Summary
Questo protocollo descrive la rimozione dei lipidi endogeni dagli allergeni e la loro sostituzione con ligandi specificati dall'utente attraverso HPLC in fase inversa accoppiato con ricottura termica. 31 di cui: La commissione per la P-NMR e dicroismo circolare consentono la rapida conferma della rimozione/caricamento del ligando e il recupero della struttura allergenica nativa.
Abstract
Molti allergeni principali si legano a molecole idrofobiche lipidiche, tra cui Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 e Fel d 1. Questi ligandi sono fortemente mantenuti e hanno il potenziale per influenzare il processo di sensibilizzazione stimolando direttamente il sistema immunitario o alterando le proprietà biofisiche della proteina allergenica. Al fine di controllare queste variabili, sono necessarie tecniche per la rimozione dei ligandi legati endogenamente e, se necessario, la sostituzione con lipidi di composizione nota. L'allergene scarafaggio Bla g 1 racchiude una grande cavità idrofobica che lega una miscela eterogenea di lipidi endogeni quando purificata con tecniche tradizionali. Qui descriviamo un metodo attraverso il quale questi lipidi vengono rimossi utilizzando HPLC in fase inversa seguito da ricottura termica per produrre Bla g 1 nella sua forma Apo o ricaricati con una miscela definita dall'utente di acidi grassi o carichi fosfolipidici. L'accoppiamento di questo protocollo con saggi biochimici rivela che i carichi di acidi grassi alterano significativamente la termostabilità e la resistenza proteolitica di Bla g 1, con implicazioni a valle per il tasso di generazione di epitopi delle cellule T e allergenicità. Questi risultati evidenziano l'importanza dei protocolli di rimozione/ricarica lipidica come quello descritto nel presente documento quando si studiano gli allergeni provenienti sia da fonti ricombinanti che naturali. Il protocollo è generalizzabile ad altre famiglie di allergeni tra cui lipocaline (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) e Uteroglobina (Fel d 1), fornendo un prezioso strumento per studiare il ruolo dei lipidi nella risposta allergica.
Introduction
Un'indagine del database degli allergeni rivela che gli allergeni si trovano solo nel 2% di tutte le famiglie proteiche conosciute, suggerendo che le proprietà funzionali e biofisiche comuni contribuiscono all'allergenicità1. Di queste proprietà, la capacità di legare carichi lipidici sembra essere fortemente sovrarappresentate tra gli allergeni, suggerendo che questi carichi possono influenzare il processo di sensibilizzazione1. In effetti, è stato dimostrato che l'allergene della noce del Brasile Ber e 1 richiede la co-somministrazione con il suo lipide endogeno per realizzare il suo pieno potenzialesensibilizzante 2. Questi lipidi potrebbero potenzialmente stimolare il sistema immunitariodirettamentecome illustrato dagli allergeni degli acari Der p 2 e Der p 7, entrambi condividono una forte omologia strutturale con proteine leganti LPS 3,4,5. Sulla base di questa osservazione è stato proposto che Derp 2 e Der p 7 potessero legare lipidi batterici e stimolare direttamente il sistema immunitario ospite attraverso la segnalazione mediata da TLR4, facilitando il processo di sensibilizzazione5,6. È anche possibile che i lipidi legati endogenamente possano alterare le proprietà biofisiche delle stesse proteine allergeniche. Ad esempio, la capacità di Sin a 2 (senape) e Ara h 1 (arachidi) di interagire con vescicole fosfolipidiche ha aumentato significativamente la loro resistenza alla degradazione gastrica ed endosomica7, mentre il legante al principale allergene di polline di betulla Bet v 1 ha alterato sia il tasso di lavorazione endosomica che la diversità dei peptidirisultanti 8. Ciò è particolarmente rilevante per l'allergenicità data la correlazione osservata tra stabilità, generazione di epitopi delle cellule T e allergenicità per proteine come Bet v 1 e Bla g 1; quest'ultimo sarà oggetto di questo lavoro9,10.
Bla g 1 rappresenta il membro prototipo della famiglia proteica dell'insetto Major Allergen (MA) e possiede una struttura unica composta da 12 alfa eliche anfipatiche che racchiudono una cavità idrofobica anormalmentegrande 9,11. La struttura cristallina a raggi X disponibile di Bla g 1 mostra la densità degli elettroni all'interno di questa cavità coerente con i ligandi fosfolipidici o acidi grassi legati; una congettura confermata da 31P-NMR e spettrometria di massa. Questi carichi erano di natura eterogenea e la loro composizione dipendeva fortemente dalla fonte allergenica, con diversi profili lipidici osservati per il ricombinante Bla g 1 espresso in E. coli e P. pastoris. Curiosamente, Bla g 1 purificato dalla sua fonte naturale di allergeni (frass di scarafaggio) conteneva prevalentemente acidi grassi all'interno del suo sito di legame, con una miscela di palmitato, oleato e stearato identificati come suoi ligandi "naturali"9,11. La capacità di Bla g 1 di trattenere lipidi e acidi grassi a seguito di molteplici fasi di purificazione ostacola gli sforzi per studiare la proteina in isolamento. Al contrario, è stato suggerito che i ligandi naturali palmitati, stearati e oleati di Bla g 1 (d'ora in poi denominati nMix) svolgano un ruolo chiave sia nella sua allergenicità che nella funzione biologica nativa9. Tuttavia, questi ligandi non sono presenti nel Bla g 1 ottenuto da fonti ricombinanti, rendendo difficile valutare questa ipotesi. Problemi simili sono stati osservati per altri allergeni leganti lipidici come Bet v 112,13. Per facilitare lo studio sistematico delle interazioni lipidico-allergene abbiamo sviluppato un protocollo attraverso il quale gli allergeni possono essere quantitativamente spogliati dei loro lipidi legati endogenamente e ricostituiti in forma Apo o caricati con ligandi specifici.
