Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Aanvulling van splicingactiviteit door een Galectin-3 - U1 snRNP-complex op kralen

Published: December 9, 2020 doi: 10.3791/61990
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

Summary

Dit artikel beschrijft de experimentele procedures voor (a) depletie van U1 snRNP uit nucleaire extracten, met gelijktijdig verlies van splicingactiviteit; en (b) reconstitutie van splicingactiviteit in het U1-uitgeputte extract door galectine-3 - U1 snRNP-deeltjes gebonden aan kralen covalent gekoppeld aan anti-galectine-3-antilichamen.

Abstract

Klassieke depletie-reconstitutie-experimenten geven aan dat galectine-3 een vereiste splicingfactor is in nucleaire extracten. Het mechanisme van opname van galectine-3 in de splicingroute wordt in dit artikel behandeld. Sedimentatie van HeLa-celkernextracten op 12%-32% glycerolgradiënten levert fracties op die verrijkt zijn in een endogeen ~10S-deeltje dat galectine-3 en U1 snRNP bevat. We beschrijven nu een protocol om nucleaire extracten van U1 snRNP uit te putten met gelijktijdig verlies van splicingactiviteit. Splicing-activiteit in het U1-uitgeputte extract kan worden gereconstitueerd door het galectine-3 - U1 snRNP-deeltje gevangen op agarose-kralen covalent gekoppeld aan anti-galectine-3-antilichamen. De resultaten geven aan dat het galectine-3 - U1 snRNP - pre-mRNA ternair complex een functioneel E-complex is dat leidt tot tussenproducten en producten van de splicingreactie en dat galectine-3 de splicingroute binnenkomt door zijn associatie met U1 snRNP. Het schema van het gebruik van complexen affiniteit- of immuno-geselecteerd op kralen om splicing activiteit te reconstitueren in extracten uitgeput van een specifieke splicing factor kan algemeen toepasbaar zijn op andere systemen.

Introduction

De productie van de meeste eukaryote boodschapper-RNA's (mRNA's) omvat verwijdering van introns en ligatie van exonen in een nucleair proces dat pre-mRNA-splicing wordt genoemd1. Twee klassen van RNA-eiwitcomplexen (RRP's) sturen de verwerking van pre-messenger RNA tot volwassen mRNA via spliceosomale complexen. Eén klasse, ontluikende pre-messenger RRP's, wordt co-transcriptioneel gevormd door de binding van heterogene nucleaire RNP-eiwitten en andere RNA-bindende eiwitten, waaronder enkele leden van de SR-familie, die hnRNP-complexen opleveren2. De tweede klasse, uracil-rijke kleine nucleaire RRP's (U snRNPs met U1, U2, U4, U5 en U6 snRNAs) is geassocieerd met U-specifieke en kerneiwitten3,4. De U snRNPs interageren op een geordende manier met specifieke regio's van pre-messenger RRP's in een dynamische remodelleringsroute, terwijl introns worden weggesneden en exonen worden geligeerd om volwassen mRNPs5 te produceren. Veel extra nucleaire eiwitten nemen deel aan deze verwerkingsgebeurtenissen6.

Galectine-1 (Gal1) en galectine-3 (Gal3) zijn twee eiwitten die vereiste factoren zijn in de splicingroute, zoals aangetoond door depletie-reconstitutiestudies7,8. Verwijdering van beide galectines uit het splitsen van competente nucleaire extracten (NE) elimineert spliceosoomassemblage en splicingactiviteit in een vroeg stadium. Toevoeging van beide galectine aan zo'n dubbel uitgeput NE herstelt beide activiteiten. Gal1 en Gal3 zijn componenten van actieve spliceosomen zoals blijkt uit specifieke immunoprecipitatie van pre-mRNA, splicing intermediates en volwassen mRNA door antiserum specifiek voor Gal1 of Gal39. Belangrijk is dat Gal3 zich associeert met endogene U-snRNA die deeltjes in het NE bevatten buiten de splicingroute, zoals blijkt uit de precipitatie van snRNPs door anti-Gal3 antisera10. Ten slotte verandert het uitschakelen van Gal3 in HeLa-cellen de splicingpatronen van talrijke genen11.

In NE voorgeïncubeerd om voorgevormde spliceosomen12 te demonteren, worden snRNPs gevonden in meerdere complexen die sedimenteren in glycerolgradiënten van 7S tot groter dan 60S. Hoewel glycerolgradiëntfractionering een veelgebruikte techniek is voor de isolatie van spliceosomale complexen en componenten (zie bijvoorbeeld referenties13,14,15), hebben we deze methode uitgebreid door specifieke fracties te karakteriseren met behulp van antilichaamimmunoprecipitaties. Een snRNP-sedimentering op 10S bevat alleen U1-snRNA samen met Gal3. Immunoprecipitatie van de 10S-fractie met antisera specifiek voor Gal3 of U1 snRNP co-precipiteert zowel U1 als Gal3, wat aangeeft dat sommige van de U1 snRNP-monodeeltjes gebonden zijn aan Gal310. Aangezien U1 snRNP het eerste complex is dat bindt aan pre-mRNP in spliceosomale assemblage1,5, vertegenwoordigt deze stap een potentiële ingangsplaats voor Gal3 in de splicingroute. Op basis hiervan toonden we aan dat 10S Gal3-U1 snRNP monodeeltjes gebonden aan anti-Gal3 bevattende kralen de splicingactiviteit herstelden tot een U1 snRNP uitgeput NE, waardoor dit complex werd vastgesteld als één mechanisme waarmee Gal3 wordt gerekruteerd in de spliceosomale route16. Dit in tegenstelling tot pogingen om spliceosomen te isoleren in specifieke stadia van de splicingreactie en het catalogiseren van de geassocieerde factoren17,18. In dergelijke studies wordt de aanwezigheid van bepaalde factoren op een bepaald moment vastgesteld, maar niet het mechanisme waarmee ze werden geladen.

