácidas46. Estudos prévios abrangentes criaram domínios de imunoglobulina fundidos a uma proteína de interesse, muitas vezes chamada de IgG-fusions, que este protocolo também pode acomodar28. Ao criar e expressar uma fusão IgG composta de um IgG1 humanizado fundido a um GFP e asGFP, pudemos visualizar a presença da proteína desejada durante os processos de expressão, extração e purificação.

Se um pesquisador qualificado seguir esse protocolo, as folhas começarão a exibir sinais de necrose nos locais de infiltração entre os dias 4 e 5. No entanto, ao utilizar os vetores descritos, as áreas infiltradas das folhas devem parecer saudáveis até o dia 5 com os devidos cuidados. É importante notar que a infecção por agrobacterium por si só resultará em necrose das folhas vegetais devido ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) como parte da resposta imune das células vegetais51,52. Essa resposta imune e o nível resultante de necrose podem variar de acordo com vários fatores51, incluindo o direcionamento celular, a localização da proteína, o tipo de proteína que está sendo produzida, o vetor de expressão e a cepa de Agrobacterium utilizada53,54. Além disso, variações na densidade óptica (OD600) do Agrobacterium utilizado para infiltração podem afetar os níveis de necrose55. Muitos vetores de expressão utilizam proteínas que ligam a proteína do retinoblastoma para manter as células vegetais em fase de síntese (S) e aumentar a divisão celular e a frequência de transformação56,57. Aumentos na produção de proteínas, como os causados pela ligação à proteína retinoblastoma, podem levar à necrose56,57. Avanços no design vetorial, como os utilizados em versões modificadas dos relicários geminivírus BeYDV usados neste protocolo, minimizaram a necrose mantendo altos níveis de expressão proteica58. Além disso, os replicons beydv não são concorrentes, fornecendo expressão de múltiplas proteínas em um único sem limitações de tamanho conhecidas53,59.

Vários fatores afetam o crescimento das plantas antes e depois da infiltração, o que pode eventualmente levar a um baixo rendimento proteico. Ao semear plantas, muitas sementes por pelota vegetal podem resultar em muitos pequenos brotos de plantas levando a um crescimento vegetal mais modesto. Assim, reduzir o número de sementes por pelota de turfa e remover os brotos extras após uma semana resultará em um melhor crescimento da planta. Manter a umidade adequada do solo é outro fator que afeta a saúde geral das plantas. O sobreaguamento, o subaguamento, a adição de muito ou pouco fertilizante podem contribuir para a clorose e afetar a saúde da planta60,61,62. Necrose e clorose podem ser causadas pela produção de uma proteína que causa estresse celular. Este fenômeno tem sido visto muitas vezes com a expressão de complexos imunológicos recombinantes (RIC)56. Observamos que mudanças na estrutura proteica e fusão de proteínas podem ajudar a minimizar a necrose; no entanto, algumas proteínas podem permanecer tóxicas para as plantas mesmo após várias modificações. Se utilizar os vetores de expressão aqui descritos, a extração de proteínas pode ser realizada precocemente e antes do início da necrose significativa, resultando em alto rendimento proteico56.

Diferentes condições de crescimento podem retardar ou até mesmo inibir o crescimento do Agrobacterium. A agrobacterium cresce de forma ideal a 28 °C-30 °C e experimenta um choque térmico quando incubada acima de 30 °C, produzindo erros de divisão celular62. O crescimento também pode ser impedido pela adição de muita rifampicina, uma vez que diferentes cepas de Agrobacterium são mais ou menos naturalmente resistentes a este antibiótico62. A cultura bacteriana preparada para infiltração com OD600 significativamente maior do que o recomendado provavelmente causará necrose55. Um OD600 ligeiramente maior da cultura geralmente não afeta o rendimento, mas se for menor que 0,1, o rendimento da proteína pode ser consideravelmente reduzido. O acúmulo de células mortas pode ocorrer em duas circunstâncias; 1) a cultura foi supervalada, levando a uma fração significativa das células mortas da OD, e 2) danificar/matar o Agrobacterium após o crescimento, como com resíduos químicos ou altas velocidades de centrífuga. Infiltrações usando um número crescente de células mortas na cultura podem reduzir a expressão proteica. Além disso, perfurar as folhas aplicando muita pressão pode danificar as folhas e, portanto, pode levar à necrose prematura. Considerando esses possíveis fatores ao expressar proteínas recombinantes em Nicotiana benthamiana,pode levar a uma maior produção de proteínas.

A obtenção de baixo rendimento proteico pode ser devido a alguns problemas nas etapas de extração e purificação. Em primeiro lugar, o tampão de extração pode precisar de otimização dependendo da proteína de interesse. Durante a mistura, o material vegetal deve ser homogêneo sem quaisquer pedaços de folha visíveis. Em seguida, algumas proteínas requerem detergentes para solubilização no tampão de extração, como Tween-20 ou Triton. Outras proteínas podem precisar de ureia em altas concentrações ~7,5 M para solubilização, enquanto algumas podem ser extraídas apenas com PBS. A degradação da proteína pode ocorrer se tampões, tecido vegetal, centrífugas, etc. não forem mantidos frios durante o processo de extração. A falta de inibidores de protease e ascorbate de sódio ou produtos químicos similares no tampão de extração também podem causar degradação ou agregação. Alguns inibidores de protease como o PMSF se degradam rapidamente, e o ascorbate de sódio leva algum tempo para se tornar aquoso. No geral, os pesquisadores devem determinar condições ideais para sua proteína de interesse.