Gli allergeni sono più comunemente purificati dalle loro fonti naturali o ricombinanti usando cromatografia di affinità e/o cromatografia ad esclusione di dimensioni. Qui, introduciamo un ulteriore passaggio di purificazione sotto forma di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) impiegando una colonna C18 in fase inversa da cui l'allergene viene eluito in un solvente organico simile ai protocolli sviluppati per le proteine leganti gli acidigrassi 14. La proteina risultante viene quindi sottoposta a una fase di ricottura termica in assenza o presenza di acidi grassi e/o fosfolipidi. Oltre a recuperare la piega nativa Bla g 1, le temperature elevate aumentano la solubilità e l'accessibilità dei carichi lipidici, producendo Bla g 1 in forma di Apo o caricati uniformemente con il ligando idrofobico desiderato. 31 di cui: La commissione per la Gli spettri P-NMR di Bla g 1 purificati in questo modo hanno confermato la completa rimozione dei ligandi legati endogenamente e la sostituzione uniforme con i composti desiderati, mentre il dicroismo circolare ha confermato il successo del recupero della piega Bla g 1. L'utilità di questo metodo è evidenziata in un recente lavoro in cui è stato trovato il legame del carico per migliorare la termostabilità e la resistenza proteolitica bla g 1, alterando la cinetica della generazione di epitopi delle cellule T con potenziali implicazioni per la sensibilizzazione e l'allergenicità9.
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Protocol
1. Bla g 1 clonazione
- Ottenere il gene per l'allergene scarafaggio Bla g 1.0101 (residui 34-216), che rappresenta una singola ripetizione del dominio MA. Per semplicità, Bla g 1 sarà usato durante tutto il lavoro per rappresentare questa singola ripetizione, piuttosto che l'intera trascrizione bla g 1.0101.
- Subcllone il gene Bla g 1 nel vettore desiderato. In questo studio, il gene contenente un tag N-terminale glutatione S-transferasi (GST) accoppiato a un sito di scissione della proteasi del virus dell'incisione del tabacco (TEV) è stato inserito in un vettore pGEX per l'espressione come descrittoin precedenza 11.
- Trasformate il vettore Bla g 1 pGEX in cellule BL21 DE3 E. coli.
- Preparare uno stock di 10 ng/μL del vettore desiderato.
- Combinare 1 μL di 10 ng/μL di DNA stock con 50 μL di cellule BL21 DE3 come fornito dal produttore.
- Incubare la miscela BL21 DE3-DNA per 30 minuti sul ghiaccio. Trasferire in un bagno d'acqua a 42 °C per 1 min, quindi trasferire immediatamente sul ghiaccio per un'ulteriore incubazione di 1 minuto.
- Aggiungere 200 μL di mezzi LB alle cellule e incubare per un ulteriore 1 h a 37 °C.
- Placcare le cellule trasformate su piastre LB-Agar contenenti 100 mg/L di ampicillina e crescere a 37 °C durante la notte.
2. Espressione iniziale e purificazione
- Inoculare 1 L di supporti LB contenenti 100 mg/L di ampicillina con una singola colonia di cellule BL21 DE3 trasformate con il vettore Bla g 1 come descritto in 1.3. Crescere a 37 °C durante la notte.
- Il giorno successivo, le cellule di raccolta (OD600 ~1,5) tramite centrifugazione a 6.000 x g per 10 minuti e resuspend in 2 L di 2 mezzi YT contenenti 100 mg/L di ampicillina. Lasciare crescere le cellule per un ulteriore 1 h a 37 °C a un OD600 > 0,6.
- Indurre l'espressione proteica attraverso l'aggiunta di 0,5 mM IPTG. Trasferire le cellule a 18 °C e incubare durante la notte.
- Il giorno successivo, raccogliere le cellule come descritto al punto 2.2. Il pellet di cellule risultante può essere congelato e conservato a -20 °C.
- Pellet di resuspend ottenuto da 1 L di coltura in 50 mL di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM NaCl) contenente 1 compressa inibitore della proteasi (o equivalente) e 1 μL di nucleasi benzonasi.
- Le cellule Lyse che utilizzano un sonicatore a sonda (500 W, 20 kHz) sono impostate sul 30-50% di potenza per 4 minuti con un ciclo di servizio del 50%. Mantenere il lysate in un bagno di ghiaccio durante la sonicazione
- Centrifuga lysate a 45.000 x g per 20 min. Scartare la frazione insolubile (pellet).
- Rimuovere 28 μL di proteine solubili. Combinare con 7 μL di buffer SDS-PAGE 5x e memorizzare per l'analisi SDS-PAGE. Ripetere questo passaggio per le frazioni di flusso, lavaggio ed eluizione della colonna GST prima e dopo l'incubazione con TEV.
