Summary
פרוטוקול זה מתאר את הסרת השומנים האנדוגניים מאלרגנים, ואת החלפתם בליגדות שצוינו על-ידי המשתמש באמצעות HPLC הפוך בשילוב עם חישול תרמי. 31 P-NMR ו dichroism מעגלי לאפשר אישור מהיר של הסרת ליגנד / טעינה, ואת ההתאוששות של מבנה אלרגנים מקורי.
Abstract
אלרגנים מרכזיים רבים נקשרים למולקולות הידרופוביות דמויי שומנים, כולל Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 ו- Fel d 1. ליגנדים אלה נשמרים בחוזקה ויש להם פוטנציאל להשפיע על תהליך הרגישות או באמצעות גירוי ישיר של המערכת החיסונית או שינוי התכונות הביופיזיות של החלבון האלרגני. על מנת לשלוט על משתנים אלה, טכניקות נדרשות להסרת ליגנדים מאוגדים אנדוגני, ואם יש צורך, החלפה עם שומנים של הרכב ידוע. אלרגן המקק Bla g 1 מוקף חלל הידרופובי גדול אשר קושר תערובת הטרוגנית של שומנים אנדוגני כאשר מטוהרים באמצעות טכניקות מסורתיות. כאן, אנו מתארים שיטה שדרכה שומנים אלה מוסרים באמצעות HPLC פאזה הפוכה ואחריו חישול תרמי להניב Bla g 1 בצורת Apo שלה או נטען מחדש עם תערובת מוגדרת על ידי המשתמש של חומצות שומן או מטענים פוספוליפידים. צימוד פרוטוקול זה עם מבחנים ביוכימיים מגלה כי מטעני חומצות שומן משנים באופן משמעותי את התרמו היציבות וההתנגדות הפרוטאוליטית של Bla g 1, עם השלכות במורד הזרם על קצב ייצור האפיטופים של תאי T ואלרגניות. תוצאות אלה מדגישות את החשיבות של הסרת השומנים / טעינה מחדש פרוטוקולים כגון זה המתואר בזאת בעת לימוד אלרגנים ממקורות רקומביננטיים וטבעיים כאחד. הפרוטוקול ניתן להכללה למשפחות אלרגנים אחרות כולל ליפוקלינים (Mus m 1), PR-10 (בית v 1), MD-2 (Der p 2) ו Uteroglobin (פל ד 1), מתן כלי רב ערך כדי ללמוד את התפקיד של שומנים בתגובה אלרגית.
Introduction
סקר של מסד הנתונים אלרגנים מגלה כי אלרגנים נמצאים רק 2% של כל משפחות החלבון הידוע, מציע תכונות תפקודיות וביופיזיות נפוצות לתרום אלרגניות1. מבין מאפיינים אלה, נראה כי היכולת לקשור מטעני שומנים מיוצגת יתר על המיד בקרב אלרגנים, דבר המצביע על כך שמטענים אלה עשויים להשפיע על תהליך הרגישות1. אכן, הוכח כי ברזיל אגוז אלרגן Ber e 1 דורש שיתוף ממשל עם השומנים אנדוגני שלה כדי לממש את מלוא פוטנציאל הרגישות שלה2. שומנים אלה עלולים לעורר את המערכת החיסונית ישירות כפי שמודגם על ידי אלרגנים קרדית Der p 2 ו Der p 7, שניהם חולקים הומולוגיה מבנית חזקה עם חלבונים מחייבי LPS3,4,5. בהתבסס על תצפית זו הוצע כי Derp 2 ו Der p 7 יכול לקשור שומנים חיידקיים ישירות לעורר את המערכת החיסונית המארחת באמצעות איתות TLR4 בתיווך, להקל על תהליך הרגישות5,6. זה גם אפשרי כי שומנים מאוגדים אנדוגני יכול לשנות את המאפיינים הביופיזיים של חלבונים אלרגניים עצמם. לדוגמה, היכולת של חטא 2 (חרדל) ו Ara h 1 (בוטנים) לקיים אינטראקציה עם פוספוליפידים vesicles שיפרה באופן משמעותי את עמידותם השפלה קיבה אנדוסומלית7, בעוד קשירה ליגנד אלרגן אבקה ליבנה הגדול ב ' v 1 שינה הן את קצב העיבוד האנדוזומלי ואת המגוון של פפטידים וכתוצאה מכך8. זה רלוונטי במיוחד לאלרגניות בהתחשב במתאם שנצפה בין יציבות, דור האפיטופים של תאי T ואלרגניות לחלבונים כמו Bet v 1 ו- Bla g 1; האחרון שבהם יהיה הנושא של עבודה זו9,10.
Bla g 1 מייצג את החבר הטיפוסי של משפחת החלבון מייג'ור אלרגן (MA), ובעל מבנה ייחודי המורכב מ -12 הליקי אלפא אמפיפתיים המקיפים חלל הידרופובי גדול באופן חריג9,11. מבנה גביש רנטגן זמין של Bla g 1 מראה צפיפות אלקטרונים בתוך חלל זה עולה בקנה אחד עם פוספוליפיד קשור או חומצת שומן ליגנדים; השערה שאושרה על ידי 31P-NMR וספקטרומטריית מסה. מטענים אלה היו הטרוגניים בטבע והרכבם היה תלוי במידה רבה במקור האלרגן, עם פרופילי שומנים שונים שנצפו עבור Bla g 1 רקומביננטי לידי ביטוי E. coli ו P. pastoris. באופן מוזר, Bla g 1 מטוהר ממקור האלרגן הטבעי שלו (frass ג'וק) הכיל בעיקר חומצות שומן בתוך אתר הכריכה שלה, עם תערובת של palmitate, oleate, ו stearate להיות מזוהה כמו ליגנדים "טבעי" שלה9,11. היכולת של Bla g 1 לשמור שומנים וחומצות שומן בעקבות צעדי טיהור מרובים מעכבת את המאמצים לחקור את החלבון בבידוד. לעומת זאת, הוצע כי פלמיאט טבעי, stearate, ו oleate ליגנדים של Bla g 1 (מעתה ואילך המכונה nMix) לשחק תפקיד מפתח הן אלרגניות שלה פונקציה ביולוגית מקורית9. עם זאת, ליגנדים אלה אינם נוכחים Bla g 1 המתקבל ממקורות רקומביננטיים, מה שמקשה להעריך השערה זו. בעיות דומות נצפו עבור אלרגנים מחייבים שומנים אחרים כגון בית v 112,13. כדי להקל על המחקר השיטתי של אינטראקציות השומנים-אלרגן פיתחנו פרוטוקול שבאמצעותו אלרגנים יכולים להיות מופשטים כמותית של השומנים שלהם מאוגדים אנדוגנית ו reconstituted או אפו טופס או טעון עם ליגנדים ספציפיים.