We hadden eerder in detail de bereiding van NE, het splicing substraat, de assemblage van het splicing reactiemengsel en de analyse van producten beschreven in onze documentatie van de rol van galectinen in pre-mRNA splicing19. We beschrijven nu de experimentele procedures voor fractionering van nucleaire extracten om een fractie verrijkt in Gal3 - U1 snRNP-complex te verkrijgen en voor immunoselectie van het laatste complex om splicingactiviteit te reconstitueren in een U1-uitgeput nucleair extract.

Figure 1
Figuur 1: Schematisch diagram ter illustratie van de complementatie van splicingactiviteit in nucleair extract uitgeput van U1 snRNP door een Gal3-U1 snRNP-complex op kralen. (A) NE in Buffer C (NE(C)) wordt geïncubeerd met eiwit A-Sepharose kralen covalent gekoppeld aan anti-U1 snRNP (αU1 kralen). De ongebonden fractie is uitgeput van U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE in Buffer D (NE(D)) wordt gefractioneerd over een glycerolgradiënt van 12%-32% door ultracentrifugatie. Fracties die overeenkomen met het 10S-gebied (fracties 3-5) worden gecombineerd en gemengd met kralen die covalent zijn gekoppeld aan anti-Gal3-antilichamen (αGal3-kralen). Het materiaal gebonden aan de kralen bevat een Gal3-U1 snRNP monodeeltje. (C) Het Gal3-U1 snRNP-complex uit deel (B) wordt gemengd met U1ΔNE uit deel (A) in een splicing-assay met behulp van 32P-gelabeld MINX pre-mRNA-substraat en de tussenproducten en producten van de splicingreactie worden geanalyseerd door gel-elektroforese en autoradiografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Opmerkingen over de algemene procedures

  1. Zorg ervoor dat alle chemicaliën (buffercomponenten, enzymen, enz.) vrij worden gehouden van ribonuclease (RNase). Sequester alle commercieel gekochte reagensflessen van algemeen laboratoriumgebruik. Draag handschoenen voor alle stappen van de experimentele procedure. Gebruik alleen glaswerk en keukengerei dat is gebakken (zie stap 1.2 hieronder) en oplossingen die zijn voorbehandeld (zie stap 1.3 hieronder).
  2. Bak al het glaswerk (bekers, flacons, flessen, pipetten, enz.) minimaal 4 uur bij 177 °C. Wikkel andere gebruiksvoorwerpen (spatels, roerstaafjes, enz.) in aluminiumfolie voordat u onder dezelfde omstandigheden gaat bakken.
  3. Bereid een 0,1% (vol/vol) oplossing van diethylpyrocarbonaat (DEPC) in dubbel gedestilleerd water (ddH2O). Gebruik een magnetische roerstaaf, roer deze oplossing een nacht en autoclaaf. Gebruik deze met DEPC behandelde H2O om alle oplossingen die Tris bevatten te maken; filter vervolgens steriliseer met behulp van een vacuümfilter met flesdeksel. Gebruik gewone ddH2O om alle andere oplossingen te bereiden (zonder Tris); behandel vervolgens met DEPC (0,1%, vol/vol) en autoclaaf.
    OPMERKING: De buffers die in de volgende reeks experimentele procedures worden gebruikt, zijn alfabetisch weergegeven in tabel 1.
Naam van de buffer Compositie
Boraatbuffer 0,2 M natriumboraat, pH 9
Buffer C 20 mM HEPES, pH 7,9, 25% (vol/vol) glycerol, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 0,5 mM dithiothreitol (DTT)
Buffer D 10 mM HEPES, pH 7,9, 20% (vol/vol) glycerol, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM DTT
60%D 60% Buffer D en 40% H2O
Ethanolamine 0,2 M ethanolamine, pH 8
HEPES bindingsbuffer 20 mM HEPES, pH 7,9
HEPES wasbuffer 20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M NaCl
RNA-laadbuffer 90% formamide, 20 mM EDTA, pH 8, 0,05% (w/v) broomfenolblauw
SDS-PAGE buffer 25 mM Tris, 169 mM glycine, 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS), pH 8,8
SDS-voorbeeldbuffer 62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0,1% (w/v) broomfenolblauw
TBE-buffer voor RNA-gels 89 mM Tris, 89 mM boorzuur, 2,5 mM EDTA, pH 8,3
TE-buffer 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA
Buffer overdragen 25 mM Tris, 1,92 M glycine, 20% methanol, pH 8,3
T-TBS-buffer 10 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,5
TX wasbuffer 0,05% Triton X-100 (TX) in 60%D

