Summary
Ce protocole décrit le déplacement des lipides endogènes des allergènes, et leur remplacement par les ligands utilisateur-spécifiés par HPLC de reverse-phase couplé avec le recuit thermique. 31 ans La RMN-P et le dichroïsme circulaire permettent la confirmation rapide de l’élimination/chargement des ligands et la récupération de la structure allergène native.
Abstract
De nombreux allergènes majeurs se lient à des molécules hydrophobes de type lipidique, y compris Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 et Fel d 1. Ces ligands sont fortement retenus et ont le potentiel d’influencer le processus de sensibilisation soit en stimulant directement le système immunitaire, soit en modifiant les propriétés biophysiques de la protéine allergène. Afin de contrôler ces variables, des techniques sont nécessaires pour l’élimination des ligands liés de manière endogène et, si nécessaire, leur remplacement par des lipides de composition connue. L’allergène cafard Bla g 1 renferme une grande cavité hydrophobe qui lie un mélange hétérogène de lipides endogènes lorsqu’il est purifié à l’aide de techniques traditionnelles. Ici, nous décrivons une méthode par laquelle ces lipides sont éliminés à l’aide de la CLHP en phase inverse suivie d’un recuit thermique pour donner Bla g 1 sous sa forme Apo ou rechargée avec un mélange défini par l’utilisateur de cargaisons d’acides gras ou de phospholipides. Le couplage de ce protocole avec des analyses biochimiques indique que les cargaisons d’acides gras modifient de manière significative la thermostabilité et la résistance protéolytique de Bla g 1, avec des implications en aval pour le taux de génération d’épitope à cellule T et d’allergénicité. Ces résultats soulignent l’importance des protocoles d’élimination/rechargement des lipides tels que celui décrit ici lors de l’étude des allergènes provenant de sources recombinantes et naturelles. Le protocole est généralisable à d’autres familles d’allergènes comprenant les lipocalines (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) et uteroglobin (Fel d 1), fournissant un outil précieux pour étudier le rôle des lipides dans la réponse allergique.
Introduction
Une enquête de la base de données sur les allergènes révèle que les allergènes ne se trouvent que dans 2% de toutes les familles de protéines connues, ce qui suggère que les propriétés fonctionnelles et biophysiques communes contribuent à l’allergénicité1. Parmi ces propriétés, la capacité de lier les cargaisons lipidiques semble être fortement surreprésentée parmi les allergènes, ce qui suggère que ces cargaisons peuvent influencer le processus de sensibilisation1. En effet, il a été démontré que l’allergène de noix du Brésil Ber e 1 nécessite une co-administration avec son lipide endogène pour réaliser son plein potentiel sensibilisant2. Ces lipides pourraient potentiellement stimuler directement le système immunitaire comme l’illustrent les allergènes acariens Der p2 et Der p7, qui partagent tous deux une forte homologie structurelle avec les protéines liant les LPS3,4,5. Sur la base de cette observation, il a été proposé que Derp 2 et Der p 7 puissent lier les lipides bactériens et stimuler directement le système immunitaire de l’hôte grâce à la signalisation médiée par TLR4, facilitant le processus de sensibilisation5,6. Il est également possible que les lipides liés de manière endogène puissent modifier les propriétés biophysiques des protéines allergènes elles-mêmes. Par exemple, la capacité de Sin a 2 (moutarde) et d’Ara h1 (arachides) à interagir avec les vésicules phospholipidiques a considérablement amélioré leur résistance à la dégradation gastrique et endosomal7,tandis que la liaison du ligand au principal allergène de pollen de bouleau Bet v1 a altéré à la fois le taux de traitement endosomal et la diversité des peptides résultants8. Ceci est particulièrement pertinent pour l’allergénicité étant donné la corrélation qui a été observée entre la stabilité, la génération d’épitopes des lymphocytes T et l’allergénicité pour des protéines telles que Bet v 1 et Bla g 1; ce dernier faisant l’objet de ces travaux9,10.
Bla g1 représente le membre prototypique de la famille des protéines allergènes majeures (MA) des insectes, et possède une structure unique composée de 12 hélices alpha amphipathiques qui entourent une cavité hydrophobe anormalement grande9,11. La structure cristalline à rayons X disponible de Bla g1 montre la densité électronique dans cette cavité compatible avec les ligands liés aux phospholipides ou aux acides gras; une conjecture confirmée par 31P-RMN et spectrométrie de masse. Ces cargaisons étaient de nature hétérogène et leur composition dépendait fortement de la source de l’allergène, avec différents profils lipidiques observés pour le Bla g1 recombinant exprimé en E. coli et P. pastoris. Curieusement, Bla g1 purifié de sa source naturelle d’allergènes (cafard frass) contenait principalement des acides gras dans son site de liaison, avec un mélange de palmitate, d’oléate et de stéarate étant identifié comme ses ligands « naturels »9,11. La capacité de Bla g 1 à retenir les lipides et les acides gras après de multiples étapes de purification entrave les efforts pour étudier la protéine de manière isolée. A l’inverse, il a été suggéré que les ligands naturels palmitate, stéarate, et oléate de Bla g1 (ci-après dénommés nMix) jouent un rôle clé à la fois dans son allergénicité et dans sa fonction biologique native9. Cependant, ces ligands ne sont pas présents dans Bla g1 obtenu à partir de sources recombinantes, ce qui rend difficile l’évaluation de cette hypothèse. Des problèmes similaires ont été observés pour d’autres allergènes de liaison aux lipides tels que Bet v1 12,13. Pour faciliter l’étude systématique des interactions lipide-allergène, nous avons développé un protocole par lequel les allergènes peuvent être quantitativement dépouillés de leurs lipides liés de manière endogène et reconstitués sous forme apo ou chargés de ligands spécifiques.
