Summary
Detta protokoll beskriver avlägsnandet av endogena lipider från allergener, och deras ersättning med användarspecificerade ligander genom omvänd fas HPLC i kombination med termisk glödgning. 31 (31) P-NMR och cirkulär dichroism möjliggör snabb bekräftelse av ligand borttagning /lastning, och återvinning av inhemska allergen struktur.
Abstract
Många stora allergener binder till hydrofobiska lipidliknande molekyler, inklusive Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 och Fel d 1. Dessa ligander är starkt behållna och har potential att påverka sensibiliseringsprocessen antingen genom att direkt stimulera immunsystemet eller ändra de biofysiska egenskaperna hos det allergiframkallande proteinet. För att kontrollera dessa variabler krävs tekniker för avlägsnande av endogent bundna ligands och vid behov ersätta lipider med känd komposition. Kackerlackan allergen Bla g 1 omsluter en stor hydrofobisk hålighet som binder en heterogen blandning av endogena lipider när de renas med traditionella tekniker. Här beskriver vi en metod genom vilken dessa lipider avlägsnas med hjälp av omvänd fas HPLC följt av termisk glödgning för att ge Bla g 1 i antingen dess Apo-form eller laddas om med en användardefinierad blandning av fettsyra eller fosfolipid laster. Koppling av detta protokoll med biokemiska analyser visar att fettsyralaster avsevärt förändrar termostabiliteten och proteolytisk resistens hos Bla g 1, med nedströms konsekvenser för T-cells epitopgenerering och allergiframkallande egenskaper. Dessa resultat belyser vikten av lipid borttagning/omladdning protokoll såsom den som beskrivs häri när studera allergener från både rekombinanta och naturliga källor. Protokollet är generaliserbart för andra allergenfamiljer inklusive lipokoliner (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) och Uteroglobin (Fel d 1), vilket ger ett värdefullt verktyg för att studera lipidernas roll i det allergiska svaret.
Introduction
En undersökning av allergendatabasen visar att allergener finns i endast 2% av alla kända proteinfamiljer, vilket tyder på att vanliga funktionella och biofysiska egenskaper bidrar till allergiframkallandeegenskaper 1. Av dessa egenskaper verkar förmågan att binda lipidlaster vara starkt överrepresenterad bland allergener, vilket tyder på att dessa laster kan påverka sensibiliseringsprocessen1. Det har faktiskt visat sig att Brasiliens mutter allergen Ber e 1 kräver samadministration med sin endogena lipid för att förverkliga sin fulla sensibiliserande potential2. Dessa lipider kan potentiellt stimulera immunsystemet direkt som illustreras av mitten allergenerna Der p 2 och Der p 7, som båda delar en stark strukturell homologi med LPS-bindande proteiner3,4,5. Baserat på denna observation föreslogs att Derp 2 och Der p 7 kunde binda bakteriella lipider och direkt stimulera värdimmunsystemet genom TLR4-medierad signalering, vilket underlättade sensibiliseringsprocessen5,6. Det är också möjligt att endogent bundna lipider kan förändra de biofysiska egenskaperna hos allergiframkallande proteiner själva. Till exempel förbättrade Förmågan hos Sin a 2 (senap) och Ara h 1 (jordnötter) att interagera med fosfolipid vesiklar avsevärt deras motståndskraft mot mag- och endosomal nedbrytning7, medan ligand bindning till den stora björkpollen allergenEt Bet v 1 förändrade både frekvensen av endoskopisk bearbetning och mångfalden av de resulterande peptiderna8. Detta är särskilt relevant för allergiframkallande egenskaper med tanke på det samband som har observerats mellan stabilitet, T-cells epitopgenerering och allergiframkallande egenskaper för proteiner som Bet v 1 och Bla g 1; varav det senare kommer att bli föremål för detta arbete9,10.
Bla g 1 representerar den prototypiska medlemmen av insekten Major Allergen (MA) proteinfamilj, och har en unik struktur bestående av 12 amfipatiska alfahelices som omger en onormalt stor hydrofobisk hålighet9,11. Den tillgängliga röntgenkristallstrukturen i Bla g 1 visar elektrontätheten i denna hålighet som överensstämmer med bundna fosfolipider eller fettsyraligander; en gissning bekräftad av 31P-NMR och masspektrometri. Dessa laster var heterogena till sin natur och deras sammansättning var starkt beroende av allergenkällan, med olika lipidprofiler observerade för rekombinant Bla g 1 uttryckt i E. coli och P. pastoris. Märkligt nog innehöll Bla g 1 renad från sin naturliga allergenkälla (kackerlackssp frass) övervägande fettsyror inom sitt bindningsställe, med en blandning av palmitat, oleat och stearat som identifierades som dess "naturliga" ligander9,11. Bla g 1:s förmåga att behålla lipider och fettsyror efter flera reningsinsatser hindrar försöken att studera proteinet isolerat. Omvänt har det föreslagits att den naturliga palmitate, stearate och oleate ligands av Bla g 1 (hädanefter kallad nMix) spelar en nyckelroll i både dess allergiframkallande och inhemska biologiska funktion9. Dessa ligands är dock inte närvarande i Bla g 1 som erhållits från rekombinanta källor, vilket gör det svårt att bedöma denna hypotes. Liknande problem har observerats för andra lipidbindnings allergener som Bet v 112,13. För att underlätta den systematiska studien av lipid-allergeninteraktioner har vi utvecklat ett protokoll genom vilket allergener kvantitativt kan tas bort från sina endogent bundna lipider och rekonstitueras i antingen Apo-form eller laddas med specifika ligander.