אלרגנים מטוהרים בדרך כלל ממקורותיהם הטבעיים או הרקומביננטיים באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה ו/או כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל. כאן, אנו מציגים שלב טיהור נוסף בצורה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) המעסיקה עמודת C18 הפוכה שממנה האלרגן משופע לממס אורגני בדומה לפרוטוקולים שפותחו עבור חלבונים מחייבים חומצות שומן14. החלבון המתקבל נתון לאחר מכן לשלב חישול תרמי בהיעדר או נוכחות של חומצות שומן ו/או פוספוליפידים. בנוסף לשחזור Bla g הילידי 1 לקפל, הטמפרטורות גבוהות להגדיל את המסיסות והנגישות של מטעני השומנים, מניב Bla g 1 בצורה Apo או טעון באופן אחיד עם ligand הידרופובי הרצוי. 31 ספקטרום P-NMR של Bla g 1 מטוהר באופן זה אישר את ההסרה המלאה של ליגנדים מאוגדים אנדוגני והחלפה אחידה עם התרכובות הרצויות, בעוד dichroism מעגלי אישר את ההתאוששות המוצלחת של Bla g 1 לקפל. התועלת של שיטה זו מודגשת בעבודה האחרונה שבה נמצאה כריכת מטען כדי לשפר את התרמו היציבות Bla g 1 והתנגדות פרוטאוליטית, שינוי הקינטיקה של דור האפיטופים של תאי T עם השלכות פוטנציאליות על רגישות ואלרגניות9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בלה g 1 שיבוט
- השג גן עבור אלרגן ג'וק בלה g 1.0101 (שאריות 34-216), המייצג חזרה אחת של תחום MA. למען הפשטות, Bla g 1 ישמש לאורך כל העבודה כדי לייצג את החזרה הבודדת הזו, ולא את כל תעתיק Bla g 1.0101.
- תת-קלף את הגן Bla g 1 לווקטור הרצוי. במחקר זה, הגן המכיל תג גלוטתיון S-transferase N-מסוף (GST) יחד עם וירוס טבק תחריט (TEV) אתר מחשוף פרוטאז הוכנס לתוך וקטור pGEX לביטוי כמתואר קודםלכן 11.
- הפוך את וקטור Bla g 1 pGEX לתאי BL21 DE3 E. coli.
- הכינו מלאי של 10 ng/μL של הווקטור הרצוי.
- שלב 1 μL של 10 ng / μL מלאי DNA עם 50 μL של תאי BL21 DE3 כפי שסופק על ידי היצרן.
- דגירה BL21 DE3-DNA תערובת במשך 30 דקות על קרח. מעבירים לאמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך דקה, ואז מעבירים מיד בחזרה על הקרח לדקה נוספת.
- הוסף 200 μL של מדיה LB לתאים דגירה עבור 1 שעה נוספת ב 37 °C (69 °F).
- צלחת התאים שעברו המרה על לוחות LB-אגר המכילים 100 מ"ג / ליטר אמפצילין ולגדול ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
2. ביטוי ראשוני וטיהור
- לחסן 1 L של מדיה LB המכיל 100 מ"ג / L אמפצילין עם מושבה אחת של תאי DE3 BL21 השתנה עם וקטור Bla g 1 כמתואר ב 1.3. לגדול ב 37 °C (60 °F) לילה.
- ביום המחרת, תאי הקציר (OD600 ~ 1.5) באמצעות צנטריפוגה ב 6,000 x g במשך 10 דקות ו resuspend ב 2 L של 2x YT מדיה המכילה 100 מ"ג / L אמפצילין. אפשר לתאים לגדול במשך שעה נוספת ב- 37 °C (70 °F) ל- OD600 > 0.6.
- לגרום לביטוי חלבון באמצעות תוספת של 0.5 מ"מ IPTG. מעבירים תאים ל-18 מעלות צלזיוס ומדגירה בן לילה.
- למחרת, תאי הקציר כמתואר ב 2.2. גלולת התא וכתוצאה מכך ניתן להקפיא ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
- גלולה resuspend המתקבל 1 L של תרבות ב 50 מ"ל של מאגר תמוגה (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM NaCl) המכיל 1 לוח מעכב פרוטאז (או שווה ערך) ו 1 μL של גרעין בנזונז.
- תאי Lyse המשתמשים בסוניטור בדיקה (500 W, 20 kHz) מוגדרים לעוצמה של 30%-50% למשך 4 דקות עם מחזור עבודה של 50%. שמור את lysate באמבט קרח במהלך sonication
- צנטריפוגה lysate ב 45,000 x g במשך 20 דקות. השלך שבר בלתי מסיס (גלולה).
- הסר 28 μL של חלבון מסיס. שלב עם 7 μL של מאגר 5x SDS-PAGE ואחסן לניתוח SDS-PAGE. חזור על שלב זה עבור שברי הזרימה, הכביסה וההתעלות של עמודת GST לפני ואחרי הדגירה עם TEV.