Tabel 1: Naam en samenstelling van buffers

2. Bereiding van NE uitgeput van U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. Bereiding van anti-U1 kralen voor immunoadsorptie
    1. Pre-swell 50 mg Protein A-Sepharose CL-4B kralen in overtollig DEPC-behandeld H2O om ongeveer 200 μL gezwollen kralen te produceren en vervolgens te wassen in HEPES wasbuffer.
    2. Pellet voor deze wasbeurt en alle daaropvolgende wasbeurten de kralen door centrifugeren (1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s) en verwijder de ongebonden was met een micropipettor en gooi weg.
    3. Meng 150 μL gewassen kralen met 150 μL menselijk auto-immuunserum specifiek voor U1 snRNP (volume van antilichaam tot volume van kralen in een verhouding van 1:1).
    4. Stel, op basis van het totale volume van (~ 300 μL vanaf stap 2.1.3 hierboven), het mengsel aan op 20 mM HEPES, pH 7,9, overeenkomend met de voorwaarden van de HEPES-bindingsbuffer; incubeer dit mengsel met continu schommelen bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.
    5. Was de kralen gebonden met antilichamen met 1 ml boraatbuffer (0,2 M natriumboraat, pH 9) en resuspend in 1 ml van dezelfde boraatbuffer.
    6. Om het antilichaam dat gebonden is aan de eiwit A-Sepharose-kralen covalent te koppelen, voegt u dimethylpimelimidaat toe aan een eindconcentratie van 20 mM en incubeert u bij kamertemperatuur met schommelen gedurende 60 minuten.
    7. Was de kralen met 1 ml boraatbuffer.
    8. Om een niet-gereageerd cross-linking reagens te blokkeren, voegt u 1 ml 0,2 M ethanolamine (pH 8) toe en incubeert u bij kamertemperatuur met schommelen gedurende 60 minuten.
    9. Was de antilichaam-gekoppelde kralen, hierna aangeduid als anti-U1 kralen, tweemaal met 0,5 ml TX-wasbuffer (0,05% Triton X-100 in 60% D).
  2. Uitputting van U1 snRNP uit NE (zie figuur 1A)
    OPMERKING: De procedure voor het bereiden van NE uit HeLa-cellen werd aanvankelijk ontwikkeld door Dignam et al.20. We hebben de materialen en gedetailleerde methoden beschreven voor de bereiding van NE voor splicing assays19 (zie stappen 2.1 en 3.1 van die referentie). NE, zoals oorspronkelijk opgesteld, staat in buffer C en zal hierna worden aangeduid als NE(C). NE(C) gedialyseerd tegen en in evenwicht gebracht met Buffer D wordt aangeduid als NE(D).
    1. Incubeer 200 μL NE(C) met 100 μL anti-U1 kralen uit stap 2.1.9 hierboven.
    2. Voeg 5 μL RNasin toe aan het mengsel.
    3. Draai de microbuis kop-over-staart bij 4 °C gedurende 1 uur.
    4. Pelleteer het mengsel door centrifugering (1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s) en vang het ongebonden materiaal (U1ΔNE) op met een Hamilton-spuit.
    5. Dialyseer het volledige volume U1ΔNE, samen met een afzonderlijke aliquot van 50 μL van het oorspronkelijke niet-uitgeputte NE(C), in afzonderlijke compartimenten van een microdialysator, met roeren, gedurende 75 min tegen 60% D met behulp van een dialysemembraan met 8 K moleculair gewichtsafsnijding.
    6. Verdeel deze preparaten onmiddellijk na dialyse (U1ΔNE en NE in 60% D) in aliquots van 20 μL; knip vervolgens in een droogijs/ethanolbad en bewaar bij -80 °C.
  3. Analyse van het RNA- en eiwitgehalte van U1ΔNE en materiaal gebonden aan anti-U1-kralen
    1. Na het verwijderen van het ongebonden materiaal (U1ΔNE) (stap 2.2.4), wast u het materiaal dat aan de anti-U1-kralen is gebonden door 0,5 ml TX-wasbuffer toe te voegen. Pellet het mengsel door centrifugeren (1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s) en verwijder het supernatant met behulp van een micropipettor en gooi het weg.
    2. Herhaal de wasstappen 2.3.1 tweemaal.
    3. Verwijder het materiaal dat aan de anti-U1-kralen is gebonden door 100 μL 2x SDS-monsterbuffer toe te voegen aan 100 μL van de kralen en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te broeden.
    4. Pellet het mengsel door centrifugeren (1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s); verwijder het supernatant van hamilton spuit, en snap freeze in een droogijs/ethanol bad. Bewaren bij -80 °C.
    5. Vergelijk het niet-uitgeputte NE, het uitgeputte NE (U1ΔNE) en het materiaal dat aan de kralen is gebonden (uit de kralen verwijderd door sds-monsterbuffer zoals beschreven in stappen 2.3.3 en 2.3.4 hierboven). Volg stappen 2.3.6-2.3.8 voor RNA-analyse of stap 2.3.9-2.3.10 voor eiwitanalyse.
    6. Extraheer voor elk monster het RNA met 200 μL fenol-chloroform (50:50, v/v); vervolgens opnieuw extraheren met 180 μL chloroform-isoamylalcohol (25:1, v/v). Voeg na extractie 300 μL koude 200-proof ethanol toe, keer om om te mengen en bewaar het neergeslagen RNA een nacht bij -20 °C.
    7. Centrifugeer het ethanol-neergeslagen RNA (12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C). Was de pellets met 150 μL koude 70% ethanol. Centrifugeer opnieuw (12.000 x g) bij 4 °C gedurende 15 min. Verwijder het supernatant met behulp van een micropipettor en droog de pellets in een speed vac gedurende 10-15 minuten zonder warmte.
    8. Resuspend de gedroogde RNA-pellet in 10 μL RNA-laadbuffer, vortex voorzichtig vortex, verwarm tot 75-85 °C gedurende 90 s en incubeer vervolgens gedurende 2 minuten op ijs. Scheid de snRNA's door gel-elektroforese (2 uur bij 16 mA) door 13% polyacrylamide - 8,3 M ureumgels en vervolgens met ethidiumbromide of onderworpen aan noordelijke blotting10,16.
    9. Laad de eiwitmonsters, in SDS-monsterbuffer van stap 2.3.5, op 12,5% polyacrylamidegels en elektroforese bij 200 V gedurende ongeveer 45-50 minuten in SDS-PAGE (natriumdodecyrylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese) buffer.
    10. Breng de gescheiden eiwitten over in het nitrocellulosemembraan bij 400 mA gedurende 2 uur in de overdrachtsbuffer. Na overdracht, blokkeer het membraan door een nacht te incuberen in T-TBS met 10% vetvrije droge melk. Vervolgens immunobloteert u het membraan om specifieke eiwitten te onthullen8,21.