Les allergènes sont le plus souvent purifiés à partir de leurs sources naturelles ou recombinantes à l’aide de la chromatographie d’affinité et/ou de la chromatographie d’exclusion de taille. Ici, nous introduisons une étape de purification supplémentaire sous la forme d’une chromatographie liquide haute performance (CLHP) utilisant une colonne C18 en phase inverse à partir de laquelle l’allergène est élué dans un solvant organique similaire aux protocoles développés pour les protéines de liaison aux acides gras14. La protéine résultante est ensuite soumise à une étape de recuit thermique en l’absence ou la présence d’acides gras et/ou de phospholipides. En plus de récupérer le pli natif Bla g 1, les températures élevées augmentent la solubilité et l’accessibilité des cargaisons lipidiques, donnant Bla g 1 sous forme Apo ou uniformément chargé avec le ligand hydrophobe souhaité. 31 ans Les spectres RMN de Bla g 1 purifiés de cette manière ont confirmé le déplacement complet des ligands endogènement liés et le remplacement uniforme avec les composés désirés, alors que le dichroïsme circulaire confirmait le rétablissement réussi du pli bla g 1. L’utilité de cette méthode est mise en évidence dans un travail récent dans lequel la liaison de cargaison s’est avérée améliorer la thermostabilité bla g1 et la résistance protéolytique, modifiant la cinétique de la génération d’épitopes des lymphocytes T avec des implications potentielles pour la sensibilisation et l’allergénicité9.
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Protocol
1. Clonage Bla g 1
- Obtenir le gène de l’allergène blatte Bla g 1.0101 (résidus 34-216), représentant une seule répétition du domaine MA. Par souci de simplicité, Bla g 1 sera utilisé tout au long de l’œuvre pour représenter cette répétition unique, plutôt que l’intégralité de la transcription Bla g 1.0101.
- Subclone le gène Bla g 1 dans le vecteur désiré. Dans cette étude, le gène contenant une étiquette de S-transférase de glutathion N-terminale (GST) couplée à un site de clivage de protéase du virus de la gravure du tabac (TEV) a été inséré dans un vecteur de pGEX pour l’expression comme décrit précédemment11.
- Transformez le vecteur Bla g 1 pGEX en cellules BL21 DE3 E. coli.
- Préparer un stock de 10 ng/μL du vecteur désiré.
- Combiner 1 μL de stock d’ADN de 10 ng/μL avec 50 μL de cellules BL21 DE3, tel que fourni par le fabricant.
- Incuber bl21 DE3-ADN mélange pendant 30 min sur la glace. Transférer dans un bain-marie à 42 °C pendant 1 min, puis immédiatement retourner sur la glace pour une incubation supplémentaire de 1 min.
- Ajouter 200 μL de milieux LB aux cellules et incuber pendant 1 h supplémentaire à 37 °C.
- Plaquer les cellules transformées sur des plaques de LB-Agar contenant 100 mg/L d’ampicilline et les cultiver à 37 °C pendant la nuit.
2. Expression initiale et purification
- Inoculer 1 L de milieux LB contenant 100 mg/L d’ampicilline avec une seule colonie de cellules BL21 DE3 transformées avec le vecteur Bla g1 comme décrit au point 1.3. Cultiver à 37 °C pendant la nuit.
- Le lendemain, prélever des cellules (DO600 ~1,5) par centrifugation à 6 000 x g pendant 10 min et les résinsérer dans 2 L de 2 milieux de 2x YT contenant 100 mg/L d’ampicilline. Laisser les cellules se développer pendant 1 h supplémentaire à 37 °C jusqu’à une DO600 > 0,6.
- Induire l’expression des protéines par l’ajout de 0,5 mM IPTG. Transférer les cellules à 18 °C et incuber pendant la nuit.
- Le lendemain, prélever les cellules décrites au point 2.2. Le culot cellulaire résultant peut être congelé et stocké à -20 °C.
- Pastille de remise en suspension obtenue à partir de 1 L de culture dans 50 mL de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl pH 8,5, NaCl 100 mM) contenant 1 comprimé inhibiteur de protéase (ou équivalent) et 1 μL de nucléase benzonase.
- Cellules de lyse à l’aide d’un sonicateur de sonde (500 W, 20 kHz) réglé sur 30-50% de puissance pendant 4 min avec un rapport cyclique de 50%. Gardez le lysat dans un bain de glace pendant la sonication
- Lysat de centrifugeuse à 45 000 x g pendant 20 min. Jeter la fraction insoluble (granulé).
- Éliminer 28 μL de protéines solubles. Combinez avec 7 μL de tampon SDS-PAGE 5x et stockez-le pour l’analyse SDS-PAGE. Répétez cette étape pour les fractions d’écoulement, de lavage et d’élution de la colonne GST avant et après l’incubation avec la VET.
- Appliquer des protéines solubles (surnageant) sur une colonne de résine de glutathion (~ 10 mL de volume total du lit) équilibrée en PBS pH 7,4.