- Applicare proteine solubili (supernatanti) su una colonna di resina glutatione (~10 mL volume totale del letto) equilibrata in PBS pH 7.4.
- Lavare tutte le proteine non unite utilizzando 50 mL di PBS.
- Elute GST-Bla g 1 con 50 mL di PBS contenente glutatione ridotto di 10 mM.
- Incubare proteine eluite con proteasi TEV da 0,2 kU durante la notte a 4 °C o temperatura ambiente per 6 ore per rimuovere l'etichetta GST.
3. Rimozione endogena dei lipidi tramite HPLC in fase inversa
- Raccogliere il Bla g 1 scisto e concentrarlo a ~2 mL utilizzando un'unità filtrante centrifuga con un taglio del peso molecolare <10 kDa.
- Aggiungere <12 mL alla parte superiore del concentratore e ruotare a 5.000 x g per 10-15 minuti in un rotore a benna oscillante.
NOTA: Il volume del campione e la velocità di rotazione variano in base al filtro specifico e al tipo di rotore impiegato. Consultare la documentazione del produttore prima dell'uso.
- Aggiungere <12 mL alla parte superiore del concentratore e ruotare a 5.000 x g per 10-15 minuti in un rotore a benna oscillante.
- Caricare il concentrato su un sistema HPLC da 250 x 10 mm dotato di una colonna cromatografica in fase inversa C18 equilibrata con il 97% di tampone A (acqua, 0,1% di acido trifluoroacetico) e il 3% tampone B (acetonitrile, 0,1% acido trifluoroacetico).
NOTA: possono essere utilizzate colonne più piccole, ma le proteine potrebbero essere caricate ed eluizzate utilizzando più cicli per adattarsi alla ridotta capacità di legame. Quando si seleziona una colonna assicurarsi che le perline di resina abbiano una dimensione delle particelle di < 5 μm e dimensioni dei pori di >200 Å per consentire un'efficace separazione delle molecole delle dimensioni di proteine
ATTENZIONE: L'acido trifluoroacetico è altamente corrosivo e deve essere erogato all'interno di una cappa aspirante utilizzando DPI appropriati (ad esempio guanti nitrile, camice da laboratorio e occhiali). L'acetonitrile è sia moderatamente tossico, volatile e altamente infiammabile, deve essere usato e dispensato all'interno di una cappa aspirante utilizzando dPI appropriati (ad esempio guanti di nitrile, camice da laboratorio e occhiali). - Elute Bla g 1 utilizzando il protocollo mostrato nella tabella 1 ad una portata di 1,5-4,0 mL/min. Monitorare il processo di eluizione utilizzando l'assorbanza di fluorescenza a 280 nm.
- Raccogliere e mettere in piscina Bla g 1 frazioni. Bla g 1 normalmente eluisce a >74% tampone B, o ~34-40 min.
NOTA: il tempo di eluizione varia leggermente a seconda della portata o delle dimensioni della colonna. Raccogli frazioni basate su A280 per ottenere i migliori risultati.
- Raccogliere e mettere in piscina Bla g 1 frazioni. Bla g 1 normalmente eluisce a >74% tampone B, o ~34-40 min.
| Tempo (min) | Buffer A (%) | Buffer B (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
Tabella 1: Protocollo di eluizione per bla g 1. Tabella che illustra il gradiente di eluizione impiegato nell'isolamento di Bla g 1 utilizzando una colonna HPLC C18.
- Aliquota il campione in provette di vetro, non riempiendo alcuna provetta più che a metà strada (~4 mL). Coprire i tubi con pellicola di paraffina e perforare il rivestimento con due fori per consentire lo sfiato.
- Preparare un'aliquota separata di 1 mL (aliquota di prova). Questo verrà utilizzato per determinare il rendimento previsto.
- Congelare i campioni e testare l'aliquota mettendoli in un congelatore a -80 °C per 1 h o immersione in azoto liquido. Nel caso del successivo, il tubo deve essere ruotato continuamente per evitare rotture della provetta a causa dell'espansione della fase liquida al momento del congelamento.
- Asciugare i campioni di proteine delipidati risultanti utilizzando un liofilizzatore. Le proteine essiccate possono essere conservate a 4 °C per diversi mesi in un contenitore sigillato.
4. Ricostituzione di Bla g 1 caricato con Apo e carico
- Determinare la resa prevista di Bla g 1.
- Aliquota di prova risuspend liofilizzata, delipidata (post-HPLC) in 5 mL di tampone di ripiezione( 50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
- Scaldare la miscela in un bagno d'acqua (becher da 500 mL con acqua da 250 mL e mescolare la barra su una piastra calda) a 95 °C. Soluzioni vortici in modo intermittente e incubare a 95 °C per 0,5-1 h.
- Rimuovere il fuoco e lasciare lentamente che il bagno d'acqua equilibra a temperatura ambiente (~1 h). La proteina ricotta può essere conservata in questa forma durante la notte a 4 °C, se necessario.
- Passare la miscela bla g 1-lipidica ricotta attraverso un filtro siringa da 0,22 μM per rimuovere il particolato.
- Tamponare lo scambio della proteina filtrata 3x in PBS pH 7.4 utilizzando un filtro centrifugo con taglio da 10 kDa come discusso al punto 3.1 per rimuovere gli acidi grassi liberi residui e il solvente organico.