3. Immunoprecipitatie van 10S-fracties van glycerolgradiënten door anti-Gal3

  1. Bereiding van anti-Gal3 kralen voor immunoadsorptie
    OPMERKING: De afleiding en karakterisering van konijn polyklonale antisera tegen Gal3 voor konijn #2421 en voor konijn #4910 zijn eerder beschreven.
    1. Gebruik preimmune serum van konijn #49 als controle.
    2. Volg voor de bereiding van anti-Gal3-kralen de eerder beschreven procedure voor de bereiding van anti-U1-kralen (stap 2.1), met uitzondering van die welke overeenkomt met stap 2.1.3, de verhouding van antiserum (bijv. Anti-Gal3, # 49) tot kralen is 3: 1.
    3. Was vlak voor gebruik de antilichaam-gekoppelde kralen, hierna aangeduid als anti-Gal3-kralen, tweemaal met 0,5 ml TX-wasbuffer. Verwijder het supernatant, eerst met een micropipettor om het grootste deel van de vloeistof eruit te krijgen en vervolgens met een Hamilton-spuit om de vloeistof uit de kralen te krijgen; afdanken.
  2. Immunoprecipitaton van glycerolgradiëntfracties naar anti-Gal3 (zie figuur 1B)
    1. Fractionaat NE(D) over een 12%-32% glycerol gradiënt10. Combineer en meng glycerolgradiëntfracties 3, 4 en 5 (genummerd vanaf de bovenkant van het verloop), die zich in de buurt van het 10S-gebied van de gradiënt bevinden.
    2. Bereid twee monsters, elk met 150 μL aliquot van gecombineerde gradiëntfracties 3-5 (stap 3.2.1), en plaats in 50 μL anti-Gal3 kralen.
    3. Bereid tegelijkertijd twee monsters met elk 150 μL fractie 1 (met Gal3 die niet complex is met U1 snRNP10; stap 3.2.1) en plaats in 50 μL anti-Gal3-kralen.
    4. Plaats ter controle 150 μL van 60% D in een andere microbuis van 50 μL anti-Gal3 kralen.
    5. Meng zachtjes door op de buis te tikken en draai vervolgens de microbuis kop-over-staart op 4 °C gedurende 1 uur.
    6. Pellet het mengsel door zachte centrifugatie (1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s).
    7. Verwijder het supernatant (ongebonden materiaal) met een Hamilton-spuit. Was de kralen niet en gebruik ze onmiddellijk voor de toevoeging van de splicingreacties (rubriek 4.2).
  3. Analyse van het RNA- en eiwitgehalte in het ongebonden en gebonden materiaal van de anti-Gal3 precipitatie van 10S gradiëntfracties
    1. Verzamel voor de analyse van componenten van het gebonden en ongebonden materiaal van anti-Gal3-precipitatie van de 10S-gradiëntfracties het ongebonden materiaal (supernatant na stap 3.2.6), breng het over in een verse microbuis en vries het in bij -20 °C.
    2. Was de neergeslagen kralen uit stap 3.2.6 (met materiaal gebonden aan anti-Gal3) door 0,5 ml TX-wasbuffer toe te voegen.
    3. Pellet het mengsel door zachte centrifugatie (1.000 x g in een zwenkende emmerrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s); verwijder het supernatant met behulp van een micropipettor en gooi het weg. Herhaal de wasstappen nog twee keer.
    4. Voeg 50 μL 2X SDS-monsterbuffer toe aan de gewassen en gepelleteerde anti-Gal3-kralen.
    5. Meng de kralen voorzichtig en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Pelleteer het mengsel door zachte centrifugatie (1.000 x g in een zwenkende emmerrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s), verzamel het supernatant met Hamilton-spuit en bewaar het in een nieuw microbuisje bij -20 °C.
    7. Vergelijk het ongebonden materiaal (punt 3.3.1) en het gebonden materiaal (stap 3.3.6) van de anti-Gal3 precipitatie in termen van RNA en eiwitcomponenten, met behulp van procedures zoals beschreven in stap 2.3.6. tot respectievelijk 2.3.10.