Allergener renas oftast från sina naturliga eller rekombinanta källor med hjälp av affinitetskromatografi och/eller storleksuteslutning kromatografi. Här introducerar vi ytterligare ett reningssteg i form av högpresterande flytande kromatografi (HPLC) med en omvänd fas C18-kolumn från vilken allergenet elueras till ett organiskt lösningsmedel som liknar protokoll som utvecklats för fettsyrabindande proteiner14. Det resulterande proteinet utsätts sedan för ett termiskt glödgningssteg i frånvaro eller förekomst av fettsyror och/eller fosfolipider. Förutom att återvinna den inhemska Bla g 1-vikningen ökar de förhöjda temperaturerna lösligheten och tillgängligheten hos lipidlasterna, vilket ger Bla g 1 i antingen Apo-form eller jämnt laddad med önskad hydrofobisk ligand. 31 (31) P-NMR spektra av Bla g 1 renas på detta sätt bekräftade fullständig avlägsnande av endogent bundna ligands och enhetlig ersättning med önskade föreningar, medan cirkulär dikhroism bekräftade framgångsrik återhämtning av Bla g 1 gånger. Nyttan av denna metod lyfts fram i ett nyligen arbete där lastbindning konstaterades förbättra Bla g 1 termostabilitet och proteolytiskt motstånd, ändra kinetiken för T-cells epitopgenerering med potentiella konsekvenser för sensibilisering och allergiframkallandeegenskaper 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bla g 1 kloning
- Få gen för kackerlacka allergen Bla g 1.0101 (rester 34-216), som representerar en enda upprepning av MA domänen. För enkelhetens skull kommer Bla g 1 att användas under hela arbetet för att representera denna enda upprepning, snarare än hela Bla g 1.0101-transkriptionen.
- Subclone Bla g 1 genen i önskad vektor. I denna studie infogades genen som innehåller en N-terminal glutation S-transferase (GST) tagg kopplad till en tobak etch virus (TEV) protease klyvning webbplats i en pGEX vektor för uttryck som beskrivitstidigare 11.
- Omvandla Bla g 1 pGEX vektor till BL21 DE3 E. coli celler.
- Förbered ett 10 ng/μL lager av önskad vektor.
- Kombinera 1 μL 10 ng/μL DNA-lager med 50 μL BL21 DE3-celler enligt tillverkarens anvisningar.
- Inkubera BL21 DE3-DNA-blandning i 30 min på is. Överför till ett 42 °C vattenbad i 1 min och överför sedan omedelbart tillbaka på is för ytterligare 1 min inkubation.
- Tillsätt 200 μL LB-media i cellerna och inkubera i ytterligare 1 timme vid 37 °C.
- Plätera de omvandlade cellerna på LB-Agar-plattor som innehåller 100 mg/L ampicillin och växa vid 37 °C över natten.
2. Första uttryck och rening
- Inokulera 1 L LB-media som innehåller 100 mg/L ampicillin med en enda koloni av BL21 DE3-celler omvandlade med Bla g 1-vektorn enligt beskrivningen i 1.3. Odla vid 37 °C över natten.
- Nästa dag, skörda celler (OD600 ~1,5) via centrifugering vid 6,000 x g i 10 min och återanvänd i 2 L av 2x YT-media som innehåller 100 mg/L ampicillin. Låt cellerna växa ytterligare 1 timme vid 37 °C till en OD600 > 0,6.
- Inducera proteinuttryck genom tillsats av 0,5 mM IPTG. Överför celler till 18 °C och inkubera över natten.
- Nästa dag skördar du celler enligt beskrivningen i 2.2. Den resulterande cellpelleten kan frysas och förvaras vid -20 °C.
- Återanvänd pellet erhölls från 1 L odling i 50 ml lysbuffert (50 mM Tris-HCl pH 8, 5, 100 mM NaCl) innehållande 1 proteashämmartablett (eller motsvarande) och 1 μL benzonasnukleas.
- Lyseceller med en sondsonicator (500 W, 20 kHz) inställd på 30-50% effekt i 4 minuter med en 50% arbetscykel. Håll lysatet i ett isbad under ultraljudsbehandling
- Centrifug lysat vid 45 000 x g i 20 min. Kassera olöslig fraktion (pellet).
- Ta bort 28 μL lösligt protein. Kombinera med 7 μL 5x SDS-PAGE-buffert och lagra för SDS-PAGE-analys. Upprepa det här steget för GST-kolumnens genomflödes-, tvätt- och elueringsfraktioner före och efter inkubation med TEV.