- החל חלבונים מסיסים (supernatant) על עמודת שף גלוטתיון (~ 10 מ"ל נפח המיטה הכולל) שווה ב PBS pH 7.4.
- יש לשטוף חלבונים לא מאוגדים באמצעות 50 מ"ל של PBS.
- Elute GST-Bla g 1 באמצעות 50 מ"ל של PBS המכיל גלוטתיון מופחת 10 מ"מ.
- דגירה חלבון eluted עם 0.2 kU TEV פרוטאז לילה ב 4 מעלות צלזיוס, או טמפרטורת החדר במשך 6 שעות כדי להסיר תג GST.
3. הסרת שומנים אנדוגניים באמצעות HPLC פאזה הפוכה
- לאסוף את Bla g 1 בקע ולרכז אותו ~ 2 מ"ל באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלי עם <10 kDa משקל מולקולרי מנותק.
- הוסף דגימת <12 מ"ל לחלק העליון של רכז ולהסתובב ב 5,000 x g במשך 10-15 דקות רוטור דלי נדנדה.
הערה: נפח לדוגמה ומהירות הסיבוב ישתנו בהתאם למסנן הספציפי ולסוג הרוטור המועסקים. עיין בתיעוד היצרן לפני השימוש.
- הוסף דגימת <12 מ"ל לחלק העליון של רכז ולהסתובב ב 5,000 x g במשך 10-15 דקות רוטור דלי נדנדה.
- טען את התרכיז למערכת HPLC בגודל 250 x 10 מ"מ המצוידת בעמודת כרומטוגרפיה הפוכה C18 המשוווית עם 97% חיץ A (מים, 0.1% חומצה טריפלואורואציטית) ו- 3% חיץ B (אצטוניטריל, 0.1% חומצה טריפלואורואצטית).
הערה: ניתן להשתמש בעמודות קטנות יותר, אך ייתכן שיהיה צריכה לטעון חלבון ולהעלים אותו באמצעות מחזורים מרובים כדי להתאים לקיבולת האיגוד המופחתת. בעת בחירת עמודה להבטיח כי חרוזי שף יש גודל חלקיקים של < 5 מיקרומטר וגודל נקבוביות של >200 Å כדי לאפשר הפרדה יעילה של מולקולות בגודל חלבון
התראה: חומצה Trifluoroacetic הוא מאכל מאוד ויש לחלק בתוך מכסה המנוע אדים באמצעות PPE המתאים (כלומר, כפפות ניטריל, חלוק מעבדה ומשתפי מגן). Acetonitrile הוא גם רעיל בינוני, נדיף, דליק מאוד, יש להשתמש ולחלק בתוך מכסה המנוע אדים באמצעות PPE המתאים (כלומר, כפפות ניטריל, חלוק מעבדה ומשקוף). - Elute Bla g 1 באמצעות הפרוטוקול המוצג בטבלה 1 בקצב זרימה של 1.5-4.0 מ"ל/דקה. לפקח על תהליך elution באמצעות ספיגת פלואורסצנטיות ב 280 ננומטר.
- לאסוף בריכה Bla g 1 שברים. Bla g 1 בדרך כלל elutes ב >74% מאגר B, או ~ 34-40 דקות.
הערה: זמן Elution ישתנה מעט בהתאם לקצב הזרימה או לגודל העמודה. אסוף שברים בהתבסס על A280 לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
- לאסוף בריכה Bla g 1 שברים. Bla g 1 בדרך כלל elutes ב >74% מאגר B, או ~ 34-40 דקות.
| זמן (מינימום) | מאגר A (%) | מאגר ב' (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
טבלה 1: פרוטוקול Elution עבור בלה g 1. טבלה הממחישה את מעבר הצבע של elution המועסקים בבידוד של Bla g 1 באמצעות עמודת HPLC C18.
- יש לארוז את הדגימה במבחנות זכוכית, ולא למלא מבחנה יותר ממחצית הדרך (כ-4 מ"ל). מכסים צינורות עם סרט פרפין ומחוררים את הכיסוי בשני חורים כדי לאפשר אוורור.
- הכן aliquot נפרד 1 מ"ל (מבחן aliquot). זה ישמש כדי לקבוע את התשואה הצפויה.
- להקפיא את הדגימות ולבדוק aliquot על ידי הצבת אותם במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה, או טבילה בחנקן נוזלי. במקרה של מאוחר יותר, יש לסובב את הצינור ברציפות כדי למנוע שבירה במבחנה עקב הרחבת השלב הנוזלי עם ההקפאה.
- יבש את דגימות החלבון המופרדות וכתוצאה מכך באמצעות ליופילייזר. חלבון מיובש עשוי להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים במיכל אטום.
4. שחזור של אפו- ומטען טעון בלה g 1
- קבע את התשואה הצפויה של Bla g 1.
- resuspend lyophilized, מאולץ (לאחר HPLC) aliquot מבחן ב 5 מ"ל של מאגר refolding, (50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
- מחממים את התערובת באמבט מים (כוס 500 מ"ל עם 250 מ"ל מים ומערבבים בר מעל צלחת חמה) עד 95 מעלות צלזיוס. פתרונות וורטקס לסירוגין ולהדגיר ב 95 °C (69 °F) עבור 0.5-1 שעות.
- הסר חום ולאט לאט תן לאמבט המים להתייצב לטמפרטורת החדר (~ 1 שעות). חלבון Annealed ניתן לאחסן בצורה זו לילה ב 4 מעלות צלזיוס במידת הצורך.
- להעביר annealed Bla g 1-שומנים תערובת דרך מסנן מזרק 0.22 μM כדי להסיר חומר חלקיקי.
- חוצץ להחליף את החלבון מסונן 3x לתוך PBS pH 7.4 באמצעות מסנן צנטריפוגלי עם 10 kDa ניתוק כפי שנדון ב 3.1 כדי להסיר שאריות חומצות שומן חינם ממס אורגני.