- Laver toutes les protéines non liées à l’aide de 50 mL de PBS.
- Éluer GST-Bla g 1 utilisant 50 mL de PBS contenant 10 mM réduit le glutathion.
- Incuber la protéine éluée avec de la TEV protéase de 0,2 kU pendant la nuit à 4 °C, ou à température ambiante pendant 6 h pour enlever l’étiquette GST.
3. Élimination endogène des lipides par l’intermédiaire de la CLHP en phase inverse
- Recueillir le Bla g 1 clivé et le concentrer à ~2 mL à l’aide d’une unité de filtre centrifuge avec une coupure de poids moléculaire de <10 kDa.
- Ajouter < 12 mL d’échantillon au sommet du concentrateur et tourner à 5 000 x g pendant 10 à 15 min dans un rotor à godet oscillant.
REMARQUE : Le volume de l’échantillon et la vitesse de rotation varient en fonction du filtre spécifique et du type de rotor utilisé. Consultez la documentation du fabricant avant de l’utiliser.
- Ajouter < 12 mL d’échantillon au sommet du concentrateur et tourner à 5 000 x g pendant 10 à 15 min dans un rotor à godet oscillant.
- Charger le concentré sur un système HPLC de 250 x 10 mm équipé d’une colonne de chromatographie en phase inverse C18 équilibrée avec 97% de tampon A (eau, 0,1% d’acide trifluoroacétique) et 3% de tampon B (acétonitrile, 0,1% d’acide trifluoroacétique).
REMARQUE: Des colonnes plus petites peuvent être utilisées, mais les protéines peuvent devoir être chargées et éluées à l’aide de plusieurs cycles pour s’adapter à la capacité de liaison réduite. Lors du choix d’une colonne, assurez-vous que les billes de résine ont une taille de particules de < 5 μm et une taille de pores de >200 Å pour permettre une séparation efficace des molécules de la taille d’une protéine
ATTENTION : L’acide trifluoroacétique est très corrosif et doit être distribué dans une hotte à l’aide d’un EPI approprié (c.-à-d. gants en nitrile, sarrau de laboratoire et lunettes de protection). L’acétonitrile est à la fois modérément toxique, volatil et facilement inflammable, il doit être utilisé et distribué dans une hotte à l’aide d’un EPI approprié (c.-à-d. gants en nitrile, sarrau de laboratoire et lunettes de protection). - Elute Bla g 1 en utilisant le protocole indiqué au tableau 1 à un débit de 1,5–4,0 mL/min. Surveiller le processus d’élution en utilisant l’absorbance de fluorescence à 280 nm.
- Collecter et mettre en commun Bla g 1 fractions. Bla g 1 élue normalement à >74% tampon B, soit ~34–40 min.
REMARQUE : le temps d’élution varie légèrement en fonction du débit ou de la taille de la colonne. Collecter des fractions basées sur A280 pour de meilleurs résultats.
- Collecter et mettre en commun Bla g 1 fractions. Bla g 1 élue normalement à >74% tampon B, soit ~34–40 min.
| Temps (min.) | Tampon A (%) | Tampon B (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
Tableau 1 : Protocole d’élution pour Bla g 1. Tableau illustrant le gradient d’élution utilisé dans l’isolement de Bla g1 à l’aide d’une colonne HPLC C18.
- Aliquote l’échantillon dans des tubes à essai en verre, sans remplir de tube à essai à plus de la moitié (~4 mL). Couvrir les tubes avec un film de paraffine et perforer le revêtement avec deux trous pour permettre la ventilation.
- Préparer une partie aliquote distincte de 1 mL (aliquote d’essai). Cela sera utilisé pour déterminer le rendement attendu.
- Congeler les échantillons et tester la partie aliquote en les plaçant dans un congélateur à -80 °C pendant 1 h, ou immersion dans de l’azote liquide. Dans le cas de ce dernier, le tube doit être tourné en continu pour éviter la rupture du tube à essai due à l’expansion de la phase liquide lors de la congélation.
- Sécher les échantillons de protéines décalipidées résultants à l’aide d’un lyophilisateur. Les protéines séchées peuvent être conservées à 4 °C pendant plusieurs mois dans un récipient scellé.
4. Reconstitution de l’Apo- et chargé de la cargaison Bla g 1
- Déterminer le rendement bla g 1 prévu.
- Remise en suspension de la partie aliquote d’essai lyophilisée, décalipidée (post-HPLC) dans 5 mL de tampon de repliement (50 mM HEPES pH 7,4, NaCl 100 mM, 2% DMSO).
- Chauffer le mélange au bain-marie (bécher de 500 mL avec 250 mL d’eau et agiter la barre sur une plaque chauffante) à 95 °C. Solutions de vortex par intermittence et incuber à 95 °C pendant 0,5–1 h.
- Retirez la chaleur et laissez lentement le bain-marie s’équilibrer à la température ambiante (~ 1 h). Les protéines recuites peuvent être conservées sous cette forme pendant la nuit à 4 °C si nécessaire.
- Faire passer le mélange bla g 1-lipide recuit à travers un filtre à seringue de 0,22 μM pour éliminer les particules.
- Le tampon échange la protéine filtrée 3x en PBS pH 7,4 à l’aide d’un filtre centrifuge avec une coupure de 10 kDa comme indiqué au point 3.1 pour éliminer les acides gras libres résiduels et le solvant organique.