- Applicera lösliga proteiner (supernatant) på en glutationhartskolonn (~10 ml total sängvolym) jämvikt i PBS pH 7.4.
- Tvätta ut obundna proteiner med 50 ml PBS.
- Elute GST-Bla g 1 med 50 ml PBS som innehåller 10 mM reducerad glutation.
- Inkubera eluterat protein med 0,2 kU TEV proteas över natten vid 4 °C, eller rumstemperatur i 6 timmar för att ta bort GST-taggen.
3. Endogen lipidborttagning via HPLC i omvänd fas
- Samla den klyvda Bla g 1 och koncentrera den till ~ 2 ml med hjälp av en centrifugalfilterenhet med en <10 kDa molekylviktavskärning.
- Tillsätt <12 ml prov till toppen av koncentratorn och snurra på 5 000 x g i 10–15 min i en gunghinkrotor.
OBS: Provvolymen och spinnhastigheten varierar beroende på det specifika filtret och vilken typ av rotor som används. Se tillverkarens dokumentation före användning.
- Tillsätt <12 ml prov till toppen av koncentratorn och snurra på 5 000 x g i 10–15 min i en gunghinkrotor.
- Ladda koncentratet på ett 250 x 10 mm HPLC-system utrustat med en C18-kromatografikolonn i omvänd fas jämvikt med 97 % buffert A (vatten, 0,1 % trifluoracetisk syra) och 3 % buffert B (acetonitril, 0,1 % trifluoracetisk syra).
OBS: Mindre kolonner kan användas, men protein kan behöva laddas och elueras med hjälp av flera cykler för att rymma den minskade bindningskapaciteten. Vid val av kolonn ska du se till att hartspärlorna har en partikelstorlek på < 5 μm och porstorleken >200 Å för att möjliggöra effektiv separation av proteinstora molekyler
VARNING: Trifluoracetisk syra är mycket frätande och bör dispenseras i en rökhuv med lämplig personlig skyddsutrustning (dvs. nitrilhandskar, labbrock och skyddsglasögon). Acetonitril är både måttligt giftig, flyktig och mycket brandfarlig, bör användas och dispenseras i en rökhuv med lämplig personlig skyddsutrustning (dvs. nitrilhandskar, labbrock och skyddsglasögon). - Elute Bla g 1 med hjälp av protokollet i tabell 1 med en flödeshastighet på 1,5–4,0 ml/min. Övervaka elueringsprocessen med fluorescensabsorbansen vid 280 nm.
- Samla och slå samman Bla g 1 bråkdelar. Bla g 1 eluerar normalt vid >74% buffert B, eller ~34-40 min.
OBS: Elueringstiden varierar något beroende på flödeshastighet eller kolumnstorlek. Samla in bråk baserat på A280 för bästa resultat.
- Samla och slå samman Bla g 1 bråkdelar. Bla g 1 eluerar normalt vid >74% buffert B, eller ~34-40 min.
| Tid (Min) | Buffert A (%) | Buffert B (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
Tabell 1: Elutionsprotokoll för Bla g 1. Tabell som illustrerar elueringsgradienten som används vid isolering av Bla g 1 med hjälp av en C18 HPLC-kolumn.
- Alikvot provet i glas provrör, fyller inget provrör mer än halvvägs (~ 4 ml). Täck rören med paraffinfilm och perforera beläggningen med två hål för att möjliggöra ventilering.
- Förbered en separat 1 ml alikvot (test alikvot). Detta kommer att användas för att bestämma den förväntade avkastningen.
- Frys proverna och testa alikvoten genom att placera dem i en frys med -80 °C i 1 timme eller nedsänkning i flytande kväve. Vid senare ska röret roteras kontinuerligt för att undvika att provröret går sönder på grund av expansionen av vätskefasen vid frysning.
- Torka de resulterande delipiderade proteinproverna med hjälp av en lyofilis. Torkat protein får lagras vid 4 °C i flera månader i en förseglad behållare.
4. Beredning av Apo- och lastladdad Bla g 1
- Bestäm den förväntade Bla g 1-avkastningen.
- Återanvända lyofiliserad, delipiderad (post-HPLC) test alikvot i 5 ml omdubblningsbuffert, (50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
- Värm blandningen i ett vattenbad (500 ml bägare med 250 ml vatten och rör om stången över en kokplatta) till 95 °C. Virvellösningarna inkuberar intermittent och inkuberar vid 95 °C i 0,5–1 timmar.
- Ta bort värmen och låt långsamt vattenbadet balansera till rumstemperatur (~1 h). Glödgat protein kan förvaras i denna form över natten vid 4 °C om det behövs.
- Passera glödgad Bla g 1-lipidblandning genom ett 0,22 μM sprutfilter för att avlägsna partiklar.
- Buffertutbyte av det filtrerade proteinet 3x till PBS pH 7.4 med hjälp av ett centrifugalfilter med 10 kDa cutoff enligt 3.
- Utvärdera proteinkoncentrationen med BCA-analys eller annan föredragen metod som UV-absorbans. Använd detta för att bestämma den förväntade avkastningen för de återstående Bla g 1 alikvoterna.