- להעריך את ריכוז החלבון באמצעות BCA assay או שיטה מועדפת אחרת כגון ספיגת UV. השתמש באפשרות זו כדי לקבוע את התשואה הצפויה עבור aliquots Bla g 1 הנותרים.
- לשקם אפו- או מטען טעון Bla g 1
- Resuspend Bla g 1 aliquots במאגר refolding כמתואר ב 4.1.1.
- כדי לייצר Apo-Bla g 1, חזור על שלבים 4.1.2–4.1.6 כדי להשיג את התשואה הרצויה.
- כדי לטעון Bla g 1 עם חומצות שומן, להכין 20 mM מלאי פתרונות של מטען חומצת שומן הרצוי מתנול או DMSO. לאחר מכן, דלג לשלב 4.2.5.
- כדי לטעון Bla g 1 עם פוספוליפידים, להכין מלאי 10 מ"ג / מ"ל של המטען הרצוי בכלורופורם בתוך מבחנה זכוכית.
- לאדות את הכלורופורם כדי להפיק סרט שומנים. הוסף PBS למבחנה כדי לייצר ריכוז פוספוליפיד סופי של 20 מ"מ.
התראה: כלורופורם מזיק אם הוא בשאיפה או בלע. יש להשתמש במכסה המנוע הכימי או להשתמש במכונת הנשמה אם יש אוורור לקוי. יש להשתמש בכפפות ניטריל, חלוק מעבדה ומשתפי מגן בעת הטיפול. יש להיוועץ ב- MSDS לפני השימוש. - מחזרים את סרט השומנים על ידי חימום מעל טמפרטורת המעבר הפאזה של מטען השומנים ומערבולת עד שהפתרון הופך מעונן. שים לב כי sonication עשוי להידרש כדי resuspend מלא rehydrate כמה מטענים.
- אם sonication נדרש, למקם את המבחנה sonicator אמבטיה (100 W, 42 kHz) ו sonicate בעוצמה מקסימלית עד המטען הוא resuspended. לחלופין, סוניקטור בדיקה (המתואר ב 2.6) ניתן להשתמש 10-20% כוח עם מחזור חובה 50%.
התראה: Sonication משתמשת בגלי קול בתדר גבוה שעלולים לפגוע בשמיעה. השתמש PPE מדכא רעש (אטמי אוזניים או עמימות). במידת האפשר, הנח sonicator בתוך ארון או תא עמעום קול.
- לאדות את הכלורופורם כדי להפיק סרט שומנים. הוסף PBS למבחנה כדי לייצר ריכוז פוספוליפיד סופי של 20 מ"מ.
- הוסף את חומצת השומן הרצויה או מטען פוספוליפיד לייצר עודף טוחן 20x של ליגנדים יחסית Bla g 1 מבוסס על התשואה הצפויה שנקבעה 4.1. הנפח הכולל של ממס אורגני הוסיף בשלב זה לא יעלה על 2%. וורטקס לערבב.
הערה: 1 L של Bl 21 DE3 תאים בדרך כלל מניב ~ 0.25–0.4 חלבון nmol, המתאים ~ 400 μM ליגנד לכל צינור. - אנאל החלבון כמתואר ב 4.1.
5. אישור הסרת/טעינה של מטען פוספוליפידי באמצעות 31P-NMR
- לרכז דגימות של Apo- או מטען טעון Bla g 1 עד > 100 μM באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלי כמתואר ב 3.1.
- Rehydrate הפניה פוספוליפיד במאגר PBS לריכוזים הסופיים של 2, 1.5, 1, 0.5, ו 0.25 mM.
- לדלל דגימות 1:1 עם מאגר cholate (100 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10% w / v cholate) לנפח כולל של ~ 600 μL.
הערה: Cholate מועסק בשלב זה כדי לחלץ באופן מלא solubilize שומנים מן החלל ההידרופובי Bla g 1. הדבר מבטיח שהסביבה הכימית המקיפה את קבוצות הראש הפוספוליפידיות עקבית בין דגימות שונות, ומאפשרת הערכה כמותית באמצעות P-NMR 31. השימוש cholate ניתן להחליף כלורופורם / מתנול כמתואר בעבר15. - לרכוש ספקטרום 1D 31P-NMR של דגימות Bla g 1 cholate-solubilized וייחוס סטנדרטים פוספוליפידים באמצעות בדיקה בפס רחב.
הערה: ספקטרום P-NMR 31שהוצג בעבודה זו הושגו באמצעות ספקטרומטר 600 מגה-הרץ. עם זאת, מחקרים קודמים המשתמשים בטכניקות דומות מצביעים על כך שניתן להשיג רגישות מקובלת בשדות חוזק נמוך כמו 150-200 MHz15. - לעבד את הנתונים המתקבלים באמצעות תוכנהמתאימה 16.
- השג עוצמות שיא באמצעות תוכנת צפייה מועדפת של NMR17.
- השווה את ספקטרום Bla g 1 31P-NMR לאלה שהושגו עבור דגימות התייחסות פוספוליפיד כדי לאשר הסרת ליגנדים מאוגדים אנדוגני ו / או כריכה של ליגנדים הרצויים בהתבסס על השינויים הכימיים של הפסגות הנראות לעין (או היעדרם).
- אשר stoichiometry מחייב מלא על ידי השוואת עוצמת השיא של ספקטרום Bla g 1 לזה של תקני התייחסות פוספוליפיד.
6. אישור Bla g 1 קיפול
- הכן 0.5 דגימות μM של Bla g 1 במאגר תקליטורים (100 mM KH2PO4, pH חיץ 7.5). טען 2 מ"ל של המדגם לתוך Cuvette תקליטור 10 מ"מ עם מוט ערבוב מגנטי.
- למדוד ספקטרום תקליטורים של Bla g 1 כדי לאשר שחזור של מבנה משני. ודא שמתח Photomultiplier (PMT) אינו חורג מהמלצות היצרן (בדרך כלל 1 kV).