- Évaluer la concentration en protéines à l’aide d’un test de BCA ou d’une autre méthode préférée telle que l’absorbance UV. Utilisez cette cette mesure pour déterminer le rendement prévu pour les aliquotes Bla g 1 restantes.
- Reconstituer l’apo- ou la cargaison chargée Bla g 1
- Remise en suspension des aliquotes Bla g 1 dans la zone tampon de repliement comme décrit au 4.1.1.
- Pour produire Apo-Bla g 1, répétez les étapes 4.1.2 à 4.1.6 pour obtenir le rendement souhaité.
- Pour charger Bla g 1 avec des acides gras, préparez des solutions de stock de 20 mM de la cargaison d’acides gras souhaitée dans du méthanol ou du DMSO. Ensuite, passez à l’étape 4.2.5.
- Pour charger Bla g 1 avec des phospholipides, préparer un stock de 10 mg/mL de la cargaison souhaitée en chloroforme à l’intérieur d’un tube à essai en verre.
- Évaporer le chloroforme pour produire un film lipidique. Ajouter du PBS au tube à essai pour obtenir une concentration finale de phospholipides de 20 mM.
ATTENTION : Le chloroforme est nocif s’il est inhalé ou avalé. Utiliser dans une hotte chimique ou utiliser un respirateur si une ventilation inadéquate est disponible. Utilisez des gants en nitrile, du sarrau de laboratoire et des lunettes de protection lors de la manipulation. Consulter la FS avant de l’utiliser. - Réhydratez le film lipidique en le chauffant au-dessus de la température de transition de phase de la cargaison lipidique et en vortexant jusqu’à ce que la solution devienne trouble. Notez que la sonication peut être nécessaire pour ressusciter et réhydrater complètement certaines cargaisons.
- Si une sonication est nécessaire, placer le tube à essai dans un sonicateur de bain (100 W, 42 kHz) et soniquer à la puissance maximale jusqu’à ce que la cargaison soit remise en suspension. Alternativement, un sonicateur à sonde (décrit au point 2.6) peut être utilisé une puissance de 10 à 20 % avec un rapport cyclique de 50 %.
ATTENTION: La sonication utilise des ondes sonores à haute fréquence qui peuvent endommager l’audition. Utiliser des EPI antibruit (bouchons d’oreilles ou silencieux). Si possible, placez le sonicateur à l’intérieur de l’armoire ou de la chambre d’amortissement du son.
- Évaporer le chloroforme pour produire un film lipidique. Ajouter du PBS au tube à essai pour obtenir une concentration finale de phospholipides de 20 mM.
- Ajouter la cargaison d’acides gras ou de phospholipides souhaitée pour produire un excès molaire de ligands 20x par rapport à Bla g1 en fonction du rendement prévu déterminé en 4.1. Le volume total de solvant organique ajouté à cette étape ne doit pas dépasser 2%. Vortex à mélanger.
REMARQUE: 1 L de cellules Bl 21 DE3 donne généralement ~ 0,25–0,4 protéine nmol, ce qui correspond à ~ 400 μM de ligand par tube. - Recuit la protéine telle que décrite au 4.1.
5. Confirmation de l’enlèvement/chargement de la cargaison de phospholipides via 31RMN-P
- Concentrer des échantillons de Bla g 1 à >100 μM chargés d’Apo ou de cargaison à l’aide d’un filtre centrifuge tel que décrit au 3.1.
- Réhydrater le phospholipide de référence dans le tampon PBS à des concentrations finales de 2, 1,5, 1, 0,5 et 0,25 mM.
- Diluer les échantillons 1:1 avec un tampon cholate (100 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% p / v cholate) à un volume total d’environ 600 μL.
REMARQUE: Cholate est utilisé dans cette étape pour extraire et solubiliser complètement les lipides de la cavité hydrophobe Bla g 1. Cela garantit que l’environnement chimique entourant les groupes de tête de phospholipides est cohérent entre les différents échantillons, ce qui permet son évaluation quantitative à l’aide de 31RMN-P. L’utilisation du cholate peut être substituée au chloroforme/méthanol comme décrit précédemment15. - Acquérir des spectres RMN 1D 31P des échantillons Bla g 1 solubilisés cholate et étalons phospholipides de référence à l’aide d’une sonde à large bande.
REMARQUE: Les 31spectres RMN P présentés dans ce travail ont été obtenus à l’aide d’un spectromètre de 600 MHz. Cependant, des études antérieures utilisant des techniques similaires suggèrent qu’une sensibilité acceptable peut être atteinte à des concentrations de champs aussi faibles que 150-200 MHz15. - Traiter les données résultantes à l’aide d’un logiciel approprié16.
- Obtenez des intensités de crête à l’aide du logiciel de visualisation RMN préféré17.
- Comparer les spectres RMN-P Bla g1 31à ceux obtenus pour les échantillons de référence de phospholipides afin de confirmer l’élimination des ligands liés de manière endogène et/ou la liaison des ligands souhaités en fonction des décalages chimiques des pics visibles (ou de leur absence).
- Confirmer la stœchiométrie de liaison complète en comparant l’intensité maximale du spectre Bla g 1 à celle des étalons de référence phospholipides.
