Summary
该协议描述了从过敏原中去除内源性脂质，并通过逆相HPLC与热退化用用户指定的配体替换它们。 31P-NMR 和圆形二分法允许快速确认配体去除/装载，并恢复原生过敏原结构。
Abstract
许多主要过敏原与疏水性脂质状分子结合，包括Mus m 1、Bet v 1、Der p 2和Fel d 1。这些配体被强烈保留，并有可能通过直接刺激免疫系统或改变过敏蛋白的生物物理特性来影响敏感过程。为了控制这些变量，需要技术来去除内源性绑定配体，并在必要时用已知成分的脂质代替。蟑螂过敏原Bla g 1封闭了一个大的疏水腔，在使用传统技术纯化时结合了异质内源性脂质的混合物。在这里，我们描述了一种方法，通过这种方法，这些脂质被删除使用反相HPLC，然后热退化产生Bla g 1在其Apo形式或重新加载与用户定义的脂肪酸或磷脂货物的混合物。将该协议与生化检测结果结合，可显著改变Bla g 1的恒温性和蛋白解电阻，对T细胞表位生成速率和过敏性有下游影响。这些结果突出了脂质去除/重新加载协议的重要性，例如在研究来自重组源和自然来源的过敏原时所述的协议。该协议可推广到其他过敏原家族，包括脂蛋白（Mus m 1）、PR-10（投注 v 1）、MD-2（Der p 2）和乌特罗蛋白（Fel d 1），为研究脂质在过敏反应中的作用提供了宝贵的工具。
Introduction
对过敏原数据库的调查显示，过敏原只存在于所有已知蛋白质家族的2%中，这表明常见的功能和生物物理特性有助于过敏1。在这些特性中，粘合脂质货物的能力在过敏原中似乎被强烈地夸大了，这表明这些货物可能会影响敏感过程1。事实上，已经表明，巴西坚果过敏原Ber e 1需要与它的内源性脂质共同管理，以实现其充分的敏感潜力2。这些脂质可能直接刺激免疫系统，如小虫过敏原Der p 2和Der p 7所示，这两种脂质都与LPS结合蛋白3、4、5具有很强的结构同源性。根据这一观察，建议Derp 2和Der p 7可以结合细菌脂质，并通过TLR4介导信号直接刺激宿主免疫系统，促进5，6的敏感过程。内源性结合脂质也有可能改变过敏性蛋白质本身的生物物理特性。例如，Sin a 2（芥末）和阿拉h 1（花生）与磷脂性粘结体相互作用的能力显著增强了它们对胃和内分泌降解7的抵抗力，而配体与主要的白杨花粉过敏原Bet v 1结合改变了内分泌处理速率和由此产生的肽8的多样性。鉴于稳定性、T细胞表位生成和蛋白质（如Bet v 1和Bla g 1）的过敏性之间的相关性，这与过敏性特别相关：后者将是这项工作的主题9，10。
Bla g 1代表昆虫主要过敏原（MA）蛋白质家族的原型成员，并拥有由12个两栖病态α海片组成的独特结构，包围着异常大的疏水腔9，11。Bla g 1 的可用 X 射线晶体结构显示该腔内的电子密度与绑定磷脂或脂肪酸配体一致：31P-NMR和质谱法证实的猜想。这些货物在性质上是异质的，它们的组成严重依赖过敏原来源，观察到不同的脂质特征，用于大肠杆菌和P.面食表达的重组Bla g 1。奇怪的是，Bla g 1从其天然过敏原源（蟑螂菌）中纯化，在其结合部位内主要含有脂肪酸，棕榈酸盐、油酸盐和凝固物的混合物被确定为其"天然"配体9，11。Bla g 1 在多个净化步骤后保留脂质和脂肪酸的能力阻碍了孤立研究蛋白质的努力。相反，有人提出，Bla g 1（从今称为nMix）的天然棕榈酸盐、石板和油酸盐配体在其过敏性和原生生物功能9中起着关键作用。然而，这些配体在Bla g 1中并不存在，这些配体来自重组来源，因此很难评估这一假设。类似的问题已经观察到其他脂质结合过敏原，如Bet v 112，13。为了促进脂质-过敏原相互作用的系统研究，我们制定了一个协议，通过该协议，过敏原可以定量地剥离其内源性结合脂质，并以Apo形式或装载特定配体进行重组。