- Rekonstituera Apo- eller lastladdad Bla g 1
- Återanvänd Bla g 1 alikvoter i omdubblningsbuffert enligt beskrivningen i 4.1.1.
- Upprepa steg 4.1.2–4.1.6 för att få önskat utbyte för att producera Apo-Bla g 1.
- För att ladda Bla g 1 med fettsyror, förbered 20 mM lagerlösningar av önskad fettsyralast i metanol eller DMSO. Hoppa sedan till steg 4.2.5.
- För att ladda Bla g 1 med fosfolipider, förbered ett 10 mg/ml lager av önskad last i kloroform inuti ett glasteströr.
- Avdunsta kloroformen för att producera en lipidfilm. Tillsätt PBS till provröret för att producera en slutlig fosfolipidkoncentration på 20 mM.
VARNING: Kloroform är skadlig vid inandning eller förtätning. Använd i en kemisk rökhuv eller använd andningsskydd om det finns otillräcklig ventilation. Använd nitrilhandskar, labbrock och skyddsglasögon vid hantering. Se MSDS före användning. - Återfukta lipidfilmen genom att värma den över fasövergångstemperaturen för lipidlasten och virvla tills lösningen blir grumlig. Observera att ultraljudsbehandling kan krävas för att helt återanvända och återfukta vissa laster.
- Om ultraljudsbehandling krävs, placera provröret i badsonicator (100 W, 42 kHz) och ultraljudsbehandling vid maximal effekt tills lasten återanvänds. Alternativt kan en sondsonicator (beskriven i 2.6) användas en 10-20% effekt med en 50% arbetscykel.
VARNING: Ultraljudsbehandling använder högfrekventa ljudvågor som kan skada hörseln. Använd ljuddämpande personlig skyddsutrustning (öronproppar eller ljuddämpare). Placera om möjligt ljudsignalen inuti ljuddämpande skåp eller kammare.
- Avdunsta kloroformen för att producera en lipidfilm. Tillsätt PBS till provröret för att producera en slutlig fosfolipidkoncentration på 20 mM.
- Tillsätt önskad fettsyra eller fosfolipidlast för att producera ett 20x molar överskott av ligander i förhållande till Bla g 1 baserat på det förväntade utbytet fastställt i 4.1. Den totala volymen organiskt lösningsmedel som tillsätts i detta steg bör inte överstiga 2 %. Virvel att blanda.
OBS: 1 L Bl 21 DE3-celler ger vanligtvis ~0,25–0,4 nmol protein, motsvarande ~400 μM ligand per rör. - Glödgproteinet enligt beskrivningen i 4.1.
5. Bekräftande av borttagning/lastning av fosfolipidlast via 31P-NMR
- Koncentratprover av Apo- eller lastladdad Bla g 1 till >100 μM med hjälp av en centrifugalfilterenhet enligt beskrivningen i 3.1.
- Återfukta referensfosfolipid i PBS-buffert till slutliga koncentrationer på 2, 1, 5, 1, 0, 5 och 0, 25 mM.
- Späd prover 1:1 med cholatebuffert (100 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% w/v cholate) till en total volym på ~600 μL.
OBS: Cholate används i detta steg för att helt extrahera och lösliga lipider från Bla g 1 hydrofobiska håligheten. Detta säkerställer att den kemiska miljön kring fosfolipidgrupperna är konsekvent mellan olika prover, vilket möjliggör dess kvantitativa bedömning med hjälp av 31P-NMR. Användning av cholat kan ersätta kloroform/metanol enligt beskrivningen tidigare15. - Skaffa 1D 31P-NMR-spektra av cholate-lösliga Bla g 1-prover och referensfosfolipidstandarder med hjälp av en bredbandssond.
OBS: 31P-NMR spektra som presenteras i detta arbete erhölls med hjälp av en 600 MHz spektrometer. Tidigare studier med liknande tekniker tyder dock på att acceptabel känslighet kan uppnås vid fältstyrkor så låga som 150-200 MHz15. - Bearbeta de resulterande uppgifterna med lämplig programvara16.
- Få toppintensiteter med hjälp av önskad NMR-visningsprogram17.
- Jämför Bla g 1 31P-NMR-spektrat med de som erhållits för fosfolipidreferensproverna för att bekräfta avlägsnande av endogent bundna ligander och/eller bindning av önskade ligander baserat på de synliga topparnas kemiska förskjutningar (eller brist på sådana).
- Bekräfta full bindning stoichiometry genom att jämföra toppintensiteten i Bla g 1 spektrumet med fosfolipid referensstandarder.
6. Bekräfta Bla g 1 vikning
- Förbered 0,5 μM prover av Bla g 1 i CD-buffert (100 mM KH2PO4, buffert pH 7,5). Ladda 2 ml av provet i en 10 mm CD-cuvette med magnetisk omrörningsstång.
- Mät CD-spektrumet bla g 1 för att bekräfta rekonstitution av sekundär struktur. Se till att Photomultipliers (PMT) spänning inte överskrider tillverkarens rekommendationer (i allmänhet 1 kV).