4. Assemblage van splicingreactie en analyse van producten

  1. Voorbereiding van het splicing substraat
    OPMERKING: Het pre-mRNA-substraat, aangeduid als MINX, bevat twee exonsequenties en één intronsequentie van Adenovirus22. De MINX DNA-sequentie in het plasmide staat onder controle van T3-, T7- of SP6-polymerasepromotors. De materialen en gedetailleerde methoden voor de linearisatie van het MINX-plasmide-DNA met BamHI-restrictie-endonuclease, transcriptie door SP6-RNA-polymerase in aanwezigheid van α-32P [GTP] en de zuivering van 32P-gelabelde MINX voor splicing-assays zijn eerder beschreven19 (zie stappen 2.2 en 3.2 van die referentie).
    1. Bewaar het radioactief gelabelde MINX als een ethanolprecipitaat bij -20 °C; gebruik het gelabelde splicingsubstraat binnen 4-6 weken na transcriptie.
    2. Centrifugeer vlak voor gebruik de ethanol neergeslagen 32P-gelabelde MINX bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C; verwijder het supernatant met een micropipettor en gooi het weg.
    3. Voeg 150 μL 70% ethanol toe en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en droog de pellet in speedvac zonder warmte gedurende 15 minuten.
    4. Rehydrateer de pellet in 50 μL DEPC water. Spot 2 μL op elk van de twee GF/C-filters; dompel de filters gedurende 10 min onder in koud 5% trichloorazijnzuur (TCA). Spoel af met koude 5% TCA, gevolgd door 180-proof ethanol op een vacuümkolf. Droog de filters aan de lucht en onder voorbehoud van sprankeling tellen in 4 ml Safety-Solve.
    5. Verdun 32P-gelabelde MINX in 60% D tot 104 cpm/μL voor de splicing assay.
  2. Assemblage van de splicingreactie (zie figuur 1C)
    1. Monteer op ijs splicingreacties in een totaal volume van 24 μL (8 μL U1ΔNE (vanaf stap 2.2.6), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM creatinefosfaat, 0,5 mM DTT, 20 eenheden RNasin, 4 μL 32P-gelabeld MINX splicing substraat (104 cpm/μL), 60% D) en voeg toe aan elke buis kralen uit sectie 3.2.7. Monteer een identieke reeks splicingreacties in een totaal volume van 24 μL maar zonder U1ΔNE en voeg aan elke buis kralen uit stap 3.2.7 toe.
    2. Bereid een controlesplitsingsreactie voor in een totaal volume van 12 μL (4 μL NE(D), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM creatinefosfaat, 0,5 mM DTT, 20 eenheden RNasine, 2 μL 32P-gelabeld MINX splicing substraat (104 cpm/μL), 60% D).
    3. Meng de buizen voorzichtig door te tikken en draai end-over-tail bij 30°C gedurende 90 minuten. Pellet het mengsel door zachte centrifugatie bij 1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s.
    4. Stop de reactie en eluteer de eiwitten van de kralen door 24 μL 2x SDS-monsterbuffer toe te voegen aan de buisjes met kralen en 12 μL 2x SDS-monsterbuffer aan de controlebuis met NE maar geen kralen. Verwarm de buizen gedurende 7 min op 100 °C.
    5. Centrifugeer de buizen voorzichtig bij 1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10-15 s.
    6. Breng de supernatanten (elutie) over in verse microbuizen: ongeveer 48 μL uit de kraalbuizen en 24 μL uit de NE-regelbuis.
    7. Voeg Proteinase K (20 mg/ml) toe om de eiwitten te verteren en op te lossen: voeg 5 μL toe aan de 48 μL elutie van kralen en voeg 2,5 μL toe aan de 24 μL NE-controle.
    8. Incubeer de buizen op 37°C gedurende 40 min.
    9. Centrifugeer de buizen voorzichtig bij 1.000 x g in een zwenkbakrotor bij 4 °C gedurende 10 s.
    10. Verdun de korrels met 39,5 μL TE en 10 μL 3 M natriumacetaat. Verdun de NE-controle met 63,5 μL TE en 10 μL 3 M natriumacetaat.
    11. Extraheer en analyseer het RNA zoals hieronder beschreven (paragraaf 4.3).
  3. Analyse van producten van de splicingreactie
    1. Extract van de RNA's in elk monster met fenol-chloroform, gevolgd door chloroform-isoamylalcohol; de RNA's neerslaan met ethanol, centrifugeren, de pellets wassen, het supernatant verwijderen en de pellets drogen volgens dezelfde procedure als beschreven in de stappen 2.3.6 en 2.3.7.
    2. Resuspend de gedroogde RNA-pellet in 10 μL RNA-laadbuffer, vortex voorzichtig vortex, verwarm tot 75-85 °C gedurende 90 s en incubeer vervolgens gedurende 2 minuten op ijs.
    3. Bereid 20 ml van een oplossing die 13% polyacrylamide (bisacrylamide:acrylamide, 1,9:50 [wt/wt]) bevat in 8,3 M ureum; giet gels van 15 cm lang met behulp van deze oplossing.
    4. Zodra de gel is gegoten, elektroforeer deze (zonder monsters te laden) op 400 V gedurende 20 minuten met TBE als lopende buffer. Was na deze stap de putten met TBE running buffer.
    5. Laad de RNA-monsters in RNA-laadbuffer en elektroforese met TBE-buffer op 400 V gedurende 3,5 tot 4 uur. Verwijder na de elektroforese het ureum door de gel gedurende 10 minuten onder te dompelen en te draaien in gedestilleerd water.
    6. Droog de gel vacuüm op 3 M filtreerpapier, eerst gedurende 2 uur en 15 min bij 80 °C en vervolgens gedurende 30 minuten zonder warmte om het langzaam af te koelen. Onderwerp de gedroogde gel aan autoradiografie op film om de migratieposities van de radioactieve componenten te detecteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NE uitgeput van U1 snRNP (U1ΔNE uit sectie 2.2.6) en Gal3 - U1 snRNP-complexen uit het 10S-gebied van de glycerolgradiënt immunoprecipiteerd door anti-Gal3 (stap 3.2.7) werden gemengd in een splicingreactie. Dit reactiemengsel bevatte U1-snRNA (figuur 2A, baan 3) en het U1-specifieke eiwit U1-70K (figuur 2B, baan 3). Zoals verwacht heeft de anti-Gal3 Gal3 neergeslagen (figuur 2B, baan 3). Deze componenten (U1 snRNA, U1-70K-eiwit en Gal3) werden niet gevonden in de pre-immuun (PI) controleprecipitatie (Figuur 2A, Figuur 2B, baan 2). Vergeleken met een niet-uitgeput NE uitgevoerd als een positieve controle (figuur 2C, baan 1), vertoonde U1ΔNE geen splicingactiviteit (figuur 2C, baan 2). Splicingactiviteit in de U1ΔNE zou kunnen worden gereconstitueerd door het kraalgebonden Gal3 - U1 snRNP-complex (figuur 2C, baan 6). Beide producten van de splicingreactie, geligeerde exonen en weggesneden intron lariat (gemarkeerd door pijlen aan de rechterkant), evenals tussenproducten, exon 1 en lariat exon 2, werden gevonden. De componenten van fracties 3-5 waren van cruciaal belang bij het herstellen van splicing naar U1ΔNE. Wanneer fracties 3-5 werden vervangen door buffer alleen (60% D) in de immunoprecipitatie, kon geen splicingactiviteit worden waargenomen bij het mengen met U1ΔNE (figuur 2C, baan 2), wat aangeeft dat de anti-Gal3-kralen niet verantwoordelijk waren voor het herstel van splicingactiviteit in de laatste. Overtuigender is dat wanneer fracties 3-5 in de immunoprecipitatieprocedure werden vervangen door fractie 1 en vervolgens aan U1ΔNE werden toegevoegd, er geen tussenproducten of producten van de splicingreactie werden gevonden (figuur 2C, baan 4). Eerdere analyse had gedocumenteerd dat de Gal3 in fractie 1 vrij Gal3-eiwit vertegenwoordigde, niet in combinatie met enig RNP-complex10 en noordelijke blotting van het materiaal dat immuungeprecipiteerd was vanaf fractie 1, kon geen U1 snRNA16 onthullen. Ten slotte vertoonden immunoprecipitaten van fractie1 en fracties 3-5 geen splicingactiviteit wanneer ze werden getest in afwezigheid van U1ΔNE (figuur 2C, respectievelijk rijstroken 3 en 5).