过敏原通常使用亲和力色谱和/或大小排除色谱从其自然或重组来源纯化。在这里，我们引入了额外的纯化步骤，以高性能液相色谱 （HPLC） 的形式使用反相 C18 列，从该柱中将过敏原稀释成类似于为脂肪酸结合蛋白14开发的协议的有机溶剂。因此，在脂肪酸和/或磷脂的缺乏或存在的情况下，产生的蛋白质将遭受热退化步骤。除了恢复原生 Bla g 1 折外，升高的温度还增加了脂质货物的溶解性和可访问性，在 Apo 形式中产生 Bla g 1 或均匀装载所需的疏水配体。 31以这种方式净化的Bla g 1的P-NMR光谱确认完全去除内源性结合的配体，并统一更换所需的化合物，而圆形二分法则确认了Bla g 1褶皱的成功恢复。在最近一项工作中，发现货物结合可增强Bla g 1的热敏度和蛋白解电阻，改变T细胞表位生成的动力学，对感化和过敏性9具有潜在影响。
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Protocol
1. 布拉 g 1 克隆
- 获得蟑螂过敏原Bla g 1.0101（残留物34-216）的基因，表示MA域的一次重复。为了简单起见，Bla g 1 将在整个工作中用于表示此单次重复，而不是整个 Bla g 1.0101 成绩单。
- 将Bla g 1基因子将到所需的载体中。在这项研究中，含有 N - 末期谷胱甘肽 S - 转移酶（ GST ）标签的基因与烟草蚀刻病毒（ TEV ）蛋白酶部位入 pGEX 载体以表达如前所述11 。
- 将 Bla g 1 pGEX 向量转换为 BL21 DE3 大肠杆菌 细胞。
- 准备所需矢量的 10 ng/μL 库存。
- 将 10 ng/μL DNA 库存的 1μL 与制造商提供的 50 μL BL21 DE3 细胞混合。
- 在冰上孵化 BL21 DE3-DNA 混合物 30 分钟。转移到42°C的水浴1分钟，然后立即转移到冰上，再孵化1分钟。
- 将 200 μL 的 LB 介质添加到细胞中，并在 37 °C 下再孵育 1 小时。
- 将转化后的细胞放在含有 100 毫克/升安非他林的 LB-Agar 板上，并在 37 °C 的夜间生长。
2. 初始表达和净化
- 接种 1 L 的 LB 介质，其中含有 100 毫克/L 安非他明，其中单个菌落的 BL21 DE3 细胞与 Bla g 1 向量一起转化，如 1.3 所述。在37°C的夜间生长。
- 第二天，通过离心机在6，000 x g 处收获细胞（OD 600 ~1.5），10分钟，并在含有100毫克/升安非他明的2升YT介质中再供收。允许细胞在 37 °C 时再生长 1 小时，达到OD 600 > 0.6。
- 通过添加0.5 mM IPTG来诱导蛋白质表达。将细胞转移到 18 °C，并在一夜之间孵化。
- 第二天，收获细胞如2.2所述。由此产生的细胞颗粒可以冻结并储存在-20 °C。
- 在 50 毫升裂解缓冲器 （50 mM Tris-HCl pH 8.5， 100 mM NaCl） 中从 1 升培养物中获取的补液颗粒，其中含有 1 片蛋白酶抑制剂片（或等效剂）和 1μL 苯甲酸酶核糖酶。
- 使用探针声波器（500 W， 20 kHz）的 Lyse 电池在 4 分钟内将功率设置为 30-50%，负荷周期为 50%。在声波化过程中将测定将测定保存在冰浴中
- 离心解水在45，000 x g 20分钟。丢弃不溶性分数（颗粒）。