6. Confirmation du pliage Bla g 1
- Préparer des échantillons de 0,5 μM de Bla g 1 dans un tampon CD (100 mM KH2PO4,tampon pH 7,5). Charger 2 mL de l’échantillon dans une cuvette CD de 10 mm avec barre d’agitation magnétique.
- Mesurer le spectre CD de Bla g1 pour confirmer la reconstitution de la structure secondaire. Assurez-vous que la tension du photomultiplicateur (PMT) ne dépasse pas les recommandations du fabricant (généralement 1 kV).
- Mesurer le signal CD de 260 à 200 nm à 25 °C avec une hauteur de données de 0,2 nm et une vitesse de balayage de 20 nm/s avec un temps d’intégration des données de 1 s.
- Augmentez la température dans la cellule CD de 25 °C à 95 °C à un taux de 0,5 °C/min. Activez la barre d’agitation magnétique pour vous assurer que la température est uniforme dans l’ensemble de l’échantillon.
- Surveiller le CD à 222 nm, en prenant des lectures tous les 2 °C.
- Ajustez les données résultantes à une courbe de Boltzman à 2 états pour déterminer la température de fusion. En raison de la grande stabilité de Bla g1, la température de fusion (MT25)a été définie comme la température à laquelle la protéine a perdu 25% de son CD initial à 222 nm.
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Representative Results
En utilisant la chromatographie d’affinité, le GST-Bla g 1 recombinant a été facilement isolé à un niveau élevé de pureté (Figure 1A), produisant un rendement d’environ 2–4 mg/L de culture cellulaire. L’incubation pendant la nuit avec de la PROTÉASE TEV à 4 °C est suffisante pour enlever l’étiquette GST, ce qui donne le produit final à ~24 kDa. Notez que dans ce cas, il y a une quantité importante de GST-Bla g 1 dans les fractions de flux et de lavage, ce qui suggère que la capacité de liaison de la résine de glutathion a été dépassée. L’utilisation de plus de résine ou de plusieurs cycles de chargement et d’élution des échantillons pourrait apporter un remède à ce problème.
L’application du Bla g 1 à une colonne C18 en phase inverse donne un profil d’élution distinctif(Figure 1B),avec deux grands pics à ~50% de tampon B, et un second grand pic à ~75% de tampon B. L’analyse SDS-PAGE des fractions résultantes suggère que les premiers correspondent à la balise GST clivée, tandis que le second correspond à Bla g 1. À l’occasion, un troisième pic, plus petit, se produira au milieu, ce qui correspond à la GST-Bla g 1 résiduelle et non clivée. La présence de ce produit non clivé peut être éliminée en augmentant la quantité de VET utilisée dans la réaction de clivage ou en prolongeant le temps d’incubation. Bien qu’un clivage incomplet réduise le rendement, la séparation obtenue sur la colonne C18 est suffisante pour garantir que la pureté du produit final Bla g 1 reste sans compromis. Une conséquence de la CLHP en phase inverse est que le produit protéique final est élué dans un environnement de solvant organique. Bien que cela facilite l’élimination de tous les ligands hydrophobes, l’élimination de ce solvant par lyophilisation est nécessaire, ce qui donne une poudre blanche moelleuse(Figure 1C).
Le recuit de la protéine est nécessaire pour reconstituer le pli natif Bla g 1 et peut être effectué soit en l’absence, soit en présence d’une cargaison lipidique. L’ajout de DMSO aux cargaisons séchées de Bla g 1 et de phospholipides avant le tampon de repliement facilite le processus de solubilisation, bien que certaines cargaisons lipidiques à chaîne plus longue ne se dissolvent pas complètement, même à des températures élevées. Cependant, cela n’a pas été observé pour avoir un impact sur l’efficacité de la charge parmi les lipides testés dans nos études (Figure 1C). De même, l’excès de lipides précipitera souvent hors de la solution ou formera de grosses vésicules lors du refroidissement, ce qui donnera un aspect trouble après recuit(Figure 1C). Cela n’a pas non plus été observé pour affecter l’efficacité de la charge, et tous les agrégats sont facilement éliminés par la filtration et les étapes ultérieures d’échange de tampon pour obtenir une solution claire et transparente. Malgré les conditions difficiles, aucune thermolyse n’a été observée pour Bla g 1.