Figure 2
Figuur 2: Representatieve resultaten van de RNA- en polypeptidesamenstellingen van het anti-Gal3-neerslag van het 10S-gebied van de glycerolgradiënt en het vermogen om splicing te reconstitueren in nucleair extract dat is uitgeput van U1 snRNP (U1ΔNE). (A) Northern blotting analyse van U1 snRNA gebonden aan kralen in combinatie met pre-immuun serum (PI; baan 2) of aan kralen in combinatie met anti-Gal3 (αGal3; baan 3). Baan 1 vertegenwoordigt 20% van de hoeveelheid gecombineerde glycerolgradiëntfracties die worden onderworpen aan immunoprecipitatie. Rijstrook 2 en rijstrook 3 vertegenwoordigen elk 25% van het gebonden materiaal dat aan de respectievelijke kralen is onttrokken. (B) Western blotting analyse van polypeptiden gebonden aan kralen in combinatie met pre-immuun serum (lane 2) of anti-Gal3 (lane 3). Eiwitidentiteiten worden aan de rechterkant aangegeven. Baan 1 vertegenwoordigt 20% van de hoeveelheid gecombineerde glycerolgradiëntfracties die worden onderworpen aan immunoprecipitatie. Rijstrook 2 en rijstrook 3 vertegenwoordigen elk 75% van het gebonden materiaal dat aan de respectievelijke kralen is onttrokken. (C) Analyse van het vermogen om splicingactiviteit te herstellen naar U1ΔNE door anti-Gal3 (αGal3) immunoprecipitaten van glycerolgradiëntfractie 1 (Fr 1), fracties 3-5 (Fr 3-5) of 60% Buffer D (60% D). Het + of - teken boven de vetgedrukte ononderbroken lijn geeft de aan- of afwezigheid aan van elk van deze neerslagen in het splicingreactiemengsel. Het + of - teken onder de vetgedrukte ononderbroken lijn geeft de aan- of afwezigheid van U1ΔNE (of NE in buffer D) aan. Baan 1: 4 μL NE in een splicingtest van 12 μL, waarvan 100% werd onderworpen aan gelanalyse. Voor rijstroken 2-6 was het totale volume van de splicingtest 24 μL, waarvan 50% werd onderworpen aan gelanalyse. Baan 2: 8 μL U1ΔNE plus kralen van neerslag van 60% D. Baan 3: kralen van neerslag van Fr 1. Baan 4: 8 μL U1ΔNE plus kralen van neerslag van Fr 1. Baan 5: kralen van neerslag van Fr 3-5. Baan 6: 8 μL U1ΔNE plus kralen van neerslag van Fr 3-5. De posities van migratie van het pre-mRNA-substraat, de tussenproducten en de producten (intron lariat en geligeerde exonen, gemarkeerd door pijlen) zijn rechts aangegeven. De gegevens in Panel C zijn afgeleid van hetzelfde experiment als getoond in Panel A, Figuur 2 van Haudek et al.16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De resultaten in figuur 2 werden verkregen met anti-Gal3 (#49). Dezelfde resultaten konden worden waargenomen met een andere anti-Gal3 (# 24), maar het pre-immuunserum van konijn # 49 slaagde er niet in om splicing in U1ΔNE te reconstitueren na incubatie met fracties 3-516. Al deze resultaten suggereren sterk dat het pre-mRNA-substraat kan binden aan het 10S Gal3 - U1 snRNP-deeltje geïmmobiliseerd op kralen en dat het ternaire complex functioneel is in de splicingroute.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit rapport biedt de experimentele details die documenteren dat een Gal3 - U1 snRNP-complex gevangen op anti-Gal3-gecoate kralen kan binden aan pre-mRNA-substraat en dit ternaire complex kan splicingactiviteit herstellen tot een U1 snRNP-uitgeput NE. Gal3 is een lid van een familie van eiwitten die oorspronkelijk zijn geïsoleerd op basis van zijn galactose-specifieke koolhydraatbindende activiteit23 . Vroege immunofluorescentie- en subcellulaire fractioneringsstudies gaven de eerste hint van een associatie van Gal3 met componenten van de splicingmachinerie: colokalisatie in nucleaire spikkels met Sm-kernpolypeptiden van snRNPs en de serine- en argininerijke (SR) familie van spicingfactoren24,25 en sedimentatie op cesiumsulfaatgradiënten bij een dichtheid (1,3-1,35 g / ml) die overeenkomt met die van hnRNP en snRNP24 . Latere depletie-reconstitutie-experimenten toonden op hun beurt aan dat Gal3 (evenals een ander lid van de galectinefamilie, galectine-1 (Gal1)) vereiste, maar redundante factoren waren in celvrije splicing-assays7,8.