- 去除28微升的可溶性蛋白质。与 7 μL 的 5 倍 SDS-PAGE 缓冲区和存储 SDS-PAGE 分析相结合。在使用 TEV 孵化前后，重复此步骤，实现 GST 列的流过、洗涤和洗涤分数。
- 将可溶性蛋白质（超纳坦）应用于在 PBS pH 7.4 中等效的谷胱甘肽树脂柱（总床积约约 10 mL）。
- 使用 50 mL 的 PBS 洗掉任何未绑定蛋白质。
- 使用含有 10 mM 的 PBS 的 50 mL 的 Elute GST-Bla g 1 减少谷胱甘肽。
- 在 4 °C 或室温下在 4 °C 下用 0.2 kU TEV 蛋白酶孵化提升蛋白，或在 6 小时内消除 GST 标签。
3. 通过逆相HPLC去除内源性脂质
- 收集裂开的 Bla g 1，然后使用离心滤光单元将其浓缩到 +2 mL，其分子重量截止< 10 kDa。
- 将<12 mL样品添加到浓缩器顶部，在回转桶转子中以5，000 x g 旋转10×15分钟。
注意：样本体积和旋转速度将因特定过滤器和使用的转子类型而异。使用前请咨询制造商文档。
- 将<12 mL样品添加到浓缩器顶部，在回转桶转子中以5，000 x g 旋转10×15分钟。
- 将浓缩物加载到配备 C18 反相色谱列的 250 x 10 mm HPLC 系统上，该柱与 97% 缓冲 A（水、0.1% 三氟乙酸）和 3% 缓冲 B（丙酮三酯，0.1% 三氟乙酸）相等。
注意：可以使用较小的柱子，但蛋白质可能需要使用多个周期来加载和稀释，以适应绑定容量的降低。选择列时，确保树脂珠的颗粒大小为< 5 μm，孔径为>200°，从而能够有效分离蛋白质大小的分子
注意：三氟乙酸具有高度腐蚀性，应使用适当的PPE（即氮化手套、实验室外套和护目镜）在烟熏罩内分配。乙酮三甲虫具有中度毒性、挥发性和高度易燃性，应使用适当的PPE（即氮化物手套、实验室外套和护目镜）在烟熏罩内使用和配发。 - Elute Bla g 1 使用 表 1 中显示的协议，流速为 1.5×4.0 mL/分钟。使用 280 nm 的荧光吸收来监测洗脱过程。
- 收集和池布拉g 1分数。Bla g 1 通常以 > 74% 缓冲区 B 或约 34-40 分钟的速度稀释。
注意：根据流速或列大小，洗发时间略有不同。根据 A280 收集分数以获得最佳结果。
- 收集和池布拉g 1分数。Bla g 1 通常以 > 74% 缓冲区 B 或约 34-40 分钟的速度稀释。
| 时间（最小） | 缓冲区 A （%） | 缓冲区 B （%） |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
表1：Bla g 1的弹性协议。表使用 C18 HPLC 列说明在 Bla g 1 隔离中使用的弹性梯度。
- 将样品加入玻璃试管，填充试管不超过一半（约4毫升）。用石蜡膜盖住管子，用两个孔穿孔盖住盖子，以便通风。
- 准备一个单独的1mL的别名（测试阿里报价）。这将用于确定预期收益率。
- 将样品放入 -80 °C 冰柜中 1 小时或浸入液氮中，冷冻样品并测试别名。在较晚的情况下，管必须连续旋转，以避免试管破裂，由于冻结时液体相的膨胀。
- 使用除水器干燥由此产生的脱皮蛋白样本。干蛋白可在4°C下储存数月，存放在密封容器中。
4. 重组阿波和货物装载布拉 g 1
- 确定预期的 Bla g 1 收益率。
- 在 5 mL 的再折叠缓冲区中重新使用同化、脱硫 （后 HPLC） 测试别名（50 mM HEPES pH 7.4，100 mM NaCl，2% DMSO）。
