Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

Published: November 9, 2020 doi: 10.3791/61778
Automatic Translation
*1, *1,2, *3, 1, 1, 3, 3,4, 1,5,6
1Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, 2Department of Neurology, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, 3Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, Stanford University School of Medicine, 4Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine, 5Department of Neurology, Warren Alpert Medical School of Brown University, 6Center for Translational Neuroscience, Robert J. and Nancy D. Carney Institute for Brain Science and Brown Institute for Translational Science, Brown University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.

Abstract

알츠하이머 병 (AD) 및 기타 신경 퇴행성 질환에서 희소 돌기 부전은 일반적인 초기 병리학 적 특징이지만 특히 뇌의 회백질에서 질병 발달 및 진행에 어떻게 기여하는지는 거의 알려지지 않았습니다. 희소돌기아교세포 계통 세포의 기능 장애는 희소돌기아교세포 전구체 세포(OPC)의 수초화 결핍 및 자가 재생 장애로 특징지어집니다. 이 두 가지 결함은 병리학의 축적을 따라 뉴런과 희소돌기아교세포 사이의 상호 작용이 중단되어 적어도 부분적으로 발생합니다. OPC는 CNS 발달 동안 수초 희소돌기아교세포를 생성합니다. 성숙한 뇌 피질에서 OPC는 주요 증식 세포 (전체 뇌 세포의 ~ 5 %를 구성)이며 신경 활동 의존적 방식으로 새로운 미엘린 형성을 제어합니다. 이러한 뉴런-희소돌기아교세포 통신은 적절한 도구의 부족으로 인해 특히 AD와 같은 신경퇴행성 상태의 맥락에서 상당히 과소 연구되고 있습니다. 최근 몇 년 동안 우리 그룹과 다른 사람들은 인간 만능 줄기 세포에서 개별적으로 기능성 뉴런과 희소돌기아교세포를 생성하기 위해 현재 사용 가능한 프로토콜을 개선하기 위해 상당한 진전을 이루었습니다. 이 원고에서는 뉴런-희소돌기아교세포 연결을 모델링하기 위한 공동 배양 시스템의 구축을 포함하여 최적화된 절차에 대해 설명합니다. 우리의 예시적인 결과는 뇌 아밀로이드증 및 시냅스 무결성에 대한 OPC/희소돌기아교세포의 예상치 못한 기여를 시사하고 AD 연구를 위한 이 방법론의 유용성을 강조합니다. 이 환원 주의적 접근법은 뇌 내부의 고유 한 복잡성에서 특정 이종 세포 상호 작용을 해부하는 강력한 도구입니다. 여기에서 설명하는 프로토콜은 신경 퇴행의 발병 기전에서 희소돌기전 결함에 대한 향후 연구를 용이하게 할 것으로 예상됩니다.

Introduction

희소돌기아교세포 전구세포(OPC), 수초 희소돌기아교세포 및 그 사이의 전이 유형을 포함한 희소돌기아교세포 계통 세포는 신경 발달 및 노화 전반에 걸쳐 중추신경계의 적절한 작동 및 유지를 위한 많은 중요한 기능에 적극적으로 참여하는 인간 뇌 세포1의 주요 그룹을 구성합니다.2,3,4 . 희소돌기아교세포는 백질에서 신경 활동 전달을 촉진하고 축삭 건강을 지원하기 위해 미엘린을 생성하는 것으로 잘 알려져 있지만, OPC는 수초화가 부족한 회백질에 풍부하고(~5%) 학습 행동 및 기억 형성을 제어하는 활동 의존적 신호 기능을 수행합니다. 5,6,7,8 . 알츠하이머병(AD) 및 기타 연령 관련 신경퇴행성 질환의 발병기전에서 희소돌기아세포 기능 및 기능 장애가 어떻게 연구되었는지는 연구되지 않았습니다9. 적절한 모델 시스템의 부적절 함과 실험 경로를 안내하는 일반 지식의 부족이 이러한 격차의 주요 원인입니다.

배아 줄기 (ES) 및 유도 만능 줄기 (iPS) 세포를 포함한 만능 줄기 세포로부터 인간 뇌 세포를 유도하는 최근의 돌파구에 비추어 볼 때, 현대 유전자 편집 도구와 결합 된 이러한 세포 모델은 뇌에서 세포 상호 작용의 복잡한 연결을 처리하는 강력한 도구로 등장했으며 인간 특이 적 질병 증상을 입증 할 수 있습니다10, 11. 개별 뇌 세포 유형이 동일한 AD 촉진 조건12,13에 직면하여 뚜렷하고 심지어 상충되는 효과를 나타낼 수 있다는 점을 고려할 때,이 줄기 세포 방법론은 뇌 세포 유형 모음에서 집계 판독 값만을 제공하는 확립 된 생체 내 또는 시험관 내 모델을 사용하여 이전에 놓친 세포 유형 별 정보를 고유하게 제공합니다. 지난 10년 동안 ES/iPS 세포의 트랜스분화 또는 다른 말기 분화 세포 유형(예: 섬유아세포)에서 직접 전환하여 인간 뉴런을 생성하기 위해 신뢰할 수 있는 프로토콜이 많이 개발되었습니다.14,15. 특히, 주요 신경인성 전사 인자(예를 들어, 뉴로게닌 2, Ngn2)16를 인간 만능 줄기 세포에 적용하면 신경교 세포와 공배양할 필요 없이 순수 배양을 위한 잘 특성화된 뉴런 세포 유형의 균질한 집단을 생성할 수 있다12,17,18. 유도 된 인간 희소 돌기 아교 세포의 경우, 시간과 자원에서 광범위한 효율성과 수요를 가진 1 차 대응 물과 매우 유사한 기능성 세포를 생성 할 수있는 몇 가지 발표 된 프로토콜이 있습니다 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . 현재까지 이러한 프로토콜 중 어느 것도 희소돌기아교 세포가 AD 발병 기전에 어떻게 반응하고 영향을 미치는지 조사하는 데 적용되지 않았습니다.