- Valutare la concentrazione proteica utilizzando il saggio BCA o altro metodo preferito come l'assorbanza UV. Utilizzare questa per determinare la resa prevista per le restanti aliquote Bla g 1.
- Ricostituire Apo- o carico Caricato Bla g 1
- Resuspend Bla g 1 aliquote nel tampone di ripiezione come descritto al 4.1.1.
- Per produrre Apo-Bla g 1, ripetere i passaggi 4.1.2–4.1.6 per ottenere la resa desiderata.
- Per caricare Bla g 1 con acidi grassi, preparare soluzioni stock da 20 mM del carico di acidi grassi desiderato in metanolo o DMSO. Quindi, passa al passaggio 4.2.5.
- Per caricare Bla g 1 con fosfolipidi, preparare uno stock di 10 mg/ml del carico desiderato in cloroformio all'interno di una provetta di vetro.
- Evaporare il cloroformio per produrre un film lipidico. Aggiungere PBS alla provetta per produrre una concentrazione finale di fosfolipidi di 20 mM.
ATTENZIONE: Il cloroformio è dannoso se inalato o ingerito. Utilizzare in una cappa aspirante chimica o utilizzare un respiratore se è disponibile una ventilazione inadeguata. Utilizzare guanti in nitrile, camice da laboratorio e occhiali durante la manipolazione. Consultare MSDS prima dell'uso. - Reidratare il film lipidico riscaldarlo al di sopra della temperatura di transizione di fase del carico lipidico e vortice fino a quando la soluzione diventa torbide. Si noti che la sonicazione potrebbe essere necessaria per ripresopendare completamente e reidratare alcuni carichi.
- Se è necessaria la sonicazione, posizionare la provetta nel sonicatore da bagno (100 W, 42 kHz) e sonicare alla massima potenza fino a quando il carico non viene rimorsi. In alternativa, un sonicatore a sonda (descritto al punto 2.6) può essere utilizzato con una potenza del 10-20% con un duty cycle del 50%.
ATTENZIONE: La sonicazione utilizza onde sonore ad alta frequenza che possono danneggiare l'udito. Utilizzare DPI antirrosimento del rumore (tappi per le orecchie o silenziatori). Se possibile, posizionare il sonicatore all'interno dell'armadio o della camera di smorzamento del suono.
- Evaporare il cloroformio per produrre un film lipidico. Aggiungere PBS alla provetta per produrre una concentrazione finale di fosfolipidi di 20 mM.
- Aggiungere l'acido grasso desiderato o il carico fosfolipidico per produrre un eccesso molare 20x di ligandi rispetto a Bla g 1 in base alla resa prevista determinata in 4.1. Il volume totale di solvente organico aggiunto in questo passaggio non deve superare il 2%. Vortice da mescolare.
NOTA: 1 L di cellule Bl 21 DE3 produce tipicamente ~0,25-0,4 nmol di proteina, corrispondente a ~400 μM ligando per tubo. - Ricottura della proteina come descritto al 4.1.
5. Conferma della rimozione/carico del carico fosfolipidico tramite 31P-NMR
- Concentrare campioni di Bla g da 1 a >100 μM caricato con Apo o carico utilizzando un'unità filtrante centrifuga come descritto al punto 3.1.
- Reidratare il fosfolipide di riferimento nel tampone PBS a concentrazioni finali di 2, 1,5, 1, 0,5 e 0,25 mM.
- Diluire i campioni 1:1 con tampone di colina (100 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10% w/v cholato) ad un volume totale di ~600 μL.
NOTA: Il cholato viene utilizzato in questo passaggio per estrarre e solubilizzare completamente i lipidi dalla cavità idrofobica Bla g 1. Ciò garantisce che l'ambiente chimico che circonda i gruppi testo fosfolipidici sia coerente tra diversi campioni, consentendone la valutazione quantitativa utilizzando 31P-NMR. L'uso del colato può essere sostituito con cloroformio/metanolo come descritto in precedenza15. - Acquisire spettri 1D 31P-NMR dei campioni bla g 1 solubilizzati in colina e standard fosfolipidi di riferimento utilizzando una sonda a banda larga.
NOTA: Gli spettri 31P-NMR presentati in questo lavoro sono stati ottenuti utilizzando uno spettrometro a 600 MHz. Tuttavia, studi precedenti che utilizzano tecniche simili suggeriscono che una sensibilità accettabile può essere raggiunta a livelli di applicazione fino a 150-200 MHz15. - Elaborare i dati risultanti utilizzando il softwareappropriato 16.
- Ottenere intensità di picco utilizzando il software di visualizzazione NMRpreferito 17.
- Confrontare gli spettri Bla g 1 31P-NMR con quelli ottenuti per i campioni di riferimento fosfolipidici per confermare la rimozione dei ligandi legati endogenamente e/o il legame dei ligandi desiderati in base agli spostamenti chimici dei picchi visibili (o della loro mancanza).
- Confermare la stechiometria a legame completo confrontando l'intensità di picco dello spettro Bla g 1 con quella degli standard di riferimento fosfolipidici.
6. Conferma Bla g 1 pieghevole
- Preparare campioni da 0,5 μM di Bla g 1 in tampone CD (100 mM KH2PO4, pH tampone 7,5). Caricare 2 mL del campione in una cuvetta CD da 10 mm con barra di agitazione magnetica.