- 在水浴中加热混合物（500 mL 烧嘴，250 mL 水，在热板上搅拌棒）至 95 °C。涡流解决方案间歇性地孵化在 95 °C，速度为 0.5–1 小时。
- 去除热量，慢慢让水浴平衡到室温（~1小时）。如果需要，退化蛋白可在4°C过夜储存。
- 通过 0.22 μM 注射器过滤器通过已脱脂的 Bla g 1 脂混合物去除颗粒物。
- 缓冲区使用离心过滤器将过滤后的蛋白质 3 倍交换到 PBS pH 7.4 中，该离心滤清器具有 10 kDa 的切口，如 3.1 中所讨论的那样，用于去除残留的无脂肪酸和有机溶剂。
- 使用 BCA 检测或其他首选方法（如紫外线吸收）评估蛋白质浓度。使用此来确定剩余 Bla g 1 单体报价的预期收益率。
- 重组阿波或货物装载布拉 g 1
- 如4.1.1所述，在重新折叠缓冲区中重新发送 Bla g 1 引用。
- 要生产 Apo-Bla g 1，重复步骤 4.1.2–4.1.6 以获得所需的收益。
- 要将 Bla g 1 装载脂肪酸，请在甲醇或 DMSO 中准备所需的脂肪酸货物的 20 mM 库存解决方案。 然后，跳转到步骤4.2.5。
- 要将 Bla g 1 与磷脂一起装载，在玻璃试管内准备一个 10 毫克/毫升的所需货物的氯仿库存。
- 蒸发氯仿以产生脂质薄膜。将 PBS 添加到试管中，以产生 20 mM 的最终磷脂浓度。
注意：如果吸入或吞咽，氯仿是有害的。如果通风不足，请使用化学烟雾罩或使用呼吸器。处理时使用氮化物手套、实验室外套和护目镜。使用前请咨询MSDS。 - 通过加热脂质薄膜高于脂质货物的相过渡温度和漩涡，使其补充水分，直到溶液变成多云。请注意，可能需要声波完全补充和补充一些货物。
- 如果需要声波化，将试管放在浴缸声波器（100 W，42 kHz）中，并以最大功率声波化，直到货物被重新装上。或者，探针声波器（2.6 中描述）可以使用 10-20% 的功率和 50% 的关税周期。
注意：声波采用高频声波，可能会损害听力。使用降噪 PPE（耳塞或消声器）。如果可能，将声波器放在声音抑制柜或室内。
- 蒸发氯仿以产生脂质薄膜。将 PBS 添加到试管中，以产生 20 mM 的最终磷脂浓度。
- 根据在 4.1 中确定的预期产量，加入所需的脂肪酸或磷脂货物，使配体相对于 Bla g 1 的平地量增加 20 倍。本步骤中添加的有机溶剂总量不应超过 2%。漩涡混合。
注：Bl 21 DE3细胞的1升通常产生~0.25~0.4微米蛋白质，相当于每管约400微米配体。 - 将4.1中描述的蛋白质与蛋白质进行退化。
5. 通过 31P-NMR 确认磷脂货物拆卸/装载
- 使用 3.1 中描述的离心滤清器单元浓缩 Apo- 或装货 Bla g 1 至 >100 μM 的浓缩样品。
- PBS 缓冲区中的补充水分参考磷脂最终浓度为 2、1.5、1、0.5 和 0.25 mM。
- 用胆碱缓冲器（100 mM Tris pH 8.0，100m NaCl，10%w/v 胆碱）稀释样品1：1，总容量约600微l。
注意：在这一步骤中，Cholate 用于从 Bla g 1 疏水腔中充分提取和溶解脂质。这确保了磷脂头组周围的化学环境在不同样品之间保持一致，从而允许使用31P-NMR 进行定量评估。胆碱的使用可以替代氯仿/甲醇，如前所述15。 - 使用宽带探头获取胆碱化 Bla g 1 样本的 1D 31P-NMR 光谱和参考磷脂标准。
注：本作品中呈现的31P-NMR 光谱是使用 600 MHz 光谱仪获得的。然而，先前采用类似技术的研究表明，在低至150-200 MHz 15的场强度下，可以达到可接受的灵敏度。 - 使用适当的软件处理生成的数据16.