여기에서는 인간 유도 뉴런(iN) 및 OPC/희소돌기아교세포(iOPC/iOL)의 단일 및 혼합 배양에 대한 개선된 프로토콜을 설명합니다. 여기에 설명된 iN 프로토콜은 널리 사용되는 Ngn2 접근법(16)에 기초하며, glia-free라는 추가적인 특징을 갖는다. 결과 iN은 균질하고 특징적인 피라미드 형태, 유전자 발현 패턴 및 전기 생리 학적 특징17,18을 갖는 피질 층 2/3 흥분성 뉴런과 매우 유사합니다 (그림 1). 만능 줄기 세포의 직접 분화의 근본적인 장벽 중 일부를 극복하기 위해 우리는 저용량 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 전처리29,30의 간단하고 효과적인 방법을 개발했으며 Douvaras 및 Fossati 32의 널리 채택 된 프로토콜을 기반으로 인간 ES / iPS 세포가 iOPC 및 iOL로 트랜스 분화하는 성향이 향상되었다고보고했습니다32 . 우리는 프로토콜을 더욱 단순화하고 강력한 분화 촉진 화합물인 클레마스틴 7,33,34를 통합하여 희소돌기아교 성숙 과정을 가속화했습니다. 그 결과(그림 2), iOPC는 2주 내에 생성될 수 있고(마커 O4에 대해 ~95% 양성) 4주 내에 iOL이 생성될 수 있습니다(성숙한 마커 MBP 및 PLP1 발현). 흥미롭게도, 우리는 iOPCs만이 놀라운 양의 아밀로이드 β (Aβ)를 분비한다는 것을 발견했으며, 이는 희소 돌기 아교 세포35,36에서 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 풍부한 발현과 처리 프로테아제 β- 세크레타제 (BACE1)의 풍부한 발현을 보여주는 독립적 인 전사체 데이터와 일치합니다. 또한, 당사의 iN-iOPC 공동 배양 시스템은 MBP 양성 iOL 과정에 의한 축삭 외피를 촉진하고 시냅스 형성에 대한 상당한 지원을 제공합니다(그림 3). 따라서 아래에 자세히 설명된 프로토콜은 이전에 카탈로그화된 뉴런-희소돌기아교세포 공동 배양 방법에 비해 기술적 및 생물학적 이점을 가지고 있으며 AD의 신경퇴행을 더 잘 모델링할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. 인간 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 유도

  1. 렌티바이러스 준비(~5일, 앞서 설명한 세부 프로토콜16)
    1. 각 T75 플라스크에 ~100만 개의 HEK293T 세포를 플레이트하여 형질감염을 수행할 때 ~40% 합류하도록 합니다. 테트라사이클린 유도성 Ngn2 및 퓨로마이신 내성 유전자(PuroR, 동일한 TetO 프로모터 대조군 하에서), rtTA 및 3개의 헬퍼 플라스미드 pRSV-REV, pMDLg/pRRE 및 VSV-G(렌티바이러스 벡터 DNA 12μg 및 각 헬퍼 플라스미드 DNA 6μg)를 발현하는 플라스미드로 형질감염시킵니다. 렌티 바이러스 준비 당 최소 3 개의 플라스크를 준비하십시오. 제조업체의 지시에 따라 형질주입을 위해 PEI를 사용하십시오. 16시간 후에 미디어를 교체하고 폐기하십시오.
    2. Harvest는 매일 배양 배지를 수집하여 바이러스 입자를 방출하고 3 일 동안 신선한 배지로 교체했습니다. 정제를 위해 바이러스 입자가 포함된 수집된 배지를 풀링합니다. 0.22μm 필터를 통해 바이러스를 여과하고 49,000 x g 에서 90분 동안 원심분리합니다. 적절한 양의 PBS- 포도당 (~ 150 μL)에 펠릿을 재현 탁하십시오.
  2. 뉴런 유도 (~ 5 일)
    참고: 이 유도 프로토콜(그림 1A, 흐름도)은 검증된 만능성의 iPS 및 ES 세포 모두에 매우 효과적입니다(이는 잘 특성화된 만능성 마커의 면역조직화학 염색으로 분석할 수 있음; 그림 1B).
    1. 52의 계대에서 시판되는 H1 인간 ES 세포를 사용한다(재료 표 참조). ES 세포 유지 배지 (재료 표 참조)를 사용하여 6-웰 플레이트로 코팅된 세포외 매트릭스 용액(6-웰 플레이트당 ~0.5mg의 매트릭스 용액; 재료 표 참조) 상에서 세포를 배양하고, 플레이트를 5%CO2로 37°C에서 배양한다.
    2. -2일째에 1mL의 세포 분리 용액( 재료 표 참조)으로 ES 세포(80% 합류)를 분리하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 세포를 튜브로 옮깁니다. 2mL의 배지로 웰을 씻고 동일한 튜브에서 결합합니다. 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 펠릿을 배지에 재현탁시키고, 웰당 1 x 105 셀의 파종 밀도로 매트릭스 코팅된 6웰 플레이트에 세포를 플레이트화합니다.
    3. -1일째에 폴리브렌(8μg/ml)과 함께 Ngn2와 PuroR 및 rtTA를 발현하는 렌티바이러스를 새로운 ES 세포 유지 배지의 ES 세포에 추가합니다( 재료 표 참조). 바이러스의 정확한 양은 실제 역가 또는 적정에 의해 결정되어야 합니다. 일반적으로 6웰 플레이트에 웰당 각 바이러스 5μL를 추가합니다.
    4. 0일째에 모르포겐이 없는 N2 보충제와 함께 DMEM-F12 배지에 독시사이클린(2μg/mL, Ngn2 발현 활성화)을 추가합니다.
    5. 1일째에 퓨로마이신을 DMEM-F12와 N2 및 독시사이클린의 새로운 배지에 첨가하여 최종 농도 1μg/mL 배지에 첨가합니다. Puromycin에서 최소 24시간 동안 형질도입된 세포를 선택합니다. 바이러스 역가가 낮은 경우 형질도입이 부족한 세포를 적절하게 제거하기 위해 더 높은 Puromycin 농도(최대 5μg/mL)와 더 긴 선택 기간(최대 48시간)이 필요할 수 있습니다.
    6. 2일차에 세포 분리 용액( 재료 표 참조)으로 분화 뉴런을 분리하고 매트릭스 용액( 재료 표 참조)으로 코팅된 24웰 플레이트(80,000–200,000 세포/웰 사이)에 다시 플레이팅하고 독시사이클린이 없는 NBA/B27 배지에 유지합니다. 파종 밀도가 중요합니다.
    7. 이 단계에서 분리 된 뉴런은 특수 상업용 동결 매체 ( 재료 표 참조)에서 동결되어 최대 3 개월 동안 액체 질소에 저장 될 수 있습니다. 순수한 뉴런은 해동 후 전형적인 ~ 15 % -20 % 세포 사멸을 고려하여 도금되거나, 단독으로 배양되거나, 다른 뇌 세포 유형과 공동 배양 될 수 있습니다 (OPC와의 공동 배양은 3.2.3 단계 참조).
    8. 제조자의 지시에 따라 세포 외 기질 기반 용액으로 코팅 된 플레이트에서 순수한 iN을 배양합니다 ( 재료 표 참조). 특징적인 피라미드 형태는 4 일 (및 6 일째; 그림 1C). 시냅스 형성은 빠르면 14일에서 16일에 검출할 수 있으며 표준 시냅스 전후 마커를 사용한 면역조직화학 염색에 의해 24일째에 두드러집니다. (그림 1D; 시냅스 전 마커 Synapsin 1 및 수지상 마커 Map2로 표지됨).

