Summary
يصف هذا البروتوكول إزالة الدهون الذاتية من مسببات الحساسية ، واستبدالها بالليجاندات المحددة من قبل المستخدم من خلال HPLC في المرحلة العكسية إلى جانب التلين الحراري. 31 P-NMR و dichroism دائرية تسمح لتأكيد سريع لإزالة ليجند / التحميل، واستعادة بنية مسببات الحساسية الأصلية.
Abstract
ترتبط العديد من المواد المسببة للحساسية الرئيسية بالجزيئات الشبيهة بالدهون الكارهة للماء ، بما في ذلك Mus m 1 و Bet v 1 و Der p 2 و Fel d 1. يتم الاحتفاظ بهذه الليجاندات بقوة ولها القدرة على التأثير على عملية التوعية إما من خلال تحفيز الجهاز المناعي مباشرة أو تغيير الخصائص الفيزيائية الحيوية للبروتين المسبب للحساسية. من أجل السيطرة على هذه المتغيرات، وهناك حاجة إلى تقنيات لإزالة الليجانات ملزمة داخليا، وإذا لزم الأمر، واستبدال مع الدهون من تكوين معروف. يرفق مسبب الحساسية في الصرصور Bla g 1 تجويفا مائيا كبيرا يربط خليطا غير متجانس من الدهون الذاتية عند تنقيته باستخدام التقنيات التقليدية. هنا، ونحن نصف طريقة من خلالها تتم إزالة هذه الدهون باستخدام HPLC عكس المرحلة تليها التلأليد الحراري لتسفر Bla g 1 في شكلها أبو أو إعادة تحميلها مع خليط من الأحماض الدهنية أو الشحنات فوسفوليبيد المعرفة من قبل المستخدم. اقتران هذا البروتوكول مع المقايسات الكيميائية الحيوية تكشف عن أن شحنات الأحماض الدهنية تغير بشكل كبير من القدرة الحرارية والمقاومة البروتيوليك من Bla g 1 ، مع آثار المصب لمعدل توليد الظهارة T-الخلية وحساسية. تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية بروتوكولات إزالة/إعادة تحميل الدهون مثل تلك الموصوفة هنا عند دراسة مسببات الحساسية من المصادر الطبيعية والمتلفة على حد سواء. البروتوكول قابل للتعميم على العائلات المسببة للحساسية الأخرى بما في ذلك lipocalins (Mus m 1) و PR-10 (Bet v 1) و MD-2 (Der p 2) و Uteroglobin (Fel d 1) ، مما يوفر أداة قيمة لدراسة دور الدهون في الاستجابة التحسسية.
Introduction
كشف مسح لقاعدة بيانات مسببات الحساسية أن مسببات الحساسية موجودة في 2٪ فقط من جميع عائلات البروتين المعروفة ، مما يشير إلى أن الخصائص الوظيفية والفيزيائية الحيوية الشائعة تساهم في مسببات الحساسية1. ومن بين هذه الخصائص، يبدو أن القدرة على ربط شحنات الدهون ممثلة تمثيلا زائدا بقوة بين المواد المسببة للحساسية، مما يشير إلى أن هذه الشحنات قد تؤثر على عملية التوعية1. في الواقع، فقد ثبت أن البرازيل الجوز المسببة للحساسية بير ه 1 يتطلب الإدارة المشتركة مع الدهون الذاتية لتحقيق إمكاناتها توعية كاملة2. هذه الدهون يمكن أن تحفز الجهاز المناعي مباشرة كما يتضح من مسببات الحساسية العث دير p 2 و Der p 7، وكلاهما يشترك في الأوهام الهيكلية القوية مع البروتينات LPS ملزمة3،4،5. وبناء على هذه الملاحظة اقترح أن ديرب 2 ودير ص 7 يمكن ربط الدهون البكتيرية وتحفيز مباشرة الجهاز المناعي المضيف من خلال الإشارات بوساطة TLR4، وتسهيل عملية التوعية5،6. من الممكن أيضا أن الدهون المربوطة داخليا يمكن أن تغير الخصائص الفيزيائية الحيوية للبروتينات المسببة للحساسية نفسها. على سبيل المثال، فإن قدرة الخطيئة A 2 (الخردل) وأرا ح 1 (الفول السوداني) للتفاعل مع الحويصلات فوسفولبيد عززت بشكل كبير مقاومتها لتدهور المعدة والإندوسومالي7،في حين أن الربط ليغاند لمسببات الحساسية الرئيسية لحبوب اللقاح البتولا Bet v 1 غيرت كل من معدل المعالجة الإندوسولية وتنوع الببتيداتالناتجة 8. وهذا أمر وثيق الصلة بشكل خاص بحساسية الحساسية نظرا للارتباط الذي لوحظ بين الاستقرار وتوليد الخلايا التائية وحساسية البروتينات مثل Bet v 1 و Bla g 1؛ هذا الأخير الذي سيكون موضوع هذا العمل9،10.
Bla g 1 يمثل العضو النموذجي لعائلة بروتين الحشرات الرئيسية المسببة للحساسية (MA) ، ويمتلك بنية فريدة تتكون من 12 هليس ألفا البرمائي الذي يحيط تجويف مسعور كبير بشكل غير طبيعي9،11. يظهر الهيكل البلوري للأشعة السينية المتوفر في Bla g 1 كثافة الإلكترون داخل هذا التجويف بما يتفق مع الفوسفوليبيدات المنضمة أو الأحماض الدهنية. تخمين أكده 31P-NMR وقياس الطيف الكتلي. وكانت هذه الشحنات غير متجانسة في طبيعتها وكان تكوينها يعتمد بشكل كبير على مصدر مسببات الحساسية ، مع ملامح الدهون المختلفة لوحظت للمتلف Bla g 1 أعرب عنها في E. coli و P. pastoris. الغريب أن Bla g 1 المنقى من مصدر مسببات الحساسية الطبيعية (الصرصور frass) يحتوي على أحماض دهنية في الغالب داخل موقعه الملزم ، مع مزيج من البالميتات والأوليات والستيرات التي يتم تحديدها على أنها ليغندس "طبيعي"9،11. قدرة Bla g 1 على الاحتفاظ بالدهون والأحماض الدهنية بعد خطوات تنقية متعددة تعيق الجهود المبذولة لدراسة البروتين في عزلة. على العكس من ذلك ، فقد اقترح أن palmitate الطبيعية ، stearate ، وlyg ligands oleate من Bla g 1 (يشار إليها من الآن فصاعدا باسم nMix) تلعب دورا رئيسيا في كل من الحساسية والوظيفة البيولوجيةالأصلية 9. ومع ذلك، هذه الليجاند غير موجودة في Bla g 1 التي تم الحصول عليها من مصادر مؤتلفة، مما يجعل من الصعب تقييم هذه الفرضية. وقد لوحظت قضايا مماثلة لغيرها من المواد المسببة للحساسية ملزمة الدهون مثل بيت ضد 112،13. لتسهيل الدراسة المنهجية للتفاعلات الدهون المسببة للحساسية وضعنا بروتوكولا يمكن من خلاله تجريد المواد المسببة للحساسية كميا من الدهون المرتبطة بها وإعادة تشكيلها إما في شكل آبو أو تحميلها مع ليغاندس محددة.
يتم تنقية مسببات الحساسية الأكثر شيوعا من مصادرها الطبيعية أو المؤتلفة باستخدام الكروماتوغرافيا المتقاربة و / أو الكروماتوغرافيا استبعاد الحجم. هنا ، نقدم خطوة تنقية إضافية في شكل كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC) تستخدم عمود C18 في المرحلة العكسية التي يتم من خلالها تحويل مسببات الحساسية إلى مذيب عضوي مشابه للبروتوكولات المطورة للبروتينات الملزمة للأحماض الدهنية14. ثم يتعرض البروتين الناتج لخطوة التلين الحراري في غياب أو وجود الأحماض الدهنية و / أو فوسفوليبيدات. بالإضافة إلى استعادة الأصلي Bla g 1 أضعاف, ارتفاع درجات الحرارة زيادة قابلية الذوبان وسهولة الوصول للشحنات الدهون, تسفر عن Bla g 1 إما في شكل أبو أو محملة بشكل موحد مع ليغاند الكاره للماء المطلوب. 31 أكدت أطياف P-NMR من Bla g 1 المنقى بهذه الطريقة الإزالة الكاملة للليجانات المربوطة داخليا والاستبدال الموحد بالمركبات المطلوبة ، في حين أكدت الديسكروزم الدائرية الانتعاش الناجح لأضعاف Bla g 1. يتم تسليط الضوء على فائدة هذه الطريقة في عمل حديث تم العثور فيه على ربط البضائع لتعزيز Bla g 1 thermostability والمقاومة البروتيوليكية ، وتغيير حركية توليد الصرع بالخلايا التائية مع الآثار المحتملة على التوعية وحساسية9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bla g 1 الاستنساخ
- الحصول على جين لمسببات الحساسية الصرصور Bla g 1.0101 (المخلفات 34-216) ، مما يمثل تكرارا واحدا لنطاق MA. من أجل البساطة، سيتم استخدام Bla g 1 طوال العمل لتمثيل هذا التكرار الفردي، بدلا من النص الكامل Bla g 1.0101.
- subclone الجين Bla g 1 في المتجه المطلوب. في هذه الدراسة، تم إدراج الجين الذي يحتوي على علامة N-محطة الجلوتاثيون S-transferase (GST) إلى جانب فيروس التبغ حفر (TEV) موقع الانقسام protease في ناقل pGEX للتعبير كما هو موضح سابقا11.
- تحويل المتجه Bla g 1 pGEX إلى خلايا BL21 DE3 E. القولونية.
- إعداد مخزون 10 نانوغرام/ميكرولتر من المتجه المطلوب.
- الجمع بين 1 ميكرولتر من 10 نانوغرام / ميكرولتر مخزون الحمض النووي مع 50 ميكرولتر من خلايا DE3 BL21 على النحو المنصوص عليه من قبل الشركة المصنعة.
- احتضان BL21 DE3-DNA خليط لمدة 30 دقيقة على الجليد. نقل إلى حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، ثم نقل فورا مرة أخرى على الجليد لاحتضان إضافية 1 دقيقة.
- إضافة 200 ميكرولتر من وسائط LB إلى الخلايا واحتضان ل1 ساعة إضافية في 37 درجة مئوية.
- لوحة الخلايا المحولة على لوحات LB-أجار التي تحتوي على 100 ملغ / لتر أمبيسلين وتنمو في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
2. التعبير الأولي وتنقية
- تلقيح 1 لتر من وسائط LB تحتوي على 100 ملغم /لتر أمبيسلين مع مستعمرة واحدة من خلايا BL21 DE3 التي تم تحويلها مع متجه Bla g 1 كما هو موضح في 1.3. تنمو عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، حصاد الخلايا (OD600 ~ 1.5) عن طريق الطرد المركزي في 6000 x ز لمدة 10 دقيقة وإعادة الإنفاق في 2 لتر من وسائط YT 2x تحتوي على 100 ملغم / لتر الأمبيسلين. السماح للخلايا بالنمو لمدة ساعة واحدة إضافية عند 37 درجة مئوية إلى OD600 > 0.6.
- حث التعبير البروتين من خلال إضافة 0.5 M IPTG. نقل الخلايا إلى 18 درجة مئوية واحتضان بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي، حصاد الخلايا كما هو موضح في 2.2. يمكن تجميد بيليه الخلية الناتجة وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
- Resuspend بيليه التي تم الحصول عليها من 1 لتر من الثقافة في 50 مل من العازلة تحلل (50 mM تريس-HCl الرقم الحموضة 8.5، 100 mM NaCl) تحتوي على 1 قرص مثبط البروتيز (أو ما يعادلها) و 1 ميكرولتر من نواة البنزوناسي.
- خلايا الليس باستخدام سونيكاتور التحقيق (500 واط، 20 كيلوهرتز) تعيين إلى 30-50٪ السلطة لمدة 4 دقائق مع دورة واجب 50٪. الحفاظ على lysate في حمام جليدي أثناء سونيكيشن
- lysate الطرد المركزي في 45،000 × ز لمدة 20 دقيقة. تجاهل الكسر غير القابل للذوبان (بيليه).
- إزالة 28 ميكرولتر من البروتين القابل للذوبان. الجمع مع 7 ميكرولتر من المخزن المؤقت 5X SDS-PAGE وتخزين لتحليل SDS-PAGE. كرر هذه الخطوة لتدفق العمود GST من خلال، وغسل، وكسور elution قبل وبعد الحضانة مع TEV.
- تطبيق البروتينات القابلة للذوبان (supernatant) إلى عمود راتنج الجلوتاثيون (~ 10 مل إجمالي حجم السرير) متساوية في PH PBS 7.4.
- غسل أي بروتينات غير منضمة باستخدام 50 مل من برنامج تلفزيوني.
- Elute GST-Bla g 1 باستخدام 50 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 10 مليون متر غلوتاثيون مخفض.
- احتضان البروتين eluted مع 0.2 kU TEV بروتياز بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية، أو درجة حرارة الغرفة لمدة 6 ساعات لإزالة علامة GST.
3. إزالة الدهون الذاتية عن طريق عكس المرحلة HPLC
- جمع 1 Bla ز مشقوق وتركيزه إلى ~ 2 مل باستخدام وحدة تصفية الطرد المركزي مع <10 كيلودا خفض الوزن الجزيئي.
- أضف عينة <12 مل إلى الجزء العلوي من المكثف وتدور عند 5000 × غرام لمدة 10-15 دقيقة في دوار دلو الأرجوحة.
ملاحظة: تختلف سرعة حجم العينة والدوران استنادا إلى عامل التصفية المحدد ونوع الدوار المستخدم. راجع وثائق الشركة المصنعة قبل الاستخدام.
- أضف عينة <12 مل إلى الجزء العلوي من المكثف وتدور عند 5000 × غرام لمدة 10-15 دقيقة في دوار دلو الأرجوحة.
- قم بتحميل التركيز على نظام HPLC 250 × 10 مم مجهز بعمود كروماتوغرافي من المرحلة العكسية C18 مع توازن 97٪ من العازلة A (الماء، 0.1٪ حمض ثلاثي فلوريك) و3٪ عازل B (أسيتونيتريل، 0.1٪ حمض ثلاثي فلوريك).
ملاحظة: يمكن استخدام أعمدة أصغر، ولكن قد يلزم تحميل البروتين وتدوينه باستخدام دورات متعددة لاستيعاب سعة الربط المنخفضة. عند اختيار عمود تأكد من أن حبات الراتنج لديها حجم جسيم < 5 ميكرومتر وحجم المسام من 200 Å > للسماح بفصل فعال للجزيئات بحجم البروتين
تنبيه: حمض ثلاثي فلوريوستيك هو تآكل شديد وينبغي الاستغناء عنها داخل غطاء الدخان باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (أي قفازات النتريل، معطف المختبر ونظارات واقية). Acetonitrile على حد سواء معتدلة السمية, متقلبة, واشتعالا عاليا, وينبغي استخدام والاستغناء عنها داخل غطاء الدخان باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة (أي, قفازات النتريل, معطف المختبر ونظارات واقية). - Elute Bla g 1 باستخدام البروتوكول الموضح في الجدول 1 بمعدل تدفق 1.5-4.0 مل/دقيقة. مراقبة عملية التواؤم باستخدام امتصاص الفلورسينس في 280 نانومتر.
- جمع وتجمع Bla g 1 كسور. Bla g 1 عادة ما يكون في >74٪ من العازلة B، أو ~ 34-40 دقيقة.
ملاحظة: يختلف وقت Elution قليلا استنادا إلى معدل التدفق أو حجم العمود. جمع الكسور على أساس A280 للحصول على أفضل النتائج.
- جمع وتجمع Bla g 1 كسور. Bla g 1 عادة ما يكون في >74٪ من العازلة B، أو ~ 34-40 دقيقة.
| الوقت (الحد الأدنى) | المخزن المؤقت A (٪) | المخزن المؤقت B (٪) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
الجدول 1: بروتوكول إلوتيون ل Bla g 1. جدول يوضح تدرج اليضوء المستخدم في عزل Bla g 1 باستخدام عمود C18 HPLC.
- Aliquot العينة في أنابيب اختبار الزجاج، وملء أي أنبوب اختبار أكثر من منتصف الطريق (~ 4 مل). تغطية أنابيب مع فيلم البارافين وثقب الغطاء مع اثنين من الثقوب للسماح التنفيس.
- إعداد منفصلة 1 مل aliquot (اختبار aliquot). سيتم استخدام هذا لتحديد العائد المتوقع.
- تجميد العينات واختبار aliquot عن طريق وضعها في الفريزر -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، أو الغمر في النيتروجين السائل. في حالة لاحق، يجب أن يكون أنبوب استدارة باستمرار لتجنب كسر أنبوب اختبار بسبب التوسع في المرحلة السائلة عند التجميد.
- جفف عينات البروتين الهذيانية الناتجة باستخدام الليوفيلييزر. يمكن تخزين البروتين المجفف عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لعدة أشهر في وعاء مغلق.
4. إعادة تشكيل Apo- والبضائع محملة Bla g 1
- تحديد العائد المتوقع Bla g 1.
- Resuspend lyophilized، delipidated (ما بعد HPLC) اختبار aliquot في 5 مل من العازلة إعادة طي، (50 م م HEPES pH 7.4، 100 MM NaCl، 2٪ DMSO).
- سخني الخليط في حمام مائي (500 مل كوب مع 250 مل من الماء وحركي شريطا فوق طبق ساخن) إلى 95 درجة مئوية. حلول الدوامة بشكل متقطع واحتضان في 95 درجة مئوية ل0.5-1 ساعة.
- إزالة الحرارة والسماح ببطء التوازن حمام الماء لدرجة حرارة الغرفة (~ 1 ساعة). يمكن تخزين البروتين الصلب في هذا النموذج بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
- تمرير خليط Bla g 1-lipid من خلال فلتر حقنة 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات.
- تبادل العازلة البروتين المصفاة 3x في برنامج تلفزيوني درجة الحموضة 7.4 باستخدام مرشح الطرد المركزي مع قطع 10 كيلودا كما نوقش في 3.1 لإزالة الأحماض الدهنية الحرة المتبقية والمذيبات العضوية.
- تقييم تركيز البروتين باستخدام المقايسة BCA أو طريقة أخرى مفضلة مثل امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. استخدم هذا لتحديد العائد المتوقع ل aliquots Bla g 1 المتبقية.
- إعادة تشكيل Apo- أو البضائع المحملة Bla g 1
- Resuspend Bla ز 1 aliquots في إعادة طي العازلة كما هو موضح في 4.1.1.
- لإنتاج Apo-Bla g 1، كرر الخطوات 4.1.2-4.1.6 للحصول على العائد المطلوب.
- لتحميل Bla g 1 بالأحماض الدهنية، قم بإعداد حلول مخزون 20 مللي متر من شحنة الأحماض الدهنية المطلوبة في الميثانول أو DMSO. ثم انتقل إلى الخطوة 4.2.5.
- لتحميل Bla g 1 مع فوسفوليبيدات، قم بإعداد مخزون 10 ملغم/مل من الشحنة المطلوبة في الكلوروفورم داخل أنبوب اختبار زجاجي.
- تبخر الكلوروفورم لإنتاج فيلم الدهون. إضافة برنامج تلفزيوني إلى أنبوب الاختبار لإنتاج تركيز الفوسفوليبيد النهائي من 20 مليون متر.
تنبيه: الكلوروفورم ضار إذا تم استنشاقه أو ابتلاعه. استخدام في غطاء الدخان الكيميائي أو استخدام الجهاز التنفسي إذا كانت التهوية غير كافية متاحة. توظيف قفازات النتريل، معطف المختبر ونظارات واقية عند التعامل معها. استشر MSDS قبل الاستخدام. - إعادة ترطيب الفيلم الدهون عن طريق تسخينه فوق درجة حرارة المرحلة الانتقالية من البضائع الدهنية ودوامة حتى يتحول الحل غائم. لاحظ أنه قد تكون هناك حاجة sonication لإعادة الإنفاق بالكامل وإعادة ترطيب بعض الشحنات.
- إذا كان sonication مطلوبا، ضع أنبوب الاختبار في جهاز صوتنة الحمام (100 واط، 42 كيلوهرتز) و sonicate بأقصى طاقة حتى يتم إعادة إنفاق البضائع. بدلا من ذلك، يمكن استخدام سونيكاتور التحقيق (الموصوفة في 2.6) قوة 10-20٪ مع دورة واجب 50٪.
تنبيه: تستخدم Sonication موجات صوتية عالية التردد قد تضر بالسمع. استخدام معدات الوقاية الشخصية التي تمنع الضوضاء (سدادات الأذن أو كاتم الصوت). إذا كان ذلك ممكنا، ضع سونيكاتور داخل مجلس الوزراء أو غرفة تهدئة الصوت.
- تبخر الكلوروفورم لإنتاج فيلم الدهون. إضافة برنامج تلفزيوني إلى أنبوب الاختبار لإنتاج تركيز الفوسفوليبيد النهائي من 20 مليون متر.
- إضافة الأحماض الدهنية المطلوبة أو البضائع فوسفولبيد لإنتاج فائض الضرس 20x من الليجانات بالنسبة إلى Bla g 1 على أساس العائد المتوقع المحدد في 4.1. يجب ألا يتجاوز الحجم الإجمالي للمذيبات العضوية المضافة في هذه الخطوة 2٪. دوامة لخلط.
ملاحظة: 1 لتر من خلايا Bl 21 DE3 عادة ما تسفر عن ~ 0.25-0.4 بروتين نانومول، وهو ما يقابل ~ 400 ميكرومتر ليغند لكل أنبوب. - أنال البروتين كما هو موضح في 4.1.
5. تأكيد إزالة البضائع فوسفولبيد / تحميل عبر 31P-NMR
- تركيز عينات من Apo- أو البضائع محملة Bla g 1 إلى >100 ميكرومتر باستخدام وحدة فلتر الطرد المركزي كما هو موضح في 3.1.
- إعادة ترطيب الفوسفولبيد المرجعي في مخزن تلفزيوني مؤقت إلى التركيزات النهائية من 2 و 1.5 و 1 و 0.5 و 0.25 mM.
- تمييع عينات 1:1 مع العازلة cholate (100 mM تريس درجة الحموضة 8.0، 100 م م NaCl، 10٪ ث / v cholate) إلى حجم إجمالي قدره ~ 600 ميكرولتر.
ملاحظة: يعمل Cholate في هذه الخطوة لاستخراج الدهون وتزييتها بالكامل من تجويف Bla g 1 الكاره للماء. وهذا يضمن أن البيئة الكيميائية المحيطة مجموعات الرأس فوسفولبيد متسقة بين عينات مختلفة، مما يسمح لتقييمها الكمي باستخدام 31P-NMR. يمكن استبدال استخدام المرارة بالكلوروفورم / الميثانول كما هو موضح سابقا15. - الحصول على 1D 31P-NMR أطياف cholate-solubilized Bla g 1 العينات والمعايير المرجعية فوسفولبيد باستخدام مسبار النطاق العريض.
ملاحظة: تم الحصول على أطياف P-NMR 31المعروضة في هذا العمل باستخدام مطياف MHz 600. ومع ذلك، تشير الدراسات السابقة التي تستخدم تقنيات مماثلة إلى أنه يمكن تحقيق حساسية مقبولة في المجالات التي يصل فيها مستوى القوة إلى 150-200 ميغاهرتز15. - معالجة البيانات الناتجة باستخدام البرامج المناسبة16.
- الحصول على كثافة الذروة باستخدام المفضل NMR عرض البرمجيات17.
- قارن أطياف Bla g 1 31P-NMR بتلك التي تم الحصول عليها للعينات المرجعية الفوسفولبيد لتأكيد إزالة الليجانات المربوطة داخليا و / أو ربط الليجاندات المطلوبة استنادا إلى التحولات الكيميائية للقمم المرئية (أو عدم وجودها).
- تأكيد قياس الاستواء الملزم الكامل من خلال مقارنة كثافة الذروة في طيف Bla g 1 بالمعايير المرجعية للفوسفولبيد.
6. تأكيد بلا ز 1 للطي
- إعداد عينات 0.5 ميكرومتر من Bla g 1 في المخزن المؤقت للقرص المضغوط (100 mM KH2PO4، درجة الحموضة المخزن المؤقت 7.5). تحميل 2 مل من العينة في cuvette CD 10 ملم مع شريط تحريك المغناطيسي.
- قياس طيف CD من Bla g 1 لتأكيد إعادة تشكيل البنية الثانوية. تأكد من أن الجهد الضوئي (PMT) لا يتجاوز توصيات الشركة المصنعة (عموما 1 كيلو فولت).
- قياس إشارة القرص المضغوط من 260-200 نانومتر في 25 درجة مئوية مع الملعب البيانات من 0.2 نانومتر ومعدل المسح الضوئي من 20 نانومتر / ثانية مع وقت تكامل البيانات من 1 ثانية.
- زيادة درجة الحرارة في الخلية المضغوطة من 25 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية بمعدل 0.5 درجة مئوية/دقيقة. قم بتنشيط شريط تحريك مغناطيسي لضمان أن تكون درجة الحرارة موحدة عبر العينة.
- رصد CD في 222 نانومتر، مع قراءات كل 2 درجة مئوية.
- تناسب البيانات الناتجة عن منحنى بولتزمان 2 دولة لتحديد درجة حرارة ذوبان. نظرا للاستقرار العالي ل Bla g 1 ، تم تعريف درجة حرارة الذوبان (MT25)على أنها درجة الحرارة التي فقد فيها البروتين 25٪ من قرصه المضغوط الأولي عند 222 نانومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام الكروماتوغرافيا تقارب، تم عزل إعادة تركيب GST-Bla ز 1 بسهولة إلى مستوى عال من النقاء(الشكل 1A)،مما أدى إلى غلة ~ 2-4 ملغم / لتر من ثقافة الخلية. الحضانة بين عشية وضحاها مع بروتياز TEV في 4 درجة مئوية كافية لإزالة علامة GST، مما أسفر عن المنتج النهائي في ~ 24 كيلودا. لاحظ أنه في هذه الحالة هناك كمية كبيرة من GST-Bla g 1 في كسور التدفق والغسيل ، مما يشير إلى تجاوز قدرة ربط راتنج Glutathione. ويمكن أن يوفر استخدام المزيد من الراتنج أو دورات متعددة من تحميل العينات والوضوء علاجا لهذه المسألة.
تطبيق Bla g 1 على عمود C18 في المرحلة العكسية ينتج ملف تعريف elution مميز(الشكل 1B)، مع قمتين كبيرتين عند ~ 50٪ عازلة B ، وذروة كبيرة ثانية عند ~ 75٪ من العازلة B. SDS-PAGE تحليل الكسور الناتجة تشير إلى أن الأول يتوافق مع علامة GST المشقوقة ، في حين أن الأخير يتوافق مع Bla g 1. في بعض الأحيان سوف تحدث ذروة ثالثة أصغر في الوسط المقابلة لبقايا GST-Bla 1 غير المشقوقة. يمكن القضاء على وجود هذا المنتج غير المشقوق عن طريق زيادة كمية TEV المستخدمة في رد فعل الانقسام أو تمديد وقت الحضانة. في حين أن الانقسام غير المكتمل سيقلل من الغلة ، فإن الفصل الذي تم الحصول عليه على عمود C18 يكفي لضمان بقاء نقاء منتج Bla g 1 النهائي دون انقطاع. نتيجة للتراجع في مرحلة HPLC هو أن المنتج النهائي للبروتين هو eluted في بيئة المذيبات العضوية. في حين أن هذا يسهل إزالة أي ليغاندس الكارهة للماء، إزالة هذا المذيب عن طريق الليوفيلية مطلوب، مما أسفر عن مسحوق أبيض رقيق (الشكل 1C).
مطلوب الأكسدة من البروتين لإعادة تشكيل الأصلي Bla g 1 أضعاف ويمكن القيام به إما في غياب أو وجود شحنة الدهون. إضافة DMSO إلى البضائع المجففة Bla g 1 وفوسفولبيد قبل العازلة إعادة طي يسهل عملية التشحيم، على الرغم من أن بعض الشحنات الدهون سلسلة أطول لن تذوب تماما حتى في درجات حرارة مرتفعة. ومع ذلك، لم يلاحظ هذا للتأثير على فعالية التحميل بين الدهون اختبارها في دراساتنا(الشكل 1C). وبالمثل، فإن الدهون الزائدة غالبا ما تعجل للخروج من الحل أو تشكيل الحويصلات الكبيرة عند التبريد، مما أدى إلى ظهور غائم بعد التلين(الشكل 1C). كما لم يلاحظ ذلك للتأثير على كفاءة التحميل، ويتم إزالة أي مجاميع بسهولة من خلال الترشيح وخطوات تبادل المخزن المؤقت اللاحقة للتوصل إلى حل واضح وشفاف. على الرغم من الظروف القاسية، لم يلاحظ أي تحليل حراري لBla g 1.
الشكل 1: التطهير الأولي لبلا ز 1. (أ) SDS-PAGE تظهر كسر البروتين القابل للذوبان بعد التحلل الأولي (S)؛ تدفق من خلال (FT)، وغسل (W)، والوضوء من عمود الجلوتاثيون سيبهاروز (E)؛ والنهائي Bla g 1 المنتج بعد انشقاق TEV من علامة GST (TEV). يظهر ملف تعريف elution HPLC للمنتج Bla g 1 الناتج بعد انشقاق TEV في (B). يظهر280 باللون الأزرق، بينما يظهر تدرج الوضوء (٪ المخزن المؤقت B) باللون الأخضر. يشار إلى الكسور المقابلة لعلامة GST المشقوقة (H1، H2)، وبقايا GST-Bla g 1 (H3)، وBla g 1 (H4) المنقى بسهام حمراء بنسبة ~ 50٪، و~ 65٪، و ~ 74٪ من العازلة B على التوالي. يتم عرض تحليل SDS-PAGE للكسور H1- H4 في (A) ويتم تصنيفه وفقا لذلك. (ج) صور تمثيلية تظهر Bla g 1 في مراحل مختلفة من عملية التلين. لاحظ أن دقة ومدى تكوين الترسبات كما هو مبين في الثانية والثالثة يعتمد على نوع البضاعة الدهنية المستخدمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
31 P-NMR أطياف Apo-Bla g 1 المنقى بهذه الطريقة لا تظهر أي فوسفوليبيدات يمكن اكتشافها إما عن طريق NMR(الشكل 2A)أو الكروموتوغرافيا طبقة رقيقة (البيانات غير مبينة). وعلى النقيض من ذلك، تظهر أطياف مماثلة تم الحصول عليها ل Bla g 1 محملة بفوسفولبيد (DSPC) distearoylphosphatidylcholine ذروة قوية تتوافق مع المجموعة الرأسية فوسفاتيديلكولين. للمقارنة، فإن طيفا تمثيليا من 31P-NMR من Bla g 1 منقى من الإشريكية القولونية المؤتلفة دون استخدام بروتوكول إزالة الدهون /التلين الموصوف هنا (ecBla g 1) يظهر مزيجا غير متجانس من الدهون الذاتية المستخرجة من نظام التعبير المؤتلف(الشكل 2B). الاستفادة من الطبيعة الكمية لNMR، يمكن إنتاج منحنى قياسي باستخدام عينات مرجعية من تركيزات DSPC المعروفة(الشكل 2C). مقارنة كثافة إشارة 31P التي تم الحصول عليها من DSPC-Bla g 1 مقابل هذا المنحنى القياسي تسفر عن قياس ستويتشوميتري ملزم يبلغ 4.7 ± 0.5 شحم لكل بروتين؛ القيمة التي تقارن بشكل إيجابي إلى قياس الاستواء الملزم الكامل المتوقع الذي تم الحصول عليه من دراسات silico والتحليل الهيكلي9. لاحظ أن هذه التقنية سوف تكشف فقط ليغاندس التي تحتوي على نواة P 31مثل فوسفوليبيدات، ليسوفوسفوليبيدات، شواريد ليبوبوليساكاريد الخ. ومع ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة لتحليل 13C-NMR. في هذه الحالة، سوف يوصىميثيل-13C المسمى الأحماض الدهنية بسبب خصائصه الاسترخاء NMR مواتية. كما يسهل تقييد وضع العلامات النظيرية على موقع واحد التفسير الطيفي، حيث يتوقع أن تكون هناك ذروة واحدة فقط، مع خفض التكلفة في الوقت نفسه مقارنة بنظيراتها الموحدة التي تحمل علامة C البالغ عددها 13نظيرا. وهناك نهج بديل هو استخدام المواصفات الشامل لتحديد الليجاندات ملزمة، كما هو موضح في دراسة سابقة التي حددت خليط من الأحماض الدهنية والشحن الطبيعي من Bla g 1 معزولة عن الصرصور frass (nBla g 1)9. ومع ذلك، فإن قدرات الكمية المحدودة للمواصفات الكتلية تحول دون إجراء قياس دقيق لقياس الاستواء الملزم دون معايير كافية.
الشكل 2: التحقق من إزالة الدهون وتحميل Bla g 1. (أ) 31P-NMR أطياف أبو - (أسود) أو DSPC محملة Bla g 1 (أحمر) أعدت باستخدام بروتوكول التلوي الموصوفة في هذا العمل مما يدل على إزالة كاملة من الدهون في السابق، وتحميل متجانسة من الدهون فوسفاتيديلكولين (PC) التي تحققت في هذا الأخير. في المقابل، Bla g 1 تنقيتها من القولونية E. المؤتلف دون تجريد الدهون والعلج (ecBla g 1) يظهر خليط غير متجانس من فوسفاتيديليثانولامين الذاتية (PE) وفوسفاتيديلجليسيرول (PG) الدهون عند تحليلها باستخدام هذه الطريقة(B). يظهر منحنى معياري تمثيلي تم الحصول عليه من عينات مرجعية DSPC من التركيزات المعروفة في (C)، والتي يمكن من خلالها الحصول على قياس ستويتشوميتري الربط Bla g 1. الأرقام المقتبسة من فو وآخرون (2019) والمقدمة بموجب ترخيص المشاع الإبداعي CC BY9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
تكشف الهياكل البلورية من Bla g 1 عن طية فريدة تتكون من 12 ألفا-هيليس أمفيباثيك. يمثل الإملاء الدائري طريقة سريعة ومريحة لتقييم ما إذا كان قد تم إعادة تشكيل هذا الحظيرة بنجاح بعد عملية التلين. أطياف القرص المضغوط ل Apo- والدهون (nMix) محملة Bla g 1 تظهر مينيما ~ 220 و 210 نانومتر يدل على هيكل ألفا-helical في الغالب (الشكل 3A). وهذا الطيف مشابه إلى حد بعيد للطيف الذي تم الحصول عليه بالنسبة ل ecBla g 1 و nBla g 1، مما يوفر دليلا إضافيا على أن الهيكل الأصلي لبلا ز 1 قد تم استرداده بنجاح. وقد تأكد ذلك كذلك من خلال استخدام 19F و 1H-15N الحل-NMR، ومناقشة كاملة والتي تتوفر في مكان آخر9. تظهر مقايسات التشبع الحراري المستندة إلى القرص المضغوط فقدانا تعاونيا للبنية الثانوية ألفا -هلية مما يدل على مجال كروي مطوي(الشكل 3B). تحليل درجات الحرارة ذوبان الناتجة (الشكل 3C) تظهر زيادة كبيرة على ربط ليغاند nMix. هذه الحرارة المرتفعة تتماشى مع تلك المحسوبة ل nBla g 1 ، مما يشير إلى أننا قادرون على إعادة إنتاج الحالة الطبيعية ل Bla g 1 بشكل كامل. لاحظ أن ecBla g 1 يظهر أيضا تعزيزا مماثلا ، إن لم يكن أكبر في القدرة على الحرارة ، مما يوضح إمكانية تداخل الدهون المتبقية المرتبطة داخليا مع التوصيف الفيزيائي الحيوي لمسببات الحساسية التي يتم تنقيتها باستخدام النهج التقليدية القائمة على FPLC. وعلى النقيض من ذلك، فإن القدرة على إزالة وإعادة تحميل الشحنات الكارهة للماء من المواد المسببة للحساسية مثل Bla g 1 توفر وسيلة فريدة لدراسة دور الدهون في الاستجابة التحسسية. هنا، ونحن نصف طريقة لدراسة تأثير الشحنات الدهنية على هيكل والاستقرار والمعالجة endosomal من البروتينات المسببة للحساسية أنفسهم، على الرغم من أن سبل أخرى للدراسة يمكن النظر فيها.
الشكل 3: تأكيد الانتعاش الناجح للطي Bla g 1. (أ) أطياف القرص المضغوط من Apo- (أسود) أو nMix محملة (الأحمر) Bla ز 1 تنقيتها وعلى باستخدام البروتوكول المذكور هنا، مع مينيما في ~ 220 و 210 نانومتر يدل على هيكل ألفا-هلي في الغالب تتفق مع هيكل الكريستال الأشعة السينية المتاحة. كل من Apo- و nMix محملة Bla g 1 أطياف متشابهة للغاية مع تلك التي تم الحصول عليها لBla g 1 تنقيتها من القولونية E. المؤتلف (ecBla g 1, الأخضر) أو من مصدرها المسبب للحساسية الطبيعية (nBla g 1, الأزرق) دون إزالة الدهون وبروتوكول الصلب, مزيد من الدعم للاسترداد الناجح للهيكل الأصلي في السابق. (ب) ملامح الحرارية التمثيلية ل Apo- (أسود) و nMix محملة (أحمر) Bla g 1 تظهر منحنى sigmoidal تعاونية إرشادية تتكشف. nBla g 1 (أزرق) و ecBla g 1 (أخضر) كما هو موضح كمرجع. تظهر درجات حرارة الذوبان المحسوبة (MT25)من Bla g 1 في (C). ربط ليغاندس nMix (أحمر) تسفر عن زيادة كبيرة في الحرارة بالنسبة إلى آبو بلا ز 1 (أسود). وهذا يعكس الاتجاه الملاحظ ل nBla g 1 (أزرق)، مما يشير إلى أننا قادرون على استعادة الولاية الأصلية بنجاح. ويبرز الاستقرار الأكبر الملاحظ ل ecBla g 1 إمكانية تداخل الدهون المرتبطة داخليا مع التوصيف الفيزيائي الحيوي لمسببات الحساسية. تمثل قيم MT25 المعروضة في C القيمة الوسطى التي تم الحصول عليها من ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. تمثل أشرطة الخطأ قيم الانحراف المعياري المطابقة. الأرقام المقتبسة من فو وآخرون (2019) والمقدمة بموجب ترخيص المشاع الإبداعي CC BY9. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تم تطبيق البروتوكول الموصوف في هذا العمل بنجاح لدراسة خصائص ربط الدهون بشكل منهجي من Bla g 1. وكشف هذا عن وجود علاقة بين ربط البضائع ، والترمسة ، والمعالجة الاندوسومالية ، وهذا الأخير كان مرتبطا بانخفاض في توليد epitope الخلايا التائية المعروفة مع الآثار المحتملة على المناعة9،18. بالإضافة إلى Bla g 1 ، ثبت أن المواد المسببة للحساسية الأخرى مثل Pru p 3 و Bet v 1 تحتفظ بشحناتها المربوطة داخليا عند تنقيتها باستخدام طرق الكروماتوغرافيا القياسية واستبعاد الحجم13و19و20و21و22. يمكن لهؤلاء الضيوف غير مرحب به تغيير الخصائص الحيوية الفسيولوجية والمناعية لهذه البروتينات بطريقة مماثلة، وتسليط الضوء على الحاجة إلى تقنيات لضمان delipidation كاملة مثل تلك المعروضة هنا.
في حين أن استخدام HPLC في المرحلة العكسية في تنقية المواد المسببة للحساسية قد وصف سابقا2، فإن اقترانه ببروتوكول تمي حراري يوفر فرصة غير عادية إلى حد ما لإعادة تشكيل مسببات الحساسية مع مجموعة من الليجاندات الطبيعية وغير الطبيعية ، مما يسمح للمستخدمين بالتحقيق في التفاعلات المسببة للحساسية الدهنية. وقد تبين أن خطوة التشبع الحراري هذه ضرورية لغرضين رئيسيين. أولا ، مطلوب التشبع الحراري لتسهيل الوصول إلى تجاويف الربط التي ، بسبب طبيعتها الكارهة للماء ، غالبا ما يتم دفنها بعيدا عن المذيب المائي9،22. ثانيا، غالبا ما تشكل الليجاندات الكارهة للماء مثل الأحماض الدهنية والفوسفوليبيدات هياكل فوق الجزيئات الأكبر مثل الميكليس أو الحويصلات عند وضعها في بيئة مائية. يمكن تقريب تركيز الليجاندات الأحادية أو "الحرة" المتاحة لربط البروتين باستخدام تركيز micelle الحرج (CMC). DSPC وغيرها من الفوسفوليبيدات سلسلة طويلة لديها قيم CMC في نطاق nM، مما يدل على أن هناك تقريبا أي ليغاندس الحرة المتاحة لربط Bla g 1. حتى سلسلة الدهون القصيرة والأحماض الدهنية لديها CMC في نطاق μm إلى mM منخفضة، مما يشير إلى أن نسبة كبيرة من هذه الليغندات لا تزال في مرحلة micellar أو ثنائية الطبقة23. ومع ذلك ، فإن درجات الحرارة العالية المستخدمة في بروتوكول التشبع لدينا تفرق هذه المجاميع الكبيرة ، مما يسهل الربط. وقد استخدمت الدراسات السابقة عادة فترات حضانة طويلة لتسهيل هذه العملية. ومع ذلك ، فإن عدم وجود عملية التشبع الحراري / التلين يثير الشكوك حول فعالية التحميل. على سبيل المثال، احتضان مسببات الحساسية العث دير ف 5 مع النظائرية الأحماض الدهنية الفلورية 11-(Dansylamino)حمض أونديكانويك (DAUDA) أسفرت عن قياس ستويتشوميتري ملزمة من 0.66 على الرغم من امتلاك تجويف مسعور كبير على قدم المساواة مع Bla g 124. وبالمثل ، تم العثور على خصوصية ملزمة وقياس ستويتشوميتري من nsLTPs النبات تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على ما إذا كانت الدهون والبروتين هي أول solubilized في الميثانول قبل إضافة العازلة المائية ، مما يدل على أن ligand و / أو ربط الوصول إلى الموقع كان عاملا يحد25.
بالإضافة إلى Bla g 1 ، قمنا بتطبيق نفس الاستراتيجية بنجاح على العديد من بروتينات نطاق MA الأخرى من الصراصير وبعوضة(A. aegypti)، وكذلك Der p 2 (البيانات غير المعروضة). لاحظنا أن كلا من Bla g 1 homologues و Der p 2 تم تهيأهما في وقت مختلف عن Bla g 1 من عمود C18 (الخطوة 3.3). قد تحتاج تدرجات الغضوء في هذه الخطوة إلى تحسينها للبروتينات الأخرى. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام أعمدة HPLC ذات المرحلة الثابتة الأقل رهابا للماء (مثل C8)، على الرغم من أنه في حالة Bla g 1، كان من الضروري زيادة رهاب الماء في عمود C18 لإزالة ملوثات فوسفولبيد دياسيل تماما من ecBla g 1. على الرغم من الاختلافات في الخصائص الفيزيائية الحيوية والبيوكيميائية، وجدنا أن هذا البروتوكول قوي للغاية ويمكن تطبيقه بسهولة على البروتينات المسببة للحساسية الأخرى. في حين أن الظروف القاسية المستخدمة قد تشكل قيدا محتملا ، فإن زيادة المرونة الملاحظة للعديد من مسببات الحساسية تقلل من تأثيرها26و27. في الواقع ، لوحظ العديد من المواد المسببة للحساسية الغذائية والاستنشاق مثل Der p 2 و Ber e 1 و Ara a 6 و Lep w 1 لاستعادة بنيتها ومناعيتها بعد التشبع الحراري ، على الرغم من أن تحسين ظروف العازلة قد يكون مطلوبا28و29و30و31و32و33؛ على سبيل المثال التشبع عكسها من nsLTP (كور 8) وthumatins (مال د 2 وقانون د 2) لوحظ فقط تحت الشروط الحمضية (pH <4)28،30،31. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن المؤلفين لم يحاولوا تحسين التوقيت أو درجات الحرارة المستخدمة في بروتوكول التلين. فمن الممكن أن التشحيم ليغاند والبروتين للطي / تتكشف يمكن تحقيقها باستخدام درجة حرارة قصوى أقل كما رأينا مع بير ه 1 الذي يتحقق التشبع عكسها في 82 درجة مئوية29. ومن المتوقع أن يؤدي استخدام هذه التدابير إلى توسيع نطاق المواد المسببة للحساسية التي يمكن تطبيق هذا البروتوكول عليها.
وثمة اعتبار آخر مهم عند تكييف هذا البروتوكول مع أنظمة الحساسية الأخرى هو تركيز الليغندات المطلوبة أثناء عملية التلألذ. في حالة Bla g 1 يكون العائد المتوقع ~ 0.25-0.4 ميكرومول من البروتين لكل 1 لتر من زراعة الخلايا. ونظرا لقياس الاستواء الملزم الواضح ل 8 أحماض دهنية أو 4 دهون متسلسلة دياسيل لكل مسبب للحساسية، تم استخدام فائض مولار 20-40 ضعفا من البضائع (5-10 ميكرومول). وتجدر الإشارة إلى أن القدرة على ربط الدهون من Bla g 1 ومتجانساتها فريدة من نوعها؛ على سبيل المثال قبلت nsLTP عموما لربط في اثنين على الأكثر ليغاندس الدهون25 في حين أن lipocalins لديها أقل من 1 قياس الاستواء34. على هذا النحو ، يمكن إنجاز التحميل الكامل لهذه الأنواع من المواد المسببة للحساسية مع فائض أصغر من الليغند. ومن الاعتبارات النهائية عند تكييف هذا البروتوكول مع أنظمة مسببات الحساسية الأخرى وجود روابط ثنائية الكبريتيد، والتي يمكن أن تكون إشكالية إن لم تكن مشكلة بشكل صحيح قبل الإزالة. ويتمثل أحد النهج الممكنة في تنفيذ عملية التلوين في وجود عامل تخفيض مثل 2 mM DTT. ويمكن في وقت لاحق إعادة تشكيل السندات الأصلية ثنائي الكبريتيد من خلال إضافة الجلوتاثيون المنخفض والمأكسد على النحو الموصوفلجزأة مسببات الحساسية الفول السوداني التي درسها Aalberse وآخرون. وفي هذه الحالة، ينبغي تقييم استرداد الترابط الصحيح للكبريتيد تجريبيا عن طريق قياس الطيف الكتلي35.
في هذا العمل نقوم بوصف تقنية يمكن من خلالها تهذي المواد المسببة للحساسية وإعادة تمليكها بمختلف شحنات الفوسفولبيد والأحماض الدهنية. ومع ذلك ، هناك العديد من الفئات الأخرى من الليغندات المناعية أو المؤنضة المحتملة الموجودة داخل خزانات مسببات الحساسية الشائعة. على سبيل المثال ، تم اقتراح مسببات الحساسية القط والكلب والعث لربط الدهون الدهنية (LPS) والدهون البكتيرية الأخرى من غبار المنزل36، في حين ثبت أن Bet v 1 لاستخراج الفلافونويدات المعقدة من مصفوفة حبوب اللقاح13. يمكن تكييف البروتوكول الموصوف في هذا العمل بسهولة لاستكشاف دور هذه الدهون بطريقة أكثر تفصيلا. كدليل على مفهوم تمكنا من إثبات أن تجويف مسعور من Bla g 1 قادر على ربط حمض ليبوتيتشيويك (LTA) من جدران الخلايا من البكتيريا الإيجابية غرام، ولكن يستبعد LPS من الأنواع السلبية غرام، مما يعكس احتمال أكبر عدد من سلاسل أسيل في الأخير9. مع اتخاذ هذه الخطوة خطوة أخرى ، يمكن للمرء الاستفادة من بروتوكول التشبع الحراري / التلأليد لدمج المسابير الفلورية وغيرها من نظائرها الأحماض الدهنية غير الطبيعية في البروتينات المسببة للحساسية. في الواقع ، تمكنا من تحميل تجويف الكاره للماء من متجانس البعوض من Bla g 1 مع DAUDA ، مما فتح سبلا إضافية لدراسة آثار الليجانات الدهنية على الأمراض المسببة للحساسية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ونود أن نشكر الدكتور توم كيربي وسكوت غابل والدكتور روبرت لندن على مساعدتهم ومساعدتهم طوال هذا العمل، إلى جانب الدكتور بوب بتروفيتش ولوري إدواردز على استخدام أدواتهم ومساعدتهم في توليد بنى Bla g 1 المستخدمة في هذه الدراسة. نشكر أندريا آدامز على المساعدة في قياس الطيف الكتلي، والدكتور يوجين ديروس للمساعدة في أجهزة NMR. تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث داخل العين من المعاهد القومية للصحة، المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية، Z01-ES102906 (GAM). المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