Figure 1 : Purification initiale de Bla g 1. (A) FDS-PAGE montrant la fraction protéique soluble après lyse initiale (S) ; écoulement à travers (FT), lavage (W), et élution de la colonne de glutathion-sépharose (E); et le produit Bla g 1 final suivant le clivage TEV de la balise GST (TEV). Le profil d’élution HPLC du produit Bla g 1 résultant après clivage TEV est représenté dans (B). Un280 est indiqué en bleu, tandis que le gradient d’élution (% tampon B) est indiqué en vert. Les fractions correspondant à la balise GST clivée (H1, H2), à la GST-Bla g 1 non clivée résiduelle (H3) et au Bla g 1 purifié (H4) sont indiquées par des flèches rouges à ~50%, ~65% et ~74% Buffer B respectivement. L’analyse SDS-PAGE des fractions H1-H4 est présentée en(A)et étiquetée en conséquence. (C) Images représentatives montrant Bla g 1 à différents stades du processus de recuit. Il est à noter que la précision et l’étendue de la formation de précipités, telles qu’elles sont décrites aux points ii et iii, dépendent du type de cargaison lipidique utilisée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
31 ans Les spectres RMN P d’Apo-Bla g1 purifiés de cette manière ne montrent aucun phospholipide détectable ni par RMN(figure 2A),soit par chromotographie en couche mince (données non représentées). En revanche, des spectres similaires obtenus pour Bla g1 chargé d’un phospholipide distearoylphosphatidylcholine (DSPC) montrent un fort pic correspondant au groupe de tête de la phosphatidylcholine. A titre de comparaison, un spectre représentatif de 31RMN-P de Bla g1 purifié à partir de E. coli recombinant sans l’utilisation du protocole d’élimination/recuit des lipides décrit ici (ecBla g1) montre un mélange hétérogène de lipides endogènes extraits du système d’expression recombinante(figure 2B). Tirant parti de la nature quantitative de la RMN, une courbe standard peut être produite à l’aide d’échantillons de référence de concentrations connues de DSPC (Figure 2C). La comparaison de l’intensité du signal 31P obtenue à partir de DSPC-Bla g1 par rapport à cette courbe standard donne une stœchiométrie de liaison de 4,7 ± 0,5 lipides par protéine ; une valeur qui se compare favorablement à la stœchiométrie de liaison complète prédite obtenue à partir d’études in silico et d’analyses structurales9. Notez que cette technique ne détectera que les ligands qui contiennent un noyau de 31P tels que les phospholipides, les lysophospholipides, les lipopolysaccharides, etc. Cependant, ce protocole peut être facilement adapté pour l’analyse 13C-RMN. Dans ce cas, les acides gras marqués au méthyl-13C seraient recommandés en raison de ses propriétés favorables de relaxation RMN. La restriction de l’étiquetage isotopique à un seul site facilite également l’interprétation spectrale, car un seul pic est attendu, tout en réduisant simultanément le coût par rapport aux homologues uniformes marqués 13C. Une autre approche serait d’employer mass-spec pour identifier les ligands liés, comme démontré dans une étude précédente qui a identifié un mélange d’acides gras comme la cargaison naturelle de Bla g 1 isolé de cafard frass (nBla g 1)9. Cependant, les capacités de quantification limitées des spécifications de masse ont empêché une mesure précise de la stœchiométrie de liaison sans étalons suffisants.
Figure 2 : Vérification de l’élimination et de la charge lipidiques de Bla g 1. (A) 31spectres RMN P d’Apo- (noir) ou de Bla g1 (rouge) chargés de DSPC préparés à l’aide du protocole de recuit décrit dans ce travail démontrant l’élimination complète des lipides dans le premier, et la charge homogène en lipides phosphatidylcholine (PC) obtenue dans ce dernier. En revanche, Bla g1 purifié à partir de E. coli recombinant sans décapage lipidique et recuit (ecBla g 1) montre un mélange hétérogène de lipides endogènes phosphatidyléthanolamine (PE) et phosphatidylglycérol (PG) lorsqu’il est analysé à l’aide de cette méthode(B). Une courbe étalon représentative obtenue à partir d’échantillons de référence DSPC de concentrations connues est représentée en(C),à partir de laquelle la stœchiométrie de liaison Bla g1 peut être obtenue. Figures adaptées de Foo et al. (2019) et présentées sous la licence Creative Commons CC BY9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Les structures cristallines de Bla g 1 révèlent un pli unique composé de 12 hélices alpha amphipathiques. Le dichroïsme circulaire représente une méthode rapide et pratique pour évaluer si ce pli a été reconstitué avec succès après le processus de recuit. Les spectres CD pour Apo- et lipides (nMix)-chargés Bla g 1 montrent des minima ~ 220 et 210 nm indicatifs d’une structure principalement alpha-hélicoïdale (Figure 3A). Ce spectre est extrêmement similaire à celui obtenu pour ecBla g1 et nBla g1, fournissant une preuve supplémentaire que la structure native de Bla g1 est récupérée avec succès. Ceci a été confirmé par l’utilisation de 19F et 1H-15 N solution-RMN, dont une discussion complète est disponible ailleurs9. Les essais de dénéaturation thermique à base de CD montrent une perte coopérative de structure secondaire alpha-hélicoïdale indiquant un domaine globulaire plié (Figure 3B). L’analyse des températures de fusion résultantes(figure 3C)montre une augmentation significative de la liaison au ligand nMix. Cette thermostabilité élevée est conforme à celle calculée pour nBla g1, ce qui indique que nous sommes capables de reproduire pleinement l’état naturel de Bla g1. Notez que ecBla g 1 montre également une amélioration similaire, sinon plus grande, de la thermostabilité, illustrant le potentiel des lipides résiduels liés de manière endogène à interférer avec la caractérisation biophysique des allergènes purifiés à l’aide d’approches traditionnelles basées sur FPLC. En revanche, la capacité d’éliminer quantitativement et de recharger les cargaisons hydrophobes d’allergènes tels que Bla g 1 fournit une avenue unique pour examiner le rôle des lipides dans la réponse allergique. Ici, nous décrivons une méthode pour examiner l’influence des cargaisons de lipide sur la structure, la stabilité, et le traitement endosomal des protéines allergènes elles-mêmes, bien que d’autres avenues d’étude aient pu être considérées.
Figure 3 : Confirmation de la récupération réussie du pli Bla g 1. (A) spectres CD d’Apo- (noir) ou nMix-chargé (rouge) Bla g1 purifiés et recuits en utilisant le protocole décrit ici, avec des minima à ~220 et 210 nm indicatifs d’une structure principalement alpha-hélicoïdale compatible avec la structure cristalline à rayons X disponible. Les spectres Bla g 1 chargés d’Apo et de nMix sont extrêmement similaires à ceux obtenus pour Bla g1 purifié à partir de E. coli recombinant (ecBla g 1, vert) ou de sa source allergène naturelle (nBla g 1, bleu) sans le protocole d’élimination des lipides et de recuit, soutenant davantage la récupération réussie de la structure native dans le premier. (B) Profils thermiques représentatifs pour Apo- (noir) et nMix-loaded (rouge) Bla g 1 montrant une courbe sigmoïdale indiquant un déroulement coopératif. nBla g 1 (bleu) et ecBla g 1 (vert) indiqués comme référence. Les températures de fusion calculées (MT25)de Bla g1 sont indiquées en(C). La liaison des ligands nMix (rouge) donne une augmentation significative de la thermostabilité par rapport à Apo-Bla g 1 (noir). Cela reflète la tendance observée pour nBla g 1 (bleu), ce qui suggère que nous sommes en mesure de récupérer avec succès l’état natif. La stabilité encore plus grande observée pour ecBla g 1 met en évidence le potentiel des lipides liés de manière endogène à interférer avec la caractérisation biophysique des allergènes. Les valeursMT 25 présentées en C représentent la valeur moyenne obtenue à partir d’au moins trois essais indépendants. Les barres d’erreur représentent les valeurs d’écart type correspondantes. Figures adaptées de Foo et al. (2019) et présentées sous la licence Creative Commons CC BY9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le protocole décrit dans ce travail a été appliqué avec succès pour étudier systématiquement les propriétés de liaison lipidique de Bla g1. Ceci a révélé une corrélation entre la liaison de la cargaison, la thermostabilité, et le traitement endosomal, ce dernier étant corrélé avec la diminution de la génération d’un épitope à cellule T connu avec des implications potentielles pour l’immunogénicité9,18. En plus de Bla g1, il a été démontré que d’autres allergènes tels que Pru p3 et Bet v1 conservent leurs cargaisons liées de manière endogène lorsqu’ils sont purifiés à l’aide de méthodes de chromatographie standard d’affinité et d’exclusion de taille13,19,20,21,22. Ces invités indésirables pourraient modifier les propriétés biophysiques et immunologiques de ces protéines de la même manière, soulignant la nécessité de techniques pour assurer une délilipidation complète telle que celle présentée ici.
Alors que l’utilisation de la CLHP en phase inverse dans la purification des allergènes a été décrite précédemment2, le couplage avec un protocole de recuit thermique offre l’occasion plutôt inhabituelle de reconstituer les allergènes avec une gamme de ligands naturels et non naturels, permettant aux utilisateurs de sonder les interactions lipide-allergène. Cette étape de daturation thermique s’est avérée essentielle à deux fins principales. Tout d’abord, la daturation thermique est nécessaire pour faciliter l’accès des ligands à leurs cavités de liaison qui, en raison de leur nature hydrophobe, sont souvent enfouies loin du solvant aqueux9,22. Deuxièmement, les ligands hydrophobes tels que les acides gras et les phospholipides forment souvent des structures supramoléculaires plus grandes telles que des micelles ou des vésicules lorsqu’ils sont placés dans un environnement aqueux. La concentration de ligands monomères ou « libres » disponibles pour la liaison aux protéines peut être estimée à l’aide de la concentration critique de micelles (CMC). DSPC et d’autres phospholipides à longue chaîne ont des valeurs CMC dans la plage nM, indiquant qu’il n’y a pratiquement aucun ligand libre disponible pour la liaison Bla g 1. Même les lipides à chaîne courte et les acides gras ont des CMC dans la gamme de μm à mM faible, ce qui indique qu’une grande proportion de ces ligands restent dans la phase micellaire oubicouche 23. Cependant, les températures élevées utilisées dans notre protocole de daturation dispersent ces agrégats plus grands, facilitant la liaison. Des études antérieures ont généralement utilisé des périodes d’incubation prolongées pour faciliter ce processus. Cependant, l’absence d’un processus de daturation thermique / recuit soulève des doutes quant à l’efficacité du chargement. Par exemple, l’incubation de l’allergène d’acariens Der p 5 avec l’acide gras fluorescent analogue 11-(Dansylamino)undécanoïque (DAUDA) a donné une stœchiométrie de liaison de 0,66 malgré la possession d’une grande cavité hydrophobe à égalité avec Bla g 124. De même, la spécificité de liaison et la stœchiométrie des nsLTPs végétaux se sont avérées varier considérablement selon que les lipides et les protéines sont d’abord solubilisés dans du méthanol avant l’ajout d’un tampon aqueux, ce qui indique que l’accessibilité du ligand et/ou du site de liaison était un facteur limitant25.