A purificação das fusões IgG inclui poucos passos que podem precisar de modificações se o baixo rendimento de proteínas for obtido. Analisar as alíquotas de amostra coletadas durante todo o processo pela SDS-PAGE e pela Western ajudará a identificar a falha dos métodos. Por exemplo, se o fluxo contém uma quantidade substancial de proteína, então a ligação da proteína pode ser facilitada alterando o pH do buffer. O uso de altas concentrações de detergentes durante o processo de extração pode afetar a propriedade vinculante da resina, especialmente se a resina for reutilizada várias vezes. O armazenamento adequado da resina, conforme descrito nos métodos, é vital para a vida útil da resina. Além disso, se a etapa de lavagem remover a proteína de interesse da resina, os buffers podem precisar ser refeitos para resolver este problema. Outros problemas com a purificação de proteínas podem ser devido a proteínas mal dobradas ou degradadas, o que pode exigir uma análise mais aprofundada do design geral da proteína. Referenciar a solução de problemas descrita pode aumentar a eficiência da purificação usando este protocolo.

A purificação de fusão GFP-IgG descrita é útil em um ambiente de ensino. A visualização é fundamental para a educação científica porque permite que os alunos compreendam conceitos com maisfacilidade 39. Os alunos frequentemente relatam mal-entendidos, além da dificuldade em entender conceitos no nível molecular39. Em particular, os experimentos que requerem uma compreensão da localização específica da proteína em cada passo podem ser modificados marcando proteína de interesse com moléculas fluorescentes. Portanto, o GFP ou asGFP, dependendo do ambiente de pH utilizado, pode ser utilizado para aproveitar sua fluorescência para facilitar a elucidação da técnica de purificação de proteínas para os alunos.

Em resumo, descrevemos um método simples de expressão e purificação de um Ab recombinante fundido a um GFP em plantas N. benthamiana. Este protocolo pode ser usado para a purificação de um Ab fundido a qualquer proteína alvo desejada. O processo pode ser editado para acomodar várias quantidades de material da folha e permite a determinação visual da presença proteica antes, durante e após a conclusão do processo de extração e purificação de proteínas. Esses métodos podem ser úteis como controles e podem ser destinados às técnicas de ensino.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Maria Pia DiPalma pela edição do vídeo. Agradecemos também ao Escritório de Divulgação Educacional e Serviços Estudantis da Universidade Estadual do Arizona por sua generosa assistência à taxa de publicação. A pesquisa para este protocolo foi apoiada pela School of Life Sciences da Universidade Estadual do Arizona.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 mL syringe any N/A
50 mL syringe any N/A
Agar SIGMA-ALDRICH A5306
Blender with cups any N/A
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404
DTT (DL-Dithiothreitol) MP BIOMEDICALS 219482101
EDTA (Ethylenedinitrilo)tetraacetic acid SIGMA-ALDRICH E-6760
Ethanol any N/A
Glycerol G-Biosciences BTNM-0037
Glycine SIGMA-ALDRICH G7126-500G
HCl (Hydrochloric acid) EMD MILLIPORE CORPORATION HX0603-4
Heating block any reputable supplier N/A
Jiffy-7 727 w/hole peat pellets Hummert International 14237000
Kanamycin Gold Biotechnology Inc K-120-100
KCl (Potassium Chloride) SIGMA-ALDRICH P9541-500G
KH2PO4 (Potassium Phosphate) J.t.baker 3248-05
KOH (Potassium Hydroxide) VWR BDH0262
Magnesium sulfate heptahydrate SIGMA-ALDRICH M2773
MES (2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid) SIGMA-ALDRICH M8250
Miracloth Millipore 4 75855-1R
Moisture control potting mix Miracle-Gro 755783
Na2HPO4 (Sodium Phosphate) J.t.baker 3827-01
NaCl (Sodium Chloride) Santa Cruz Biotechnology sc-203274C
Nicotiana benthamiana seeds any reputable supplier N/A
PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) G-Biosciences 786-787
Polypropylene Column any N/A
Precision Plus Protein Dual Color Standards Bio-Rad 1610394
Protein G resin Thermo Fisher Scientific 20399
Rifampicin Gold Biotechnology Inc R-120-25
SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) G-Biosciences DG093
Sodium Ascorbate SIGMA-ALDRICH A7631-500G
Spectrophotometer any reputable supplier N/A
Titan3 0.75 µm glass fiber filter ThermoScientific 40725-GM
Tray for peat pellets with dome any N/A
TRIS Base J.t.baker 4109-02
Tris-HCl Amresco M108-1KG
Tryptone SIGMA-ALDRICH 17221
UV lamp any N/A
Water Soluble All Purpose Plant Food Miracle-Gro 2000992
Yeast extract SIGMA-ALDRICH 9182

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Produção de Proteínas IgG Fusion Transitóriamente Expressa em <em>Nicotiana benthamiana</em>
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Kamzina, A. S., DiPalma, M. P., Hunter, J. G. L., Diamos, A. G., Armer, B., Mor, T. S., Mason, H. S. Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana. J. Vis. Exp. (167), e61774, doi:10.3791/61774 (2021).

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