- Misurare lo spettro CD di Bla g 1 per confermare la ricostituzione della struttura secondaria. Assicurarsi che la tensione del fotomoltiplicatore (PMT) non superi le raccomandazioni del produttore (generalmente 1 kV).
- Misurare il segnale CD da 260 a 200 nm a 25 °C con un'intonazione dati di 0,2 nm e una velocità di scansione di 20 nm/s con un tempo di integrazione dei dati di 1 s.
- Aumentare la temperatura nella cella CD da 25 °C a 95 °C ad una velocità di 0,5 °C/min. Attivare la barra di agitazione magnetica per garantire che la temperatura sia uniforme in tutto il campione.
- Monitora il CD a 222 nm, prendendo letture ogni 2 °C.
- Adattare i dati risultanti a una curva di Boltzman a 2 stati per determinare la temperatura di fusione. A causa dell'elevata stabilità di Bla g 1, la temperatura di fusione (MT25) è stata definita come la temperatura alla quale la proteina ha perso il 25% del suo CD iniziale a 222 nm.
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Representative Results
Usando la cromatografia di affinità, il ricombinante GST-Bla g 1 è stato facilmente isolato ad un alto livello di purezza (Figura 1A), producendo una resa di ~2-4 mg/L di coltura cellulare. L'incubazione notturna con proteasi TEV a 4 °C è sufficiente per rimuovere l'etichetta GST, producendo il prodotto finale a ~ 24 kDa. Si noti che in questo caso c'è una quantità significativa di GST-Bla g 1 nelle frazioni di flusso e lavaggio, suggerendo che la capacità di legame della resina glutatione è stata superata. L'uso di più resina o più cicli di caricamento ed eluizione del campione potrebbe fornire rimedio a questo problema.
L'applicazione del Bla g 1 a una colonna C18 in fase inversa produce un profilo di eluizione distintivo (Figura 1B), con due picchi di grandi dimensioni a ~50% tampone B, e un secondo picco grande a ~75% buffer B. L'analisi SDS-PAGE delle frazioni risultanti suggerisce che i primi corrispondono al tag GST scisto, mentre il secondo corrisponde a Bla g 1. Occasionalmente si verificherà un terzo picco più piccolo al centro corrispondente alla GST-Bla g 1 residua e non sciccata. La presenza di questo prodotto non scollato può essere eliminata aumentando la quantità di TEV impiegata nella reazione di scissione o prolungando il tempo di incubazione. Mentre la scissione incompleta ridurrà la resa, la separazione ottenuta sulla colonna C18 è sufficiente a garantire che la purezza del prodotto finale Bla g 1 rimanga senza compromessi. Una conseguenza dell'HPLC in fase inversa è che il prodotto proteico finale viene eluito in un ambiente solvente organico. Mentre questo facilita la rimozione di eventuali ligandi idrofobi, è necessaria la rimozione di questo solvente attraverso la lofilizzazione, producendo una polvere bianca soffice (Figura 1C).
La ricottura della proteina è necessaria per ricostituire la piega nativa Bla g 1 e può essere effettuata in assenza o presenza di un carico lipidico. L'aggiunta di DMSO ai carichi secchi Bla g 1 e fosfolipidi prima del tampone di ripiepiatura facilita il processo di solubilizzazione, anche se alcuni carichi lipidici a catena più lunga non si dissolveranno completamente anche a temperature elevate. Tuttavia, ciò non ha influito sull'efficacia del carico tra i lipidi testati nei nostri studi(figura 1C). Allo stesso modo, i lipidi in eccesso spesso precipitano fuori dalla soluzione o formano grandi vescicole al raffreddamento, con conseguente aspetto torbido dopo la ricottura (Figura 1C). Anche questo non è stato osservato per aumentare l'efficienza di carico e gli aggregati vengono prontamente rimossi attraverso la filtrazione e le successive fasi di scambio tampone per produrre una soluzione chiara e trasparente. Nonostante le dure condizioni, non è stata osservata alcuna termolisi per Bla g 1.
Figura 1: Purificazione iniziale del Bla g 1. (A) SDS-PAGE che mostra la frazione proteica solubile dopo la llisi iniziale (S); flusso (FT), lavaggio (W) ed eluizione dalla colonna glutatione-sefarose (E); e l'ultimo prodotto Bla g 1 dopo la scissione TEV del tag GST (TEV). Il profilo di eluizione HPLC del prodotto Bla g 1 risultante dopo la scissione TEV è riportato in (B). Un280 è mostrato in blu, mentre il gradiente di eluizione (% Buffer B) è mostrato in verde. Le frazioni corrispondenti all'etichetta GST scissa (H1, H2), alla GST-Bla g 1 (H3) residue non scissa e al Bla g 1 purificato (H4) sono indicate rispettivamente con frecce rosse a ~50%, ~65% e ~74% buffer B. L'analisi SDS-PAGE delle frazioni H1- H4 è mostrata nella (A) ed etichettata di conseguenza. (C) Immagini rappresentative che mostrano bla g 1 nelle varie fasi del processo di ricottura. Si noti che la precisione e l'entità della formazione di precipitati di cui ai dati ii e iii dipendono dal tipo di carico lipidico impiegato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
31 di cui: La commissione per la Gli spettri P-NMR di Apo-Bla g 1 purificati in questo modo non mostrano fosfolipidi rilevabili né da NMR (Figura 2A) né da cromatografia a strato sottile (dati non mostrati). Al contrario, spettri simili ottenuti per Bla g 1 caricato con un fosfolipide distearoilfosfatidilcolina (DSPC) mostrano un picco forte corrispondente al gruppo testa della fosfatidilcolina. Per fare un confronto, uno spettro rappresentativo 31P-NMR di Bla g 1 purificato dal ricombinante E. coli senza l'uso del protocollo di rimozione/ricottura lipidica descritto nel presente documento (ecBla g 1) mostra una miscela eterogenea di lipidi endogeni estratti dal sistema di espressione ricombinante(figura 2B). Sfruttando la natura quantitativa della NMR, è possibile produrre una curva standard utilizzando campioni di riferimento di concentrazioni DSPC note (Figura 2C). Confrontando l'intensità del segnale 31P ottenuta da DSPC-Bla g 1 con questa curva standard si ottiene una stechiometria legante di 4,7 ± 0,5 lipidi per proteina; un valore che si confronta favorevolmente con la stechiometria di legame completo prevista ottenuta da studi silico e analisi strutturali9. Si noti che questa tecnica rileverà solo ligandi che contengono un nucleo 31P come fosfolipidi, lisofosfolipidi, lipoppiosaccaridi ecc. Tuttavia, questo protocollo può essere facilmente adattato per l'analisi C-NMR 13. In questo caso, gli acidi grassi etichettati metil-13C sarebbero raccomandati a causa delle sue favorevoli proprietà di rilassamento NMR. Limitare l'etichettatura isotopica a un singolo sito facilita anche l'interpretazione spettrale, poiché è previsto un solo picco, riducendo contemporaneamente il costo rispetto alle controparti uniformi con etichetta 13C. Un approccio alternativo sarebbe quello di utilizzare specifiche di massa per identificare i ligandi legati, come dimostrato in uno studio precedente che ha identificato una miscela di acidi grassi come il carico naturale di Bla g 1 isolato dalla mischia di scarafaggio (nBla g 1)9. Tuttavia, le limitate capacità di quantificazione delle specifiche di massa precludevano una misurazione accurata della stechiometria legata senza standard sufficienti.
Figura 2: Verifica della rimozione e del carico lipidico di Bla g 1. (A) 31spettri P-NMR di Apo- (nero) o DSPC caricato Bla g 1 (rosso) preparati utilizzando il protocollo di ricottura descritto in questo lavoro che dimostra la completa rimozione dei lipidi nel primo e il carico omogeneo di lipidi fosfatidilcolina (PC) raggiunto nel secondo. Al contrario, Bla g 1 purificato dal ricombinante E. coli senza stripping lipidico e ricottura (ecBla g 1) mostra una miscela eterogenea di fosfatidilammina endogenamina (PE) e lipidi fosfatidilglicerolo (PG) se analizzati con questo metodo (B). Una curva standard rappresentativa ottenuta da campioni di riferimento DSPC di concentrazioni note è indicata nella letteraC, dalla quale è possibile ottenere la stechiometria leganti Bla g 1. Figure adattate da Foo et al. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Le strutture cristalline di Bla g 1 rivelano una piega unica composta da 12 alfa-eliche anfipatiche. Il dicroismo circolare rappresenta un metodo rapido e conveniente per valutare se questa piega è stata ricostituita con successo dopo il processo di ricottura. Gli spettri CD per Bla g 1 caricato con Apo e lipidi (nMix) mostrano minimi ~220 e 210 nm indicativi di una struttura prevalentemente alfa-elicoiale (Figura 3A). Questo spettro è estremamente simile a quello ottenuto per ecBla g 1 e nBla g 1, fornendo ulteriori prove che la struttura nativa di Bla g 1 è stata recuperata con successo. Ciò è stato ulteriormente confermato dall'uso di soluzione-NMR 19F e1 H-15N, la cui discussione completa è disponibile altrove9. I saggi di denaturazione termica basati su CD mostrano una perdita cooperativa di struttura secondaria alfa-elicoiale indicativa di un dominio globulare piegato (Figura 3B). L'analisi delle temperature di fusione risultanti (Figura 3C) mostra un aumento significativo del legame del ligando nMix. Questa elevata termostabilità è in linea con quella calcolata per nBla g 1, indicando che siamo in grado di riprodurre completamente lo stato naturale di Bla g 1. Si noti che ecBla g 1 mostra anche un miglioramento simile, se non maggiore, della termostabilità, che illustra il potenziale dei lipidi residui legati endogenamente per interferire con la caratterizzazione biofisica degli allergeni purificati utilizzando i tradizionali approcci basati su FPLC. Al contrario, la capacità di rimuovere quantitativamente e ricaricare carichi idrofobici da allergeni come Bla g 1 fornisce una via unica per esaminare il ruolo dei lipidi nella risposta allergica. Qui descriviamo un metodo per esaminare l'influenza dei carichi lipidici sulla struttura, la stabilità e la lavorazione endosomica delle proteine allergeniche stesse, anche se potrebbero essere prese in considerazione altre vie di studio.