En plus de Bla g 1, nous avons appliqué avec succès la même stratégie à plusieurs autres protéines du domaine MA des cafards et des moustiques (A. aegypti), ainsi qu’à Der p 2 (données non présentées). Nous avons noté que les homologues Bla g 1 et Der p 2 ont élué à un moment différent de Bla g 1 de la colonne C18 (étape 3.3). Les gradients d’élution de cette étape peuvent devoir être optimisés pour d’autres protéines. Alternativement, des colonnes HPLC avec une phase stationnaire moins hydrophobe (par exemple, C8) peuvent être employées, bien que dans le cas de Bla g 1 l’hydrophobicité accrue de la colonne C18 ait été nécessaire pour éliminer complètement les contaminants de phospholipide diacyl de ecBla g 1. En dépit des différences dans les propriétés biophysiques et biochimiques, nous avons trouvé ce protocole pour être extrêmement robuste et pourrait être facilement appliqué à d’autres protéines allergéniques. Alors que les conditions difficiles employées peuvent présenter une limitation potentielle, la résilience accrue observée pour de nombreux allergènes réduit son impact26,27. En effet, plusieurs allergènes alimentaires et inhalés tels que Der p2, Ber e1, Ara a6 et Lep w1 ont été observés pour retrouver leur structure et leur immunogénicité suite à la dénaturation thermique, bien qu’une optimisation des conditions tampons puisse être nécessaire 28,29,30,31,32,33 ; par exemple la dénaturation réversible des nsLTP (Cor a 8) et des thaumatines (Mal d2 et Acte d2) n’est observée que dans des conditions acides (pH <4)28,30,31. De plus, il convient de noter que les auteurs n’ont pas tenté d’optimiser le moment ou les températures utilisés dans le protocole de recuit. Il est possible que la solubilisation du ligand et le repliement/dépliage des protéines puissent être obtenus en utilisant une température maximale plus basse comme on le voit avec Ber e 1 pour lequel une daturation réversible est obtenue à 82°C29. L’utilisation de telles mesures devrait élargir la gamme des allergènes auxquels ce protocole peut s’appliquer.
Une autre considération importante lors de l’adaptation de ce protocole à d’autres systèmes allergènes est la concentration de ligands requise pendant le processus de recuit. Dans le cas de Bla g 1, le rendement attendu est d’environ 0,25–0,4 μmol de protéines par culture cellulaire de 1 L. Compte tenu de la stœchiométrie de liaison démontrée de 8 acides gras ou de 4 lipides à chaîne diacyle par allergène, un excès molaire de 20 à 40 fois de cargaison (5 à 10 μmol) a été utilisé. Il convient de noter que la capacité de liaison lipidique de Bla g1 et de ses homologues est unique; par exemple les nsLTP sont généralement acceptés pour lier au plus deux ligands lipidiques25 alors que les lipocalines ont moins de 1 stœchiométrie34. En tant que tel, le chargement complet de ces types d’allergènes peut être accompli avec un plus petit excès de ligands. Une considération finale en adaptant ce protocole à d’autres systèmes allergènes est la présence de liaisons disulfures, qui peuvent être problématiques si elles ne sont pas correctement formées avant la dénaturation. Une approche possible serait d’effectuer le processus de recuit en présence d’un agent réducteur tel que la TNT 2 mM. Les liaisons disulfures indigènes pourraient être par la suite reformées par l’ajout de glutathion réduit et oxydé tel que décrit pour le fragment d’allergène d’arachide étudié par Aalberse et al.35. Dans ce cas, la récupération de la liaison disulfure correcte doit être évaluée empiriquement par spectrométrie de masse35.
Dans ce travail nous décrivons une technique par laquelle des allergènes peuvent être décalipidés et re-recuits avec de diverses cargaisons de phospholipide et d’acide gras. Cependant, il existe de nombreuses autres classes de ligands potentiellement immunogènes ou adjuventisants présents dans les réservoirs d’allergènes courants. Par exemple, des allergènes de chat, de chien et d’acariens ont été proposés pour lier les lipopolysaccharides (LPS) et d’autres lipides bactériens de la poussière domestique36,tandis que le Bet v 1 a été montré pour extraire des flavonoïdes complexes de la matrice pollinique13. Le protocole décrit dans ce travail peut être facilement adapté pour explorer le rôle de ces lipides d’une manière plus détaillée. Comme preuve de concept, nous avons pu démontrer que la cavité hydrophobe de Bla g1 est capable de lier l’acide lipotéichoïque (LTA) à partir des parois cellulaires des bactéries à Gram positif, mais exclut les LPS des espèces à Gram négatif, reflétant potentiellement le plus grand nombre de chaînes acyle dans ces dernières9. En poussant cela un peu plus loin, on pourrait utiliser le protocole de dénéaturation thermique / recuit pour incorporer des sondes fluorescentes et d’autres analogues d’acides gras non naturels dans les protéines allergènes. En effet, nous avons pu charger la cavité hydrophobe de l’homologue moustique de Bla g1 avec DAUDA, ouvrant des pistes supplémentaires pour examiner les effets des ligands lipidiques sur les maladies allergènes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier le Dr Tom Kirby, Scott Gabel et le Dr Robert London pour leur aide et leur assistance tout au long de ce travail, ainsi que le Dr Bob Petrovich et Lori Edwards pour l’utilisation de leur instrumentation et leur aide dans la génération des constructions Bla g 1 utilisées dans cette étude. Nous remercions Andrea Adams pour son aide avec la spectrométrie de masse, et le Dr Eugene DeRose pour son aide avec l’instrumentation RMN. Cette recherche a été soutenue par le programme de recherche intra-muros des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de l’Institut national des sciences de la santé environnementale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
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