Summary
Bu protokol, endojen lipitlerin alerjenlerden uzaklaştırılmasını ve termal tavlama ile birleştiğinde ters faz HPLC ile kullanıcı tarafından belirtilen ligandlarla değiştirilmesini açıklar. 31 P-NMR ve dairesel dikroizm, ligand çıkarma/yüklemenin hızlı bir şekilde onaylanmasına ve doğal alerjen yapısının geri kazanılmasına izin verir.
Abstract
Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 ve Fel d 1 dahil olmak üzere birçok büyük alerjen hidrofobik lipid benzeri moleküllere bağlanır. Bu ligandlar güçlü bir şekilde korunur ve bağışıklık sistemini doğrudan uyararak veya alerjenik proteinin biyofiziksel özelliklerini değiştirerek duyarlılık sürecini etkileme potansiyeline sahiptir. Bu değişkenleri kontrol etmek için, endojen olarak bağlı ligandların çıkarılması ve gerekirse bilinen bileşimin lipitleri ile değiştirilmesi için teknikler gereklidir. Hamamböceği alerjeni Bla g 1, geleneksel teknikler kullanılarak saflaştırıldığında endojen lipitlerin heterojen bir karışımını bağlayan büyük bir hidrofobik boşluğu çevreler. Burada, bu lipitlerin ters fazlı HPLC kullanılarak çıkarıldığı ve ardından Apo formunda Bla g 1'i elde etmek için termal tavlamanın veya kullanıcı tanımlı bir yağ asidi veya fosfolipid kargo karışımı ile yeniden yüklendiğini açıklıyoruz. Bu protokolü biyokimyasal testlerle birebir hale getiren yağ asidi yüklerinin Bla g 1'in termostabilitesini ve proteolitik direncini önemli ölçüde değiştirdiğini, T hücre epitopu üretimi ve alerjeniklik oranı için aşağı yönlü etkileri olduğunu ortaya koymaktadır. Bu sonuçlar, hem rekombinant hem de doğal kaynaklardan alerjenleri incelerken burada açıklanan gibi lipit çıkarma/yeniden yükleme protokollerinin önemini vurgulamaktadır. Protokol, lipitlerin alerjik yanıttaki rolünü incelemek için değerli bir araç sağlayan lipokalinler (Muş m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) ve Uteroglobin (Fel d 1) dahil olmak üzere diğer alerjen aileler için genelleştirilebilir.
Introduction
Alerjen veritabanında yapılan bir anket, alerjenlerin bilinen tüm protein ailelerinin sadece% 2'sinde bulunduğunu ortaya koymaktadır, bu da ortak fonksiyonel ve biyofiziksel özelliklerin alerjenikliğe katkıda bulunduğunu göstermektedir1. Bu özelliklerden, lipid yüklerini bağlama yeteneği alerjenler arasında güçlü bir şekilde aşırı temsil edilmiş gibi görünmektedir, bu da bu kargoların duyarlılık sürecini etkileyebileceğini düşündürmektedir1. Gerçekten de, Brezilya Somun alerjeni Ber e 1'in tam duyarlılık potansiyelini gerçekleştirmek için endojen lipid ile birlikte yönetim gerektirdiği gösterilmiştir2. Bu lipitler, her ikisi de LPS bağlayıcı proteinler 3 ,4,5ile güçlü bir yapısal homolojiyi paylaşan akar alerjenleri Der p 2 ve Der p7tarafından gösterildiği gibi bağışıklık sistemini doğrudan uyarabilir. Bu gözleme dayanarak, Derp 2 ve Der p 7'nin bakteriyel lipitleri bağlayabileceği ve TLR4 aracılı sinyal yoluyla konak bağışıklık sistemini doğrudan uyarabileceği ve duyarlılık sürecini kolaylaştırabileceği önerildi5,6. Endojen olarak bağlanmış lipitlerin alerjenik proteinlerin biyofiziksel özelliklerini kendileri değiştirebileceği de mümkündür. Örneğin, Sin a 2 (hardal) ve Ara h 1'in (yer fıstığı) fosfolipid veziküllerle etkileşime girme yeteneği mide ve endosomal bozulmaya karşı dirençlerini önemli ölçüde artırdı7, ana huş poleni alerjen Bet v 1'e ligand bağlanması hem endosomal işlem oranını hem de ortaya çıkan peptitlerin çeşitliliğini değiştirdi8. Bu özellikle Bet v 1 ve Bla g 1 gibi proteinler için stabilite, T hücre epitop üretimi ve alerjeniklik arasında gözlenen korelasyon göz önüne alındığında alerjeniklikle ilgilidir; ikincisi bu çalışmanın konusu olacak9,10.
Bla g 1, böcek Major Allergen (MA) protein ailesinin prototipik üyesini temsil eder ve anormal derecede büyük bir hidrofobik boşluğu9,11 içine alan12amfipatik alfa helikesten oluşan benzersiz bir yapıya sahiptir. Bla g 1'in mevcut X-ışını kristal yapısı, bağlı fosfolipid veya yağ asidi ligandları ile tutarlı olarak bu boşluk içindeki elektron yoğunluğunu gösterir; 31P-NMR ve kütle spektrometresi tarafından doğrulanmış bir varsayım. Bu kargolar doğada heterojendi ve bileşimleri alerjen kaynağına büyük ölçüde bağlıydı, E. coli ve P. pastoris'teifade edilen rekombinant Bla g 1 için farklı lipid profilleri gözlendi. İlginç bir şekilde, Bla g 1 doğal alerjen kaynağından (hamamböceği frass) arındırıldı, bağlama alanında ağırlıklı olarak yağ asitleri içeriyordu, palmitat, oleat ve stearat karışımı "doğal" ligands9,11olarak tanımlanıyor. Bla g 1'in birden fazla saflaştırma adımını takiben lipitleri ve yağ asitlerini tutma yeteneği, proteini izole bir şekilde inceleme çabalarını engeller. Tersine, Bla g 1'in doğal palmitat, stearat ve oleat ligandlarının (bundan böyle nMix olarak adlandırılır) hem alerjenikliği hem de yerel biyolojik işlevinde önemli bir rol oynadığı öne sürülmektedir9. Bununla birlikte, bu ligandlar rekombinant kaynaklardan elde edilen Bla g 1'de bulunmaz ve bu hipotezi değerlendirmeyi zorlaştırır. Bet v 112,13gibi diğer lipid bağlayıcı alerjenler için de benzer sorunlar gözlenmiştir. Lipid-alerjen etkileşimlerinin sistematik çalışmasını kolaylaştırmak için, alerjenlerin endojen olarak bağlanmış lipitlerinden nicel olarak sıyrılabilecekleri ve Apo formunda veya belirli ligandlarla yüklenebilecekleri bir protokol geliştirdik.