- מדוד אות תקליטור מ- 260-200 ננומטר ב- 25 °C (60 °F) עם גובה נתונים של 0.2 ננומטר וקצב סריקה של 20 ננומטר לשעה עם זמן שילוב נתונים של 1 s.
- הגדל את הטמפרטורה בתא התקליטור מ- 25 °C (79 °F) °C (70 °F) בקצב של 0 °C (70 °F) / דקה. הפעל מוט ערבוב מגנטי כדי להבטיח שהטמפרטורה אחידה על פני המדגם.
- נטר תקליטור במהירות של 222 ננומטר, תוך לקיחת קריאות כל 2 °C (60 °F).
- התאם את הנתונים המתקבלים לעקומת בולצמן דו-מצבית כדי לקבוע את טמפרטורת ההיתוך. בשל היציבות הגבוהה של Bla g 1, טמפרטורת ההיתוך (MT25) הוגדרה כטמפרטורה שבה החלבון איבד 25% מהתקליטור הראשוני שלו ב 222 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה, GST-Bla g 1 רקומביננטי היה מבודד בקלות לרמה גבוהה של טוהר (איור 1A),לייצר תשואה של ~ 2-4 מ"ג / ליטר של תרבות התא. דגירה לילה עם פרוטאז TEV ב 4 מעלות צלזיוס מספיק כדי להסיר את תג GST, מניב את המוצר הסופי ב ~ 24 kDa. שים לב כי במקרה זה יש כמות משמעותית של GST-Bla g 1 בשברים זרימה דרך לשטוף, מה שמרמז על קיבולת מחייבת גלוטתיון. השימוש יותר שף או מחזורים מרובים של טעינה מדגם elution יכול לספק תרופה לבעיה זו.
החלת Bla g 1 על עמודת C18 הפוכה מניבה פרופיל elution ייחודי (איור 1B), עם שתי פסגות גדולות ב ~ 50% מאגר B, ושיא גדול שני ב ~ 75% מאגר B. ניתוח SDS-PAGE של השברים וכתוצאה מכך עולה כי הראשון מתאים תג GST cleaved, בעוד האחרון מתאים Bla g 1. מדי פעם שיא שלישי, קטן יותר יתרחש באמצע המתאים שיורית, לא בקע GST-Bla g 1. נוכחותו של מוצר זה ללא מחשוף ניתן לחסל על ידי הגדלת כמות TEV מועסק בתגובת המחשוף או הארכת זמן הדגירה. בעוד מחשוף לא שלם יקטין את התשואה, ההפרדה המתקבלת בעמודה C18 מספיקה כדי להבטיח שטוהר המוצר הסופי של Bla g 1 יישאר ללא פשרות. תוצאה של HPLC הפוך היא כי מוצר החלבון הסופי הוא eluted לתוך סביבת ממס אורגני. בעוד זה מקל על הסרת כל ליגנדים הידרופובי, הסרת ממס זה באמצעות lyophilization נדרש, מניב אבקה לבנה רכה (איור 1C).
חישול של החלבון נדרש כדי לשקם את Bla g יליד 1 לקפל והוא יכול להתבצע גם בהעדר או נוכחות של מטען השומנים. הוספת DMSO למטעני Bla g 1 ופוספוליפידים מיובשים לפני חיץ הקיפול מחדש מקלה על תהליך ההזנה, אם כי כמה מטעני שומנים ארוכים יותר בשרשרת לא יתמוססו במלואם אפילו בטמפרטורות גבוהות. עם זאת, זה לא נצפתה כדי להשפיע על יעילות הטעינה בקרב השומנים שנבדקו במחקרים שלנו (איור 1C). באופן דומה, שומנים עודפים לעיתים קרובות לזרז מתוך פתרון או ליצור vesicles גדולים על קירור, וכתוצאה מכך מראה מעונן לאחר חישול (איור 1C). זה גם לא נצפתה כדי להשפיע על יעילות הטעינה, וכל אגרגטים מוסרים בקלות באמצעות הסינון ואת שלבי חילופי המאגר הבאים כדי להניב פתרון ברור ושקוף. למרות התנאים הקשים, לא נצפתה תרמוליזה עבור Bla g 1.