- Mät CD-signalen från 260–200 nm vid 25 °C med en datahöjd på 0,2 nm och en skanningshastighet på 20 nm/s med en dataintegrationstid på 1 s.
- Öka temperaturen i CD-cellen från 25 °C–95 °C med en hastighet av 0,5 °C/min. Aktivera magnetomrörstången för att säkerställa att temperaturen är jämn över provet.
- Bildskärms-CD vid 222 nm, med avläsningar var 2 °C.
- Anpassa resulterande data till en 2-stats Boltzman-kurva för att bestämma smälttemperaturen. På grund av den höga stabiliteten hos Bla g 1 definierades smälttemperaturen (MT25)som den temperatur vid vilken proteinet har förlorat 25% av sin ursprungliga CD vid 222 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av affinitetskromatografi isolerades rekombinant GST-Bla g 1 lätt till en hög renhetsnivå (figur 1A), vilket ger ett utbyte av ~ 2-4 mg / L av cellkultur. Inkubation över natten med TEV-proteas vid 4 °C är tillräcklig för att ta bort GST-taggen, vilket ger slutprodukten vid ~ 24 kDa. Observera att det i detta fall finns en betydande mängd GST-Bla g 1 i genomflödes- och tvättfraktionerna, vilket tyder på att glutationhartsbindningskapaciteten överskreds. Användning av mer harts eller flera cykler av provbelastning och eluering kan ge ett botemedel mot detta problem.
Om bla g 1 appliceras på en C18-kolumn i omvänd fas får en distinkt elueringsprofil (Figur 1B), med två stora toppar vid ~ 50% buffert B, och en andra stor topp vid ~ 75% buffert B. SDS-PAGE-analys av de resulterande fraktionerna tyder på att den förstnämnda motsvarar den klyvda GST-taggen, medan den senare motsvarar Bla g 1. Ibland kommer en tredje, mindre topp att inträffa i mitten som motsvarar återstående, oknämda GST-Bla g 1. Förekomsten av denna okvävda produkt kan elimineras genom att öka mängden TEV som används i klyvningsreaktionen eller förlänga inkubationstiden. Även om ofullständig klyvning kommer att minska utbytet, är separationen som erhålls på C18-kolumnen tillräcklig för att säkerställa att renheten hos den slutliga Bla g 1-produkten förblir kompromisslös. En konsekvens av hplc i omvänd fas är att den slutliga proteinprodukten eluteras till en organisk lösningsmedelsmiljö. Även om detta underlättar avlägsnandet av hydrofobiska ligander, krävs avlägsnande av detta lösningsmedel via lyofilisering, vilket ger ett fluffigt vitt pulver (figur 1C).
Glödgning av proteinet krävs för att rekonstruera den inhemska Bla g 1-vikningen och kan utföras antingen i frånvaro eller närvaro av en lipidlast. Tillsats av DMSO till de torkade Bla g 1- och fosfolipidlasterna före omdubblningsbufferten underlättar löslighetsprocessen, även om vissa längre kedjefettlaster inte kommer att lösas upp helt ens vid förhöjda temperaturer. Detta observerades dock inte för att påverka belastningseffekten bland de lipider som testades i våra studier (figur 1C). På samma sätt kommer överflödiga lipider ofta att fälla ut ur lösningen eller bilda stora blåsor vid kylning, vilket resulterar i ett grumligt utseende efter glödgning (Figur 1C). Detta observerades inte heller för att påverka lasteffektiviteten, och eventuella aggregat avlägsnas lätt genom filtrerings- och efterföljande buffertutbytessteg för att ge en tydlig och transparent lösning. Trots de hårda förhållandena observerades ingen termolys för Bla g 1.