- 使用首选的 NMR 查看软件17获得峰值的特性。
- 将 Bla g 1 31P-NMR 光谱与磷脂参考样品获得的光谱进行比较，以确认根据可见山峰的化学移位（或缺乏）去除内源性绑定配体和/或绑定所需的配体。
- 通过比较 Bla g 1 频谱的峰值强度和磷脂参考标准的峰值强度来确认完全结合的固态测量。
6. 确认 Bla g 1 折叠
- 在 CD 缓冲区中准备 0.5 μM Bla g 1 样本（100 mM KH2PO4，缓冲区 pH 7.5）。将样品的 2 mL 加载到带磁搅拌棒的 10 mm CD 小面包中。
- 测量 Bla g 1 的 CD 频谱，以确认二级结构的重组。确保光倍增压器 （PMT） 电压不超过制造商建议（一般为 1 kV）。
- 测量 CD 信号从 260–200 nm 在 25 °C 与数据间距 0.2 nm 和扫描速率为 20 nm/s 与数据集成时间 1 s.
- 以 0.5 °C/分钟的速度将 CD 单元中的温度从 25 °C=95 °C 升高。激活磁搅拌棒，以确保整个样品的温度均匀。
- 在222纳米时监视CD，每2°C读数。
- 将生成的数据与 2 状态博尔茨曼曲线配合，以确定熔化温度。由于Bla g 1的高稳定性，熔化温度（MT25）被定义为蛋白质在222纳米时失去初始CD的25%的温度。
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Representative Results
使用亲和色谱法，重组的 GST-Bla g 1 很容易被隔离到高纯度 （图1A），产生 +2+4 毫克/升的细胞培养产量。在 4 °C 下与 TEV 蛋白酶进行隔夜孵化足以去除 GST 标签，最终产品为 +24 kDa。请注意，在这种情况经和洗涤分数中有大量 GST - Bla g 1 ，这表明谷胱甘肽树脂绑定容量已超出。使用更多的树脂或样品加载和洗脱的多个周期可以为这个问题提供补救措施。
将 Bla g 1 应用于反相 C18 列可产生独特的弹性轮廓 （图 1B），两个大峰值位于 +50% 缓冲 B，第二个大峰值位于 +75% 缓冲 B. SDS-PAGE 对由此产生的分数的分析表明，前者对应于裂解的 GST 标记，而后者对应于 Bla g 1。偶尔，第三个较小的峰值将发生在中间，对应于残留的、未切割的 GST-Bla g 1。通过增加反应中使用的 TEV 量或延长孵化时间，可以消除这种未切割产品的存在。虽然不完全的会降低产量，但 C18 列上的分离足以确保最终 Bla g 1 产品的纯度保持不妥协。逆相HPLC的一个结果是，最终的蛋白质产品被引入有机溶剂环境。虽然这有助于去除任何疏水配体，但需要通过溶血去除这种溶剂，产生蓬松的白色粉末（图1C）。
蛋白质的折中需要重组原生Bla g 1折，可以在没有脂质货物或存在脂质货物的情况下进行。在重新折叠缓冲之前，将 DMSO 添加到干燥的 Bla g 1 和磷脂货物中，有利于溶解过程，尽管即使在高温下，一些较长的链脂货物也不会完全溶解。然而，没有观察到这会影响我们研究中测试的脂质的负荷功效（图1C）。同样，多余的脂质通常会在冷却时沉淀出溶液或形成大的网状物，导致退化后出现多云（图1C）。也没有观察到这能提高装载效率，并且通过过滤和随后的缓冲交换步骤很容易去除任何聚合物，以产生清晰、透明的解决方案。尽管条件恶劣，但未观察到Bla g 1的热解。
图1：Bla g 1的初始净化。（A） SDS-PAGE 显示初始裂解后可溶性蛋白质分数 （S）：流通 （FT）， 洗涤 （W）， 和从谷胱甘肽 - 塞法罗斯列 （E）：和最终的 Bla g 1 产品后， TEV 的 GST 标签（ TEV ）。由此产生的 Bla g 1 产品在 TEV 之后的 HPLC 提升配置文件显示在（B）中。280以蓝色显示，而弹性梯度 （%缓冲区 B） 以绿色显示。与切割的 GST 标记（H1、H2）、剩余未切割的 GST-Bla g 1 （H3） 和纯化 Bla g 1 （H4） 对应的分数分别以红色箭头表示，分别为 +50%、+65% 和 +74% 缓冲区 B。SDS-PAGE 对 H1-H4 分数的分析显示在（A）中，并相应地标记。（C） 代表图像显示 Bla g 1 处于退赛过程的不同阶段。请注意，ii 和 iii 中描述的沉淀形成的精确和程度取决于所使用的脂质货物类型。请单击此处查看此图的较大版本。
31以这种方式纯化的 Apo-Bla g 1 的 P-NMR 光谱显示 NMR （图 2A）或薄层色谱（未显示的数据）均未检测到磷脂。相比之下，为Bla g 1获得的类似光谱中含有异丙磷酸磷胆碱（DSPC）磷脂，显示出与磷脂胆碱头群相对应的强峰值。相比之下，Bla g 1的具有代表性的 31P-NMR 光谱从重组 大肠杆菌 中纯化，无需使用此处描述的脂质去除/退化协议 （ecBla g 1） 显示从重组表达系统中提取的内源性脂质的异质混合物 （图2B）。利用 NMR 的定量性质，可以使用已知 DSPC 浓度的参考样本（图 2C）生成标准曲线。将DSPC-Bla g 1获得的31P信号强度与此标准曲线进行比较，得出每蛋白质4.7±0.5脂质的结合性血脂：与从硅学研究和结构分析9中获得的预测的完全结合的石器学相比，这个值是有利的。请注意，此技术仅检测含有 31P 核的配体，如磷脂、利索磷脂、脂糖等。但是，此协议可以轻松地适应 13个 C-NMR 分析。在这种情况下，甲基-13C标记脂肪酸将建议由于其有利的NMR放松特性。将同位素标签限制在单个站点也便于光谱解释，因为预计只有一个峰值，同时降低与统一 的 13个 C 标记对应方相比的成本。另一种方法是采用质量规格来识别绑定配体，如先前的一项研究所证明的，该研究将脂肪酸的混合物确定为Bla g 1的天然货物，与蟑螂的纤维（nBla g1）9分离。然而，质量规格的量化能力有限，无法对没有足够标准的结合性气质学进行精确测量。
图2： 验证 Bla g 1 的脂质去除和加载。 （A） 31P-NMR 光谱的 Apo- （黑色） 或 DSPC 加载 Bla g 1 （红色） 准备使用本作品中描述的退化协议，证明前者脂质完全去除，以及后者实现磷酸胆碱 （PC） 脂质的同质加载。相比之下，Bla g 1纯化从重组 大肠杆菌 没有脂质剥离和退化（ecBla g 1）显示异质混合物的内源性磷乙二醇胺（PE）和磷酸二甘醇（PG）脂质当分析使用这种方法（B）.从DSPC中获取的已知浓度参考样本中显示一个具有代表性的标准曲线，从中可以获得Bla g 1结合性气质测量。数字改编自Foo等人（2019年），并根据知识共享CC许可证9呈现。 请单击此处查看此图的较大版本。
Bla g 1 的水晶结构揭示了一个由 12 个两栖火山口组成的独特褶皱。圆形二分法是评估该褶皱在退赛后是否已成功重组的快速而方便的方法。Apo - 和脂质 （nMix） 加载 Bla g 1 的 CD 光谱显示最小 ~220 和 210 nm 表示以阿尔法螺旋结构为主 （图 3A）。此频谱与 ecBla g 1 和 nBla g 1 获得的频谱极为相似，进一步证明 Bla g 1 的原生结构已成功恢复。这通过使用19个F和1个H-15N解决方案-NMR得到进一步证实，在其他地方9个解决方案-NMR中可以充分讨论这个问题。基于 CD 的热变性测定显示，阿尔法-赫利科二级结构的合作损失表明折叠球状域 （图 3B）。对由此产生的熔化温度（图3C）的分析显示，nMix配体结合显著增加。这种升高的恒温性与为 nBla g 1 计算的一致，表明我们能够完全再现 Bla g 1 的自然状态。请注意，ecBla g 1 也显示了类似的，如果不是更大的恒温增强，说明残余内源性结合脂质干扰使用传统的 FPLC 方法纯化的过敏原的生物物理特征的可能性。相比之下，从 Bla g 1 等过敏原中定量去除和重新装载疏水货物的能力提供了检验脂质在过敏反应中的作用的独特途径。在这里，我们描述了一种方法，以检查脂质货物对过敏蛋白本身的结构、稳定性和内分泌处理的影响，尽管可以考虑其他研究途径。
图3： 确认成功恢复Bla g 1折。 （A） Apo- （黑色） 或 nMix 加载（红色） Bla g 1 的 CD 光谱使用此处描述的协议进行纯化和退化，最小为 220 和 210 nm 表示主要为字母螺旋结构，与可用的 X 射线晶体结构一致。Apo- 和 nMix 加载的 Bla g 1 光谱都与从重组 大肠杆菌 （ecBla g 1， 绿色） 或从其天然过敏源 （nBla g 1， 蓝色） 中获得的 Bla g 1 非常相似， 没有脂去除和退化协议， 进一步支持了前者原生结构的成功恢复。（B） Apo- （黑色） 和 nMix 加载 （红色） Bla g 1 的代表热配置文件显示西格莫伊达尔曲线指示性合作展开。nBla g 1 （蓝色） 和 ecBla g 1 （绿色） 显示为参考。Bla g 1 的计算熔化温度 （MT25）显示在（C）中。与 Apo-Bla g 1（黑色）相比，nMix 配体（红色）的结合可显著提高恒温性。这反映了 nBla g 1 （蓝色） 观察到的趋势，表明我们能够成功地恢复原生状态。ecBla g 1 观察到的更大稳定性突出了内源性结合脂质干扰过敏原生物物理特征的潜力。C 中提出的MT 25 值表示至少三次独立试验的平均值。错误条表示相应的标准偏差值。数字改编自Foo等人（2019年），并根据知识共享CC许可证9呈现。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本工作中描述的协议已成功地应用于系统地研究 Bla g 1 的脂质结合特性。这揭示了货物结合、恒温和内分泌处理之间的相关性，后者与已知T细胞表位的产生减少有关，对免疫原性9、18有潜在影响。除了 Bla g 1 之外，其他过敏原（如保诚 p 3 和 Bet v 1）已证明在使用标准亲和力和大小排除色谱方法13、19、20、21、22进行纯化时保留其内源性绑定货物。这些不受欢迎的客人可以以类似的方式改变这些蛋白质的生物物理和免疫特性，强调需要技术来确保完全脱毛，如这里介绍的。
虽然在过敏原净化中使用逆相HPLC已经描述过2，但将其与热退化协议耦合提供了相当不寻常的机会，用一系列天然和非天然配体重组过敏原，使用户能够探测脂质-过敏原相互作用。发现这种热变性步骤对于两个主要目的至关重要。首先，需要热变性，以方便配体进入其结合腔，由于其疏水性质，往往被埋在远离水溶剂9，22。其次，疏水性配体，如脂肪酸和磷脂，在水环境中放置时，往往形成较大的超色结构，如鼠标或囊泡。可用于蛋白质结合的单体或"自由"配体的浓度可以使用临界鼠标浓度 （CMC） 进行近似。DSPC 和其他长链磷脂在 nM 范围内具有 CMC 值，表明 Bla g 1 绑定几乎没有可用的免费配体。即使是短链脂和脂肪酸也有CMC的在低μm至mM范围内，表明这些配体的很大一部分仍然留在鼠标或双层相23。然而，在我们的变性协议中采用的高温分散了这些较大的聚合物，便于绑定。先前的研究通常采用较长的潜伏期来促进这一过程。然而，缺乏热变性/退化过程使人们对装载的功效产生怀疑。例如，用荧光脂肪酸类比11-（丹西拉米诺）不分偶酸（DAUDA）孵育小虫过敏原Der p 5，尽管具有与Bla g 124相当的大疏水腔，但产生了0.66的结合性气孔。同样，植物 nsLTP 的结合特异性和固态测量也有很大的不同，具体取决于脂质和蛋白质是否在加入水性缓冲之前首先在甲醇中溶解，这表明配体和/或结合部位可访问性是一个限制因素25。
除了Bla g 1，我们还成功地将同样的策略应用于蟑螂和蚊子（A.aegypti）以及Der p 2（未显示的数据）的其他几个MA域蛋白。我们注意到，与 C18 列的 Bla g 1 不同的时间，Bla g 1 同义词和 Der p 2 同义词（步骤 3.3）。此步骤中的弹性梯度可能需要针对其他蛋白质进行优化。 或者，可以使用具有较少疏水性静止相（例如 C8） 的 HPLC 列，尽管在 Bla g 1 中，C18 列的疏水性增加对于完全去除 ecBla g 1 中的二甲二磷脂污染物是必要的。尽管生物物理和生化特性不同，我们发现这个协议是非常强大的，可以很容易地应用于其他过敏性蛋白质。虽然恶劣的条件可能带来潜在的限制，但观察到的许多过敏原的复原能力增强会降低其影响26，27。事实上，已经观察到一些食物和吸入过敏原，如Der p 2，Ber e 1，阿拉a 6和Lep w 1，以恢复其结构和免疫原性后，热变性，虽然可能需要优化缓冲条件28，29，30，31，32，33：例如，nsLTP（Cor a 8）和沙乌马汀（Mal d 2 和 act d 2）的可逆变性仅在酸性（pH <4） 条件下28、30、31下观察到。此外，应当指出，作者没有试图优化退化协议中采用的时间或温度。有可能使用 Ber e 1 的较低最高温度实现配体溶解和蛋白质折叠/展开，从而在 82 °C29实现可逆变性。预计使用这种措施将扩大应用本议定书的过敏原的范围。
将此协议调整为其他过敏原系统时的另一个重要考虑因素是退膜过程中所需的配体浓度。在 Bla g 1 的情况下，预期产量为每 1 升细胞培养 0.25~0.4 微米蛋白质。鉴于已证明的结合性脂肪酸或每过敏原4个二甲酸链脂，使用了20-40倍摩尔过量的货物（5+10微摩尔）。应当指出，Bla g 1 及其同声的脂质结合能力是独一无二的：例如nsLTP的通常被接受绑定最多两个脂质配体25，而脂质素有小于1斯托基奥米特里34。因此，这些类型的过敏原的完全加载可以完成与较小的过多的配体。将此协议调整为其他过敏原系统时，最后考虑的是存在脱硫键，如果在去硝化之前没有正确形成，这可能会有问题。一种可能的方法是在减少剂（如2mM DTT）的情况下进行退化过程。原生硫化物键随后可以通过添加减少和氧化谷胱甘肽，如Alberse等人研究的花生过敏原片段所描述的那样重新形成。在这种情况下，恢复正确的脱硫粘结应经验评估质谱35。
在这项工作中，我们描述了一种技术，通过这种技术，过敏原可以脱脂，并重新与各种磷脂和脂肪酸货物。然而，在常见的过敏原储层中，还有许多其他可能具有免疫力或辅助性的配体。例如，猫，狗和小虫过敏原已被建议结合脂质糖（LPS）和其他细菌脂质从房子灰尘36，而Bet v 1已被证明从花粉基质13提取复杂的黄酮类化合物。这项工作中描述的协议可以很容易地适应，以更详细的方式探索这些脂质的作用。作为概念的证明，我们已经能够证明Bla g 1的疏水腔能够将脂乙酸（LTA）从克正细菌的细胞壁中结合，但将LPS排除在克负菌种之外，可能反映了后9个细胞链的更多。更进一步，可以利用热变性/退化协议，将荧光探头和其他非天然脂肪酸类似物纳入过敏原蛋白中。事实上，我们能够用DAUDA装载Bla g 1蚊子同源体的疏水腔，开辟更多的途径来检查脂质配体对过敏性疾病的影响。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢汤姆·柯比博士、斯科特·加贝尔博士和罗伯特·伦敦博士在整个工作中给予的帮助和帮助，以及鲍勃·彼得罗维奇博士和萝莉·爱德华兹博士在本研究中使用的仪器和帮助产生Bla g 1构造。我们感谢安德里亚·亚当斯对质谱学的帮助，感谢尤金·德罗斯博士对NMR仪器的帮助。这项研究得到了国家卫生研究院、国家环境卫生科学研究院（Z01-ES102906）的校内研究计划的支持。内容完全由作者负责，不一定代表国家环境卫生科学研究所的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
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