איור 1: טיהור ראשוני של בלה g 1. (A)SDS-PAGE המציג את שבר החלבון המסיס בעקבות התמוגה הראשונית (S); זרימה דרך (FT), לשטוף (W), ו elution מעמוד גלוטתיון-sepharose (E); ואת המוצר האחרון Bla g 1 בעקבות מחשוף TEV של תג GST (TEV). פרופיל elution HPLC של המוצר בלה g 1 וכתוצאה מכך בעקבות מחשוף TEV מוצג ב (B). 280 מוצג בכחול, ואילו מעבר הצבע של elution (% Buffer B) מוצג בירוק. שברים המתאימים לתג GST המבקע (H1, H2), שאריות GST-Bla g 1 (H3) ו Bla g מטוהרים 1 (H4) מסומנים עם חצים אדומים ב ~ 50%, ~ 65%, ו ~ 74% מאגר B בהתאמה. ניתוח SDS-PAGE של שברים H1- H4 מוצגים ב- (A) ומסומנים בהתאם. (ג)תמונות מייצגות המציגות את Bla g 1 בשלבים שונים של תהליך חישול. שים לב כי מידה מדויקת של היווצרות משקעים כמתואר ב ii ו- iii תלוי בסוג של מטען השומנים מועסק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
31 ספקטרום P-NMR של אפו-בלה g 1 המטוהר באופן זה אינו מראה פוספוליפידים הניתנים לגילוי על ידי NMR(איור 2A)או כרומוטוגרפיה של שכבה דקה (נתונים שאינם מוצגים). לעומת זאת, ספקטרום דומה המתקבל עבור Bla g 1 טעון עם פוספוליפיד distearoylphosphatidylcholine (DSPC) להראות שיא חזק המתאים לקבוצת הראש פוספטידילכולין. לשם השוואה, ספקטרום מייצג של 31P-NMR של Bla g 1 המטוהר מ- E. coli רקומביננטי ללא שימוש בפרוטוקול הסרת /חישול השומנים המתואר בזאת (ecBla g 1) מראה תערובת הטרוגנית של שומנים אנדוגניים המופקים ממערכת הביטוי הרקומביננטית (איור 2B). תוך ניצול האופי הכמותי של NMR, ניתן לייצר עקומה סטנדרטית באמצעות דגימות ייחוס של ריכוזי DSPC ידועים (איור 2C). השוואת עוצמת אות 31P המתקבל DSPC-Bla g 1 נגד עקומה סטנדרטית זו מניבה stoichiometry מחייב של 4.7 ± 0.5 שומנים לחלבון; ערך המשווה לטובה את stoichiometry מחייב מלא חזוי המתקבל במחקרים silico וניתוח מבני9. שים לב כי טכניקה זו תזהה רק ליגנדים המכילים גרעין P 31כגון פוספוליפידים, ליזופוספוליפידים, ליפופלסכרידים וכו '. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות עבור 13ניתוח C-NMR. במקרה זה, מתיל-13C מסומן חומצות שומן יומלץ בשל תכונות הרפיה NMR חיובי שלה. הגבלת תיוג איזוטופי לאתר יחיד גם מקלה על פרשנות ספקטרלית, שכן רק שיא אחד צפוי, ובו זמנית להפחית את העלות יחסית אחיד 13C-labeled עמיתים. גישה חלופית תהיה להשתמש mass-spec לזהות ליגנדים קשורים, כפי שהוכח במחקר קודם אשר זיהה תערובת של חומצות שומן כמו המטען הטבעי של Bla g 1 מבודד מ frass ג'וק (nBla g 1)9. עם זאת, יכולות הכמות המוגבלות של מפרט המסה מנעו מדידה מדויקת של stoichiometry מחייב ללא סטנדרטים מספיקים.
איור 2: אימות הסרת השומנים וטעינה של Bla g 1. (A) 31P-NMR ספקטרום של אפו - (שחור) או DSPC טעון Bla g 1 (אדום) מוכן באמצעות פרוטוקול חישול המתואר בעבודה זו המדגים את ההסרה המלאה של שומנים לשעבר, ואת הטעינה הומוגנית של שומנים פוספטידילכולין (PC) שהושגו האחרון. לעומת זאת, Bla g 1 מטוהרים מן recombinant E. coli ללא הפשטת שומנים וחישול (ecBla g 1) מראה תערובת הטרוגנית של phosphatidylethanolamine אנדוגני (PE) ושומנים פוספטידילגליצרול (PG) כאשר מנתחים בשיטה זו (B). עקומה סטנדרטית מייצגת המתקבלת מדגימות התייחסות DSPC של ריכוזים ידועים מוצגת ב -( C), שממנה ניתן להשיג את stoichiometry מחייב Bla g 1. נתונים שהותאמו מ- Foo et al. (2019) והוצגו תחת רישיון Creative Commons BY License9. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
מבני קריסטל של Bla g 1 חושפים קיפול ייחודי המורכב מ-12 הליקי אלפא אמפיפתיים. דיכרואיזם מעגלי מייצג שיטה מהירה ונוחה להעריך אם קיפול זה הוקם מחדש בהצלחה לאחר תהליך חישול. ספקטרום תקליטורים עבור Apo- ושומנים (nMix)-טעון Bla g 1 להראות מינימה ~ 220 ו 210 ננומטר המעיד על מבנה אלפא סלילי בעיקר (איור 3A). ספקטרום זה דומה מאוד לזה שהושג עבור ecBla g 1 ו nBla g 1, מתן ראיות נוספות כי המבנה הטבעי של Bla g 1 הוא התאושש בהצלחה. זה אושר עוד באמצעות שימוש של 19F ו 1H-15N פתרון-NMR, דיון מלא אשר זמין במקום אחר9. מבחני denaturation תרמיים מבוססי תקליטור מראים אובדן שיתופי של מבנה משני אלפא-סלילי המעיד על תחום כדורי מקופל (איור 3B). ניתוח הטמפרטורות המתמוססות הנובעות מכך (איור 3C) מראה עלייה משמעותית על כריכת ליגנד nMix. תרמוביות מוגבהת זו עולה בקנה אחד עם זה מחושב עבור nBla g 1, המציין כי אנו מסוגלים לשחזר באופן מלא את המצב הטבעי של Bla g 1. שים לב כי ecBla g 1 גם מראה דומה, אם לא שיפור גדול יותר תרמוביות, הממחיש את הפוטנציאל של שומנים הקשורים אנדוגני שיורית להפריע אפיון ביופיזי של אלרגנים מטוהרים באמצעות גישות מבוססות FPLC מסורתי. לעומת זאת, היכולת להסיר באופן כמותי ולטעון מחדש מטענים הידרופוביים מאלרגנים כגון Bla g 1 מספקת דרך ייחודית לבחון את תפקידם של השומנים בתגובה האלרגית. כאן, אנו מתארים שיטה לבחון את ההשפעה של מטעני השומנים על המבנה, היציבות והעיבוד האנדוזומלי של החלבונים האלרגניים עצמם, אם כי ניתן היה לשקול דרכי מחקר אחרות.
איור 3: אישור התאוששות מוצלחת של הקיפול Bla g 1. (A) ספקטרום תקליטורים של Apo- (שחור) או nMix טעון (אדום) Bla g 1 מטוהרים ו annealed באמצעות הפרוטוקול המתואר בזאת, עם מינימה ב ~ 220 ו 210 ננומטר המעיד על מבנה אלפא סלילי בעיקר עולה בקנה אחד עם מבנה גביש רנטגן זמין. גם Apo- ו nMix טעון Bla g 1 ספקטרום דומים מאוד עם זה שהושג עבור Bla g 1 מטוהרים recombinant E. coli (ecBla g 1, ירוק) או ממקור אלרגני טבעי שלה (nBla g 1, כחול) ללא הסרת השומנים פרוטוקול חישול, עוד יותר תמיכה ההתאוששות המוצלחת של המבנה המקומי לשעבר. (B) פרופילים תרמיים מייצגים עבור Apo- (שחור) ו nMix טעון (אדום) Bla g 1 מראה עקומת sigmoidal אינדיקציה שיתוף פעולה נפרש. nBla g 1 (כחול) ו ecBla g 1 (ירוק) מוצג כהפניה. טמפרטורות ההיתוך המחושבות (MT25)של Bla g 1 מוצגות ב- (C). איגוד הליגות nMix (אדום) מניב עלייה משמעותית בתרמוביות ביחס לאפו-בלה g 1 (שחור). זה משקף את המגמה שנצפתה עבור nBla g 1 (כחול), מה שמרמז כי אנו מסוגלים לשחזר בהצלחה את המצב המקורי. היציבות הגדולה עוד יותר שנצפתה עבור ecBla g 1 מדגישה את הפוטנציאל של שומנים הקשורים אנדוגני להפריע אפיון ביופיזי של אלרגנים. ערכי MT25 המוצגים ב- C מייצגים את הערך הממוצע המתקבל משלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות. קווי שגיאה מייצגים את ערכי סטיית התקן המתאימים. נתונים שהותאמו מ- Foo et al. (2019) והוצגו תחת רישיון Creative Commons BY License9. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול המתואר בעבודה זו יושם בהצלחה כדי לחקור באופן שיטתי את תכונות איגוד השומנים של Bla g 1. זה חשף מתאם בין מחייב מטען, תרמו יציבות, ועיבוד אנדוזומלי, האחרון שבהם היה בקורלציה עם ירידה בדור של אפיטופ T-cell ידוע עם השלכות פוטנציאליות על אימונוגניות9,18. בנוסף Bla g 1, אלרגנים אחרים כגון Pru p 3 ו Bet v 1 הוכחו לשמור על מטענים אנדוגני שלהם מאוגד כאשר מטוהרים באמצעות זיקה סטנדרטית שיטות כרומטוגרפיה הדרה גודל13,19,20,21,22. אורחים לא רצויים אלה יכולים לשנות את המאפיינים הביופיזיים והחימונולוגיים של חלבונים אלה באופן דומה, ולהדגיש את הצורך בטכניקות שיבטיחו דיון מלא כמו זה המוצג כאן.
בעוד שהשימוש ב- HPLC הפוך בטיהור אלרגנים תואר בעבר2, צימודו עם פרוטוקול חישול תרמי מספק את ההזדמנות יוצאת הדופן למדי לשקם אלרגנים עם מגוון ליגנדים טבעיים ולא טבעיים, ומאפשר למשתמשים לחקור אינטראקציות של ליפיד-אלרגן. שלב זה של דנטורציה תרמית נמצא חיוני לשתי מטרות עיקריות. ראשית, דנטורציה תרמית נדרשת כדי להקל על גישה ליגנד חללי מחייב שלהם אשר, בשל האופי ההידרופובי שלהם, קבורים לעתיםקרובותהרחק ממס מימית 9,22. שנית, ליגנדים הידרופוביים כגון חומצות שומן ופוספוליפידים יוצרים לעתים קרובות מבנים על-תאיים גדולים יותר כגון מיקלים או סיליקלים כאשר הם ממוקמים בסביבה מימית. ניתן להעריך את הריכוז של ליגנדים מונומריים, או "חופשיים" הזמינים לכריכת חלבון באמצעות ריכוז המיקל הקריטי (CMC). DSPC ופוספוליפידים ארוכי שרשרת אחרים יש ערכי CMC בטווח nM, המציין כי אין כמעט ליגנדים חינם זמין עבור Bla g 1 מחייב. אפילו שומנים קצרים שרשרת וחומצות שומן יש CMC של בטווח μm נמוך כדי mM, המציין כי חלק גדול של ליגנדים אלה נשארים micellar או bilayer שלב23. עם זאת, הטמפרטורות הגבוהות המועסקים בפרוטוקול denaturation שלנו מפזר אגרגטים גדולים אלה, להקל על מחייב. מחקרים קודמים העסיקו בדרך כלל תקופות דגירה ממושכות כדי להקל על תהליך זה. עם זאת, היעדר תהליך denaturation תרמית / חישול מעלה ספקות ליעילות של טעינה. לדוגמה, דגירה של אלרגן קרדית Der p 5 עם חומצת שומן פלואורסצנטית אנלוגי 11-(Dansylamino)חומצה undecanoic (DAUDA) הניב stoichiometry מחייב של 0.66 למרות בעל חלל הידרופובי גדול שווה עם Bla g 124. כמו כן, הספציפיות מחייבת stoichiometry של nsLTPs הצמח נמצאו להשתנות מאוד בהתאם אם השומנים והחלבון הם solubilized הראשון מתנול לפני תוספת של חיץ מימית, המציין כי נגישות אתר ligand ו / או מחייב היה גורם מגביל25.