Figur 1: Första reningen av Bla g 1. (A) SDS-PAGE som visar den lösliga proteinfraktionen efter initial lysis (S). genomflöde (FT), tvätt (W) och eluering från glutation-sepharose-kolonnen (E). och den slutliga Bla g 1-produkten efter TEV-klyvning av GST-taggen (TEV). HPLC-elueringsprofilen för den resulterande Bla g 1-produkten efter TEV-klyvning visas i (B). En280 visas i blått, medan elueringsgradienten (% buffert B) visas i grönt. Fraktioner som motsvarar den klyvda GST-taggen (H1, H2), återstående oklydnad GST-Bla g 1 (H3) och renad Bla g 1 (H4) indikeras med röda pilar på ~ 50%, ~ 65% respektive ~ 74% buffert B. SDS-PAGE analys av fraktioner H1- H4 visas i (A) och märks i enlighet därmed. C)Representativa bilder som visar Bla g 1 i olika skeden av glödgningsprocessen. Observera att den exakta och omfattning av fällningsbildningen enligt ii och iii är beroende av vilken typ av lipidlast som används. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
31 (31) P-NMR-spektra av Apo-Bla g 1 som renats på detta sätt visar inga påvisbara fosfolipider vare sig av NMR (figur 2A) eller tunnskiktskkromotografi (data visas inte). Däremot visar liknande spektra som erhållits för Bla g 1 laddat med en distearoylfosfatidylkolin (DSPC) fosfolipid en stark topp som motsvarar fosfatidylkolingruppen. Som jämförelse visar ett representativt 31P-NMR-spektrum av Bla g 1 renat från rekombinant E. coli utan användning av lipidborttagnings-/glödgningsprotokollet som beskrivs häri (ecBla g 1) en heterogen blandning av endogena lipider extraherade från det rekombinanta uttryckssystemet (figur 2B). Med hjälp av NMR:s kvantitativa karaktär kan en standardkurva tas fram med hjälp av referensprover av kända DSPC-koncentrationer(figur 2C). Att jämföra den 31P-signalintensitet som erhålls från DSPC-Bla g 1 med denna standardkurva ger en bindande stoichiometry på 4,7 ± 0,5 lipider per protein; ett värde som kan jämföras positivt med den förväntade fullbindnings stoichiometry som erhållits från i silicostudier och strukturell analys9. Observera att denna teknik endast kommer att upptäcka ligander som innehåller en 31P-kärna som fosfolipider, lysophospholipider, lipopolysackarider etc. Detta protokoll kan dock enkelt anpassas för 13C-NMR-analys. I det här fallet skulle metyl-13C-märkta fettsyror rekommenderas på grund av dess gynnsamma NMR-avslappningsegenskaper. Att begränsa isotopmärkning till en enda plats underlättar också spektraltolkning, eftersom endast en enda topp förväntas, samtidigt som kostnaden i förhållande till enhetliga 13C-märkta motsvarigheter minskas. Ett alternativt tillvägagångssätt skulle vara att använda massspecifikationer för att identifiera bundna ligands, vilket framgår av en tidigare studie som identifierade en blandning av fettsyror som den naturliga lasten av Bla g 1 isolerad från kackerlacksfras (nBla g 1)9. Den begränsade kvantifieringsförmågan hos massspecifikationer hindrade dock en noggrann mätning av bindande stoichiometry utan tillräckliga standarder.
Figur 2: Kontroll av borttagning och lastning av lipider av Bla g 1. a) 31P-NMR-spektra av Apo- (svart) eller DSPC-laddad Bla g 1 (röd) beredd med hjälp av glödgningsprotokollet som beskrivs i detta arbete och som visar att lipider helt avlägsnats i det förstnämnda, och homogen belastning av fosfatidylkolin (PC) lipider som uppnåtts i det senare. Bla g 1 renad från rekombinant E. coli utan lipidborttagning och glödgning (ecBla g 1) visar däremot en heterogen blandning av endogen fosfatidyletanolamin (PE) och fosfatidylglycerol (PG) lipider när de analyseras med denna metod (B). En representativ standardkurva som erhålls från DSPC-referensprover av kända koncentrationer visas i( C), från vilken Bla g 1-bindande stoichiometry kan erhållas. Siffror anpassade från Foo et al. (2019) och presenterades under Creative Commons CC BY License9. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kristallstrukturer av Bla g 1 avslöjar en unik vik bestående av 12 amphipatiska alfa-helices. Cirkulär dichroism representerar en snabb och bekväm metod för att bedöma om denna vik framgångsrikt har rekonstruerats efter glödgningsprocessen. CD-spektra för Apo- och lipid (nMix)-laddad Bla g 1 show minima ~220 och 210 nm som tyder på en övervägande alfa-spiralformad struktur (Figur 3A). Detta spektrum är extremt likt det som erhållits för ecBla g 1 och nBla g 1, vilket ger ytterligare bevis för att den inhemska strukturen i Bla g 1 framgångsrikt återvinns. Detta bekräftades ytterligare genom användning av 19F och 1H-15N lösning-NMR, vars fullständiga diskussion finns tillgänglig någon annanstans9. CD-baserade termiska denatureringsanalyser visar en kooperativ förlust av alfa-spiralformad sekundär struktur som tyder på en vikt klotformig domän (figur 3B). Analysen av de resulterande smälttemperaturerna (Figur 3C) visar en betydande ökning vid nMix ligand-bindning. Denna förhöjda termostabilitet är i linje med den som beräknas för nBla g 1, vilket indikerar att vi fullt ut kan reproducera det naturliga tillståndet i Bla g 1. Observera att ecBla g 1 också visar en liknande, om inte större förbättring av termostabilitet, som illustrerar potentialen för kvarvarande endogent bundna lipider att störa biofysisk karakterisering av allergener som renats med traditionella FPLC-baserade metoder. Däremot ger förmågan att kvantitativt ta bort och ladda om hydrofoba laster från allergener som Bla g 1 en unik väg för att undersöka lipidernas roll i det allergiska svaret. Här beskriver vi en metod för att undersöka lipidlasters inverkan på strukturen, stabiliteten och endosomal bearbetningen av de allergiframkallande proteinerna själva, även om andra studievägar kan övervägas.