Wanneer NE wordt gefractioneerd over een glycerolgradiënt, leverde immunoprecipitatie van gradiëntfracties met anti-Gal3 verschillende complexen op met verschillende verhoudingen van verschillende snRNA's en geassocieerde eiwitten, wat suggereert dat Gal3 geassocieerd is met meerdere snRNPs in afwezigheid van pre-mRNA splicing substraat10. In het bijzonder worden Gal3 en U1 snRNP geassembleerd tot een monodeeltje dat sedimenteert naar het ~ 10S-gebied van de gradiënt (fracties 3-5 van een 12% -32% glycerolgradiënt). Aangezien de binding van U1 snRNP aan de 5'-spliceplaats van het pre-mRNA de eerste stap in spliceosoomassemblage5,26 vertegenwoordigt, was het mogelijk dat Gal3 toegang zou krijgen tot de splicingroute via zijn associatie met U1 snRNP. Dit idee wordt ondersteund door de observatie dat Gal3, als onderdeel van het 10S Gal3-U1 snRNP-complex, kon worden gevonden om te associëren met een pre-mRNA-substraat, maar niet met controle-RNA zonder splice-sites, wat suggereert dat 5'splice site-herkenning door U1 snRNP een belangrijke vereiste was in zijn assemblage tot een spliceosoom. Bovendien schafte de voorbehandeling van de fracties die het Gal3-U1 snRNP-deeltje bevatten met microkokkennuclease de belasting van Gal3 op het pre-mRNA10 af. De hamvraag is dus of dit vroege ternaire complex, bestaande uit Gal3, U1 snRNP en pre-mRNA, een functioneel E-complex vertegenwoordigt dat zich toelegt op de splicingroute of een doodlopend H-complex dat de splicing pathway niet kan binnengaan5,26. We hebben deze vraag beantwoord door te testen of de Gal3 - U1 snRNP splicingactiviteit kan reconstitueren in NE uitgeput van U1 snRNP met gelijktijdig verlies van splicingcapaciteit (U1ΔNE). De resultaten van onze experimenten, waarvan het protocol in dit artikel wordt beschreven, geven aan dat Gal3 - U1 snRNP bindt aan pre-mRNA-substraat om een functioneel E-complex te vormen en dat U1 snRNP nodig is om Gal3 op te nemen in de splicing pathway16.

Twee kritieke stappen binnen het beschreven experimentele protocol moeten worden opgemerkt. Ten eerste roept stap 3.2.7 op tot het verwijderen van het supernatant ongebonden materiaal na anti-Gal3-precipitatie van de glycerolfracties. Volledige verwijdering van de vloeistof uit de gepelleteerde agarose-kralen vereist dat de naaldpunt van de Hamilton-spuit op de bodem van de kralen wordt ingebracht. Dit moet zorgvuldig worden gedaan, zodat de kralen de naald van de spuit niet verstoppen of verloren gaan door zich aan de naald te hechten terwijl deze uit de buis wordt getrokken. Ten tweede is het belangrijk dat de gepelleteerde kralen worden gebruikt voor de assemblage van de splicingreacties met zo min mogelijk vertraging. De coördinatie van deze twee stappen was van cruciaal belang voor het welslagen van de procedure. In dit verband moet ook worden opgemerkt dat we onlangs het herstel van Gal3-U1 snRNP-complexen in de pelletfractie hebben verbeterd door eiwit A-Sepharose CL-4B-kralen te vervangen door eiwit A-magnetische nanodeeltjes in de covalente koppeling van het anti-Gal3-antilichaam aan kralen.

De belangrijkste conclusie is afgeleid van experimenten waarin U1ΔNE, verstoken van splicingactiviteit, wordt aangevuld met het 10S Gal3 - U1 snRNP-deeltje immunoprecipiteerd door kralen covalent gederivatiseerd met anti-Gal3-antilichamen. Hoewel er duidelijk bewijs was van intronverwijdering, was de efficiëntie van exon-verbinding minder dan die waargenomen in de reactie die werd uitgevoerd in afwezigheid van kralen (vergelijk rijstrook 6 versus rijstrook 1 in figuur 2C). In onze celvrije splicing-assays wordt ongeveer 30% van de radioactiviteit in het pre-mRNA-substraat meestal omgezet in geligeerde exonen. Dit tekort in exonligatie kan te wijten zijn aan: (a) een minder dan optimale hoeveelheid van een kritieke component, hetzij in U1ΔNE (figuur 1A) of in het Gal3 - U1 snRNP-complex (figuur 1B); of (b) enkele structurele beperkingen (bijv. moeilijkheden bij het ondergaan van een conformatieverandering) van de Gal3 - U1 snRNP geïmmobiliseerd op de anti-Gal3-kralen tijdens de splicingreactie (figuur 1C).

Andere onderzoekers hebben het gebruik van solide fase immunoselectie gemeld om specifieke complexen te vangen en katalytische activiteit of een geordende progressie van spliceosoomstructuren te documenteren. Chiu et al. toonden bijvoorbeeld aan dat toevoeging van de gistsplitsingsfactor Cwc25 het pre-mRNA-substraat op een antilichaam-gevangen geassembleerd spliceosoom in de eerste katalytische reactie kan achtervolgen, wat de tussenproducten exon 1 en lariat-exon227 oplevert. In hetzelfde gistsysteem gebruikten Krishnan et al. een eiwit A-tag om, via gebiotinyleerd-IgG, gezuiverd Bact-spliceosoomcomplex te immobiliseren tot streptavidin-gecoate magnetische kralen in een biofysische studie van pre-mRNA-remodellering (afstand tussen de 5'-spliceplaats en het vertakkingspunt) voorafgaand aan de eerste splicingstap28. Ons huidige artikel breidt deze eerdere studies uit in termen van het voltooien van beide stappen van de splicingreactie en kan daarom betekenis van technische aard hebben: dezelfde reeks procedures kan worden toegepast op een aantal andere splicingfactoren die verband houden met snRNPs om te onderzoeken wanneer en hoe deze factoren op spliceosomale complexen laden. Het vermogen om mRNA-productvorming van de splicingreactie te volgen, vormt een sterk bewijs dat deze geassembleerde spliceosomen inderdaad functioneel zijn. Dit kan ons begrip van hoe spliceosomen zich vormen bevorderen, aangezien eerdere rapporten met behulp van proteomische benaderingen17 alleen de aanwezigheid van sommige factoren in een bepaald complex catalogiseren in plaats van hoe de factoren mogelijk op het complex zijn geladen.