בנוסף Bla g 1, יישמנו בהצלחה את אותה אסטרטגיה על כמה חלבונים אחרים MA תחום מקקים ויתושים (A. aegypti), כמו גם Der p 2 (נתונים לא מוצגים). ציינו כי גם Bla g 1 homologues וגם Der p 2 eluted בזמן שונה מאשר Bla g 1 מהעמודה C18 (שלב 3.3). ייתכן שיהיה צורך למטב את מעברי הדרגה בשלב זה לחלבונים אחרים. לחלופין, עמודות HPLC עם שלב נייח הידרופובי פחות (למשל, C8) עשוי להיות מועסק, אם כי במקרה של Bla g 1 הידרופוביות מוגברת של עמודת C18 היה צורך להסיר לחלוטין מזהמים פוספוליפיד diacyl מ ecBla g 1. למרות ההבדלים בתכונות ביופיזיות וביוכימיות, מצאנו פרוטוקול זה להיות חזק מאוד יכול להיות מיושם בקלות על חלבונים אלרגניים אחרים. בעוד התנאים הקשים המועסקים עשויים להציג מגבלה פוטנציאלית, החוסן המוגבר שנצפה עבור אלרגנים רבים מפחית את השפעתו26,27. ואכן, מספר אלרגנים מזון ושאיפת כגון Der p 2, Ber e 1, Ara a 6 ו Lep w 1 נצפו לשחזר את המבנה שלהם אימונוגניות בעקבות denaturation תרמית, אם כי אופטימיזציה של תנאי חיץ עשוי להידרש28,29,30,31,32,33; לדוגמה denaturation הפיך של nsLTP (Cor a 8) ו thaumatins (Mal d 2 ו מעשה ד 2) נצפתה רק בתנאים חומציים (pH <4)תנאים 28,30,31. בנוסף, יש לציין כי המחברים לא ניסו לייעל את העיתוי או הטמפרטורות המועסקים בפרוטוקול חישול. זה אפשרי כי solubilization ligand ו חלבון קיפול / נפרש ניתן להשיג באמצעות טמפרטורה מקסימלית נמוכה יותר כפי שניתן לראות עם Ber e 1 שעבורו denaturation הפיך מושגת ב 82 °C (69 °F29). השימוש באמצעים כאלה צפוי להרחיב את טווח האלרגנים שעליהם ניתן ליישם פרוטוקול זה.
שיקול חשוב נוסף בעת התאמת פרוטוקול זה למערכות אלרגנים אחרות הוא ריכוז הליגנדים הנדרשים במהלך תהליך חישול. במקרה של Bla g 1 התשואה הצפויה היא ~ 0.25–0.4 מיקרומול של חלבון לכל 1 L תרבות התא. בהינתן stoichiometry מחייב הוכיח של 8 חומצות שומן או 4 שומנים שרשרת diacyl לכל אלרגן, עודף טוחנת 20-40 קיפול של מטען (5-10 מיקרומול) הועסק. יש לציין כי יכולת מחייב השומנים של Bla g 1 וההומולוגים שלה היא ייחודית; לדוגמה nsLTP של מקובלים לאגד לכל היותר שני ליגנדים השומנים25 בעוד ליפוקלינים יש פחות מ 1 stoichiometry34. ככזה, טעינה מלאה של סוגים אלה של אלרגנים עשוי להתבצע עם עודף קטן יותר של ליגנדים. שיקול סופי בעת התאמת פרוטוקול זה למערכות אלרגנים אחרות הוא נוכחות של קשרים דיסולפידים, אשר יכול להיות בעייתי אם לא נוצר כראוי לפני denaturing. גישה אפשרית אחת תהיה לבצע את תהליך חישול בנוכחות סוכן צמצום כגון 2 mM DTT. הקשרים הדיסולפידיים המקומיים יכולים להיווצר מחדש לאחר מכן באמצעות תוספת של גלוטתיון מופחת ומחמצן כמתואר עבור שבר אלרגן בוטנים שנחקר על ידי Aalberse et al.35. במקרה זה, התאוששות של מליטה דיסולפידית נכונה צריכה להיות מוערכת באופן אמפירי על ידי ספקטרומטריית מסה35.
בעבודה זו אנו מתארים טכניקה שבאמצעותה ניתן להפרות אלרגנים ולחנות מחדש מטענים שונים של פוספוליפידים וחומצות שומן. עם זאת, ישנם סוגים רבים אחרים של ליגנדים אימונוגניים או adjuventising נוכח בתוך מאגרי אלרגנים נפוצים. לדוגמה, חתול, כלב, ואלרגנים קרדית הוצעו לאגד lipopolysaccharides (LPS) ושומנים חיידקיים אחרים מאבק הבית36, בעוד בית v 1 הוכח לחלץ פלבנואידים מורכבים מטריצת האבקה13. הפרוטוקול המתואר בעבודה זו ניתן להתאים בקלות כדי לחקור את התפקיד של שומנים אלה באופן מפורט יותר. כהוכחת רעיון הצלחנו להוכיח כי החלל ההידרופובי של Bla g 1 מסוגל לקשור חומצה ליפוטיכואית (LTA) מקירות התא של חיידקים חיוביים גרם, אבל לא כולל LPS מן המינים השליליים גרם, פוטנציאל המשקף את המספר הגדול יותר של שרשראות acyl האחרון9. אם ניקח את זה צעד אחד קדימה, אפשר לנצל את פרוטוקול denaturation תרמית / חישול לשלב בדיקות פלואורסצנטיות אחרים אנלוגים חומצות שומן טבעיות לתוך חלבוני אלרגנים. אכן, הצלחנו לטעון את החלל ההידרופובי של הומולוג היתושים של Bla g 1 עם DAUDA, פתיחת אפיקים נוספים כדי לבחון את ההשפעות של ליגנדים השומנים על מחלה אלרגנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר טום קירבי, סקוט גבל וד"ר רוברט לונדון על עזרתם וסיועם לאורך כל העבודה, יחד עם ד"ר בוב פטרוביץ' ולורי אדוארדס על השימוש במכשור שלהם ועל עזרתם ביצירת מבני Bla g 1 המועסקים במחקר זה. אנו מודים לאנדריאה אדמס על הסיוע בספקטרומטריית ההמונים, וד"ר יוג'ין דה-רוז על הסיוע במכשור NMR. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר התוך-רחמי של NIH, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, Z01-ES102906 (GAM). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיו הרשמיות של המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