Alerjenler en sık benzeşim kromatografisi ve/veya boyut dışlama kromatografisi kullanılarak doğal veya rekombinant kaynaklarından arındırılır. Burada, alerjenin yağ asidi bağlayıcı proteinler için geliştirilen protokollere benzer organik bir çözücüye dönüştürdürüldü ters fazlı bir C18 sütunu kullanan yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) şeklinde ek bir saflaştırma adımı sunuyoruz14. Elde edilen protein daha sonra yağ asitlerinin ve / veya fosfolipidlerin yokluğunda veya varlığında termal bir tavlama adımına tabi tutulur. Yerel Bla g 1 katını kurtarmanın yanı sıra, yüksek sıcaklıklar lipid yüklerinin çözünürlüğü ve erişilebilirliğini arttırır, Apo formunda veya istenen hidrofobik ligand ile düzgün bir şekilde yüklenen Bla g 1'i verir. 31 Bla g 1'in P-NMR spektrumu bu şekilde saflaştırılarak endojen olarak bağlanmış ligandların tamamen çıkarılması ve istenen bileşiklerle tek tip değiştirilmesi doğrulanırken, dairesel dikroizm Bla g 1 kıvrımının başarılı bir şekilde geri kazanılmasını doğruladı. Bu yöntemin faydası, kargo bağlamanın Bla g 1 termostabilitesini ve proteolitik direncini artırdığı, T hücre epitopu neslinin kinetiğini duyarlılık ve alerjeniklik için potansiyel etkileri olan değiştirdiği yeni bir çalışmada vurgulanmıştır9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bla g 1 klonlama
- Ma alanının tek bir tekrarını temsil eden hamamböceği alerjeni Bla g 1.0101 (kalıntılar 34-216) için gen elde edin. Basitlik adına, Bla g 1, tüm Bla g 1.0101 transkript yerine, bu tek tekrarı temsil etmek için çalışma boyunca kullanılacaktır.
- Bla g 1 genini istenen vektöre dahil edin. Bu çalışmada, bir tütün etch virüsü (TEV) proteaz bölünme bölgesine bağlı bir N-terminal glutatyon S-transferaz (GST) etiketi içeren gen, daha önce açıklandığı gibi ifade için bir pGEX vektörüneeklenmiştir 11.
- Bla g 1 pGEX vektörünü BL21 DE3 E. coli hücrelerine dönüştürün.
- İstediğiniz vektörün 10 ng/μL stokunu hazırlayın.
- 1 μL 10 ng/μL DNA stoğunu üretici tarafından sağlanan 50 μL BL21 DE3 hücresi ile birleştirin.
- BL21 DE3-DNA karışımını buzda 30 dakika kuluçkaya yatır. 1 dakika boyunca 42 °C'lik bir su banyosuna aktarın, ardından 1 dakika daha inkübasyon için hemen buza geri aktarın.
- Hücrelere 200 μL LB ortam ekleyin ve 37 °C'de 1 saat daha kuluçkaya yatırın.
- Dönüştürülen hücreleri 100 mg/L ampisilin içeren LB-Agar plakaları üzerine plakalayın ve bir gecede 37 °C'de büyüyün.
2. İlk ifade ve arınma
- 1.3'te açıklandığı gibi Bla g 1 vektörü ile dönüştürülmüş tek bir BL21 DE3 hücre kolonisi ile 100 mg/L ampisilin içeren 1 L LB ortam aşıla. Bir gecede 37 °C'de büyüyün.
- Ertesi gün, 10 dakika boyunca6.000 x g'da santrifüjleme yoluyla hücreleri (OD 600 ~1.5) hasat edin ve 100 mg / L ampisilin içeren 2 L 2x YT ortama yeniden harcayın. Hücrelerin 37 °C'de 1 saat daha büyümesine izin vererek0,6 > bir OD 600'e kadar büyüyün.
- 0,5 mM IPTG ilavesi ile protein ekspresyonunun indüklene. Hücreleri 18 °C'ye aktarın ve gece boyunca kuluçkaya yatırın.
- Ertesi gün, 2.2'de açıklandığı gibi hücreleri hasat edin. Elde eden hücre peledi dondurulabilir ve -20 °C'de saklanabilir.
- 1 proteaz inhibitörü tablet (veya eşdeğeri) ve 1 μL benzonaz çekirdeği içeren 50 mL lizis tamponunda (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM NaCl) 1 L kültürden elde edilen resüspend pelet.
- Bir prob sonicator (500 W, 20 kHz) kullanan Lyse hücreleri, %50 görev döngüsü ile 4 dakika boyunca%30-50 güce ayarlanır. Sonication sırasında bir buz banyosunda lisat tutun
- Santrifüj 20 dakika boyunca 45.000 x g'da lisat. Çözünmeyen fraksiyonu (pelet) atın.
- 28 μL çözünür proteini çıkarın. 7 μL 5x SDS-PAGE arabelleği ile birleştirin ve SDS-PAGE analizi için saklayın. TEV ile inkübasyondan önce ve sonra GST sütun akış, yıkama ve elütion fraksiyonları için bu adımı yineleyin.
- PBS pH 7.4'te dengelenmiş bir glutatyon reçine sütununa (~10 mL toplam yatak hacmi) çözünür proteinler (süpernatant) uygulayın.
- 50 mL PBS kullanarak ilişkisiz proteinleri yıkayın.
- Elute GST-Bla g 1, 10 mM azaltılmış glutatyon içeren 50 mL PBS kullanarak.
- GST etiketini çıkarmak için bir gecede 4 °C'de 0,2 kU TEV proteaz veya 6 saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatır.
3. Ters fazlı HPLC ile endojen lipit çıkarılması
- Bölünmüş Bla g 1'i toplayın ve <10 kDa moleküler ağırlık kesmeli bir santrifüj filtre ünitesi kullanarak ~2 mL'ye konsantre edin.
- <12 mL numuneyi konsantratörün üstüne ekleyin ve salıncak kovası rotorunda 10-15 dakika boyunca 5.000 x g'da döndürün.
NOT: Numune hacmi ve dönüş hızı, belirli filtreye ve kullanılan rotor türüne bağlı olarak değişir. Kullanmadan önce üretici belgelerine bakın.
- <12 mL numuneyi konsantratörün üstüne ekleyin ve salıncak kovası rotorunda 10-15 dakika boyunca 5.000 x g'da döndürün.
- Konsantreyi% 97 tampon A (su, % 0.1 trifluoroasetik asit) ve% 3 tampon B (asetonitril,% 0.1 trifluoroasetik asit) ile dengelenmiş bir C18 ters faz kromatografi sütunu ile donatılmış 250 x 10 mm HPLC sistemine yükleyin.
NOT: Daha küçük sütunlar kullanılabilir, ancak proteinin azaltılmış bağlama kapasitesine uyum sağlamak için birden fazla döngü kullanılarak yüklenmesi ve yakalanması gerekebilir. Bir sütun seçerken, protein büyüklüğündeki moleküllerin etkili bir şekilde ayrılmasına izin vermek için reçine boncuklarının < 5 μm parçacık boyutuna ve >200 şgözenek boyutuna sahip olduğundan emin olun
DİkKAT: Trifluoroasetik asit oldukça aşındırıcıdır ve uygun KKD (örneğin, nitril eldivenler, laboratuvar önlüğü ve gözlükler) kullanılarak bir duman kaputuna dağıtılmalıdır. Asetonitril hem orta derecede toksik, uçucu hem de oldukça yanıcıdır, uygun KKD (örneğin, nitril eldivenler, laboratuvar önlüğü ve gözlükler) kullanılarak bir duman başlığı içinde kullanılmalıdır. - Tablo 1'de 1,5–4,0 mL/dk akış hızında gösterilen protokolü kullanarak Elute Bla g 1. 280 nm'de floresan absorbansını kullanarak elüasyon sürecini izleyin.
- Bla g 1 kesirleri toplayın ve havuzlayın. Bla g 1 normalde %>74 tampon B veya ~34-40 dk'da elutes.
NOT: Elution süresi akış hızına veya sütun boyutuna bağlı olarak biraz değişecektir. En iyi sonuçlar için A280'e göre kesirleri toplayın.
- Bla g 1 kesirleri toplayın ve havuzlayın. Bla g 1 normalde %>74 tampon B veya ~34-40 dk'da elutes.
| Zaman (Min) | A Arabelleği (%) | B Arabelleği (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
Tablo 1: Bla g 1 için elution protokolü. Bir C18 HPLC sütunu kullanarak Bla g 1'in yalıtımında kullanılan elution gradyanını gösteren tablo.
- Aliquot örneği cam test tüplerine, hiçbir test tüpünü yarıdan fazla doldurmadan (~4 mL). Tüpleri parafin filmi ile örtün ve havalandırmaya izin vermek için kaplamayı iki delik ile delin.
- Ayrı bir 1 mL aliquot hazırlayın (test aliquot). Bu, beklenen verimi belirlemek için kullanılacaktır.
- Numuneleri dondurun ve aliquot'u -80 °C dondurucuya 1 saat boyunca yerleştirerek veya sıvı nitrojene batırarak test edin. Daha sonra olması durumunda, donma sırasında sıvı fazının genişlemesi nedeniyle test tüpünün kırılmasını önlemek için tüp sürekli olarak döndürülmelidir.
- Elde edilen delipidated protein örneklerini bir liyofilzer kullanarak kurutun. Kurutulmuş protein, kapalı bir kapta birkaç ay boyunca 4 °C'de saklanabilir.
4. Apo ve kargo yüklü Bla g 1'in yeniden uzlaştırılması
- Beklenen Bla g 1 verimini belirleyin.
- 5 mL yeniden katlama tamponunda (50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, %2 DMSO) lizofilize, delipidated (HPLC sonrası) test aliquot'u yeniden dürttü.
- Karışımı bir su banyosunda (250 mL su ile 500 mL beher) ısıtın ve çubuğu sıcak bir plaka üzerinde karıştırın) 95 °C'ye ısıtın. Vortex çözeltileri aralıklı olarak ve 95 °C'de 0,5-1 saat kuluçkaya yaslanın.
- Isıyı çıkarın ve su banyosunun oda sıcaklığına (~1 saat) eşdeğer olmasını yavaşça bırakın. Tavlanmış protein, gerekirse bu formda bir gecede 4 °C'de saklanabilir.
- Tavlanmış Bla g 1 lipid karışımını partikül maddeyi çıkarmak için 0,22 μM şırınna filtresinden geçirin.
- Tampon, filtrelenmiş proteini 3x PBS pH 7.4'e, artık serbest yağ asitlerini ve organik çözücüyü çıkarmak için 3.1'de tartışıldığı gibi 10 kDa kesmeli bir santrifüj filtre kullanarak değiştirin.
- BCA test veya UV absorbansı gibi tercih edilen diğer yöntemleri kullanarak protein konsantrasyonu değerlendirin. Kalan Bla g 1 aliquots için beklenen verimi belirlemek için bunu kullanın.
- Yeniden inşa Apo- veya kargo yüklü Bla g 1
- 4.1.1'de açıklandığı gibi yeniden katlama tamponunda Bla g 1 aliquots'u yeniden dürt.
- Apo-Bla g 1 üretmek için, istenen verimi elde etmek için 4.1.2–4.1.6 adımlarını tekrarlayın.
- Bla g 1'i yağ asitleri ile yüklemek için metanol veya DMSO'da istenen yağ asidi kargosunun 20 mM stok solüsyonunu hazırlayın. Ardından, 4.2.5 adımına geçin.
- Bla g 1'i fosfolipidlerle yüklemek için, bir cam test tüpünün içindeki kloroformda istenen kargonun 10 mg / mL stokunu hazırlayın.
- Bir lipid filmi üretmek için kloroformu buharlaştır. 20 mM'lik son fosfolipid konsantrasyonu üretmek için test tüpüne PBS ekleyin.
DİkKAT: Kloroform solunduğunda veya yutulduğunda zararlıdır. Kimyasal duman kaputunda kullanın veya yetersiz havalandırma varsa solunum cihazı kullanın. Elleçleme yaparken nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük kullanın. Kullanmadan önce MSDS'ye başvurun. - Lipid filmini lipid kargonun faz geçiş sıcaklığının üzerinde ısıtarak ve çözelti bulanıklanınya kadar girdaplayarak yeniden sulendirin. Bazı kargoları tamamen yeniden sulandırmak ve yeniden sulandırmak için sonication gerekebileceğini unutmayın.
- Sonication gerekiyorsa, test tüpünü banyo sonicator 'a (100 W, 42 kHz) yerleştirin ve kargo yeniden dirilene kadar maksimum güçte sonicate yapın. Alternatif olarak, bir prob sonicator (2.6 olarak açıklanmıştır) % 50 görev döngüsü ile% 10-20 güç kullanılabilir.
DİkKAT: Sonication işitme zarar verebilir yüksek frekanslı ses dalgaları istihdam eder. Gürültü bastırıcı KKD (kulak tıkacı veya susturucu) kullan. Mümkünse, sonicator'u ses sönümleme kabininin veya haznenin içine yerleştirin.
- Bir lipid filmi üretmek için kloroformu buharlaştır. 20 mM'lik son fosfolipid konsantrasyonu üretmek için test tüpüne PBS ekleyin.
- 4.1'de belirlenen beklenen verime göre Bla g 1'e göre 20x molar fazla ligand üretmek için istenen yağ asidini veya fosfolipid kargoyu ekleyin. Bu adımda eklenen toplam organik çözücü hacmi% 2'yi geçmemelidir. Karıştırmak için girdap.
NOT: Bl 21 DE3 hücrelerinin 1 L'si tipik olarak tüp başına ~400 μM ligand'a karşılık gelen ~0.25–0.4 nmol protein verir. - Proteini 4.1'de açıklandığı gibi tavla.
5. 31P-NMR ile fosfolipid kargo kaldırma / yüklemenin onaylanması
- Apo veya kargo yüklü Bla g 1 ila >100 μM'lik konsantre numuneleri, 3,1'de açıklandığı gibi bir santrifüj filtre ünitesi kullanarak.
- PBS tamponunda fosfolipid'i 2, 1,5, 1, 0,5 ve 0,25 mM'lik son konsantrasyonlara yeniden sulayın.
- Örnekleri 1:1 cholate tamponu (100 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, %10 w/v cholate) ile toplam ~600 μL hacme seyreltin.
NOT: Bla g 1 hidrofobik boşluktan lipitleri tamamen çıkarmak ve çözünürlükize etmek için bu adımda cholate kullanılır. Bu, fosfolipid kafa gruplarını çevreleyen kimyasal ortamın farklı numuneler arasında tutarlı olmasını sağlayarak 31P-NMR kullanarak nicel değerlendirmesine olanak sağlar. Kollat kullanımı daha önce açıklandığı gibi kloroform / metanol içindeğiştirilebilir 15. - Kolitle çözünen Bla g 1 örneklerinin 1D 31P-NMR spektrumunu alın ve geniş bant probu kullanarak fosfolipid standartlarına başvurun.
NOT: Bu çalışmada sunulan 31P-NMR spektrumları 600 MHz spektrometre kullanılarak elde edilmiştir. Bununla birlikte, benzer tekniklerin kullanılarak yapılan önceki çalışmalar, 150-200 MHz15gibi düşük alanlarda kabul edilebilir hassasiyet elde edilebileceğini göstermektedir. - Elde ettiği verileri uygun yazılım kullanarak işleyin16.
- Tercih edilen NMR görüntüleme yazılımını kullanarak en yüksek yoğunlukları elde edin17.
- Bla g 1 31P-NMR spektrumunu fosfolipid referans örnekleri için elde edilenlerle karşılaştırın, uçojen olarak bağlı ligandların çıkarılmasını ve/veya görünür zirvelerin kimyasal kaymalarına (veya eksikliğine) dayanarak istenen ligandların bağlanmasını onaylayın.
- Bla g 1 spektrumunun en yüksek yoğunluğunu fosfolipid referans standartlarınınkiyle karşılaştırarak tam bağlama stoichiometrisini onaylayın.
6. Bla g 1 katlamayı onaylama
- CD tamponunda 0,5 μM Bla g 1 numunesi hazırlayın (100 mM KH2PO4,tampon pH 7,5). Numunenin 2 mL'sini manyetik karıştırma çubuğuna sahip 10 mm'lik bir CD cuvette'e yükleyin.
- İkincil yapının yeniden yapılanmasını onaylamak için Bla g 1'in CD spektrumunun ölçüldü. Photomultiplier (PMT) voltajın üretici önerilerini (genellikle 1 kV) aşmamasını sağlayın.
- 25 °C'de 260-200 nm'den CD sinyalini 0,2 nm veri aralığı ve 1 s veri tümleştirme süresiyle 20 nm/s tarama hızıyla ölçün.
- CD hücresindeki sıcaklığı 0,5 °C/dk hızında 25 °C–95 °C'den artırın. Sıcaklığın numune boyunca düzgün olduğundan emin olmak için manyetik karıştırma çubuğunu etkinleştirin.
- CD'yi 222 nm'de izleyin, her 2 °C'de bir okuma alın.
- Elde eden verileri, erime sıcaklığını belirlemek için 2 durumlu bir Boltzman eğrisine sığdırın. Bla g 1'in yüksek stabilitesi nedeniyle, erime sıcaklığı (MT25),proteinin ilk CD'sinin% 25'ini 222 nm'de kaybettiği sıcaklık olarak tanımlandı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Benzeşim kromatografisi kullanılarak, rekombinant GST-Bla g 1, hücre kültüründe~2-4mg/L verim üreten yüksek saflık seviyesine ( Şekil 1A) kolayca izole edildi. 4 °C'de TEV proteaz ile gecelik inkübasyon, GST etiketini çıkarmak için yeterlidir ve nihai ürünü ~24 kDa'da verir. Bu durumda, akış ve yıkama fraksiyonlarında önemli miktarda GST-Bla g 1 olduğunu ve glutatyon reçine bağlama kapasitesinin aşıldığını unutmayın. Daha fazla reçine veya birden fazla numune yükleme ve elution döngüsü kullanımı bu sorun için çare sağlayabilir.
Bla g 1'i ters fazlı bir C18 sütununa uygulamak, ~%50 tampon B'de iki büyük tepe noktası olan ayırt edici bir elution profili (Şekil 1B)verir ve elde edilen kesirlerin ~% 75 tampon B. SDS-PAGE analizi, ilkinin bölünmüş GST etiketine karşılık geldiğini, ikincisinin bla g 1'e karşılık geldiğini göstermektedir. Bazen ortada artık, bölünmemiş GST-Bla g 1'e karşılık gelen üçüncü, daha küçük bir tepe oluşur. Bölünmemiş bu ürünün varlığı, dekolte reaksiyonunda kullanılan TEV miktarının artırılması veya kuluçka süresinin uzatılması ile ortadan kaldırılabilir. Eksik bölünme verimi düşürürken, C18 sütununda elde edilen ayırma, nihai Bla g 1 ürününün saflığının ödünsüz kalmasını sağlamak için yeterlidir. Ters fazlı HPLC'nin bir sonucu, nihai protein ürününün organik bir çözücü ortama elde edilmiş olmasıdır. Bu, hidrofobik ligandların çıkarılmasını kolaylaştırırken, bu çözücünün liyofilizasyon yoluyla çıkarılması gerekir ve kabarık beyaz bir toz elde edilir (Şekil 1C).
Proteinin tavlanması, yerli Bla g 1 katını yeniden inşa etmek için gereklidir ve bir lipid kargosunun yokluğunda veya varlığında gerçekleştirilebilir. DMSO'nun yeniden katlama tamponu öncesinde kurutulmuş Bla g 1 ve fosfolipid kargolara eklenmesi, çözünürleştirme işlemini kolaylaştırır, ancak bazı uzun zincir lipit kargoları yüksek sıcaklıklarda bile tam olarak çözülmez. Ancak bunun çalışmalarımızda test edilen lipitler arasındaki yükleme etkinliğini etkilediği gözlenmedi(Şekil 1C). Benzer şekilde, aşırı lipitler genellikle çözeltiden çökelecek veya soğutma üzerine büyük veziklinler oluşturacak ve tavlamadan sonra bulutlu bir görünüme neden olacaktır (Şekil 1C). Bunun yükleme verimliliğini etkilediği de gözlenmedi ve net, şeffaf bir çözüm elde etmek için filtrasyon ve sonraki arabellek değişim adımları aracılığıyla herhangi bir agrega kolayca çıkarılır. Zorlu koşullara rağmen Bla g 1 için termoliz gözlenmedi.
Şekil 1: Bla g 1'in ilk saflaştırılması. (A) İlk liziz (S) sonrasında çözünür protein fraksiyonunu gösteren SDS-PAGE; akış (FT), yıkama (W) ve glutatyon-sepharose kolonundan (E) elüsyon; ve GST etiketinin (TEV) TEV bölünmesini takiben son Bla g 1 ürünü. TEV bölünmesini takiben ortaya çıkan Bla g 1 ürününün HPLC elution profili (B) içinde gösterilmiştir. 280 mavi, elution gradyanı (% Tampon B) yeşil renkte gösterilir. Bölünen GST etiketine (H1, H2), artık bölünmemiş GST-Bla g 1 'e (H3) ve saflaştırılmış Bla g 1'e (H4) karşılık gelen kesirler sırasıyla ~%50, ~%65 ve ~%74 Tampon B'de kırmızı oklarla gösterilir. H1- H4 fraksiyonlarının SDS-PAGE analizi (A) olarak gösterilir ve buna göre etiketlenir. (C) Tavlama işleminin çeşitli aşamalarında Bla g 1'i gösteren temsili görüntüler. ii ve III'te gösterildiği gibi çökelti oluşumunun kesin ve kapsamının kullanılan lipit kargonun türüne bağlı olduğunu unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
31 Bu şekilde saflaştırılmış Apo-Bla g 1'in P-NMR spektrumu, NMR ( Şekil2A) veya ince tabaka kromografyası (veri gösterilmez) ile tespit edilebilir fosfolipid göstermez. Bunun aksine, distearoylphosphatidylcholine (DSPC) fosfolipid yüklü Bla g 1 için elde edilen benzer spektrumlar fosfatidikolin kafa grubuna karşılık gelen güçlü bir tepe göstermektedir. Karşılaştırma için, burada açıklanan lipit çıkarma / tavlama protokolü kullanılmadan rekombinant E. coli'den arındırılmış bla g 1'in temsili 31P-NMR spektrumu (ecBla g 1), rekombinant ifade sisteminden çıkarılan endojen lipitlerin heterojen bir karışımını göstermektedir (Şekil 2B). NMR'nin nicel yapısından yararlanarak, bilinen DSPC konsantrasyonlarının referans örnekleri kullanılarak standart bir eğri üretilebilir (Şekil 2C). DSPC-Bla g 1'den elde edilen 31P sinyal yoğunluğunun bu standart eğriyle karşılaştırılması, protein başına 4,7 ± 0,5 lipit bağlayıcı bir stoichiometry verir; siliko çalışmalarında ve yapısal analizlerde elde edilen öngörülen tam bağlayıcı stoichiometry ile olumlu bir şekilde karşılaştıran bir değer9. Bu tekniğin sadece fosfolipidler, lizosfolipidler, lipopolisakkaritler vb. Ancak, bu protokol 13C-NMR analizi için kolayca uyarlanabilir. Bu durumda, uygun NMR gevşeme özellikleri nedeniyle metil-13C etiketli yağ asitleri önerilecektir. İzotopik etiketlemenin tek bir siteyle sınırlandırılması, yalnızca tek bir tepe beklendiği için spektral yorumlamayı kolaylaştırırken, aynı zamanda tek tip 13C etiketli muadillerine göre maliyeti azaltır. Alternatif bir yaklaşım, hamamböceği frass (nBla g 1)9'danizole edilmiş Bla g 1'in doğal kargosu olarak yağ asitlerinin bir karışımını tanımlayan önceki bir çalışmada gösterildiği gibi, bağlı ligandları tanımlamak için kütle spektrometresi istihdam etmek olacaktır. Bununla birlikte, kütle spektrometresinin sınırlı miktar yetenekleri, yeterli standart olmadan bağlama stoichiometry'nin doğru bir şekilde ölçülmesini önledi.
Şekil 2: Lipid çıkarılmasının ve yüklenmesinin doğrulanması Bla g 1. (A) Apo-(siyah) veya DSPC yüklü Bla g 1 (kırmızı) 31P-NMR spektrumları, bu çalışmada açıklanan tavlama protokolü kullanılarak hazırlandı ve ilkinde lipitlerin tamamen çıkarılmasını ve ikincisinde elde edilen fosfatidylcholine (PC) lipitlerinin homojen yüklenmesini gösterdi. Buna karşılık, Bla g 1 lipid sıyırma ve tavlama olmadan rekombinant E. coli'den arındırıldı (ecBla g 1), bu yöntem (B)kullanılarak analiz edildiğinde endojen fosfatidilentolamin (PE) ve fosfatidilolizol (PG) lipitlerinin heterojen bir karışımını gösterir. Bilinen konsantrasyonların DSPC referans örneklerinden elde edilen temsili standart eğri, Bla g 1 bağlama stoichiometrisinin elde edilebildiği (C)olarak gösterilmiştir. Foo ve ark. (2019) tarafından uyarlanan ve Creative Commons CC BY License9altında sunulan rakamlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Bla g 1'in kristal yapıları, 12 amfipatik alfa-helikes'den oluşan benzersiz bir kıvrım ortaya koymaktadır. Dairesel dikroizm, bu kıvrımın tavlama işleminden sonra başarıyla yeniden inşa edilip edilmediğini değerlendirmek için hızlı ve kullanışlı bir yöntemi temsil eder. Apo ve lipid (nMix) yüklü Bla g 1 için CD spektrumu, ağırlıklı olarak alfa-sarmal bir yapının göstergesi olan minima ~220 ve 210 nm gösterir (Şekil 3A). Bu spektrum, ecBla g 1 ve nBla g 1 için elde edilene son derece benzer ve Bla g 1'in yerel yapısının başarıyla kurtarıldığına dair daha fazla kanıt sağlar. Bu, 19F ve 1 H- 15Nçözümü-NMR kullanılarak daha da doğrulandı, tam bir tartışma başka bir yerdemevcut 9. CD tabanlı termal denatürasyon tahlilleri, katlanmış bir küresel etki alanını gösteren alfa-sarmal ikincil yapının kooperatifsel kaybını göstermektedir (Şekil 3B). Elde eden erime sıcaklıklarının analizi (Şekil 3C) nMix ligand bağlama üzerinde önemli bir artış göstermektedir. Bu yüksek termostabiliyet, Bla g 1'in doğal durumunu tamamen yeniden üretebildiğimizi gösteren nBla g 1 için hesaplananla uyumludur. ECBla g 1'in de benzer bir, termostabiliyette daha fazla gelişme göstermediğini, artık endojen olarak bağlanmış lipitlerin geleneksel FPLC tabanlı yaklaşımlar kullanılarak saflaştırılmış alerjenlerin biyofiziksel karakterizasyonuna müdahale etme potansiyelini gösterdiğini unutmayın. Buna karşılık, Bla g 1 gibi alerjenlerden hidrofobik yükleri nicel olarak çıkarma ve yeniden yükleme yeteneği, lipitlerin alerjik yanıttaki rolünü incelemek için benzersiz bir yol sağlar. Burada, lipit yüklerinin alerjenik proteinlerin yapısı, stabilitesi ve endosomal işlenmesi üzerindeki etkisini incelemek için bir yöntem açıklıyoruz, ancak diğer çalışma yolları düşünülebilir.
Şekil 3: Bla g 1 fold'un başarılı bir şekilde kurtarılmasını onaylamak. (A)Apo- (siyah) veya nMix yüklü (kırmızı) Bla g 1 CD spektrumları, burada açıklanan protokol kullanılarak saflaştırılmış ve tavlanmış, minima ~220 ve 210 nm'de mevcut X-ışını kristal yapısıyla tutarlı ağırlıklı olarak alfa-sarmal bir yapının göstergesidir. Hem Apo hem de nMix yüklü Bla g 1 spektrumu, rekombinant E. coli'den (ecBla g 1, yeşil) veya lipid çıkarma ve tavlama protokolü olmadan doğal alerjenik kaynağından (nBla g 1, mavi) arındırılan Bla g 1 için elde edilenle son derece benzerdir ve eskisinde yerel yapının başarılı bir şekilde kurtarılmasını daha da destekler. (B) Apo için temsili termal profiller- (siyah) ve nMix yüklü (kırmızı) Bla g 1 bir sigmoidal eğri gösterge kooperatifi açma gösteren. Referans olarak nBla g 1 (mavi) ve ecBla g 1 (yeşil) gösterilir. Bla g 1'in hesaplanan erime sıcaklıkları (MT25)(C) olarak gösterilmiştir. nMix ligandlarının (kırmızı) bağlanması, Apo-Bla g 1'e (siyah) göre termostabilde önemli bir artış sağlar. Bu, nBla g 1 (mavi) için gözlenen eğilimi yansıtır ve yerel durumu başarıyla kurtarabildiğimizi gösterir. ecBla g 1 için gözlenen daha da fazla stabilite, endojen olarak bağlanmış lipitlerin alerjenlerin biyofiziksel karakterizasyonuna müdahale etme potansiyelini vurgulamaktadır. C'de sunulan MT25 değerleri, en az üç bağımsız denemeden elde edilen ortalama değeri temsil eder. Hata çubukları karşılık gelen standart sapma değerlerini temsil eder. Foo ve ark. (2019) tarafından uyarlanan ve Creative Commons CC BY License9altında sunulan rakamlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada açıklanan protokol, Bla g 1'in lipit bağlama özelliklerini sistematik olarak incelemek için başarıyla uygulanmıştır. Bu, kargo bağlama, termostabiliyet ve endosomal işleme arasında bir korelasyon ortaya koydu, ikincisi bilinen bir T hücre epitopunun neslindeki azalma ile immünojeniklik için potansiyel etkileri ile ilişkiliydi9,18. Bla g 1'e ek olarak, Pru p 3 ve Bet v 1 gibi diğer alerjenlerin, standart benzeşim ve boyut dışlama kromatografi yöntemleri 13 , 19 , 20,21,22kullanılarak saflaştırıldığında endojen olarak bağlı yüklerini korudukları gösterilmiştir. Bu istenmeyen konuklar, bu proteinlerin biyofiziksel ve immünolojik özelliklerini benzer şekilde değiştirebilir ve burada sunulan gibi tam bir delipidasyon sağlamak için tekniklere olan ihtiyacı vurgulayabilir.
Alerjenlerin saflaştırılmasında ters faz HPLC kullanımı daha önce tanımlanmış olsa da2, termal tavlama protokolü ile birleştirilmesi, alerjenleri bir dizi doğal ve doğal olmayan ligand ile yeniden oluşturmak için oldukça sıradışı bir fırsat sağlar ve kullanıcıların lipid-alerjen etkileşimlerini araştırmalarını sağlar. Bu termal denatürasyon adımının iki ana amaç için gerekli olduğu bulunmuştur. İlk olarak, hidrofobik doğası nedeniyle genellikle sulu çözücü9,22'denuzağa gömülen bağlayıcı boşluklarına ligand erişimini kolaylaştırmak için termal denatürasyon gereklidir. İkincisi, yağ asitleri ve fosfolipidler gibi hidrofobik ligandlar genellikle sulu bir ortama yerleştirildiğinde miseller veya veziküller gibi daha büyük supramoleküler yapılar oluştururlar. Protein bağlama için mevcut monomerik veya "serbest" ligandların konsantrasyonu, kritik misel konsantrasyonu (CMC) kullanılarak yaklaşık olarak kullanılabilir. DSPC ve diğer uzun zincirli fosfolipidler nM aralığında CMC değerlerine sahiptir, bu da Bla g 1 bağlaması için neredeyse hiç ücretsiz ligand bulunmadığını gösterir. Kısa zincir lipitler ve yağ asitleri bile CMC'lere düşük μm ila mM aralığında sahiptir, bu da bu ligandların büyük bir kısmının miseller veya bilayer faz23'tekaldığını gösterir. Bununla birlikte, denatürasyon protokolümüzde kullanılan yüksek sıcaklıklar bu daha büyük agregaları dağıtarak bağlamayı kolaylaştırır. Önceki çalışmalar genellikle bu süreci kolaylaştırmak için uzun süreli kuluçka süreleri iştir. Bununla birlikte, termal bir denatürasyon / tavlama işleminin olmaması, yüklemenin etkinliğine ilişkin şüpheleri artırmaktadır. Örneğin, akar alerjeni Der p 5'i floresan yağ asidi analogu 11-(Dansylamino)undecanoic acid (DAUDA) ile inkübe etmek, Bla g 124ile eşit olarak büyük bir hidrofobik boşluğa sahip olsa da 0.66'lık bağlayıcı bir stoichiometry verdi. Aynı şekilde, bitki nsLTP'lerinin bağlayıcı özgüllüğünün ve stoichiometry'nin, sulu tampon eklenmeden önce lipitlerin ve proteinin metanolde ilk kez çözünülüp çözünmediğine bağlı olarak büyük ölçüde değiştiği bulunmuştur, bu da ligand ve / veya bağlama bölgesi erişilebilirliğinin sınırlayıcı bir faktör olduğunu göstermektedir25.
Bla g 1'e ek olarak, aynı stratejiyi hamamböceği ve sivrisinekten(A. aegypti)ve Der p 2'den (veriler gösterilmeyen veriler) diğer birkaç MA alan proteinine başarıyla uyguladık. Hem Bla g 1 homologues hem de Der p 2'nin C18 sütunundan Bla g 1'den farklı bir zamanda elde edildiğini kaydettik (adım 3.3). Bu adımdaki elüsyon gradyanlarının diğer proteinler için optimize edilmesi gerekebilir. Alternatif olarak, daha az hidrofobik sabit fazlı HPLC sütunları (örneğin, C8) kullanılabilir, ancak Bla g 1 durumunda C18 sütununun artan hidrofobikliği, ecBla g 1'den diasikl fosfolipid kirleticileri tamamen çıkarmak için gerekliydi. Biyofiziksel ve biyokimyasal özelliklerdeki farklılıklara rağmen, bu protokolün son derece sağlam olduğunu ve diğer alerjenik proteinlere kolayca uygulanabileceğini gördük. Kullanılan zorlu koşullar potansiyel bir sınırlama sunsa da, birçok alerjen için gözlenen artan esneklik etkisini azaltır26,27. Gerçekten de, Der p 2, Ber e 1, Ara a 6 ve Lep w 1 gibi çeşitli gıda ve inhalasyon alerjenlerinin termal denatürasyondan sonra yapılarını ve immünojenitelerini geri kazantığı gözlenmiştir, ancak tampon koşullarının optimizasyonugerekebilir 28,29,30,31,32,33; örneğin, nsLTP'nin (Cor a 8) ve thaumatins'in (Mal d 2 ve Act d 2) ters çevrilebilir denatürasyonu yalnızca asidik (pH <4)28,30,31koşullarında gözlenir. Ek olarak, yazarların tavlama protokolünde kullanılan zamanlamayı veya sıcaklıkları optimize etmeye çalışmadığı belirtilmelidir. Ligand çözünürlüğü ve protein katlanması / açılma, 82 °C29'daters çevrilebilir denatürasyon elde edilen Ber e 1 ile görüldüğü gibi daha düşük bir maksimum sıcaklık kullanılarak elde edilebilir. Bu tür önlemlerin kullanımının, bu protokolün uygulanabileceği alerjenlerin kapsamını genişletmesi beklenebilir.
Bu protokolü diğer alerjen sistemlere uyarlarken bir diğer önemli husus, tavlama işlemi sırasında gerekli ligandların konsantrasyonudur. Bla g 1 durumunda beklenen verim 1 L hücre kültürü başına ~0.25–0.4 μmol proteindir. Alerjen başına 8 yağ asidi veya 4 diacyl zincir lipitinin ortaya konan bağlayıcı stoichiometry'si göz önüne alındığında, 20-40 kat azı dişi yük fazlalığı (5-10 μmol) kullanıldı. Bla g 1 ve homologlarının lipid bağlama yeteneğinin benzersiz olduğu belirtilmelidir; örneğin, nsLTP'ler genellikle en fazla iki lipid ligand25 bağlamak için kabul edilirken, lipocalinler 1 stoichiometry34'tenazdır. Bu nedenle, bu tür alerjenlerin tam yüklenmesi daha küçük bir ligand fazlalığı ile gerçekleştirilebilir. Bu protokolü diğer alerjen sistemlere uyarlarken son bir husus, denatüre edilmeden önce düzgün oluşturulmamışsa sorunlu olabilecek disülfid bağların varlığıdır. Olası bir yaklaşım, tavlama işlemini 2 mM DTT gibi bir azaltıcı ajanın varlığında gerçekleştirmek olacaktır. Yerli disülfid bağları daha sonra Aalberse ve ark.35tarafından incelenen fıstık alerjen parçası için açıklandığı gibi azaltılmış ve oksitlenmiş glutatyon ilavesi ile yeniden oluşturulabilir. Bu durumda, doğru disülfid yapıştırma geri kazanımı ampirik olarak kütle spektrometresi35ile değerlendirilmelidir.
Bu çalışmada alerjenlerin çeşitli fosfolipid ve yağ asidi kargoları ile delipided ve yeniden tavlanabileceği bir teknik açıklıyoruz. Bununla birlikte, yaygın alerjen rezervuarlarında bulunan potansiyel olarak immünojenik veya adjuventising ligandlarının başka birçok sınıfı vardır. Örneğin, kedi, köpek ve akar alerjenlerinin lipopolisakkaritleri (LPS) ve diğer bakteriyel lipitleri ev tozundan bağlaması önerilmiştir36, Bet v 1'in polen matrisinden karmaşık flavonoidleri çıkardığı gösterilmiştir13. Bu çalışmada açıklanan protokol, bu lipitlerin rolünü daha ayrıntılı bir şekilde keşfetmek için kolayca uyarlanabilir. Bir kavram kanıtı olarak, Bla g 1'in hidrofobik boşluğunun lipoteikoik asidi (LTA) gram pozitif bakterilerin hücre duvarlarından bağlayabildiğini gösterebildik, ancak LPS'yi gram negatif türlerden dışlıyor, potansiyel olarak ikinci9'dakidaha fazla sayıda acyl zincirini yansıtıyor . Bunu bir adım daha ileri götürerek, floresan probları ve diğer doğal olmayan yağ asidi analoglarını alerjen proteinlerine dahil etmek için termal denatürasyon / tavlama protokolünü kullanabilir. Gerçekten de, Bla g 1'in sivrisinek homologunun hidrofobik boşluğunu DAUDA ile yükleyebildik, lipid ligandlarının alerjenik hastalık üzerindeki etkilerini incelemek için ek yollar açtık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Dr. Tom Kirby, Scott Gabel ve Dr. Robert London'a bu çalışma boyunca yardımları ve yardımları için, Dr. Bob Petrovich ve Lori Edwards'a enstrümantasyonlarını kullandıkları ve bu çalışmada kullanılan Bla g 1 yapılarının oluşturulmasındaki yardımları için teşekkür ederiz. Kitle spektrometresi konusunda yardım için Andrea Adams'a ve NMR enstrümantasyonuna yardım için Dr. Eugene DeRose'a teşekkür ederiz. Bu araştırma NIH, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü, Z01-ES102906 (GAM) Intramural Araştırma Programı tarafından desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü'nün resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