Figura 3: Conferma del recupero riuscito del Bla g 1 pieghe. (A) Spettri CD di Apo- (nero) o nMix-caricato (rosso) Bla g 1 purificato e ricotto utilizzando il protocollo qui descritto, con minimi a ~220 e 210 nm indicativi di una struttura prevalentemente alfa-elicoiale coerente con la struttura cristallina a raggi X disponibile. Entrambi gli spettri Bla g 1 caricati da Apo e nMix sono estremamente simili a quello ottenuto per Bla g 1 purificato dal ricombinante E. coli (ecBla g 1, verde) o dalla sua fonte allergenica naturale (nBla g 1, blu) senza il protocollo di rimozione e ricottura lipidica, supportando ulteriormente il successo del recupero della struttura nativa nel primo. (B) Profili termici rappresentativi per Apo- (nero) e nMix-caricato (rosso) Bla g 1 che mostra uno sviluppo di una cooperativa indicativa di curva sigmoidale. nBla g 1 (blu) ed ecBla g 1 (verde) indicati come riferimento. Le temperature di fusione calcolate (MT25) di Bla g 1 sono indicate in (C). Il legame dei ligandi nMix (rosso) produce un aumento significativo della termostabilità rispetto ad Apo-Bla g 1 (nero). Questo rispecchia la tendenza osservata per nBla g 1 (blu), suggerendo che siamo in grado di recuperare con successo lo stato nativo. La stabilità ancora maggiore osservata per ecBla g 1 evidenzia il potenziale dei lipidi legati endogenamente per interferire con la caratterizzazione biofisica degli allergeni. Ivalori mt 25 presentati in C rappresentano il valore medio ottenuto da almeno tre prove indipendenti. Le barre di errore rappresentano i valori di deviazione standard corrispondenti. Figure adattate da Foo et al. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo descritto in questo lavoro è stato applicato con successo per studiare sistematicamente le proprietà di legame lipidico di Bla g 1. Ciò ha rivelato una correlazione tra legame del carico, termostabilità e lavorazione endosomica, quest'ultima correlata alla diminuzione della generazione di un epitopo noto delle cellule T con potenziali implicazioni per l'immunogenicità9,18. Oltre a Bla g 1, altri allergeni come Pru p 3 e Bet v 1 hanno dimostrato di mantenere i loro carichi legati endogenamente quando purificati utilizzando metodi standard di cromatografia di affinità ed esclusione di dimensioni13,19,20,21,22. Questi ospiti sgradite potrebbero alterare le proprietà biofisiche e immunologiche di queste proteine in modo simile, evidenziando la necessità di tecniche per garantire una completa delipidazione come quella qui presentata.
Mentre l'uso dell'HPLC in fase inversa nella purificazione degli allergeni è stato descritto inprecedenza 2, l'accoppiamento con un protocollo di ricottura termica offre l'opportunità piuttosto insolita di ricostituire allergeni con una gamma di ligandi naturali e non naturali, consentendo agli utenti di sondare le interazioni lipidico-allergene. Questa fase di denaturazione termica si è trovata essenziale per due scopi principali. In primo luogo, la denaturazione termica è necessaria per facilitare l'accesso dei ligandi alle loro cavità di legame che, a causa della loro natura idrofobica, sono spesso sepolte lontano dal solvente acquoso9,22. In secondo luogo, i ligandi idrofobi come acidi grassi e fosfolipidi spesso formano strutture supramolecolari più grandi come micelle o vescicole quando vengono collocati in un ambiente acquoso. La concentrazione di ligandi monomerici o "liberi" disponibili per il legame proteico può essere approssimata utilizzando la concentrazione critica di micelle (CMC). DSPC e altri fosfolipidi a catena lunga hanno valori CMC nell'intervallo nM, il che indica che non ci sono praticamente ligandi liberi disponibili per l'associazione Bla g 1. Anche i lipidi a catena corta e gli acidi grassi hanno CMC nella gamma da μm a mM bassi, indicando che gran parte di questi ligandi rimangono nella fase micellare obistrato 23. Tuttavia, le alte temperature impiegate nel nostro protocollo di denaturazione disperdono questi aggregati più grandi, facilitando il legame. Studi precedenti hanno in genere impiegato periodi di incubazione prolungati per facilitare questo processo. Tuttavia, la mancanza di un processo di denaturazione/ricottura termica solleva dubbi sull'efficacia del carico. Ad esempio, l'incubazione dell'allergene dell'acaro Der p 5 con l'acido grasso fluorescente analogo 11-(Dansylamino)acido nondecanoico (DAUDA) ha prodotto una stechiometria legante di 0,66 nonostante possieda una grande cavità idrofobica alla pari con Bla g 124. Allo stesso modo, la specificità legante e la stechiometria degli NSLTP vegetali sono risultati molto diversi a seconda che i lipidi e le proteine siano solubilizzati per la prima volta in metanolo prima dell'aggiunta di tampone acquoso, indicando che l'accessibilità del ligando e / o del sito di legame era un fattorelimitante 25.
Oltre a Bla g 1, abbiamo applicato con successo la stessa strategia a diverse altre proteine del dominio MA da scarafaggi e zanzare(A. aegypti), così come Der p 2 (dati non mostrati). Abbiamo notato che sia gli omologhi bla g 1 che Der p 2 sono stati eluitati in un momento diverso da Bla g 1 dalla colonna C18 (fase 3.3). I gradienti di eluizione in questo passaggio potrebbero dover essere ottimizzati per altre proteine. In alternativa, possono essere utilizzate colonne HPLC con una fase stazionaria meno idrofobica (ad esempio, C8), anche se nel caso di Bla g 1 l'aumento dell'idrofobicità della colonna C18 era necessario per rimuovere completamente i contaminanti fosfolipidici diacil da ecBla g 1. Nonostante le differenze nelle proprietà biofisiche e biochimiche, abbiamo scoperto che questo protocollo è estremamente robusto e potrebbe essere facilmente applicato ad altre proteine allergeniche. Mentre le dure condizioni impiegate possono presentare una potenziale limitazione, l'aumento della resilienza osservato per molti allergeni riduce il suoimpatto 26,27. In effetti, sono stati osservati diversi allergeni alimentari e di inalazione come Der p 2, Ber e 1, Ara a 6 e Lep w 1 per recuperare la loro struttura e immunogenicità a seguito della denaturazione termica, anche se può essere richiesta l'ottimizzazione dellecondizioni tampone 28,29,30,31,32,33; ad esempio, la denaturazione reversibile delle nsLTP (Cor a 8) e delle taumatine (Mal d 2 e Atto d 2) è osservata solo in condizioni acide (pH <4)28,30,31. Inoltre, va notato che gli autori non hanno tentato di ottimizzare né i tempi né le temperature utilizzate nel protocollo di ricottura. È possibile che la solubilizzazione del ligando e la piegatura/dispiegamento delle proteine possano essere ottenute utilizzando una temperatura massima più bassa come si vede con Ber e 1 per la quale la denaturazione reversibile si ottiene a 82 °C29. Si prevede che l'uso di tali misure amplierà la gamma di allergeni a cui questo protocollo può essere applicato.
Un'altra considerazione importante quando si adatta questo protocollo ad altri sistemi allergenici è la concentrazione di ligandi richiesta durante il processo di ricottura. Nel caso di Bla g 1 la resa prevista è di ~0,25-0,4 μmol di proteine per 1 L di coltura cellulare. Data la stechiometria legante dimostrata di 8 acidi grassi o 4 lipidi della catena diacil per allergene, è stato impiegato un eccesso molare di carico di 20-40 volte (5-10 μmol). Va notato che la capacità di legame lipidico di Bla g 1 e dei suoi omologhi è unica; ad esempio gli nsLTP sono generalmente accettati per legare al massimo due ligandi lipidici25 mentre le lipocaline hanno meno di 1 stechiometria34. Come tale, il caricamento completo di questi tipi di allergeni può essere effettuato con un minore eccesso di ligandi. Un'ultima considerazione quando si adatta questo protocollo ad altri sistemi allergenici è la presenza di legami disolfuro, che possono essere problematici se non adeguatamente formati prima della denaturazione. Un possibile approccio sarebbe quello di eseguire il processo di ricottura in presenza di un agente riducente come 2 mM DTT. I legami disolfuro nativi potrebbero essere successivamente riformatiattraversol'aggiunta di glutatione ridotto e ossidato come descritto per il frammento di allergene di arachidi studiato da Aalberse et al. In questo caso, il recupero del corretto legame disolfuro deve essere valutato empiricamente mediante spettrometria di massa35.
In questo lavoro descriviamo una tecnica attraverso la quale gli allergeni possono essere delipidati e ricotti con vari carichi fosfolipidici e acidi grassi. Tuttavia, ci sono molte altre classi di ligandi potenzialmente immunogenici o adiuvante presenti all'interno di comuni serbatoi allergenici. Ad esempio, gli allergeni di gatti, cani e acari sono stati proposti per legare lipopolysaccaridi (LPS) e altri lipidi batterici dalla polveredomestica 36, mentre il Bet v 1 ha dimostrato di estrarre flavonoidi complessi dalla matrice di polline13. Il protocollo descritto in questo lavoro può essere facilmente adattato per esplorare il ruolo di questi lipidi in modo più dettagliato. Come prova del concetto siamo stati in grado di dimostrare che la cavità idrofobica di Bla g 1 è in grado di legare l'acido lipoteichoico (LTA) dalle pareti cellulari dei batteri gram positivi, ma esclude l'LPS dalle specie gram negative, potenzialmente riflettendo il maggior numero di catene acili in quest'ultimo9. Facendo un ulteriore passo avanti, si potrebbe utilizzare il protocollo di denaturazione/ricottura termica per incorporare sonde fluorescenti e altri analoghi di acidi grassi non naturali nelle proteine allergeniche. Infatti, siamo stati in grado di caricare la cavità idrofobica dell'omologo di zanzare di Bla g 1 con DAUDA, aprendo ulteriori strade per esaminare gli effetti dei ligandi lipidici sulla malattia allergenica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dr. Tom Kirby, Scott Gabel e il Dr. Robert London per il loro aiuto e assistenza durante tutto questo lavoro, insieme al Dr. Bob Petrovich e Lori Edwards per l'uso della loro strumentazione e la loro assistenza nella generazione dei costrutti Bla g 1 impiegati in questo studio. Ringraziamo Andrea Adams per l'assistenza con la spettrometria di massa e il Dott. Eugene DeRose per l'assistenza con la strumentazione NMR. Questa ricerca è stata supportata dal Programma di ricerca intramurale del NIH, Istituto Nazionale di Scienze della Salute Ambientale, Z01-ES102906 (GAM). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell'Istituto Nazionale di Scienze della Salute Ambientale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
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