2. 만능줄기세포로부터 인간 희소돌기아교세포 전구세포(OPCs) 유도 및 희소돌기아교세포 성숙

  1. 신경 전구 세포(NPC) 생성: 단층 프로토콜(~7일). 흐름도는 그림 2A 를 참조하십시오.
    1. 앞서 설명한 대로 H1 인간 ES 세포를 배양하고(1.2.1단계 참조) 여러 신호 경로에 대한 소분자 억제제를 사용하여 이중 SMADi라는 확립된 접근 방식을 통해 신경 전구 세포(NPC)로 트랜스분화합니다. 여기에서는 널리 사용되는 상용 키트를 사용하고 제조업체에서 제공하는 단층 프로토콜을 따릅니다( 재료 표 참조).
    2. -1일째에 ES 세포 유지 배지(재료 표 참조)를 사용하여 성장 인자 감소 매트릭스 용액(재료 표 참조, 6웰 플레이트당 ~0.5mg의 매트릭스 용액)으로 코팅된 6웰 플레이트에 웰당 0.5–1 x 106개의 세포를 플레이트합니다(재료 표 참조). 이 성장 인자 감소 매트릭스 용액은 다음 단계에서 사용될 모든 플레이트를 코팅하는 데 사용됩니다.
    3. 0일째에 2% DMSO가 보충된 ES 세포 유지 배지( 재료 표 참조)로 24시간 동안 세포를 처리합니다.
    4. 1-6일째에 상용 키트의 SMAD 억제제가 포함된 따뜻한(37°C) 신경 유도 배지로 전체 배지를 교체합니다( 재료 표 참조). 세포가 분열하여 7일 전에 합류점에 도달하면 2.1.2단계 앞에서 설명한 대로 0.5–1 x 106의 파종 밀도로 계대합니다.
    5. 7일차에 NPC를 세포 분리 용액( 재료 표 참조)을 사용하여 24웰 플레이트의 파종 밀도가 1–2 x 105 셀/웰로 플레이트합니다.
    6. 다능성 마커, 예를 들어 OCT4의 부재 및 NPC 마커, 예컨대 PAX6, Nestin 및 Sox1의 존재에 대한 면역조직화학(IHC) 염색에 의한 분화 효율을 분석한다.
    7. 이 단계에서 분리된 NPC는 특수 상업용 NPC 냉동 매체( 재료 표 참조)에서 동결하고 최대 3개월 동안 액체 질소에 보관할 수 있습니다. 한 번 동결 및 해동 후에도 NPC는 여전히 신뢰할 수 있는 프로토콜을 가진 뉴런, 성상세포 및 OPC를 생성하는 다능성을 유지합니다.
  2. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC) 생성(~7일). 흐름도는 그림 2A 를 참조하십시오.
    1. 7일째에 NPC를 세포 분리 용액(재료 표 참조)을 사용하여 통과시키고 따뜻한 (37°C) 신경 유도 배지의 24웰 플레이트에 웰당 1–2 x 105 세포의 파종 밀도로 플레이팅하고 상용 키트의 SMAD 억제제를 추가합니다(재료 표 참조).
    2. 8일째에 OPC 분화 배지에서 1% DMSO 용액을 준비하고 도금된 NPC를 24시간 동안 처리한다. OPC 분화 배지는 DMEM / F12 배지, 1 % N2 보충제, 1 % B27 보충제, 20 ng / mL에서 bFGF, 1 μM에서 SAG, 10 ng / mL에서 PDGF-AA로 구성됩니다 ( 재료 표 참조).
    3. 9일째에 배지를 DMSO가 없는 새로운 OPC 분화 배지로 교체합니다. 15 일까지 격일로 세포를 먹이십시오. 세포가 15일 전에 합류점에 도달하면 2.2.1단계에 설명된 대로 웰당 1–2 x 105 개의 세포로 계대합니다.
    4. 14일째에, OPC를 24-웰 플레이트에서 1-2 x 105 세포/웰의 밀도로 OPC 분화 배지 중의 플레이트화시켰다.
    5. 이 단계 (제15일)에, IHC 염색 또는 qPCR에 의한 OPC 특이적 마커의 존재에 대한 시험 세포 (예를 들어, O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; 그림 2B) NPC 마커가없는 경우 (Pax6 또는 Nestin; 그림 2D). 우리는 일반적으로 15 일째에 세포의 95 % 이상에서 O4 면역 반응성을 검출합니다. 알츠하이머병과 특히 관련하여, APP (아밀로이드 전구체 단백질), BACE1 (프로테아제 β-세크레아제 1 처리) 및 펩티드 아밀로이드-β(Aβ)의 발현은 OPCs에 풍부하다(도 2F).
  3. 희소돌기아교세포(OL) 성숙(~7–20일)
    1. 15일째에 배지를 OL 성숙 배지로 교체하십시오: 신경기저-A 배지, 2% B27 보충제, 1μM cAMP, 200ng/mL T3 트리요오드티로닌 및 1μM의 클레마스틴( 재료 표 참조). 필요한 경우 격일로 또는 매일 매체를 교체하십시오.
    2. 세포가 90% 합류에 도달하면 최대 2계대까지 1:3 비율로 또는 세포 분열이 상당히 느려질 때까지 분할합니다. OPC가 너무 빨리 분열하고 3일 이내에 컨플루언스에 도달하면 1-3일 동안 2-5μM 농도로 Ara-C( 재료 표 참조)를 추가합니다. 활성 증식은 성숙 효율이 낮아졌음을 나타냅니다.
    3. OL 마커, 예를 들어 CLDN11, PLP1, MBP의 발현을 qPCR, IHC 염색 또는 면역블로팅으로 평가함으로써 희소돌기아교세포 성숙의 효율을 조사한다. 매우 복잡한 구조의 특징적인 형태 (그림 2C)와 OL 마커의 발현 (그림 2E)은 28 일까지 쉽게 감지되어야합니다.

3. 인간 유도 뉴런(iN)과 희소돌기아교세포 전구세포(iOPC)의 공동 배양

  1. iOPC 도금 (~ 3 일)
    1. 플레이트 iOPC를 14일째에 24-웰 플레이트에서 웰당 1 x 105 개의 세포 밀도로 (단계 2.2.4에서 상기 기술된 바와 같이) OPC 분화 배지 (단계 2.2.2.에 기재된 바와 같음).
  2. iN-iOPC 공동 문화 설정
    1. 15일째에, Puromycin 선택 후 (단계 1.2.6에 기재된 바와 같이) 후 2일째의 단계에서 유도된 인간 뉴런을 세포 분리 용액으로 분리한다( 재료 표 참조).
    2. 배양된 OPC 상에 뉴런을 추가하고, 성장하는 OPC를 갖는 24-웰 플레이트에서 웰당 2 x 105 세포의 파종 밀도로 도금한다(단계 3.1.1에서). Neurobasal-A 배지, 2% B27 보충제 및 100ng/mL T3 트리요오드티로닌이 포함된 공동 배양 배지를 사용하십시오. 다음 날 매체를 교체하고 그 이후에는 격일로 배지를 교체하십시오. OPC가 너무 빨리 증식하고 3일 이내에 컨플루언스에 도달하면 2-5μM 농도로 Ara-C를 추가합니다. 7일 후 뉴런 공동 배양에서 성장한 iNs 및 iOPCs의 대표 이미지가 도 3A에 도시되어 있다.
    3. OPCs와의 공동 배양을 위해 단계 1.2.7에서 전술한 바와 같이 제조된 동결 뉴런을 사용한다. 플레이트 동결 및 해동 뉴런을 웰당 3 x 105 세포의 더 높은 밀도로 만듭니다.
    4. 공동 배양에서 14-16 일 후, iNs의 시냅스 형성은 시냅스 전후 마커의 IHC 염색에 의해 관찰 될 수 있으며, 21 일째에는 시냅스 반점이 풍부해야하며 (그림 3C) 신경 세포 활동을 안정적으로 기록 할 수 있습니다.
    5. 21일째부터 세포에서 OL 특이적 마커(예를 들어, MBP 및 PLP1)에 대해 시험한다. 28일째까지, 우리는 일반적으로 특정 마커에 대한 IHC 염색으로 표지된 iOL 과정에 의한 iN 축삭의 피복 현상을 관찰합니다(그림 3B; iN 축삭의 경우 신경섬유 NF, iOPC 과정의 경우 MBP).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

인간 만능 줄기 세포에서 인간 유도 뉴런의 직접 생성
시작하는 인간 다 능성 줄기 세포가 iN 또는 iOPC / iOL의 성공적인 생성을 위해 높은 수준의 다 능성을 나타내는 것이 매우 중요합니다. 따라서, 세포는 본 원고에 기재된 유도 프로토콜 중 하나를 시작하기 전에 Oct4 및 SOX2와 같은 특정 마커에 대해 염색되어야 한다(도 1A). 인간 H1 세포는 Zhang et al.에 의해 이전에 발표된 프로토콜에 따라 유도된 흥분성 전뇌 뉴런을 얻기 위해 사용되었으며, 일부 변형(그림 1C)12,16,17,18이 있었습니다. 여기에서는 2 일째의 iN이 피더 층이없는 상태에서 매트릭스 용액 (재료 표 참조)에서 순수 배양으로 재 도금되는 프로토콜을 제시합니다 : glia 또는 fibroblasts. 이전에 발표 된 프로토콜 외에도 2 일째에 iN을 동결해도 세포 생존율에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 관찰되었습니다 (해동 후 ~ 15 % -20 % 세포 사멸). 배양 된 순수한 뉴런은 14-16 일에 synapsin1을 발현하기 시작합니다 (그림 1D). 특정 인자, 예를 들어 주요 AD 위험 인자 ApoE가 영양층의 세포에 의해 발현될 수 있고 이로 인해 결과가 크게 혼란스러울 수 있기 때문에 순수한 뉴런 배양을 확립하는 것이 매우 중요합니다.

iOPC 생성 및 iOL 성숙은 DMSO 처리에 의해 개선됩니다.
여기에서는 2주 내에 iOPC를 생성하고 4-5주 내에 성숙한 iOL을 생성할 수 있는 빠르고 효율적인 프로토콜을 제시합니다(그림 2A). 우리는 ES 및 iPS 세포 29,30,31의 분화 효율을 높이기 위해 이전에 개발한 일시적인 DMSO 처리 방법을 활용했습니다. DMSO 처리는 더 나은 신호 통합을 위해 초기 G1 단계의 세포 수를 풍부하게하여 분화를 선호합니다. 인간 ES 세포가 NPC를 생성하도록 유도하기 전에 첫 번째 처리를 수행했고, NPC를 iOPC로 분화하기 전에 두 번째 처리를 수행했습니다. ES H1 세포의 도금 후 빠르면 2주 이내에 특정 OPC 마커(Olig2, CSPG4, NKX2.2 및 PDGFRA)를 검출할 수 있습니다(그림 2B, E). 이 단계의 iOPC 집단은 상당히 균질하며 세포의 >95%가 O4 염색에 양성이고 다른 마커에 대한 면역 반응성이 높습니다(그림 2B). 15일째에 OL 성숙이 시작된 후 일반적으로 28일째부터 특정 OL 마커(MBP, O1, CLDN11 및 PLP1)를 검출할 수 있습니다(그림 2C, E). 이러한 단계 특이적 마커의 발현은 희소돌기아교세포의 발달 과정과 상관관계가 있으며, NPC 마커가 점진적으로 감소하고, OPC 마커가 2주차에 정점에 도달하고, OL 마커가 3주차까지 상승하는 가속화된 속도를 시사합니다(그림 2D,E)37. 이 성숙 과정은 세포 집단을 다양 화합니다. OPC와 성숙한 수초 희소돌기아교세포 사이의 여러 중간 단계를 포함하는 연속체의 하위 집단이 존재할 수 있으며 전체 세포의 다양한 비율을 차지할 수 있으며 나중에 더 성숙한 세포가 우세합니다.

비교하자면, 우리는 많이 참조된 iOPC를 구입하고 제조업체 프로토콜에 따라 iOL에서 성숙시켰습니다. 우리는 iOPC 및 iOL 제제와 우리가 구입 한 세포에서 위에서 언급 한 마커의 발현을 테스트했습니다. 우리는 프로토콜에 따라 생성 된 세포가 테스트 된 모든 유전자 중 더 높은 발현을 보였다는 것을 확인했습니다 (그림 2E). 흥미롭게도 iN과 iOPC에서 아밀로이드 β의 두 가지 주요 이소 형 (Aβ40 및 Aβ42)의 분비 수준을 테스트했을 때 iOPC가 두 단편을 더 많이 분비했지만 비율은 동일하게 유지되었습니다 (그림 2F).

iN과 iOPC의 공동 배양
이 프로토콜은 iN과 iOPC를 공동 배양하는 데 특별히 최적화되어 있으며 신경 발달 과정에서 이러한 두 세포 유형 간의 세포 간 통신을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 두 세포 유형에 대한 이상적인 도금 밀도는 적절한 분화를 달성하기 위해 일련의 세포 수 적정으로 결정해야 합니다(그림 3A). 공동 배양 4주 후, iOPC는 MBP와 같은 특정 마커에 양성인 OL로 적절하게 분화되고 초이스 축삭으로 프로세스를 확장할 것으로 예상됩니다(그림 3B). 공동 배양 시스템은 시냅스 수를 강력하게 늘릴 수 있으며, 이는 iOPC가 물리적 접촉 또는 영양 인자의 방출을 통해 신경 지원을 제공한다는 것을 나타냅니다(그림 3C). 우리는 최대 6 주 동안 허용 가능한 건강 상태로 공동 배양을 유지할 수 있으며 시냅스 수 및 기타 신경 세포 속성이 5 주경에 정체되는 것을 관찰 할 수 있습니다. 참고로, 성상 세포와 미세 아교 세포는 우리의 준비에 존재하지 않으며 특정 마커의 발현을 확인하여 그 부재를 문서화 할 수 있습니다 (그림 3D). iOPC는 파라크린(예: 뉴로트로핀 및 대사산물) 및/또는 시냅스 방식(그림 3E 및 3F)으로 이웃 뉴런의 활동 의존적 신호에 잠재적으로 반응하고 매개할 수 있는 많은 수의 잘 특성화된 유전자를 발현합니다.

Figure 1
그림 1: hPSC에서 인간 유도 뉴런(iN)의 직접 생성. (A) iN 생성의 흐름도. (b) 만능성을 확인하기 위한 인간 만능줄기세포(H1)의 배양 개시 대표 명시야 및 면역형광 이미지. Oct4는 빨간색으로, Sox2는 녹색으로 표시됩니다. (C) 4일째 및 6일차의 iN의 대표적인 명시야 이미지. (D) 24일 동안 순수 배양에서 성장한 iNs에서 수지상 수목 수목 및 시냅스 반점에 대한 특징적인 형태와 수지상 마커 Map2 및 시냅스 전 마커 Synapsin 1(Syn1)에 대한 면역형광 염색으로 염색합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: iOPC 생성 및 iOL 성숙. (A) iOPC 및 iOL 생성의 흐름도. (B) 15일째에 iOPC의 대표적인 명시야 및 면역형광 이미지. Olig2 (범-희소돌기아교세포 마커)는 녹색, O4 (OPC 마커)는 빨간색, DAPI는 파란색으로 표시됩니다. 이미징 결과 iOPC의 >95%가 O4에 양성이고 Olig2에 대해 25%가 양성인 것으로 나타났습니다. (C) 28일째에 iOL의 대표적인 명시야 및 면역형광 이미지. MBP는 녹색, O1은 빨간색, DAPI는 파란색으로 표시됩니다. (D) NPC 마커 PAX6의 발현은 14일째에 iOPC에서 극적으로 감소하고 28일째에 OL에서 배경으로 더 낮아져 강력한 NPC 트랜스 분화와 iOPC 집단에서 높은 수준의 균질성을 나타냅니다. (e) 시간-과정 발현 프로필을 기술된 프로토콜에 의해 생성된 배양물에서, DMSO 인큐베이션하는 단계 없이(-DMSO) 또는 (+DMSO) DMSO 인큐베이션하는 단계 (단계 2.1.3 및 2.2.2)를 상이한 시점에서 검정한다. 비교로서, 상업용 iOPC ( 재료 표 참조)는 제조업체의 지침에 따라 성숙되었으며, iOPC (iOPC-Tempo) 또는 iOL (iOL-Tempo)은 동일한 마커에 대해 테스트되었습니다. 예상대로, MBP (성숙한 희소 돌기 아교 세포 마커)는 테스트 된 모든 iOPC에서 분화 초기 단계에서 검출되지 않았습니다 (ND). DMSO는 OPC 분화 및 OL 성숙의 효율을 크게 향상시켰다. (F) 순수한 iNs 및 iOPCs 배양물에서 얻은 상청액에 대해 상업용 ELISA 키트 ( 재료 표 참조)로 측정하고 세포 번호로 정규화 된 순수 iNs 및 iOPC 배양에서 Aβ40 및 Aβ42의 생산 및 분비 (둘 다 24 웰 플레이트에서 웰당 200,000 세포의 밀도에서). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

막대 그래프의 데이터는 평균± SEM으로 표시됩니다(n ≥ 3). 통계학적 유의성은 스튜던트 t-검정에 의해 평가되었다 (*, p < 0.05; ***, p < 0.001); (D)에서, NPC와 비교; (E)에서, 대조군 iOPC-템포와 비교; (F)에서 iN과 비교합니다.

Figure 3
그림 3: iN과 iOPC의 공동 배양. (A) 7일째에 공동 배양된 iN 및 iOPC의 대표적인 명시야 이미지로, 추가 성숙을 위한 적절한 밀도를 보여줍니다. (B) 28일 동안 공동 배양된 iNs 및 iOPC의 대표적인 면역형광 이미지. 축삭 마커 신경 섬유 NF는 녹색으로, 희소 돌기 세포 마커 MBP는 빨간색으로 표시됩니다. 오른쪽은 iOL 과정(MBP+)에 의해 피복된 iN 축삭의 한 부분입니다. (C) 4 주령의 공동 배양에서 분석 된 시냅스 형성. 세포를 Synapsin 1 (Syn1, 녹색) 및 MAP2 (적색)에 대해 염색하고, 시냅스 반점을17,18에 기재된 바와 같이 수지상 세그먼트를 따라 밀도의 공초점 분석에 의해 정량화하였다. (D) iN과 iOPC의 공동 배양 (공동 배양 7 일)에서 성상 세포 마커 인 ALDHL1 및 GFAP의 발현은 최소화 (상단)이며 미세 아교 세포 마커 인 TMEM119, TREM2 및 CD33의 발현은 qPCR에 의해 검출되지 않습니다 (ND). 따라서이 두 가지 신경교 세포 유형의 오염이 배제됩니다. (E) iOPC를 iN과 공동 배양하면 뉴런-OPC 시냅스가 형성됩니다. 형광 태그가 부착된 시냅스 후 마커 PSD95-mCherry는 OPC에서만 발현되며 단일 배양(왼쪽)에서는 확산 패턴을 나타내지만 응집되어 공동 배양에서는 반점을 형성합니다(오른쪽, 화살표로 표시; Tuj1, 뉴런 마커). (F) 14일째에 iOPC의 순수 배양에서 뉴런 활동을 감지하고 반응할 수 있는 잘 특성화된 희소돌기아교 유전자의 발현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

막대 그래프의 데이터는 평균± SEM으로 표시됩니다(n ≥ 3). 통계적 유의성은 스튜던트 t-검정에 의해 평가되었다 (**, p < 0.005; ***, p < 0.001); (C)에서, OPC 없는 조건과 비교하여; (D)에서, 상단 패널의 1 차 성상 세포와 비교.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

시냅스 구조를 안정화시키고 수초화에 의한 염분 신호 전도를 촉진하는 물리적 및 대사적 지원 외에도 희소돌기아교세포 계통 세포는 뉴런 5,6,7과의 빠르고 역동적인 혼선을 통해 뉴런 활동 패턴을 형성할 수 있습니다. AD 병리학에서 희소돌기아교세포 반응은 처음에는 염증 및 산화 스트레스에 이차적인 것으로 간주되었지만, 이제 손상된 미엘린 완전성이 Aβ 응집 및 타우 과인산화9가 나타나기 전의 초기 병원성 사건이라고 주장하는 유망한 증거가 있습니다. 더욱이, OPC의 자가 갱신을 통한 수초화의 복구는 AD38에서 특히 취약한데, 이는 뉴런 활동에 크게 의존하는 과정이다. 따라서 건강한 뉴런-희소돌기아교세포 신호 전달을 지원하는 메커니즘을 이해하는 것은 새로운 치료 표적을 식별할 수 있는 훌륭한 기회를 나타냅니다.

단일 전사 인자 Ngn2 프로토콜은 줄기 세포 유래 인간 뉴런의 생성에 가장 많이 사용되는 기술 중 하나이며 여기에 설명된 절차는 순수한 뉴런 배양을 얻기 위한 추가 개선입니다. 당사의 iOPC/iOL 프로토콜은 이전에 발표된 연구(4-24주)보다 유도 기간이 짧으며, 일반적으로 사용되는 다른 프로토콜 19,20,22,23,24,25,26,27,28에 필적하는 강력한 수율과 순도를 제공합니다. . 우리의 프로토콜은 특성화 된 패터닝 큐에 의해 NPC, OPC 및 최종적으로 희소 돌기 아교 세포에 대한 ES 세포의 단계적 분화를 도입하고, 이전 연구에서 설명한 바와 같이 체외 또는 생체 내에서 (예 : 떨림 마우스 모델로의 생착에 의해) 수초 항상성 및 복구의 조절을 연구하는 데 사용할 수있는 기능성 세포를 생성합니다. 우리 프로토콜의 개선은 망막 모세포종 단백질을 활성화하고 세포주기의 G1 단계를 연장하여 지시 된 분화의 자극을보다 잘 통합하고 기능적 유도체29,30으로의 말단 분화를 향상시키는 DMSO 배양에 의해 크게 촉진됩니다. 마지막으로, 재수초 치료제(33)에 대한 약물 스크리닝을 통해 확인된 무스카린성 및 항히스타민성 화합물인 클레마스틴의 사용은 iPS 세포 제제 및살아있는 동물7,28에서 관찰된 바와 같이 희소돌기아교세포 성숙을 추가로 단축시킨다.

이 기술의 한계는 주로 단순화 된 체외 설정과 뇌의 생체 내 환경 사이의 본질적인 불일치에 있습니다. 이러한 불일치는 개별 뇌 세포 유형에 대한 고급 단계에서 완전한 발달 잠재력을 할인합니다. iN의 경우 최근 연구에서 상당히 오랜 기간 동안 양호한 시냅스 건강 상태로 배양을 유지할 수 있었지만 여전히 "오래된" iN 배양(25개월 된 배양)에서 척추와 같은 구조가 감소하고 자발적인 시냅스 전달 장애로 나타나는 일부 상대적 미성숙이 밝혀졌습니다.39. iOPC가 형질전환 마우스 뇌에 이식된 후 생체 내에서 축삭을 수초화하는 것으로 재현 가능하게 입증되었지만, 전자 현미경 평가를 통한 시험관 내 수초화 분석은 여전히 이것을 포함하여 거의 모든 공개된 프로토콜19,28에 대해 만족스럽지 못한 효율성을 갖는 기술적 도전을 나타냅니다. 따라서 우리의 뉴런-OPC 공동 배양 시스템은 AD 병리학의 후기 단계뿐만 아니라 뇌 노화 과정을 충실하게 모방 할 것으로 예상되지 않습니다. 오히려, 뉴런과 OPC 또는 초기 단계의 희소돌기아교세포 사이의 정교한 세포 간 상호 작용을 풀 수 있는 고유한 태세를 갖추고 있으며, 이는 수초화와 무관하지만 적절한 신경 발달 및 질병 발병 기전에 필수적입니다.

여기에 설명된 세 가지 절차 각각에는 프로토콜 내에서 c ritical 단계가 있으며 수정 및 문제 해결이 필요할 수 있습니다. iN 프로토콜의 경우 퓨로마이신 선택(단계 1.2.5)과 도금 밀도(단계 1.2.6)의 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 형질도입되지 않은 세포의 불완전한 제거는 잘 분화되지 않은 세포의 오염을 초래하고 뉴런의 생존 및 기능을 손상시킨다. 단계 1.2.5에 설명된 바와 같이 더 높은 농도와 더 긴 배양으로 더 강력한 퓨로마이신 선택을 위한 변형을 고려해야 합니다. 적절한 도금 밀도는 각 만능 세포주에 대한 적정에 의해 결정되어야 하는데, 이는 낮은 밀도는 배양물의 붕괴로 이어지고 높은 밀도는 세포 응집을 촉진하고 신경 성장을 방해하기 때문입니다. iOPC/iOL 프로토콜의 경우, 두 가지 중요한 단계는 OPC 분화에서의 세포 증식 제어(단계 2.2.3) 및 OL 성숙을 위한 도금 밀도(단계 2.2.4 및 2.3.2)이다. 분화 NPC의 과도한 성장은 OPC 분화 자극에 대한 반응이 좋지 않음을 나타내며 적절한 용량의 Ara-C 치료(표시된 범위 내)로 완화해야 합니다. 성숙을 위해 OPC를 도금하는 동안, 희소 분포가 복잡한 구조의 생리학적 형태의 유도를 용이하게 할 수 있기 때문에 여기에서 더 낮은 범위의 세포 밀도가 바람직하다( 도 2C에 도시된 바와 같이). iN-iOPC 공동 배양 프로토콜의 경우, 두 세포 유형 모두에 대해 적절한 밀도로 도금하는 중요한 단계(3.1.1단계 및 3.2.2단계)에 주목하고자 합니다. 특히, iN은 성장하는 OPC 사이에 표면에 잘 부착되지 않을 수 있으며 배양이 컨플루언스에 도달하면 먼저 분리되는 경향이 있습니다. 최적의 비율은 셀 수를 적정하여 결정해야 합니다.

전반적으로, 우리 프로토콜에 상주하는이 환원 주의적 접근 방식은 인간 두뇌의 고유 한 복잡성에서 특정 이종 세포 상호 작용을 해부하고 건강 및 AD에서 희소 돌기 생물학을 밝히는 강력한 도구입니다. 따라서 기존 방법과 관련된 중요성은 우리의 의견으로는 상당히 분명합니다. 미래의 응용을 위해 여기에서 개발된 방법의 추가의 유용성은 방사선 요법 후(40) 및 척수 손상(41,42)과 같은 탈수초성 상태에 대한 세포 기반 요법이다. 또한, 이 줄기세포 기반 시스템의 높은 처리량 용량은 뉴런, OPC, 희소돌기아교세포 및 이들의 상호작용의 생리학적 상태를 보호하거나 복원할 수 있는 화합물에 대한 소분자 라이브러리를 스크리닝하는 데 더 큰 규모로 활용될 수도 있습니다. 따라서 우리는 여기에 설명 된 프로토콜이 AD 및 기타 신경 퇴행성 장애에 대한 더 나은 모델링 도구와 효과적인 치료법을 개발하는 데있어 향후 작업을 용이하게 할 것이라고 믿습니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 작업은 국립 보건원 (R00 AG054616에서 YAH, T32 GM136566에서 KC), 스탠포드 의과 대학 및 Siebel Fellowship (SC에 수여)의 보조금으로 지원되었습니다. YAH는 브라운 중개 과학 연구소의 중개 신경 과학 센터의 GFL 번역 교수입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Accutase STEMCELL Technologies 7920
B27 supplement ThermoFisher 17504044
bFGF ThermoFisher PHG 0266
cAMP MilliporeSigma A9501
Clemastine MilliporeSigma SML0445
DMEM/F12 medium STEMCELL Technologies 36254
DMSO ThermoFisher D12345
Doxycycline MilliporeSigma D3072
Fetal Bovine Serum ScienCell 10
H1 human ES cells WiCell WA01
Matrigel Corning 354234
mTeSR plus STEMCELL Technologies 5825
N2 supplement ThermoFisher 17502001
Neurobasal A medium ThermoFisher 10888-022
Non Essential Amino Acids ThermoFisher 11140-050
PDGF-AA R&D Systems 221-AA-010
PEI VWR 71002-812
pMDLg/pRRE Addgene 12251
Polybrene MilliporeSigma TR-1003-G
pRSV-REV Addgene 12253
Puromycin ThermoFisher A1113803
ROCK Inhibitor Y-27632 STEMCELL Technologies 72302
SAG Tocris 4366
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Media STEMCELL Technologies 5838
STEMdiff SMADi Neural Induction Kit STEMCELL Technologies 8581
T3 triiodothyronine MilliporeSigma T6397
Tempo-iOlogo: Human iPSC-derived OPCs Tempo BioScience SKU102
TetO-Ng2-Puro Addgene 52047
VSV-G Addgene 12259

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelvig, D. P., Pakkenberg, H., Stark, A. K., Pakkenberg, B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiology of Aging. 29 (11), 1754-1762 (2008).
  2. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  3. De Strooper, B., Karran, E. The cellular phase of Alzheimer's disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
  4. Monje, M. Myelin plasticity and nervous system function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
  5. Hughes, E. G., Orthmann-Murphy, J. L., Langseth, A. J., Bergles, D. E. Myelin remodeling through experience-dependent oligodendrogenesis in the adult somatosensory cortex. Nature Neuroscience. 21 (5), 696-706 (2018).
  6. Gibson, E. M., et al. Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain. Science. 344 (6183), 1252304 (2014).
  7. Pan, S., Mayoral, S. R., Choi, H. S., Chan, J. R., Kheirbek, M. A. Preservation of a remote fear memory requires new myelin formation. Nature Neuroscience. 23 (4), 487-499 (2020).
  8. Thornton, M. A., Hughes, E. G. Neuron-oligodendroglia interactions: Activity-dependent regulation of cellular signaling. Neuroscience Letters. 727, 134916 (2020).
  9. Ettle, B., Schlachetzki, J. C. M., Winkler, J. Oligodendroglia and myelin in neurodegenerative diseases: more than just bystanders. Molecular Neurobiology. 53 (5), 3046-3062 (2016).
  10. Essayan-Perez, S., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Huang, Y. A. Modeling Alzheimer's disease with human iPS cells: advancements, lessons, and applications. Neurobiology of Disease. 130, 104503 (2019).
  11. Li, L., et al. GFAP mutations in astrocytes impair oligodendrocyte progenitor proliferation and myelination in an hiPSC model of Alexander disease. Cell Stem Cell. 23 (2), 239-251 (2018).
  12. Lin, Y. T., et al. APOE4 causes widespread molecular and cellular alterations associated with Alzheimer's disease phenotypes in human iPSC-derived brain cell types. Neuron. 98 (6), 1294 (2018).
  13. TCW, J., et al. Cholesterol and matrisome pathways dysregulated in human APOE ε4 glia. bioRxiv. , (2019).
  14. Ang, C. E., Wernig, M. Induced neuronal reprogramming. Journal of Comparitive Neurology. 522 (12), 2877-2886 (2014).
  15. Penney, J., Ralvenius, W. T., Tsai, L. H. Modeling Alzheimer's disease with iPSC-derived brain cells. Molecular Psychiatry. 25 (1), 148-167 (2020).
  16. Zhang, Y., et al. Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  17. Huang, Y. A., Zhou, B., Nabet, A. M., Wernig, M., Sudhof, T. C. Differential signaling mediated by ApoE2, ApoE3, and ApoE4 in human neurons parallels Alzheimer's Disease risk. Journal of Neuroscience. 39 (37), 7408-7427 (2019).
  18. Huang, Y. A., Zhou, B., Wernig, M., Sudhof, T. C. ApoE2, ApoE3, and ApoE4 Differentially Stimulate APP Transcription and Abeta Secretion. Cell. 168 (3), 427-441 (2017).
  19. Yang, N., et al. Generation of oligodendroglial cells by direct lineage conversion. Nature Biotechnology. 31 (5), 434-439 (2013).
  20. Douvaras, P., et al. Efficient generation of myelinating oligodendrocytes from primary progressive multiple sclerosis patients by induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (2), 250-259 (2014).
  21. Lee, E. H., Park, C. H. Comparison of reprogramming methods for generation of induced-oligodendrocyte precursor cells. Biomolecules & Therapeutics (Seoul). 25 (4), 362-366 (2017).
  22. Ehrlich, M., et al. Rapid and efficient generation of oligodendrocytes from human induced pluripotent stem cells using transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (11), 2243-2252 (2017).
  23. Rodrigues, G. M. C., et al. Defined and scalable differentiation of human oligodendrocyte precursors from pluripotent stem cells in a 3D culture system. Stem Cell Reports. 8 (6), 1770-1783 (2017).
  24. Hu, B. Y., Du, Z. W., Li, X. J., Ayala, M., Zhang, S. C. Human oligodendrocytes from embryonic stem cells: conserved SHH signaling networks and divergent FGF effects. Development. 136 (9), 1443-1452 (2009).
  25. Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Molecular and Cellular Neuroscience. 34 (3), 310-323 (2007).
  26. Yamashita, T., et al. Differentiation of oligodendrocyte progenitor cells from dissociated monolayer and feeder-free cultured pluripotent stem cells. PLoS One. 12 (2), 0171947 (2017).
  27. Wang, S., et al. Human iPSC-derived oligodendrocyte progenitor cells can myelinate and rescue a mouse model of congenital hypomyelination. Cell Stem Cell. 12 (2), 252-264 (2013).
  28. Chanoumidou, K., Mozafari, S., Baron-Van Evercooren, A., Kuhlmann, T. Stem cell derived oligodendrocytes to study myelin diseases. Glia. 68 (4), 705-720 (2020).
  29. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  30. Li, J., et al. A transient DMSO treatment increases the differentiation potential of human pluripotent stem cells through the Rb family. PLoS One. 13 (12), 0208110 (2018).
  31. Sambo, D., Li, J., Brickler, T., Chetty, S. Transient treatment of human pluripotent stem cells with DMSO to promote differentiation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), (2019).
  32. Douvaras, P., Fossati, V. Generation and isolation of oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (8), 1143-1154 (2015).
  33. Mei, F., et al. Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis. Nature Medicine. 20 (8), 954-960 (2014).
  34. Madhavan, M., et al. Induction of myelinating oligodendrocytes in human cortical spheroids. Nature Methods. 15 (9), 700-706 (2018).
  35. Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
  36. Grubman, A., et al. A single-cell atlas of entorhinal cortex from individuals with Alzheimer's disease reveals cell-type-specific gene expression regulation. Nature Neuroscience. 22 (12), 2087-2097 (2019).
  37. Goldman, S. A., Kuypers, N. J. How to make an oligodendrocyte. Development. 142 (23), 3983-3995 (2015).
  38. Behrendt, G., et al. Dynamic changes in myelin aberrations and oligodendrocyte generation in chronic amyloidosis in mice and men. Glia. 61 (2), 273-286 (2013).
  39. Patzke, C., et al. Neuromodulator signaling bidirectionally controls vesicle numbers in human synapses. Cell. 179 (2), 498-513 (2019).
  40. Piao, J., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitors remyelinate the brain and rescue behavioral deficits following radiation. Cell Stem Cell. 16 (2), 198-210 (2015).
  41. Keirstead, H. S., et al. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 25 (19), 4694-4705 (2005).
  42. Kim, D. S., et al. Rapid generation of OPC-like cells from human pluripotent stem cells for treating spinal cord injury. Experimental & Molecular Medicine. 49 (7), 361 (2017).

Tags

신경 과학 이슈 165 유도 만능 줄기 세포 iPS 세포 인간 배아 줄기 세포 ES 세포 뉴런 희소 돌기 아교 세포 희소 돌기 아교 세포 전구 세포 OPC 알츠하이머 병 아밀로이드 베타 펩타이드 시냅스

Erratum

Formal Correction: Erratum: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions
Posted by JoVE Editors on 12/29/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. The Representative Results section has been updated.

Figure 3 was updated from:

Figure 3
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 3
Figure 3: Co-culture of iNs and iOPCs. (A) Representative bright field image of co-cultured iNs and iOPCs at Day 7, showing a proper density for further maturation. (B) Representative immunofluorescence image of iNs and iOPCs co-cultured for 28 days. Axonal marker neurofilament NF is shown in green and oligodendrocytic marker MBP in red. Right, a segment of iN axon ensheathed by iOL process (MBP+). (C) Synapse formation assayed in 4-week-old co-cultures. Cells were stained for Synapsin 1 (Syn1, green) and MAP2 (red), and synaptic puncta were quantified by confocal analysis of density along the dendritic segments as described17,18. (D) In our co-cultures of iNs and iOPCs (7 days of co-culturing), the expression of astrocyte markers, ALDHL1 and GFAP, is minimal (top), and the expression of microglia markers, TMEM119, TREM2, and CD33, is not detected (N.D.) by qPCR. The contamination from these two glial cell types is thus excluded. (E) Coculturing iOPC with iN leads to the formation of neuron-OPC synapses. The fluorescence-tagged post-synaptic marker PSD95-mCherry is expressed only in OPCs, and display a diffuse pattern in single cultures (left) but aggregate to form puncta in cocultures (right, indicated by arrows; Tuj1, neuronal marker). (F) The expression of well-characterized oligodendroglial genes that can sense and respond to neuronal activities in the pure cultures of iOPCs at Day 14. Please click here to view a larger version of this figure.

The fourth paragraph was updated from:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D).

to:

Co-culturing of iNs and iOPCs
This protocol is optimized specifically for co-culturing iNs and iOPCs and allow our real-time monitoring of the inter-cellular communications between these two cell types along the course of neural development. The ideal plating densities for both cell types need to be decided with a series of cell number titration to achieve proper differentiation (Figure 3A). After 4 weeks in co-cultures, the iOPCs are expected to be adequately differentiated into OLs that are positive for specific markers such as MBP and extend processes to ensheath axons (Figure 3B). The co-culture system can robustly boost up the number of synapses, indicating that the iOPCs provide a neuronal support through physical contacts or release of trophic factors (Figure 3C). We can maintain the co-cultures in acceptable health condition for up to 6 weeks and observe that the synapse number and other neuronal attributes plateau around the fifth week. Of note, astrocytes and microglia are not present in our preparations and their absence can be documented by checking the expression of specific markers (Figure 3D). The iOPCs express a good number of well-characterized genes that can potentially respond to and mediate the activity-dependent signals from neighboring neurons, in a paracrine (e.g. neurotrophins and metabolites) and/or a synaptic manner (Figure 3E and 3F). 

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Assetta, B., Tang, C., Bian, J.,… More

Assetta, B., Tang, C., Bian, J., O'Rourke, R., Connolly, K., Brickler, T., Chetty, S., Huang, Y. W. A. Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions. J. Vis. Exp. (165), e61778, doi:10.3791/61778 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter