Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Entfernung endogener Lipide aus Allergenen und deren Ersatz durch benutzerdefinierte Liganden durch Umkehrphasen-HPLC in Verbindung mit thermischem Glühen. 31 P-NMR und zirkulärer Dichroismus ermöglichen die schnelle Bestätigung der Ligandenentfernung/-belastung und die Wiederherstellung der nativen Allergenstruktur.
Abstract
Viele wichtige Allergene binden an hydrophobe lipidähnliche Moleküle, darunter Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 und Fel d 1. Diese Liganden bleiben stark erhalten und haben das Potenzial, den Sensibilisierungsprozess zu beeinflussen, entweder durch direkte Stimulation des Immunsystems oder durch Veränderung der biophysikalischen Eigenschaften des allergenen Proteins. Um diese Variablen zu kontrollieren, sind Techniken zur Entfernung endogener gebundener Liganden und gegebenenfalls zum Ersatz durch Lipide bekannter Zusammensetzung erforderlich. Das Kakerlakenallergen Bla g 1 umschließt eine große hydrophobe Höhle, die eine heterogene Mischung aus endogenen Lipiden bindet, wenn sie mit traditionellen Techniken gereinigt wird. Hier beschreiben wir eine Methode, mit der diese Lipide mittels Umkehrphasen-HPLC gefolgt von thermischem Glühen entfernt werden, um Bla g 1 entweder in seiner Apo-Form oder mit einer benutzerdefinierten Mischung aus Fettsäure- oder Phospholipidladungen zu erhalten. Die Kopplung dieses Protokolls mit biochemischen Assays zeigt, dass Fettsäureladungen die Thermostabilität und proteolytische Resistenz von Bla g 1 signifikant verändern, mit nachgelagerten Auswirkungen auf die Rate der T-Zell-Epitopbildung und Allergenität. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von Lipidentfernungs- / Nachladeprotokollen wie dem hier beschriebenen bei der Untersuchung von Allergenen aus rekombinanten und natürlichen Quellen. Das Protokoll ist auf andere Allergenfamilien verallgemeinerbar, einschließlich Lipocaline (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) und Uteroglobin (Fel d 1), und bietet ein wertvolles Werkzeug, um die Rolle von Lipiden bei der allergischen Reaktion zu untersuchen.
Introduction
Eine Untersuchung der Allergendatenbank zeigt, dass Allergene nur in 2% aller bekannten Proteinfamilien vorkommen, was darauf hindeutet, dass gemeinsame funktionelle und biophysikalische Eigenschaften zur Allergenität beitragen1. Von diesen Eigenschaften scheint die Fähigkeit, Lipidladungen zu binden, unter allergenen stark überrepräsentiert zu sein, was darauf hindeutet, dass diese Ladungen den Sensibilisierungsprozess beeinflussen können1. Tatsächlich hat sich gezeigt, dass das Paranussallergen Ber e 1 eine gleichzeitige Verabreichung mit seinem endogenen Lipid erfordert, um sein volles sensibilisierendes Potenzialauszuschöpfen 2. Diese Lipide könnten potentiell das Immunsystem direkt stimulieren, wie die Milbenallergene Der p 2 und Der p 7 zeigen, die beide eine starke strukturelle Homologie mit LPS-bindenden Proteinen3,4,5teilen . Basierend auf dieser Beobachtung wurde vorgeschlagen, dass Derp 2 und Der p 7 bakterielle Lipide binden und das Immunsystem des Wirts durch TLR4-vermittelte Signalisierung direkt stimulieren könnten, was den Sensibilisierungsprozess erleichtert5,6. Es ist auch möglich, dass endogen gebundene Lipide die biophysikalischen Eigenschaften allergener Proteine selbst verändern könnten. Zum Beispiel erhöhte die Fähigkeit von Sin a 2 (Senf) und Ara h 1 (Erdnüsse), mit Phospholipidvesikeln zu interagieren, signifikant ihre Resistenz gegen Magen- und Endosomalabbau7, während die Ligandenbindung an das Hauptbirkenpollenallergen Bet v 1 sowohl die Rate der endosomalen Verarbeitung als auch die Vielfalt der resultierenden Peptide veränderte8. Dies ist besonders relevant für die Allergenität angesichts der Korrelation, die zwischen Stabilität, T-Zell-Epitopbildung und Allergenität für Proteine wie Bet v 1 und Bla g 1 beobachtet wurde; Letzteres wird Gegenstand dieser Arbeit sein9,10.
Bla g 1 repräsentiert das prototypische Mitglied der Proteinfamilie des Major Allergen (MA) des Insekts und besitzt eine einzigartige Struktur, die aus 12 amphipathischen Alpha-Helices besteht, die einen ungewöhnlich großen hydrophobenHohlraumumschließen 9,11. Die verfügbare Röntgenkristallstruktur von Bla g 1 zeigt eine Elektronendichte innerhalb dieses Hohlraums, die mit gebundenen Phospholipid- oder Fettsäureliganden übereinstimmt; eine Vermutung, die durch 31P-NMR und Massenspektrometrie bestätigt wird. Diese Ladungen waren heterogener Natur und ihre Zusammensetzung hing stark von der Allergenquelle ab, wobei für rekombinante Bla g 1, ausgedrückt in E. coli und P. pastoris,unterschiedliche Lipidprofile beobachtet wurden. Seltsamerweise enthielt Bla g 1, gereinigt von seiner natürlichen Allergenquelle (Kakerlakenfrass), überwiegend Fettsäuren an seiner Bindungsstelle, wobei eine Mischung aus Palmitat, Oleat und Stearat als seine "natürlichen" Liganden identifiziert wurde9,11. Die Fähigkeit von Bla g 1, Lipide und Fettsäuren nach mehreren Reinigungsschritten zurückzuhalten, behindert die Bemühungen, das Protein isoliert zu untersuchen. Umgekehrt wurde vermutet, dass die natürlichen Palmitat-, Stearat- und Oleatliganden von Bla g 1 (im Folgenden als nMix bezeichnet) eine Schlüsselrolle sowohl bei seiner Allergenität als auch bei seiner nativen biologischen Funktion spielen9. Diese Liganden sind jedoch in Bla g 1, die aus rekombinanten Quellen gewonnen wurden, nicht vorhanden, was es schwierig macht, diese Hypothese zu beurteilen. Ähnliche Probleme wurden für andere lipidbindende Allergene wie Bet v 112,13beobachtet. Um die systematische Untersuchung von Lipid-Allergen-Interaktionen zu erleichtern, haben wir ein Protokoll entwickelt, mit dem Allergene quantitativ von ihren endogen gebundenen Lipiden befreit und entweder in Apo-Form rekonstituiert oder mit spezifischen Liganden beladen werden können.
Allergene werden am häufigsten aus ihren natürlichen oder rekombinanten Quellen mittels Affinitätschromatographie und/oder Größenausschlusschromatographie gereinigt. Hier führen wir einen zusätzlichen Reinigungsschritt in Form der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Umkehrphasen-C18-Säule ein, aus der das Allergen in ein organisches Lösungsmittel eluiert wird, ähnlich den protokollierten Protokollen, die für fettsäurebindende Proteine entwickelt wurden14. Das resultierende Protein wird dann in Abwesenheit oder Gegenwart von Fettsäuren und/oder Phospholipiden einem thermischen Glühschritt unterzogen. Zusätzlich zur Rückgewinnung des nativen Bla g 1-fachen erhöhen die erhöhten Temperaturen die Löslichkeit und Zugänglichkeit der Lipidladungen, wodurch Bla g 1 entweder in apo-Form oder gleichmäßig mit dem gewünschten hydrophoben Liganden beladen wird. 31 P-NMR-Spektren von Bla g 1, die auf diese Weise gereinigt wurden, bestätigten die vollständige Entfernung endogener gebundener Liganden und den gleichmäßigen Ersatz durch die gewünschten Verbindungen, während der zirkuläre Dichroismus die erfolgreiche Wiederherstellung der Bla g 1-Falte bestätigte. Der Nutzen dieser Methode wird in einer kürzlich durchgeführten Arbeit hervorgehoben, in der festgestellt wurde, dass die Ladungsbindung die Thermostabilität und proteolytische Resistenz von Bla g 1 verbessert und die Kinetik der T-Zell-Epitoperzeugung mit potenziellen Auswirkungen auf die Sensibilisierung und Allergenität verändert9.
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Protocol
1. Bla g 1 Klonen
- Erhalten Sie das Gen für das Kakerlakenallergen Bla g 1.0101 (Rückstände 34-216), das eine einzige Wiederholung der MA-Domäne darstellt. Der Einfachheit halber wird Bla g 1 während des gesamten Werks verwendet, um diese einzelne Wiederholung darzustellen, und nicht das gesamte Bla g 1.0101-Transkript.
- Subklonieren Sie das Bla g 1 Gen in den gewünschten Vektor. In dieser Studie wurde das Gen, das ein N-terminales Glutathion-S-Transferase-Tag (GST) enthält, das an eine Protease-Spaltungsstelle des Tabakätzvirus (TEV) gekoppelt ist, zur Expression in einen pGEX-Vektor eingefügt, wie zuvor beschrieben11.
- Wandeln Sie den Bla g 1 pGEX-Vektor in BL21 DE3 E. coli-Zellen um.
- Bereiten Sie einen 10 ng/μL-Bestand des gewünschten Vektors vor.
- Kombinieren Sie 1 μL 10 ng/μL DNA-Stamm mit 50 μL BL21 DE3-Zellen, wie vom Hersteller angegeben.
- BL21 DE3-DNA-Mischung für 30 min auf Eis inkubieren. Für 1 min in ein 42 °C wassergünstchen Wasserbad geben, dann sofort wieder auf Eis für weitere 1 min Inkubation umlegen.
- 200 μL LB-Medien in die Zellen geben und weitere 1 h bei 37 °C inkubieren.
- Die transformierten Zellen werden auf LB-Agarplatten mit 100 mg/L Ampicillin plattiert und wachsen über Nacht bei 37 °C.
2. Anfängliche Expression und Reinigung
- Impfen Sie 1 L LB-Medium mit 100 mg/L Ampicillin mit einer einzigen Kolonie von BL21 DE3-Zellen, die mit dem Bla g 1-Vektor transformiert wurden, wie in 1.3 beschrieben. Über Nacht bei 37 °C wachsen.
- Am nächsten Tag die Zellen (OD600 ~1,5) durch Zentrifugation bei 6.000 x g für 10 min ernten und in 2 L 2x YT-Medien mit 100 mg/L Ampicillin wieder aufschnuspendieren. Lassen Sie die Zellen für weitere 1 h bei 37 °C zu einem OD600 > 0,6 wachsen.
- Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von 0,5 mM IPTG. Zellen auf 18 °C übertragen und über Nacht inkubieren.
- Am nächsten Tag ernten Sie zellen wie in 2.2 beschrieben. Das resultierende Zellpellet kann eingefroren und bei -20 °C gelagert werden.
- Resuspend-Pellet erhalten aus 1 L Kultur in 50 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaCl) mit 1 Proteasehemmertablette (oder gleichwertig) und 1 μL Benzonase-Nuklease.
- Lyse-Zellen mit einem Sondenschallator (500 W, 20 kHz), die für 4 minuten bei einer Einschaltdauer von 50 % auf 30–50 % Leistung eingestellt sind. Halten Sie das Lysat während der Beschallung in einem Eisbad
- Zentrifugenlysat bei 45.000 x g für 20 min. Entsorgen Sie unlösliche Fraktion (Pellet).
- Entfernen Sie 28 μL lösliches Protein. Kombinieren Sie mit 7 μL 5x SDS-PAGE Puffer und speichern Sie für die SDS-PAGE Analyse. Wiederholen Sie diesen Schritt für die Durchfluss-, Wasch- und Elutionsfraktionen der GST-Säule vor und nach der Inkubation mit TEV.
- Tragen Sie lösliche Proteine (Überstand) auf eine Glutathionharzsäule (~ 10 ml Gesamtbettvolumen) auf, die in PBS pH 7,4 ausgeglichen ist.
- Waschen Sie alle ungebundenen Proteine mit 50 ml PBS aus.
- Elute GST-Bla g 1 unter Verwendung von 50 ml PBS mit 10 mM reduziertem Glutathion.
- Inkubieren Sie eluiertes Protein mit 0,2 kU TEV-Protease über Nacht bei 4 °C oder Raumtemperatur für 6 h, um das GST-Tag zu entfernen.
3. Endogene Lipidentfernung mittels Umkehrphasen-HPLC
- Sammeln Sie das gespaltene Bla g 1 und konzentrieren Sie es auf ~ 2 ml mit einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer molekulargewichtsabschaltung von <10 kDa.
- Fügen Sie <12 ml Probe auf die Oberseite des Konzentrators hinzu und drehen Sie sich bei 5.000 x g für 10-15 minuten in einem Schaufelrotor.
HINWEIS: Probenvolumen und Schleudergeschwindigkeit variieren je nach spezifischem Filter und Art des verwendeten Rotors. Konsultieren Sie vor der Verwendung die Dokumentation des Herstellers.
- Fügen Sie <12 ml Probe auf die Oberseite des Konzentrators hinzu und drehen Sie sich bei 5.000 x g für 10-15 minuten in einem Schaufelrotor.
- Laden Sie das Konzentrat auf ein 250 x 10 mm HPLC-System, das mit einer C18-Umkehrphasenchromatographiesäule ausgestattet ist, die mit 97% Puffer A (Wasser, 0,1% Trifluoressigsäure) und 3% Puffer B (Acetonitril, 0,1% Trifluoressigsäure) ausgeglichen ist.
HINWEIS: Kleinere Säulen können verwendet werden, aber Protein muss möglicherweise mit mehreren Zyklen geladen und eluiert werden, um die reduzierte Bindungskapazität aufzunehmen. Achten Sie bei der Auswahl einer Säule darauf, dass die Harzperlen eine Partikelgröße von < 5 μm und eine Porengröße von >200 Å aufweisen, um eine effektive Trennung von proteingroßen Molekülen zu ermöglichen
VORSICHT: Trifluoressigsäure ist stark korrosiv und sollte mit geeigneter PSA (z. B. Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille) in einem Abzug abgegeben werden. Acetonitril ist sowohl mäßig giftig, flüchtig als auch leicht entzündlich, sollte verwendet und in einem Abzug mit geeigneten PSA (z. B. Nitrilhandschuhen, Laborkittel und Schutzbrille) abgegeben werden. - Elute Bla g 1 unter Verwendung des in Tabelle 1 gezeigten Protokolls bei einer Durchflussrate von 1,5–4,0 ml/min. Überwachen Sie den Elutionsprozess mit der Fluoreszenzabsorption bei 280 nm.
- Sammeln und poolen Sie Bla g 1 Fraktionen. Bla g 1 eluiert normalerweise bei >74% Puffer B oder ~34–40 min.
HINWEIS: Die Elutionszeit variiert je nach Durchflussrate oder Säulengröße leicht. Sammeln Sie Fraktionen basierend auf A280 für beste Ergebnisse.
- Sammeln und poolen Sie Bla g 1 Fraktionen. Bla g 1 eluiert normalerweise bei >74% Puffer B oder ~34–40 min.
| Zeit (Min) | Puffer A (%) | Puffer B (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
Tabelle 1: Elutionsprotokoll für Bla g 1. Tabelle, die den Elutionsgradienten veranschaulicht, der bei der Isolierung von Bla g 1 mit einer C18 HPLC-Säule verwendet wurde.
- Aliquotieren Sie die Probe in Glasreagenzgläser und füllen Sie kein Reagenzglas mehr als zur Hälfte (~ 4 ml). Decken Sie Rohre mit Paraffinfolie ab und perforieren Sie die Abdeckung mit zwei Löchern, um eine Entlüftung zu ermöglichen.
- Bereiten Sie ein separates 1 ml Aliquot vor (Test aliquot). Dies wird verwendet, um den erwarteten Ertrag zu bestimmen.
- Gefrieren Sie die Proben ein und testen Sie das Aliquot, indem Sie sie für 1 h in einen Gefrierschrank mit -80 °C legen oder in flüssigen Stickstoff eintauchen. Im späteren Fall muss das Rohr kontinuierlich gedreht werden, um einen Reagenzglasbruch durch Ausdehnung der flüssigen Phase beim Einfrieren zu vermeiden.
- Trocknen Sie die resultierenden entpidalten Proteinproben mit einem Lyophilisator. Getrocknetes Protein kann bei 4 °C für mehrere Monate in einem verschlossenen Behälter gelagert werden.
4. Rekonstitution von apo- und ladungsbeladenen Bla g 1
- Bestimmen Sie den erwarteten Bla g 1 Ertrag.
- Resuspend lyophilisiertes, entspeihtes (post-HPLC) Test aliquot in 5 mL Umfaltungspuffer, (50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
- Die Mischung in einem Wasserbad (500 mL Becher mit 250 mL Wasser und Rührstab über einer Kochplatte) auf 95 °C erhitzen. Wirbellösungen intermittierend und bei 95 °C für 0,5–1 h inkubieren.
- Wärme ablassen und das Wasserbad langsam auf Raumtemperatur (~1 h) ausgleichen lassen. Geglühtes Protein kann in dieser Form bei Bedarf über Nacht bei 4 °C gelagert werden.
- Geglühte Bla g 1-Lipidmischung durch einen 0,22 μM Spritzenfilter leiten, um Partikel zu entfernen.
- Pufferaustausch des gefilterten Proteins 3x in PBS pH 7,4 unter Verwendung eines Zentrifugalfilters mit 10 kDa Cutoff wie in 3.1 beschrieben, um restfreie Fettsäuren und organische Lösungsmittel zu entfernen.
- Beurteilen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA-Assay oder einer anderen bevorzugten Methode wie der UV-Absorption. Verwenden Sie dies, um den erwarteten Ertrag für die verbleibenden Bla g 1 Aliquoten zu bestimmen.
- Rekonstituierte Apo- oder ladungsbeladene Bla g 1
- Resuspend Bla g 1 Aliquoten im Refolding Buffer wie in 4.1.1 beschrieben.
- Um Apo-Bla g 1 zu erzeugen, wiederholen Sie die Schritte 4.1.2–4.1.6, um die gewünschte Ausbeute zu erzielen.
- Um Bla g 1 mit Fettsäuren zu beladen, bereiten Sie 20 mM Stammlösungen der gewünschten Fettsäureladung in Methanol oder DMSO vor. Fahren Sie dann mit Schritt 4.2.5 fort.
- Um Bla g 1 mit Phospholipiden zu beladen, bereiten Sie einen 10 mg/ ml Vorrat der gewünschten Ladung in Chloroform in einem Glasreagenzglas vor.
- Verdampfen Sie das Chloroform, um einen Lipidfilm zu erzeugen. Fügen Sie PBS in das Reagenzglas ein, um eine endgültige Phospholipidkonzentration von 20 mM zu erzeugen.
ACHTUNG: Chloroform ist schädlich, wenn es eingeatmet oder verschluckt wird. Verwenden Sie in einem chemischen Abzug oder verwenden Sie ein Atemschutzgerät, wenn eine unzureichende Belüftung verfügbar ist. Verwenden Sie bei der Handhabung Nitrilhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille. Konsultieren Sie msDS vor der Verwendung. - Rehydrieren Sie den Lipidfilm, indem Sie ihn über die Phasenübergangstemperatur der Lipidladung erhitzen und wirbeln, bis die Lösung trüb wird. Beachten Sie, dass eine Beschallung erforderlich sein kann, um einige Ladungen vollständig wieder aufzuziehen und zu rehydrieren.
- Wenn eine Beschallung erforderlich ist, legen Sie das Reagenzglas in den Badbeschallungsator (100 W, 42 kHz) und beschallen Sie mit maximaler Leistung, bis die Ladung wieder aufgewärmt ist. Alternativ kann ein Sondenschallator (beschrieben in 2.6) mit einer Leistung von 10–20 % bei einer Einschaltdauer von 50 % verwendet werden.
VORSICHT: Die Beschallung verwendet hochfrequente Schallwellen, die das Gehör schädigen können. Verwenden Sie geräuschunterdrückende PSA (Ohrstöpsel oder Schalldämpfer). Wenn möglich, platzieren Sie den Ultraschallator in einem schalldämpfenden Schrank oder einer Kammer.
- Verdampfen Sie das Chloroform, um einen Lipidfilm zu erzeugen. Fügen Sie PBS in das Reagenzglas ein, um eine endgültige Phospholipidkonzentration von 20 mM zu erzeugen.
- Fügen Sie die gewünschte Fettsäure- oder Phospholipidladung hinzu, um einen 20-fachen molaren Überschuss an Liganden relativ zu Bla g 1 zu erzeugen, basierend auf der erwarteten Ausbeute, die in 4.1 bestimmt wird. Das Gesamtvolumen des in diesem Schritt zugesetzten organischen Lösungsmittels sollte 2% nicht überschreiten. Wirbel zum Mischen.
HINWEIS: 1 L bl 21 DE3-Zellen ergibt typischerweise ~ 0,25-0,4 nmol Protein, was ~ 400 μM Ligand pro Röhrchen entspricht. - Das Protein wird wie in 4.1 beschrieben anneren.
5. Bestätigung der Entnahme/Verladung von Phospholipidladung über 31P-NMR
- Konzentrieren Sie Proben von Apo- oder ladungsbeladenen Bla g 1 bis >100 μM unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit wie in 3.1 beschrieben.
- Rehydratisieren Sie Referenzphospholipid im PBS-Puffer auf Endkonzentrationen von 2, 1,5, 1, 0,5 und 0,25 mM.
- Verdünnen Sie die Proben 1:1 mit Cholatpuffer (100 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% w/v Cholat) auf ein Gesamtvolumen von ~600 μL.
HINWEIS: Cholat wird in diesem Schritt verwendet, um Lipide vollständig aus der hydrophoben Bla g 1-Höhle zu extrahieren und zu solösen. Dies stellt sicher, dass die chemische Umgebung, die die Phospholipid-Kopfgruppen umgibt, zwischen verschiedenen Proben konsistent ist, was eine quantitative Bewertung mit 31P-NMR ermöglicht. Die Verwendung von Cholat kann durch Chloroform/Methanol ersetzt werden, wie zuvor beschrieben15. - Erfassen Sie 1D 31P-NMR-Spektren der cholatlöslichen Bla g 1-Proben und Referenzphospholipidstandards mit einer Breitbandsonde.
HINWEIS: Die in dieser Arbeit vorgestellten 31P-NMR-Spektren wurden mit einem 600-MHz-Spektrometer erhalten. Frühere Studien, die ähnliche Techniken verwenden, deuten jedoch darauf hin, dass eine akzeptable Empfindlichkeit bei Feldstärken von nur 150-200 MHz15erreicht werden kann. - Verarbeiten Sie die resultierenden Daten mit geeigneter Software16.
- Erhalten Sie Spitzendichten mit bevorzugter NMR-Anzeigesoftware17.
- Vergleichen Sie die Bla g 1 31P-NMR-Spektren mit denen, die für die Phospholipid-Referenzproben erhalten wurden, um die Entfernung endogener gebundener Liganden und/oder die Bindung gewünschter Liganden basierend auf den chemischen Verschiebungen der sichtbaren Peaks (oder deren Fehlen) zu bestätigen.
- Bestätigen Sie die vollständige Bindungsstöchiometrie, indem Sie die Spitzenintensität des Bla g 1-Spektrums mit der der Phospholipid-Referenzstandards vergleichen.
6. Bla g 1 Falten bestätigen
- 0,5 μM Proben von Bla g 1 in CD-Puffer (100 mM KH2PO4,Puffer pH 7,5) vorbereiten. 2 mL der Probe in eine 10 mm CD-Küvette mit magnetischem Rührstab laden.
- Messen Sie das CD-Spektrum von Bla g 1, um die Rekonstitution der Sekundärstruktur zu bestätigen. Stellen Sie sicher, dass die Photomultiplierspannung (PMT) die Herstellerempfehlungen (in der Regel 1 kV) nicht überschreitet.
- Messen Sie das CD-Signal von 260–200 nm bei 25 °C mit einem Datenabstand von 0,2 nm und einer Scanrate von 20 nm/s bei einer Datenintegrationszeit von 1 s.
- Erhöhen Sie die Temperatur in der CD-Zelle von 25 °C bis 95 °C mit einer Rate von 0,5 °C/min. Aktivieren Sie den magnetischen Rührbalken, um sicherzustellen, dass die Temperatur in der gesamten Probe gleichmäßig ist.
- Überwachen Sie die CD bei 222 nm und nehmen Sie alle 2 °C Messwerte auf.
- Passen Sie die resultierenden Daten an eine Boltzman-Kurve mit 2 Angaben an, um die Schmelztemperatur zu bestimmen. Aufgrund der hohen Stabilität von Bla g 1 wurde die Schmelztemperatur (MT25)als die Temperatur definiert, bei der das Protein bei 222 nm 25% seiner ursprünglichen CD verloren hat.
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Representative Results
Mit Hilfe der Affinitätschromatographie wurde rekombinantes GST-Bla g 1 leicht auf einen hohen Reinheitsgrad isoliert (Abbildung 1A), wodurch eine Ausbeute von ~ 2-4 mg / L Zellkultur erzeugt wurde. Die Inkubation über Nacht mit TEV-Protease bei 4 °C reicht aus, um das GST-Tag zu entfernen, wodurch das Endprodukt bei ~ 24 kDa entsteht. Beachten Sie, dass in diesem Fall eine signifikante Menge an GST-Bla g 1 in den Durchfluss- und Waschfraktionen vorhanden ist, was darauf hindeutet, dass die Bindungskapazität des Glutathionharzes überschritten wurde. Die Verwendung von mehr Harz oder mehrere Zyklen der Probenbeladung und -elution könnten Abhilfe für dieses Problem schaffen.
Die Anwendung des Bla g 1 auf eine C18-Säule mit umkehrphasenförmigem System ergibt ein unverwechselbares Elutionsprofil (Abbildung 1B) mit zwei großen Peaks bei ~ 50% Puffer B und einem zweiten großen Peak bei ~ 75% Puffer B. SDS-PAGE-Analyse der resultierenden Brüche legt nahe, dass erstere dem gespaltenen GST-Tag entsprechen, während letzterem Bla g 1 entspricht. Gelegentlich tritt in der Mitte ein dritter, kleinerer Peak auf, der dem verbleibenden, nicht gespaltenen GST-Bla g 1 entspricht. Das Vorhandensein dieses nicht gespaltenen Produkts kann eliminiert werden, indem die Menge an TEV, die in der Spaltungsreaktion verwendet wird, erhöht oder die Inkubationszeit verlängert wird. Während eine unvollständige Spaltung die Ausbeute verringert, reicht die an der C18-Säule erhaltene Trennung aus, um sicherzustellen, dass die Reinheit des endgültigen Bla g 1-Produkts kompromisslos bleibt. Eine Folge der Umkehrphasen-HPLC ist, dass das endgültige Proteinprodukt in eine organische Lösungsmittelumgebung eluiert wird. Während dies die Entfernung von hydrophoben Liganden erleichtert, ist die Entfernung dieses Lösungsmittels durch Lyophilisierung erforderlich, wodurch ein flauschiges weißes Pulver entsteht (Abbildung 1C).
Das Glühen des Proteins ist erforderlich, um das native Bla g 1-fach zu rekonstituieren und kann entweder in Abwesenheit oder In Gegenwart einer Lipidladung durchgeführt werden. Die Zugabe von DMSO zu den getrockneten Bla g 1- und Phospholipidladungen vor dem Umfaltungspuffer erleichtert den Solubilisierungsprozess, obwohl sich einige längerkettige Lipidladungen selbst bei erhöhten Temperaturen nicht vollständig auflösen. Es wurde jedoch nicht beobachtet, dass dies die Belastungswirksamkeit unter den in unseren Studien getesteten Lipiden beeinflusst (Abbildung 1C). In ähnlicher Weise fallen überschüssige Lipide beim Abkühlen oft aus der Lösung aus oder bilden große Vesikel, was nach dem Glühen zu einem trüben Aussehen führt (Abbildung 1C). Dies wurde auch nicht beobachtet, um die Ladeeffizienz zu verbessern, und alle Aggregate werden durch die Filtration und nachfolgende Pufferaustauschschritte leicht entfernt, um eine klare, transparente Lösung zu erhalten. Trotz der rauen Bedingungen wurde bei Bla g 1 keine Thermolyse beobachtet.
Abbildung 1: Erstreinigung von Bla g 1. (A) SDS-SEITE mit der Löslichen Proteinfraktion nach der anfänglichen Lyse (S); Durchfluss (FT), Waschen (W) und Elution aus der Glutathion-Sepharose-Säule (E); und das endgültige Bla g 1 Produkt nach TEV-Spaltung des GST-Tags (TEV). Das HPLC-Elutionsprofil des resultierenden Bla g 1-Produkts nach TEV-Spaltung ist in ( B )dargestellt. Eine280 ist blau dargestellt, während der Elutionsgradient (% Puffer B) grün dargestellt ist. Fraktionen, die dem gespaltenen GST-Tag (H1, H2), dem verbleibenden nicht gespaltenen GST-Bla g 1 (H3) und dem gereinigten Bla g 1 (H4) entsprechen, werden mit roten Pfeilen bei ~50%, ~65% bzw. ~74% Buffer B angezeigt. SDS-PAGE Analysen der Fraktionen H1- H4 sind in (A) dargestellt und entsprechend gekennzeichnet. (C) Repräsentative Bilder, die Bla g 1 in verschiedenen Phasen des Glühprozesses zeigen. Beachten Sie, dass die genaue und das Ausmaß der Niederschlagsbildung, wie in ii und iii dargestellt, von der Art der verwendeten Lipidladung abhängt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
31 P-NMR-Spektren von Apo-Bla g 1, die auf diese Weise gereinigt wurden, zeigen weder durch NMR (Abbildung 2A) noch durch Dünnschichtchromotographie nachweisbare Phospholipide (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu zeigen ähnliche Spektren, die für Bla g 1 erhalten wurden, das mit einem Distearoylphosphatidylcholin (DSPC)-Phospholipid beladen ist, einen starken Peak, der der Phosphatidylcholin-Kopfgruppe entspricht. Zum Vergleich zeigt ein repräsentatives 31P-NMR-Spektrum von Bla g 1, das aus rekombinanten E. coli gereinigt wurde, ohne die Verwendung des hier beschriebenen Lipidentfernungs-/Glühprotokolls (ecBla g 1), eine heterogene Mischung endogener Lipide, die aus dem rekombinanten Expressionssystem extrahiert wurden (Abbildung 2B). Unter Ausnutzung der quantitativen Natur der NMR kann eine Standardkurve unter Verwendung von Referenzproben bekannter DSPC-Konzentrationen erstellt werden (Abbildung 2C). Vergleicht man die von DSPC-Bla g 1 erhaltene Signalintensität von 31P mit dieser Standardkurve, erhält man eine Bindungsstöchiometrie von 4,7 ± 0,5 Lipiden pro Protein; ein Wert, der im Vergleich zu der vorhergesagten vollständig bindenden Stöchiometrie aus In-silico-Studien und Strukturanalyse günstigist 9. Beachten Sie, dass diese Technik nur Liganden erkennt, die einen 31P-Kern enthalten, wie Phospholipide, Lysophospholipide, Lipopolysaccharide usw. Dieses Protokoll kann jedoch leicht für 13C-NMR-Analysen angepasst werden. In diesem Fall wärenMethyl-13C-markierte Fettsäuren aufgrund ihrer günstigen NMR-Relaxationseigenschaften zu empfehlen. Die Beschränkung der Isotopenmarkierung auf einen einzigen Ort erleichtert auch die spektrale Interpretation, da nur ein einziger Peak erwartet wird, während gleichzeitig die Kosten im Vergleich zu einheitlichen 13C-markierten Gegenstücken gesenkt werden. Ein alternativer Ansatz wäre die Verwendung von Massenspezifikation zur Identifizierung gebundener Liganden, wie in einer früheren Studie gezeigt, die eine Mischung von Fettsäuren als natürliche Ladung von Bla g 1 identifizierte, die aus Kakerlakenfrass isoliert wurde (nBla g 1)9. Die begrenzten Quantifizierungsmöglichkeiten der Massenspezifikation schlossen jedoch eine genaue Messung der Bindungsstöchiometrie ohne ausreichende Standards aus.
Abbildung 2: Überprüfung der Lipidentfernung und -belastung von Bla g 1. (A) 31P-NMR-Spektren von Apo- (schwarz) oder DSPC-beladenem Bla g 1 (rot), hergestellt unter Verwendung des in dieser Arbeit beschriebenen Glühprotokolls, das die vollständige Entfernung von Lipiden in den ersteren und die homogene Belastung von Phosphatidylcholin (PC)-Lipiden in letzterem demonstriert. Im Gegensatz dazu zeigt Bla g 1, gereinigt von rekombinanten E. coli ohne Lipidstrreifung und Glühen (ecBla g 1), bei der Analyse mit dieser Methode eine heterogene Mischung aus endogenen Phosphatidylethanolamin (PE) und Phosphatidylglycerin (PG) Lipiden (B). Eine repräsentative Standardkurve aus DSPC-Referenzproben bekannter Konzentrationen ist in (C) dargestellt, aus der die Bla g1-Bindungsstöchiometrie gewonnen werden kann. Figuren adaptiert von Foo et al. (2019) und präsentiert unter der Creative Commons CC BY License9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Kristallstrukturen von Bla g 1 zeigen eine einzigartige Falte, die aus 12 amphipathischen Alpha-Helices besteht. Der Zirkulardichroismus stellt eine schnelle und bequeme Methode dar, um zu beurteilen, ob diese Falte nach dem Glühprozess erfolgreich rekonstituiert wurde. CD-Spektren für Apo- und Lipid (nMix)-geladene Bla g 1 zeigen Minima ~220 und 210 nm, was auf eine überwiegend alpha-helikale Struktur hinweist (Abbildung 3A). Dieses Spektrum ist dem für ecBla g 1 und nBla g 1 erhaltenen Spektrum sehr ähnlich, was einen weiteren Beweis dafür liefert, dass die native Struktur von Bla g 1 erfolgreich wiederhergestellt wurde. Dies wurde durch die Verwendung von 19F und 1H-15 NLösung-NMR weiter bestätigt, von denen eine vollständige Erörterung an anderer Stelle verfügbar ist9. CD-basierte thermische Denaturierungsassays zeigen einen kooperativen Verlust der alpha-helikalen Sekundärstruktur, der auf eine gefaltete kugelförmige Domäne hinweist (Abbildung 3B). Die Analyse der resultierenden Schmelztemperaturen (Abbildung 3C) zeigt einen signifikanten Anstieg der nMix-Ligandenbindung. Diese erhöhte Thermostabilität entspricht der für nBla g 1 berechneten, was darauf hindeutet, dass wir in der Lage sind, den natürlichen Zustand von Bla g 1 vollständig zu reproduzieren. Beachten Sie, dass ecBla g 1 auch eine ähnliche, wenn nicht sogar größere Verbesserung der Thermostabilität zeigt, was das Potenzial für resteigene endogener Lipide veranschaulicht, die biophysikalische Charakterisierung von Allergenen zu stören, die mit traditionellen FPLC-basierten Ansätzen gereinigt wurden. Im Gegensatz dazu bietet die Fähigkeit, hydrophobe Ladungen aus Allergenen wie Bla g 1 quantitativ zu entfernen und nachzuladen, eine einzigartige Möglichkeit, die Rolle von Lipiden bei der allergischen Reaktion zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Methode, um den Einfluss von Lipidladungen auf die Struktur, Stabilität und endosomale Verarbeitung der allergenen Proteine selbst zu untersuchen, obwohl andere Studienmöglichkeiten in Betracht gezogen werden könnten.
Abbildung 3: Bestätigung der erfolgreichen Wiederherstellung des Bla g 1-Fachs. (A) CD-Spektren von Apo- (schwarz) oder nMix-geladenen (rot) Bla g 1 gereinigt und geglüht unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls, mit Minima bei ~220 und 210 nm, die auf eine überwiegend alpha-helikale Struktur hinweisen, die mit der verfügbaren Röntgenkristallstruktur übereinstimmt. Sowohl Apo- als auch nMix-geladene Bla g 1-Spektren sind denen für Bla g 1, die aus rekombinantem E. coli (ecBla g 1, grün) oder aus seiner natürlichen allergenen Quelle (nBla g 1, blau) ohne das Lipidentfernungs- und Glühprotokoll erhalten wurden, äußerst ähnlich, was die erfolgreiche Wiederherstellung der nativen Struktur in der ersteren weiter unterstützt. (B) Repräsentative thermische Profile für Apo- (schwarz) und nMix-beladene (rot) Bla g 1, die eine sigmoidale Kurve zeigen, die eine kooperative Entfaltung anzeigt. nBla g 1 (blau) und ecBla g 1 (grün) als Referenz dargestellt. Die berechneten Schmelztemperaturen (MT25)von Bla g 1 sind in ( C )dargestellt. Die Bindung von nMix-Liganden (rot) führt zu einer signifikanten Erhöhung der Thermostabilität im Vergleich zu Apo-Bla g 1 (schwarz). Dies spiegelt den Trend wider, der für nBla g 1 (blau) beobachtet wurde, was darauf hindeutet, dass wir in der Lage sind, den nativen Zustand erfolgreich wiederherzustellen. Die noch größere Stabilität, die für ecBla g 1 beobachtet wurde, unterstreicht das Potenzial endogener gebundener Lipide, die biophysikalische Charakterisierung von Allergenen zu stören. Die in C dargestellten MT25-Werte stellen den Mittelwert dar, der aus mindestens drei unabhängigen Studien ermittelt wurde. Fehlerbalken stellen die entsprechenden Standardabweichungswerte dar. Figuren adaptiert von Foo et al. (2019) und präsentiert unter der Creative Commons CC BY License9. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll wurde erfolgreich angewendet, um die Lipidbindungseigenschaften von Bla g 1 systematisch zu untersuchen. Dies zeigte eine Korrelation zwischen Ladungsbindung, Thermostabilität und endosomaler Verarbeitung, von denen letztere mit einer Abnahme der Erzeugung eines bekannten T-Zell-Epitops mit möglichen Auswirkungen auf die Immunogenität korrelierte9,18. Zusätzlich zu Bla g 1 haben andere Allergene wie Pru p 3 und Bet v 1 gezeigt, dass sie ihre endogen gebundenen Ladungen behalten, wenn sie mit Standard-Affinitäts- und Größenausschlusschromatographiemethoden13,19,20,21,22gereinigt werden. Diese unerwünschten Gäste könnten die biophysikalischen und immunologischen Eigenschaften dieser Proteine auf ähnliche Weise verändern und die Notwendigkeit von Techniken zur Gewährleistung einer vollständigen Entpimpigung wie der hier vorgestellten unterstreichen.
Während die Verwendung der Umkehrphasen-HPLC bei der Reinigung von Allergenen bereits beschrieben wurde2,bietet die Kopplung mit einem thermischen Glühprotokoll die eher ungewöhnliche Gelegenheit, Allergene mit einer Reihe von natürlichen und unnaturen Liganden zu rekonstituieren, so dass Benutzer Lipid-Allergen-Interaktionen untersuchen können. Dieser thermische Denaturierungsschritt erwies sich als wesentlich für zwei Hauptzwecke. Erstens ist eine thermische Denaturierung erforderlich, um den Ligandenzugang zu ihren Bindungshöhlen zu erleichtern, die aufgrund ihrer hydrophoben Natur oft vom wässrigen Lösungsmittel9,22entfernt sind . Zweitens bilden hydrophobe Liganden wie Fettsäuren und Phospholipide oft größere supramolekulare Strukturen wie Mizellen oder Vesikel, wenn sie in einer wässrigen Umgebung platziert werden. Die Konzentration monomerer oder "freier" Liganden, die für die Proteinbindung zur Verfügung stehen, kann mit der kritischen Mizellenkonzentration (CMC) angenähert werden. DSPC und andere langkettige Phospholipide haben CMC-Werte im nM-Bereich, was darauf hindeutet, dass für die Bla g 1-Bindung praktisch keine freien Liganden verfügbar sind. Selbst kurzkettige Lipide und Fettsäuren weisen CMC's im niedrigen μm- bis mM-Bereich auf, was darauf hindeutet, dass ein großer Teil dieser Liganden in der mizellaren oder zweischichtigen Phase23verbleibt. Die hohen Temperaturen, die in unserem Denaturierungsprotokoll verwendet werden, dispergieren jedoch diese größeren Aggregate und erleichtern die Bindung. Frühere Studien haben in der Regel verlängerte Inkubationszeiten verwendet, um diesen Prozess zu erleichtern. Das Fehlen eines thermischen Denaturierungs-/Glühprozesses lässt jedoch Zweifel an der Wirksamkeit der Belastung aufkommen. Beispielsweise ergab die Inkubation des Milbenallergens Der p 5 mit dem fluoreszierenden Fettsäureanalogon 11-(Dansylamino)undekansäure (DAUDA) eine Bindungsstöchiometrie von 0,66, obwohl sie einen großen hydrophoben Hohlraum auf Augenhöhe mit Bla g 124besaß. Ebenso wurde festgestellt, dass die Bindungsspezifität und Stöchiometrie von pflanzlichen nsLTPs stark variiert, je nachdem, ob die Lipide und das Protein vor der Zugabe von wässrigem Puffer zuerst in Methanol gelöst werden, was darauf hindeutet, dass die Zugänglichkeit von Liganden und / oder Bindungsstellen ein limitierender Faktor25war .
Zusätzlich zu Bla g 1 haben wir die gleiche Strategie erfolgreich auf mehrere andere MA-Domänenproteine von Kakerlaken und Mücken (A. aegypti) sowie Der p 2 (Daten nicht gezeigt) angewendet. Wir stellten fest, dass sowohl die Bla g 1-Homologe als auch der p 2 zu einem anderen Zeitpunkt eluierten als Bla g 1 aus der C18-Spalte (Schritt 3.3). Die Elutionsgradienten in diesem Schritt müssen möglicherweise für andere Proteine optimiert werden. Alternativ können HPLC-Säulen mit einer weniger hydrophoben stationären Phase (z. B. C8) verwendet werden, obwohl im Fall von Bla g 1 die erhöhte Hydrophobie der C18-Säule notwendig war, um Diacylphospholipid-Verunreinigungen vollständig aus ecBla g 1 zu entfernen. Trotz der Unterschiede in den biophysikalischen und biochemischen Eigenschaften haben wir festgestellt, dass dieses Protokoll extrem robust ist und leicht auf andere allergene Proteine angewendet werden kann. Während die harten Bedingungen eine potenzielle Einschränkung darstellen können, reduziert die erhöhte Widerstandsfähigkeit, die für viele Allergene beobachtetwird,ihre Auswirkungen26,27. In der Tat wurde beobachtet, dass mehrere Lebensmittel- und Inhalationsallergene wie Der p 2, Ber e 1, Ara a 6 und Lep w 1 ihre Struktur und Immunogenität nach der thermischen Denaturierung wiederherstellen, obwohl eine Optimierung der Pufferbedingungen erforderlich sein kann28,29,30,31,32,33; Beispielsweise wird eine reversible Denaturierung von nsLTPs (Cor a 8) und Thaumatinen (Mal d 2 und Akt d 2) nur unter sauren (pH <4)Bedingungen 28,30,31beobachtet. Darüber hinaus ist zu beachten, dass die Autoren weder das Timing noch die im Glühprotokoll verwendeten Temperaturen zu optimieren versucht haben. Es ist möglich, dass die Ligandenlöslichkeit und die Proteinfaltung/-entfaltung unter Verwendung einer niedrigeren Maximaltemperatur wie bei Ber e 1 erreicht werden können, für die eine reversible Denaturierung bei 82 °C29erreicht wird. Es wird erwartet, dass die Verwendung solcher Maßnahmen die Palette der Allergene erweitert, auf die dieses Protokoll angewendet werden kann.
Eine weitere wichtige Überlegung bei der Anpassung dieses Protokolls an andere Allergensysteme ist die Konzentration der Liganden, die während des Glühprozesses erforderlich ist. Im Falle von Bla g 1 beträgt die erwartete Ausbeute ~0,25–0,4 μmol Protein pro 1 L Zellkultur. Unter Beständigkeit der nachgewiesenen Bindungsstöchiometrie von 8 Fettsäuren oder 4 Diacylkettenlipiden pro Allergen wurde ein 20–40-fach molarer Ladungsüberschuss (5–10 μmol) eingesetzt. Es sollte beachtet werden, dass die Lipidbindungsfähigkeit von Bla g 1 und seinen Homologen einzigartig ist; Zum Beispiel werden nsLTPs allgemein akzeptiert, um höchstens zwei Lipidliganden25 zu binden, während Lipocaline weniger als 1 Stöchiometrie34haben. Daher kann die vollständige Belastung dieser Arten von Allergenen mit einem geringeren Überschuss an Liganden erreicht werden. Eine letzte Überlegung bei der Anpassung dieses Protokolls an andere Allergensysteme ist das Vorhandensein von Disulfidbindungen, die problematisch sein können, wenn sie vor der Denaturierung nicht richtig gebildet werden. Ein möglicher Ansatz wäre, den Glühprozess in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie 2 mM DTT durchzuführen. Die nativen Disulfidbindungen konnten anschließend durch Zugabe von reduziertem und oxidiertem Glutathion wie für das von Aalberse et al.35untersuchte Erdnussallergenfragment beschrieben wieder gebildet werden. In diesem Fall sollte die Wiederherstellung der korrekten Disulfidbindung empirisch mittels Massenspektrometrie35bewertet werden.
In dieser Arbeit beschreiben wir eine Technik, mit der Allergene entfettet und mit verschiedenen Phospholipid- und Fettsäureladungen wieder geglüht werden können. Es gibt jedoch viele andere Klassen von potenziell immunogenen oder adjuventisierenden Liganden, die in häufigen Allergenreservoirs vorhanden sind. Zum Beispiel wurde vorgeschlagen, Dass Katzen-, Hunde- und Milbenallergene Lipopolysaccharide (LPS) und andere bakterielle Lipide aus Hausstaub36binden, während das Bet v 1 gezeigt hat, dass es komplexe Flavonoide aus der Pollenmatrix13extrahiert. Das in dieser Arbeit beschriebene Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Rolle dieser Lipide detaillierter zu untersuchen. Als Proof of Concept konnten wir zeigen, dass die hydrophobe Höhle von Bla g 1 in der Lage ist, Lipoteichoinsäure (LTA) aus den Zellwänden grampositiver Bakterien zu binden, aber LPS von gramnegativen Spezies ausschließt, was möglicherweise die größere Anzahl von Acylketten in den letzteren9widerspiegelt. Wenn man noch einen Schritt weiter geht, könnte man das thermische Denaturierungs- / Glühprotokoll nutzen, um fluoreszierende Sonden und andere nicht-natürliche Fettsäureanaloga in Allergenproteine zu integrieren. Tatsächlich konnten wir die hydrophobe Höhle des Mückenhomologen von Bla g 1 mit DAUDA beladen und zusätzliche Möglichkeiten eröffnen, die Auswirkungen von Lipidliganden auf allergene Erkrankungen zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Tom Kirby, Scott Gabel und Dr. Robert London für ihre Hilfe und Unterstützung während dieser Arbeit, zusammen mit Dr. Bob Petrovich und Lori Edwards für die Verwendung ihrer Instrumentierung und ihre Unterstützung bei der Erstellung der bla g 1-Konstrukte, die in dieser Studie verwendet werden. Wir danken Andrea Adams für die Unterstützung bei der Massenspektrometrie und Dr. Eugene DeRose für die Unterstützung bei der NMR-Instrumentierung. Diese Forschung wurde vom Intramural Research Program des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM) unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten des National Institute of Environmental Health Sciences dar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
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