Figur 3: Bekräfta framgångsrik återhämtning av Bla g 1-viken. (A)CD-spektra av Apo- (svart) eller nMix-laddad (röd) Bla g 1 renad och glödgad med hjälp av det protokoll som beskrivs häri, med minima vid ~220 och 210 nm som tyder på en övervägande alfa-spiralformad struktur som överensstämmer med den tillgängliga röntgenkristallstrukturen. Både Apo- och nMix-laddade Bla g 1-spektra är extremt lika med den som erhålls för Bla g 1 renad från rekombinant E. coli (ecBla g 1, grön) eller från dess naturliga allergiframkallande källa (nBla g 1, blå) utan lipidborttagnings- och glödgningsprotokollet, vilket ytterligare stöder den framgångsrika återhämtningen av den inhemska strukturen i den förra. B)Representativa termiska profiler för Apo- (svart) och nMix-laddad (röd) Bla g 1 som visar en sigmoidal kurva som indikativt utvecklas. nBla g 1 (blå) och ecBla g 1 (grön) visas som referens. De beräknade smälttemperaturerna (MT25)för Bla g 1 visas i (C). Bindning av nMix ligands (röd) ger en betydande ökning av termostabilitet i förhållande till Apo-Bla g 1 (svart). Detta speglar den trend som observerats för nBla g 1 (blå), vilket tyder på att vi framgångsrikt kan återställa det ursprungliga tillståndet. Den ännu större stabilitet som observerats för ecBla g 1 belyser potentialen hos endogent bundna lipider att störa biofysisk karakterisering av allergener. MT25-värden som presenteras i C representerar det medelvärde som erhållits från minst tre oberoende studier. Felstaplar representerar motsvarande standardavvikelsevärden. Siffror anpassade från Foo et al. (2019) och presenterades under Creative Commons CC BY License9. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs i detta arbete har framgångsrikt tillämpats för att systematiskt studera lipidbindningsegenskaperna hos Bla g 1. Detta visade ett samband mellan lastbindning, termostabilitet och endosomal bearbetning, varav den senare var korrelerad med minskning av genereringen av en känd T-cells epitop med potentiella konsekvenser för immunogenicitet9,18. Förutom Bla g 1 har andra allergener som Pru p 3 och Bet v 1 visat sig behålla sina endogent bundna laster när de renas med hjälp av standard affinitet och storleksuteslutning kromatografimetoder 13,19,20,21,22. Dessa ovälkomna gäster kan ändra dessa proteiner biofysiska och immunologiska egenskaper på ett liknande sätt, vilket belyser behovet av tekniker för att säkerställa fullständig delipidation som den som presenteras här.
Medan användningen av omvänd fas HPLC vid rening av allergener har beskrivitstidigare 2, koppling det med ett termiskt glödgningsprotokoll ger den ganska ovanliga möjligheten att rekonstituera allergener med en rad naturliga och icke-naturliga ligands, så att användare kan sondera lipid-allergen interaktioner. Detta termiska denatureringssteg befanns vara nödvändigt för två huvudändamål. För det första krävs termisk denaturering för att underlätta ligand tillgång till deras bindande håligheter som på grund av sin hydrofobiska natur ofta är begravda bort från vattenlösningsmedel9,22. För det andra bildar hydrofobiska ligander som fettsyror och fosfolipider ofta större supramolecular strukturer som micelles eller vesicles när de placeras i en vattenhaltig miljö. Koncentrationen av monomeriska eller "fria" ligands som är tillgängliga för proteinbindning kan approximeras med hjälp av den kritiska micellekoncentrationen (CMC). DSPC och andra långkedjåriga fosfolipider har CMC-värden i nM-intervallet, vilket indikerar att det praktiskt taget inte finns några gratis ligands tillgängliga för Bla g 1-bindning. Även korta kedjefetter och fettsyror har CMC i det låga μm till mM-intervallet, vilket indikerar att en stor del av dessa ligands förblir i micellar- eller bilayerfasen23. De höga temperaturer som används i vårt denatureringsprotokoll sprider dock dessa större aggregat, vilket underlättar bindning. Tidigare studier har vanligtvis använt långvariga inkubationstider för att underlätta denna process. Bristen på en termisk denaturerings-/glödgningsprocess väcker dock tvivel om lastningens effektivitet. Till exempel gav inkubation av mitten allergen Der p 5 med fluorescerande fettsyra analog 11-(Dansylamino)undecanoic acid (DAUDA) en bindande stoichiometry på 0,66 trots att ha en stor hydrofobisk hålighet i nivå med Bla g 124. På samma sätt konstaterades att den bindande specificiteten och stoichiometry av växt nsLTPs varierade kraftigt beroende på om lipiderna och proteinet först löses i metanol före tillsats av vattenbuffert, vilket indikerar att ligand och/eller bindande platstillgänglighet var en begränsande faktor25.
Förutom Bla g 1 har vi framgångsrikt tillämpat samma strategi på flera andra MA-domänproteiner från kackerlackor och mygga (A. aegypti), liksom Der p 2 (data som inte visas). Vi noterade att både Bla g 1 homologer och Der p 2 eluted vid en annan tidpunkt än Bla g 1 från C18 kolumnen (steg 3.3). Elueringsgradienterna i detta steg kan behöva optimeras för andra proteiner. Alternativt kan HPLC-kolonner med en mindre hydrofobisk stationär fas (t.ex. C8) användas, men när det gäller Bla g 1 var den ökade hydrofobiska C18-kolonnen nödvändig för att helt avlägsna diacylfosfolipida föroreningar från ecBla g 1. Trots skillnaderna i biofysiska och biokemiska egenskaper har vi funnit att detta protokoll är extremt robust och lätt kan appliceras på andra allergiframkallande proteiner. Medan de hårda förhållanden som används kan utgöra en potentiell begränsning, minskar den ökade motståndskraften som observerats för många allergener dessinverkan 26,27. Faktum är att flera mat- och inhalationstenergener som Der p 2, Ber e 1, Ara a 6 och Lep w 1 har observerats för att återställa sin struktur och immunogenicitet efter termisk denaturering, även om optimering av buffertförhållanden kankrävas 28,29,30,31,32,33; Till exempel reversibla denaturering av nsLTP (Cor a 8) och thaumatins (Mal d 2 och Act d 2) observeras endast under sura (pH <4) förhållanden28,30,31. Dessutom bör det noteras att författarna inte försökte optimera vare sig tidpunkten eller temperaturerna som används i glödgningsprotokollet. Det är möjligt att ligand löslighet och protein vikning /utfällning kan uppnås med en lägre maximal temperatur sett med Ber e 1 för vilken reversibel denaturering uppnås vid 82 °C29. Användningen av sådana åtgärder förväntas utöka det spektrum av allergener som detta protokoll kan tillämpas på.
En annan viktig faktor när man anpassar detta protokoll till andra allergensystem är koncentrationen av ligander som krävs under glödgningsprocessen. När det gäller Bla g 1 är det förväntade utbytet ~ 0,25-0,4 μmol protein per 1 L cellkultur. Med tanke på den påvisade bindande stoichiometry av 8 fettsyror eller 4 diacyl kedjan lipider per allergen, användes en 20-40 gånger molar överskott av last (5-10 μmol). Det bör noteras att lipidbindningsförmågan hos Bla g 1 och dess homologer är unik; till exempel är nsLTP: er allmänt accepterade att binda högst två lipidligander25 medan lipokcaliner har mindre än 1 stoichiometry34. Som sådan kan fullständig lastning av dessa typer av allergener åstadkommas med ett mindre överskott av ligands. En slutlig faktor vid anpassning av detta protokoll till andra allergensystem är förekomsten av disulfidbindningar, vilket kan vara problematiskt om det inte bildas ordentligt före denaturering. Ett möjligt tillvägagångssätt skulle vara att genomföra glödgningsprocessen i närvaro av ett reducerande medel som 2 mM DTT. De inhemska disulfidbindningarna kunde därefter ombildas genom tillsats av minskad och oxiderad glutation som beskrivs för jordnöts allergen fragmentet studerade av Aalberse et al.35. I detta fall bör återvinning av rätt disulfidbindning empiriskt bedömas med masspektrometri35.
I detta arbete beskriver vi en teknik genom vilken allergener kan delipideras och re-glödgas med olika fosfolipid och fettsyra laster. Det finns dock många andra klasser av potentiellt immunogena eller adjuventising ligands närvarande inom vanliga allergen reservoarer. Till exempel har katt-, hund- och mittenallergener föreslagits att binda lipopolysackarider (LPS) och andra bakteriella lipider från husdamm36, medan Bet v 1 har visat sig extrahera komplexa flavonoider från pollenmatrisen13. Protokollet som beskrivs i detta arbete kan enkelt anpassas för att utforska dessa lipiders roll på ett mer detaljerat sätt. Som ett konceptbevis har vi kunnat visa att den hydrofoba håligheten hos Bla g 1 kan binda lipotischsyra (LTA) från cellväggarna hos grampositiva bakterier, men utesluter LPS från gramnegativa arter, vilket potentiellt återspeglar det större antalet akrylkedjor i de senare9. Om man tar detta ett steg längre kan man använda det termiska denaturerings-/glödgningsprotokollet för att införliva fluorescerande sonder och andra icke-naturliga fettsyraanaloger i allergenproteiner. Faktum är att vi kunde ladda den hydrofobiska håligheten hos mygghomologen Bla g 1 med DAUDA, vilket öppnade ytterligare vägar för att undersöka effekterna av lipidligander på allergiframkallande sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dr. Tom Kirby, Scott Gabel och Dr. Robert London för deras hjälp och hjälp under hela detta arbete, tillsammans med Dr. Bob Petrovich och Lori Edwards för användningen av deras instrumentering och deras hjälp med att generera Bla g 1-konstruktionerna som används i denna studie. Vi tackar Andrea Adams för hjälp med masspektrometrin och Dr. Eugene DeRose för hjälp med NMR-instrumenteringen. Denna forskning stöddes av NIH: s intramurala forskningsprogram, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institute of Environmental Health Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