Een duidelijke beperking van de algemene toepasbaarheid van deze procedures op andere eiwitten of snRNP's om hun rol in splicing te evalueren, is de beschikbaarheid van een specifiek antilichaam gericht tegen de specifieke factor die het bijbehorende complex efficiënt zal neerslaan. Polyklonaal anti-Gal3-antisera van een aantal konijnen (bijv. # 24, # 49) immunoprecipiteerde bijvoorbeeld het Gal3-U1 snRNP-complex uit nucleair extract of glycerolfracties 3-5 (U1 snRNA en U1 70K-eiwit co-neergeslagen met het verwante antigeen, Gal3). Daarentegen leverden twee in de handel verkrijgbare monoklonale antilichamen gericht tegen Gal3, Mac-2 en NCL-GAL3, niet dezelfde resultaten op. De epitopen van Mac-2 en NCL-GAL3 zijn toegewezen aan het amino-terminale domein van het Gal3 polypeptide29 en het is mogelijk dat hun respectieve epitopen niet toegankelijk zijn in het Gal3-U1 snRNP-complex. Bovendien is het mogelijk dat een antilichaamgebonden factor (bijv. Gal3) en het bijbehorende complex (bijv. U1 snRNP) niet langer in staat zijn om aanvullende interacties met het pre-mRNA of andere spliceosomale componenten te vormen. Dit kan te wijten zijn aan fysieke interferentie door het antilichaam of door de matrix waaraan het antilichaam covalent is gekoppeld. Daarom moet elk rentestelsel van geval tot geval worden beoordeeld. Ondanks deze beperkingen lijkt het er echter op dat het schema van het gebruik van complexen affiniteit of immuno-geselecteerd op kralen om splicingactiviteit te reconstitueren in extracten die zijn uitgeput van een specifieke splicingfactor algemeen toepasbaar kan zijn op andere systemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk is ondersteund door National Science Foundation Grant MCB-0092919 en Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (aan RJP) en door National Institutes of Health Grant GM-38740 en Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (aan JLW).

Het MINX pre-mRNA substraat dat werd gebruikt in de splicing assays was een vriendelijk geschenk van Dr. Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, VS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-U1 snRNP The Binding Site Hu ENA-RNP #33471 human autoimmune serum specific for U1 snRNP
bottle top vacuum filter Fisher Scientific Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) for filtering solutions containing Tris
centrifuge International Equipment Company IEC Model PR-6 for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation
diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 159220-5G for treatment of water used in preparation of all solutions
dimethylpimelimidate (DMP) Sigma-Aldrich 80490-5G for cross-linking antibody to Sepharose beads
electrophoresis cell BioRad Laboratories, Inc Mini-Protean II for SDS-PAGE separation of proteins
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000-100ml for blocking after the cross-linking reaction
gel electrophoresis system Hoefer, Inc HSI SE 500 Series for separating snRNAs by gel electrophoresis
gel slab dryer BioRad Model 224 for drying gel slabs for autoradiography
Hybond ECL membrane GE Healthcare RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) for immunoblotting of proteins on membrane
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) Pierce Microdialyzer System 100 for exchanging the buffer of nuclear extract  
microdialyzer membranes (8K cutoff) Pierce 66310 for exchanging the buffer of nuclear extract 
non-fat dry milk Spartan Stores Spartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4B Millipore-Sigma GE 17-0780-01 for coupling antibody to beads
Proteinase K Millipore-Sigma P2308-5mg for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs
RNasin Promega N2111 for inhibiting ribonuclease activity
rocker/rotator Lab Industries, Inc  Labquake Shaker 400-110 for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation
Safety-Solve Research Products International Corp. No. 111177 scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate
scintillation counter Beckman Instruments LS6000SC scintillation counter for determination of radioactivity 
speed vaccum concentrator Savant SVC 100H for drying ethanol-precipitated RNA pellets
Transphor electrophoresis unit Hoefer, Inc Hoefer TE Series Transphor for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoskins, A. A., Moore, M. J. The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine. Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).
  2. Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing. Science. 231, 1534-1539 (1986).
  3. Lerner, M., Steitz, J. A. Snurps and scyrps. Cell. 25, 298-300 (1981).
  4. Maniatis, T., Reed, R. The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing. Nature. 325, 673-678 (1987).
  5. Hoskins, A. A., et al. Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes. Science. 331, 1289-1295 (2011).
  6. Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins. International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).
  7. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).
  8. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).
  9. Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3. Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).
  10. Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP. Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).
  11. Fritsch, K., et al. Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex. BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).
  12. Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).
  13. Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA. Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).
  14. Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes. Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).
  15. Malca, H., Shomron, N., Ast, G. The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex. Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).
  16. Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes. Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).
  17. Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome. Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).
  18. Jurica, M. S., Moore, M. J. Capturing splicing complexes to study structure and mechanism. Methods. 28, 336-345 (2002).
  19. Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing. Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).
  20. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).
  21. Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains. Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).
  22. Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles. Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).
  23. Barondes, S. H., et al. Galectins: a family of animal β-galactoside-binding proteins. Cell. 76, 597-598 (1994).
  24. Laing, J. G., Wang, J. L. Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex. Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).
  25. Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components. Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).
  26. Michaud, S., Reed, R. An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway. Genes & Development. 5, 2534-2546 (1991).
  27. Chiu, Y. -F., et al. Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction. Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).
  28. Krishnan, R., et al. Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).
  29. Gray, R. M., et al. Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3. Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).

Tags

Biochemie pre-mRNA splicing spliceosoom celvrije splicing assay glycerol gradiënt fractionering U1 snRNP complex galectines
Aanvulling van splicingactiviteit door een Galectin-3 - U1 snRNP-complex op kralen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voss, P. G., Haudek, K. C.,… More

Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads. J. Vis. Exp. (166), e61990, doi:10.3791/61990 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter