Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Komplementering af splejsning aktivitet af en Galectin-3 - U1 snRNP Kompleks på perler

Published: December 9, 2020 doi: 10.3791/61990
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

Summary

I denne artikel beskrives forsøgsprocedurerne for a) udtømning af U1 snRNP fra nukleare ekstrakter med deraf følgende tab af splejsning; og b) rekonstitution af splejsning aktivitet i U1-udtømte ekstrakt af galectin-3 - U1 snRNP partikler bundet til perler kovalent kombineret med anti-galectin-3 antistoffer.

Abstract

Klassiske udtømning-rekonstitution eksperimenter tyder på, at galectin-3 er en nødvendig splejsning faktor i nukleare ekstrakter. Mekanismen for inkorporering af galectin-3 i splejsning vej er behandlet i dette papir. Sedimentering af HeLa celle nukleare ekstrakter på 12%-32% glycerol gradienter giver fraktioner beriget i en endogen ~ 10S partikel, der indeholder galectin-3 og U1 snRNP. Vi beskriver nu en protokol om at nedbryde nukleare ekstrakter af U1 snRNP med samtidig tab af splejsning aktivitet. Splejsning aktivitet i U1-udtømte ekstrakt kan rekonstitueres af galectin-3 - U1 snRNP partikel fanget på agarose perler kovalent kombineret med anti-galectin-3 antistoffer. Resultaterne tyder på, at galectin-3 - U1 snRNP - præ-mRNA ternary kompleks er et funktionelt E-kompleks, der fører til mellemprodukter og produkter af splejsning reaktion, og at galectin-3 kommer ind i splejsning vej gennem sin tilknytning til U1 snRNP. Ordningen med at anvende komplekser affinitet- eller immun-udvalgt på perler til at rekonstruere splejsning aktivitet i ekstrakter udtømt af en bestemt splejsning faktor kan være generelt gældende for andre systemer.

Introduction

Produktion af de fleste eukaryote messenger RNA'er (mRNAs) indebærer fjernelse af introner og ligation af exons i en nuklear proces, der kaldes præ-mRNA splejsning1. To klasser af RNA-proteinkomplekser (RRNPs) leder behandlingen af RNA før budbringeren ind i moden mRNA via splejsede komplekser. En klasse, spirende pre-messenger RNPs, er dannet co-transcriptionally ved binding af heterogene nukleare RNP proteiner og andre RNA-bindende proteiner, herunder nogle medlemmer af SR familien, der giver hnRNP komplekser2. Den anden klasse, uracil-rige små nukleare RNPs (U snRNPs med U1, U2, U4, U5, og U6 snRNAs) er forbundet med U-specifikke og kerneproteiner3,4. U snRNPs interagerer på en ordnet måde med specifikke regioner af præ-messenger RNPs i en dynamisk remodeling vej som introns er fjernet og exons er ligated til at producere modne mRNPs5. Mange yderligere nukleare proteiner deltager i disse behandlingshændelser6.

Galectin-1 (Gal1) og galectin-3 (Gal3) er to proteiner, der er nødvendige faktorer i splejsning vej som vist ved udtømning-rekonstitution undersøgelser7,8. Fjernelse af begge galectiner fra splejsning af kompetente nukleare ekstrakter (NE) afskaffer splejsning og splejsning aktivitet på et tidligt trin. Tilføjelse af enten galectin til en sådan dobbelt udtømt NE genopretter begge aktiviteter. Gal1 og Gal3 er komponenter i aktive splekviomer, som det fremgår af specifik immunprecipitation af præ-mRNA, splejsning mellemprodukter, og modne mRNA ved antiserum specifikke for enten Gal1 eller Gal39. Det er vigtigt, gal3 forbinder med endogene U snRNA indeholdende partikler i NE uden for splejsning vej som det fremgår af nedbør af snRNPs af anti-Gal3 antisera10. Endelig ændrer lyddæmpning af Gal3 i HeLa-celler splejsningsmønstre af mange gener11.

I NE præ-inkuberet til at adskille præformede spleknoomer12, snRNPs findes i flere komplekser sedimentering i glycerol gradienter fra 7S til større end 60S. Selvom glycerolgradientfraktionering er en almindelig teknik til isolering af splejsede komplekser og komponenter (se f.eks. referencer13,14,15), har vi udvidet denne metode ved at karakterisere specifikke fraktioner ved hjælp af antistofimmunpitationer. En snRNP sedimentering ved 10S indeholder kun U1 snRNA sammen med Gal3. Immunprecipitation af 10S-fraktionen med antisera, der er specifik for Gal3 eller U1 snRNP, medudfælder både U1 og Gal3, hvilket indikerer, at nogle af U1 snRNP monopartiklerne er bundet til Gal310. Da U1 snRNP er det første kompleks, der binder sig til præ-mRNP i splejset samling1,5, repræsenterer dette trin et potentielt indgangssted for Gal3 i splejsningsvejen. På dette grundlag viste vi, at 10S Gal3-U1 snRNP monopartikler bundet til anti-Gal3 indeholder perler restaureret splejsning aktivitet til en U1 snRNP udtømt NE, oprettelse af dette kompleks som en mekanisme, hvorved Gal3 er rekrutteret i splejset vej16. Dette står i kontrast til forsøg på at isolere splejsomer på bestemte stadier i splejsning reaktion og katalogisering de tilhørende faktorer17,18. I sådanne undersøgelser fastslås tilstedeværelsen af visse faktorer på et tidspunkt, men ikke den mekanisme, hvormed de blev indlæst.

Vi havde tidligere beskrevet i detaljer forberedelsen af NE, splejsningsubstratet, samlingen af splejsning reaktion blanding, og analysen af produkter i vores dokumentation af galectins rolle i præ-mRNA splejsning19. Vi beskriver nu forsøgsprocedurerne for fraktionering af nukleare ekstrakter for at opnå en brøkdel beriget i Gal3 - U1 snRNP-kompleks og for immunvalg af sidstnævnte kompleks for at rekonstruere splejsningsaktivitet i et U1-udtømt nukleart ekstrakt.

Figure 1
Figur 1: Skemat diagram, der illustrerer komplementering af splejsning i nukleart ekstrakt udtømt af U1 snRNP af et Gal3-U1 snRNP-kompleks på perler. (A) NE i Buffer C (NE(C)) inkuberes med Protein A-Sepharose perler kovalent kombineret med anti-U1 snRNP (αU1 perler). Den ubundne brøk er udtømt af U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE i Buffer D (NE(D)) er fraktioneret over en 12%-32% glycerol gradient ved ultracentrifugering. Fraktioner svarende til 10S-regionen (fraktioner 3-5) kombineres og blandes med perler kovalent kombineret med anti-Gal3 antistoffer (αGal3 perler). Materialet bundet til perlerne indeholder en Gal3-U1 snRNP monopartikler. (C) Gal3-U1 snRNP-komplekset fra del (B) blandes med U1ΔNE fra del (A) i en splejsning ved hjælp af 32P-mærket MINX pre-mRNA-substrat, og mellemprodukter og produkter fra splejsningreaktionen analyseres ved gelelektroforse og autoradiografi. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bemærkninger til generelle procedurer

  1. Sørg for, at alle kemikalier (bufferkomponenter, enzymer osv.) holdes fri for ribonuklease (RNase). Sequester alle kommercielt købte reagensflasker fra almindelig laboratoriebrug. Brug handsker til alle trin i forsøgsproceduren. Brug kun glasvarer og redskaber, der er bagt (se trin 1.2 nedenfor), og opløsninger, der er forbehandlet (se trin 1.3 nedenfor).
  2. Bag alt glas (bægerglas, kolber, flasker, pipetter osv.) i mindst 4 timer ved 177 °C. Wrap andre redskaber (spateller, stir-barer, osv.) i aluminiumsfolie før bagning under de samme betingelser.
  3. Der fremstilles en opløsning på 0,1 % (vol/vol)af diethylpyrocarbonat (DEPC) i dobbeltdestilleret vand (ddH2O). Brug en magnetisk stir-bar, rør denne opløsning natten over og derefter autoklave. Brug denne DEPC-behandlede H2O til at fremstille alle løsninger, der indeholder Tris; derefter filtrere sterilisere ved hjælp af en flaske top vakuumfilter. Brug regelmæssig ddH2O til at forberede alle andre løsninger (uden Tris); derefter behandles med DEPC (0,1%, vol/vol) og autoklave.
    BEMÆRK: De buffere, der anvendes i følgende sæt forsøgsprocedurer, er angivet alfabetisk i tabel 1.
Navn på buffer Sammensætning
Borate buffer 0,2 M natriumborat, pH 9
Buffer C 20 mM HEPES, pH 7,9, 25% (vol/vol) glycerol, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,5 mM dithiothreitol (DTT)
Buffer D 10 mM HEPES, pH 7,9, 20% (vol/vol) glycerol, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM DTT
60%D 60% Buffer D og 40% H2O
Ethanolamin 0,2 M ethanolamin, pH 8
HEPES bindingsbuffer 20 mM HEPES, pH 7,9
HEPES vaskebuffer 20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M NaCl
RNA-indlæsningsbuffer 90% formamid, 20 mM EDTA, pH 8, 0,05% (w/v) bromophenol blå
SDS-PAGE-buffer 25 mM Tris, 169 mM glycin, 0,1% natrium dodecyl sulfat (SDS), pH 8,8
SDS-eksempelbuffer 62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0,1% (w/v) bromophenol blå
TBE buffer til RNA geler 89 mM Tris, 89 mM borsyre, 2,5 mM EDTA, pH 8,3
TE-buffer 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA
Overførselsbuffer 25 mM Tris, 1,92 M glycin, 20% methanol, pH 8,3
T-TBS-buffer 10 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Mellem 20, pH 7,5
TX-vaskebuffer 0,05% Triton X-100 (TX) i 60%D

Tabel 1: Navn og sammensætning af buffere

2. Forberedelse af NE udtømt af U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. Fremstilling af anti-U1 perler til immunadsorption
    1. Forsvulmet 50 mg Protein A-Sepharose CL-4B perler i overskud DEPC-behandlet H2O til at producere ca 200 μL af hævede perler og derefter vaske i HEPES vask buffer.
    2. Til denne vask og alle efterfølgende vaske, pellet perlerne ved centrifugering (1.000 x g i en svingende spand rotor ved 4 °C for 10-15 s) og fjerne ubundet vask ved hjælp af en mikropipettor og kassere.
    3. Bland 150 μL vaskede perler med 150 μL humant autoimmunt serum, der er specifikt for U1 snRNP (volumen af antistof mod volumen af perler i et forhold på 1:1).
    4. Blandingen til 20 mM HEPES, pH 7,9, svarende til betingelserne for HEPES-bindingsbufferen, justeres på grundlag af den samlede volumen på (~300 μL fra trin 2.1.3 ovenfor) til 20 mM HEPES, pH 7.9, svarende til betingelserne for HEPES-bindingsbufferen. inkubere denne blanding med kontinuerlig vuggen ved stuetemperatur i 60 min.
    5. Perlerne, der er bundet med antistoffer, vaskes med 1 mL boratbuffer (0,2 M natriumborat, pH 9) og genanvendes i 1 mL af samme boratbuffer.
    6. For at parre antistoffet bundet til Protein A-Sepharose perlerne, tilsæt dimethylpimelimidate til en endelig koncentration på 20 mM og inkuberes ved stuetemperatur med vuggende i 60 min.
    7. Vask perlerne med 1 mL boratbuffer.
    8. Hvis du vil blokere ethvert ikke-rekonkurreret krydsbindingsreagens, tilsættes 1 mL 0,2 M ethanolamin (pH 8) og inkuberes ved stuetemperatur med vuggende i 60 min.
    9. Vask de antistof-koblede perler, herefter udpeget som anti-U1 perler, to gange med 0,5 mL TX vask buffer (0,05% Triton X-100 i 60% D).
  2. Udtømning af U1 snRNP fra NE (se figur 1A)
    BEMÆRK: Proceduren for forberedelse af NE fra HeLa-celler blev oprindeligt udviklet af Dignam et al.20. Vi har beskrevet materialer og detaljerede metoder til fremstilling af NE til splejsning af assays19 (se trin 2.1 og 3.1 i denne reference). NE, som oprindeligt forberedt er i Buffer C og vil herefter blive udpeget som NE (C). NE(C) dialyzed mod og ekvilibreret med Buffer D vil blive udpeget som NE(D).
    1. Inkuberes 200 μL NE(C) med 100 μL anti-U1 perler fra trin 2.1.9 ovenfor.
    2. Tilsæt 5 μL RNasin til blandingen.
    3. Mikrorørets hoved-over-hale drejes ved 4 °C i 1 time.
    4. Pellet blandingen ved centrifugering (1.000 x g i en svingende spand rotor ved 4 °C for 10-15 s) og indsamle ubundet materiale (U1ΔNE) ved hjælp af en Hamilton sprøjte.
    5. Dialyze hele volumen af U1ΔNE, sammen med en separat 50 μL aliquot af den oprindelige nondepleted NE (C), i separate rum af en mikrodialyzer, med omrøring, i 75 min mod 60% D ved hjælp af en dialysemembran med 8 K molekylvægt cutoff.
    6. Umiddelbart efter dialyse opdeles disse præparater (U1ΔNE og NE i 60% D) i 20 μL aliquots; derefter snap fryse i en tøris / ethanol bad og opbevares ved -80 °C.
  3. Analyse af RNA og proteinindholdet i U1ΔNE og materiale bundet på anti-U1 perler
    1. Efter fjernelsen af det ubundne materiale (U1ΔNE) (trin 2.2.4) vaskes det materiale, der er bundet til anti-U1-perlerne, ved at tilsætte 0,5 mL TX-vaskebuffer. Pellet blandingen ved centrifugering (1.000 x g i en svingende spand rotor ved 4 °C for 10-15 s) og fjern supernatanten ved hjælp af en mikropipettor og kassér.
    2. Vasketrin 2.3.1 gentages to gange.
    3. Materialet, der er bundet til anti-U1-perlerne, fjernes ved at tilsætte 100 μL 2x SDS-prøvebuffer til 100 μL af perlerne og inkuberes i 10 min ved stuetemperatur.
    4. Pellet blandingen ved centrifugering (1.000 x g i en svingende spand rotor ved 4 °C for 10-15 s); supernatanten ved Hamilton-sprøjten, og snapfryse i et tøris/ethanolbad. Opbevares ved -80 °C.
    5. Sammenlign den nondepleted NE, den udtømte NE (U1ΔNE) og materialet bundet til perlerne (fjernet fra perlerne af SDS-prøvebuffer som beskrevet i trin 2.3.3 og 2.3.4 ovenfor). Følg trin 2.3.6-2.3.8 til RNA-analyse eller trin 2.3.9-2.3.10 til proteinanalyse.
    6. For hver prøve udtages RNA'et med 200 μL phenolchloroform (50:50, v/v); derefter ekstraheres igen med 180 μL chloroform-isoamylalkohol (25:1, v/v). Efter udvinding tilsættes 300 μL kold 200-korrekt ethanol, inverteres for at blandes, og det udfældede RNA opbevares natten over ved -20 °C.
    7. Centrifugere det ethanol-udfældede RNA (12.000 x g i 10 min ved 4 °C). Vask pellets med 150 μL kold 70% ethanol. Centrifuge igen (12.000 x g) ved 4 °C i 15 min. Fjern supernatanten ved hjælp af en mikropipettor og tør pellets i en hastighed vac i 10-15 min uden varme.
    8. Den tørrede RNA-pille i 10 μL RNA-belastningsbuffer, forsigtigt vortex, varme til 75-85 °C i 90 s og inkuberes derefter på is i 2 min. Adskil snRNAs ved gel elektroforese (2 timer ved 16 mA) gennem 13% polyacrylamid - 8,3 M urinstof geler og derefter enten plette med etiumbromid eller underlagt nordlige blotting10,16.
    9. Proteinprøverne i SDS-prøvebufferen fra trin 2.3.5 på 12,5 % polyacrylamidgeler og elektrophorese ved 200 V i ca. 45-50 min i SDS-PAGE (natrium dodecyl sulfatpolylektrotroforese).
    10. Overfør de adskilte proteiner til nitrocellulosemembranen ved 400 mA i 2 timer i overførselsbuffer. Efter overførsel blokeres membranen ved at inkubere natten over i T-TBS, der indeholder 10% fedtfri tør mælk. Derefter immunoblot membranen til at afsløre specifikke proteiner8,21.

3. Immunprecipitation af 10S fraktioner af glycerol gradienter ved anti-Gal3

  1. Fremstilling af anti-Gal3 perler til immunadsorption
    BEMÆRK: Afledning og karakterisering af kanin polyklonale antisera mod Gal3 for kanin # 2421 og for kanin # 4910 er blevet beskrevet tidligere.
    1. Brug præimmun serum fra kanin # 49 som kontrol.
    2. Til fremstilling af anti-Gal3 perler følg den procedure, der tidligere er beskrevet til fremstilling af anti-U1 perler (trin 2.1), med undtagelse af, at der svarer til trin 2.1.3, forholdet mellem antiserum (f.eks anti-Gal3, # 49) til perler er 3:1.
    3. Lige før brug, vask antistof-koblede perler, herefter udpeget som anti-Gal3 perler, to gange med 0,5 mL TX vask buffer. Fjern supernatanten, først med en mikropipettor for at få det meste af væsken ud og derefter med en Hamilton-sprøjte for at få væsken ud af perlerne; Kassere.
  2. Immunprecipitaton af glycerolgradientfraktioner efter anti-gal3 (se figur 1B)
    1. Fraktionere NE(D) over en 12%-32% glycerol gradient10. Kombiner og bland glycerolgradientfraktioner 3, 4 og 5 (nummereret fra toppen af gradienten), som ligger i nærheden af 10S-området i gradienten.
    2. Der forberedes to prøver, hver med 150 μL aliquot af kombinerede gradientfraktioner 3-5 (trin 3.2.1), og placeres i 50 μL anti-Gal3 perler.
    3. Parallelt hermed forberedes to prøver hver med 150 μL af fraktion 1 (indeholdende Gal3, der ikke er i kompleks med U1 snRNP10; trin 3.2.1) og placeres i 50 μL anti-Gal3 perler.
    4. Som en kontrol, placere 150 μL på 60% D i en anden mikrotube af 50 μL anti-Gal3 perler.
    5. Bland forsigtigt ved at trykke på røret, og drej derefter mikrotubens hoved-over-hale ved 4 °C i 1 time.
    6. Pellet blandingen ved blid centrifugering (1.000 x g i en svingende spand rotor ved 4 °C for 10-15 s).
    7. Fjern supernatanten (ubundet materiale) ved hjælp af en Hamilton-sprøjte. Du må ikke vaske perlerne og straks anvendes til tilsætning af splejsningerne (punkt 4.2).
  3. Analyse af RNA- og proteinindholdet i det ubundne og bundne materiale fra anti-Gal3-udfældning af 10S gradientfraktioner
    1. Til analyse af komponenter i det bundne og ubundne materiale fra anti-Gal3-udfældning af 10S-gradientfraktionerne opsamles det ubundne materiale (supernatant efter trin 3.2.6), overføres til et nyt mikrorør og fryses ved -20 °C.
    2. De udfældede perler vaskes fra trin 3.2.6 (indeholdende materiale bundet til anti-Gal3) ved at tilsætte 0,5 mL TX vaskebuffer.
    3. Pellet blandingen ved skånsom centrifugering (1.000 x g i en svingende spand rotor ved 4 °C for 10-15 s); supernatanten ved hjælp af en mikropipettor og kasseres. Gentag vasketrinene to gange mere.
    4. Der tilsættes 50 μL 2X SDS-prøvebuffer til de vaskede og pelleterede anti-Gal3-perler.
    5. Bland perlerne forsigtigt og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur.
    6. Pellet blandingen ved blid centrifugering (1.000 x g i en svingende spand rotor ved 4 °C for 10-15 s), indsamle supernatant af Hamilton sprøjte og opbevares i en frisk microtube på -20 °C.
    7. Sammenligne det ubundne materiale (punkt 3.3.1) og det bundne materiale (trin 3.3.6) af anti-Gal3-nedbøren med hensyn til RNA og proteinkomponenter ved hjælp af procedurer som beskrevet i trin 2.3.6. til henholdsvis 2.3.10.

4. Samling af splejsning reaktion og analyse af produkter

  1. Forberedelse af splejsningsubstratet
    BEMÆRK: Pre-mRNA-substratet, kaldet MINX, indeholder to exonsekvenser og en intronsekvens fra Adenovirus22. MINX DNA-sekvensen i plasmiden er under kontrol af T3, T7 eller SP6 RNA polymerase promotorer. Materialerne og detaljerede metoder til linearisering af MINX plasmid-DNA'et med BamHI-begrænsningsdonuclease, transskription ved SP6 RNA-polymerase i nærværelse af α-32P[GTP] og rensning af 32P-mærket MINX til splejsning af assays er beskrevet tidligere19 (se trin 2.2 og 3.2 i denne reference).
    1. Opbevar den radioaktive minx som ethanol bundfald ved -20 °C bruge det mærkede splejsningsubstrat inden for 4-6 uger efter transskription.
    2. Lige før brug centrifugeres ethanolen med 32P-mærket MINX ved 12.000 x g i 10 min ved 4 °C supernatanten med en mikropipettor og kasseres.
    3. Der tilsættes 150 μL 70% ethanol og centrifuge ved 12.000 x g i 15 min ved 4 °C. Kassér supernatanten og tør pelleten i hastighedsvac uden varme i 15 min.
    4. Rehydrere pellet i 50 μL DEPC vand. Spot 2 μL på hvert af to GF/C-filtre filtrene nedsænkes i kold 5% trichloreddikesyre (TCA) i 10 min. Skyl med kold 5% TCA, efterfulgt af 180-bevis ethanol på en vakuumkolbe. Luft tørre filtre og underlagt scintillation tælle i 4 mL af Safety-Solve.
    5. Fortynd 32P-mærket MINX i 60% D til 104 cpm/μL til splejsningsanalysen.
  2. Samling af splejsning (se figur 1C)
    1. Saml, på is, splejsning reaktioner i et samlet volumen på 24 μL (8 μL U1ΔNE (fra trin 2.2.6), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM kreatin fosfat, 0,5 mM DTT, 20 enheder RNasin, 4 μL 32P-mærket MINX splejsning substrat (104 cpm/μL), 60% D) og tilsættes til hvert rør af perler fra punkt 3.2.7. Et identisk sæt splejsning i et samlet volumen på 24 μL, men uden U1ΔNE, samles, og der tilsættes til hvert rør af perler fra trin 3.2.7.
    2. Der fremstilles en kontrolsplejsning i et samlet volumen på 12 μL (4 μL NE(D), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM kreatinphosphat, 0,5 mM DTT, 20 enheder RNasin, 2 μL 32P-mærket MINX splejsningsubstrat (104 cpm/μL), 60% D).
    3. Bland rørene forsigtigt ved at trykke og rotere end-over-tail ved 30 °C i 90 min. Pellet blandingen ved blid centrifugering ved 1.000 x g i en svingende spand rotor ved 4 °C for 10-15 s.
    4. Stop reaktionen, og elitørene slippes af perlerne ved at tilsætte 24 μL 2x SDS-prøvebuffer til rørene, der indeholder perler, og 12 μL 2x SDS-prøvebuffer til kontrolrøret, der indeholder NE, men ingen perler. Rørene opvarmes ved 100 °C i 7 min.
    5. Centrifugere rørene forsigtigt ved 1.000 x g i en svingende spand rotor ved 4 °C for 10-15 s.
    6. Supernatanterne (elutions) overføres til friske mikrorør: ca. 48 μL fra perlerørene og 24 μL fra NE-kontrolrøret.
    7. Proteinase K (20 mg/mL) til at fordøje og opløse proteinerne: Tilsæt 5 μL til 48 μL elution fra perler og tilsæt 2,5 μL til 24 μL NE kontrol.
    8. Inkuberes rørene ved 37 °C i 40 min.
    9. Centrifugere forsigtigt rørene ved 1.000 x g i en svingende skovlrotor ved 4 °C i 10 s.
    10. Perleefortynderne fortyndes med 39,5 μL TE og 10 μL 3 M natriumacetat. NE-styringen fortyndes med 63,5 μL TE og 10 μL 3 M natriumacetat.
    11. Uddrag og analyser RNA'et som beskrevet nedenfor (punkt 4.3).
  3. Analyse af produkter af splejsning reaktion
    1. RNA'erne udvindes i hver prøve med phenolchloroform efterfulgt af chloroform-isoamylalkohol udfældelse af RNA'erne med ethanol, centrifuge, vask af pellets, fjernelse af supernatanten og tør pillerne efter samme procedure som beskrevet i trin 2.3.6 og 2.3.7.
    2. Den tørrede RNA-pille i 10 μL RNA-belastningsbuffer, forsigtigt vortex, varme til 75-85 °C i 90 s og inkuberes derefter på is i 2 min.
    3. 20 mL af en opløsning, der indeholder 13% polyacrylamid (bisacrylamid:acrylamid, 1.9:50 [wt/wt]) i 8,3 M urinstof; støbte geler 15 cm i længden ved hjælp af denne opløsning.
    4. Når gelen er støbt, elektrophorese det (uden nogen prøver indlæst) ved 400 V i 20 min ved hjælp af TBE som den løbende buffer. Efter dette trin skal brøndene vaskes med TBE-løbebuffer.
    5. Indlæs RNA-prøverne i RNA-belastningsbufferen og elektrophorese med TBE-løbebuffer ved 400 V i 3,5 til 4 timer. Efter elektroforese fjernes urinstofet ved at nedsænke og dreje gelen i destilleret vand i 10 min.
    6. Støvsug gelen på 3 M filterpapir, først i 2 timer 15 min ved 80 °C og derefter i 30 min uden varme for langsomt at afkøle den. Underlægge den tørrede gel til autoradiografi på film til at opdage placeringen af migration af de radioaktive komponenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NE udtømt af U1 snRNP (U1ΔNE fra afsnit 2.2.6) og Gal3 - U1 snRNP komplekser fra 10S-regionen af glycerol gradient immunprecipiteret af anti-Gal3 (trin 3.2.7) blev blandet i en splejsning reaktion. Denne reaktionsblanding indeholdt U1 snRNA (figur 2A, bane 3) samt det U1-specifikke protein, U1-70K (Figur 2B, bane 3). Som forventet udfældede den anti-Gal3 Gal3 (figur 2B, vognbane 3). Disse komponenter (U1 snRNA, U1-70K protein, og Gal3) blev ikke fundet i præimmune (PI) kontrol nedbør (Figur 2A, Figur 2B, bane 2). Sammenlignet med en ikke-udtømt NE udført som en positiv kontrol (Figur 2C, vognbane 1), U1ΔNE ikke udvise splejsning aktivitet (Figur 2C, bane 2). Splejsning aktivitet i U1ΔNE kunne rekonstitueres af perle-bundet Gal3 - U1 snRNP kompleks (Figur 2C, vognbane 6). Der blev fundet både produkter af splejsningsreaktionen, ligated exons og udskårne intron lariat (fremhævet af pile til højre) samt mellemprodukter, exon 1 og lariat exon 2. Komponenterne i fraktioner 3-5 var afgørende for at genoprette splejsning til U1ΔNE. Når fraktioner 3-5 blev erstattet af buffer alene (60% D) i immunprecipitation, kunne der ikke observeres splejsning ved blanding med U1ΔNE (figur 2C, bane 2), hvilket indikerer, at anti-Gal3 perlerne ikke var ansvarlige for genoprettelsen af splejsning aktivitet i sidstnævnte. Mere overbevisende, når fraktioner 3-5 blev erstattet af fraktion 1 i immunprakitationsproceduren og derefter tilsat U1ΔNE, blev der ikke fundet mellemprodukter eller produkter af splejsningsreaktionen (Figur 2C, vognbane 4). Tidligere analyse havde dokumenteret, at Gal3 i fraktion 1 repræsenterede frit Gal3-protein, ikke i forbindelse med noget RNP-kompleks10 og nordlige blotting af materialet immunpræchiseret fra fraktion 1, undlod at afsløre nogen U1 snRNA16. Endelig udviste immunplikater fra fraktion 1 og fraktioner 3-5 ikke splejsningsaktivitet, når de blev analyseret i mangel af U1ΔNE (figur 2C, henholdsvis vognbane 3 og 5).

Figure 2
Figur 2: Repræsentative resultater af RNA- og polypeptidsammensætningerne af anti-Gal3-udfældelsen af 10S-regionen i glycerolgradienten og dets evne til at rekonstruere splejsning i atomekstrakt udtømt af U1 snRNP (U1ΔNE). A) Nordlig blottinganalyse af U1 snRNA bundet til perler kombineret med præimmun serum (PI; bane 2) eller perler kombineret med anti-Gal3 (αGal3; bane 3). Bane 1 udgør 20% af mængden af kombinerede glycerolgradientfraktioner, der udsættes for immunprecipitation. Bane 2 og vognbane 3 repræsenterer hver 25% af det bundne materiale, der er udvundet af de respektive perler. (B) Vestlig blottinganalyse af polypeptider bundet til perler kombineret med præimmun serum (bane 2) eller anti-Gal3 (vognbane 3). Proteinidentiteter er angivet til højre. Bane 1 udgør 20% af mængden af kombinerede glycerolgradientfraktioner, der udsættes for immunprecipitation. Bane 2 og vognbane 3 repræsenterer hver 75% af det bundne materiale, der er udvundet af de respektive perler. (C) Analyse af evnen til at genoprette splejsningsaktiviteten til U1ΔNE ved anti-Gal3 (αGal3) immunprecipitater af glycerolgradientfraktion 1 (Fr 1), fraktioner 3-5 (Fr 3-5) eller 60% Buffer D (60% D). Tegnet + eller - over den dristige faste linje angiver tilstedeværelsen eller fraværet af hver af disse bundfald i splejsning reaktion blandingen. Tegnet + eller - under den udfyldte dækkende linje med fed skrift angiver tilstedeværelsen eller fraværet af U1ΔNE (eller NE i Buffer D). Bane 1: 4 μL NE i en 12 μL splejsning analyse, hvoraf 100% blev udsat for gel analyse. For vognbane 2-6 var den samlede volumen af splejsningsanalysen 24 μL, hvoraf 50% blev underkastet gelanalyse. Bane 2: 8 μL U1ΔNE plus perler fra nedbør på 60% D. Bane 3: perler fra nedbør af Fr 1. Bane 4: 8 μL U1ΔNE plus perler fra nedbør af Fr 1. Lane 5: perler fra nedbør af Fr 3-5. Bane 6: 8 μL U1ΔNE plus perler fra nedbør af Fr 3-5. Migrationspositionerne af præ-mRNA-substratet, mellemprodukterne og produkterne (intron lariat og ligated exoner, fremhævet af pile) er angivet til højre. Dataene i panel C er afledt af det samme eksperiment som vist i panel A, figur 2 i Haudek et al.16. Klik her for at se en større version af dette tal.

Resultaterne i figur 2 blev opnået med anti-Gal3 (#49). De samme resultater kunne observeres med en anden anti-Gal3 (# 24), men det præimmune serum fra kanin # 49 undlod at rekonstruere splejsning i U1ΔNE efter inkubation med fraktioner 3-516. Alle disse resultater tyder stærkt på, at pre-mRNA substratet kan binde sig til 10S Gal3 - U1 snRNP partikel immobiliseret på perler, og at ternary komplekset er funktionel i splejsning vej.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne rapport giver de eksperimentelle detaljer, der dokumenterer en Gal3 - U1 snRNP kompleks fanget på anti-Gal3 belagt perler kan binde sig til præ-mRNA substrat og dette ternary kompleks kan genoprette splejsning aktivitet til en U1 snRNP-udtømt NE. Gal3 er et medlem af en familie af proteiner oprindeligt isoleret på grundlag af sin galactose-specifikke kulhydrat-bindende aktivitet23 . Tidlige immunfluorescens- og subcellulære fraktioneringsundersøgelser gav den første antydning af en sammenslutning af Gal3 med komponenter i splejsningsmaskineriet: colocalization i nukleare pletter med Sm kernepolyplip af snRNPs og serin- og argininrige (SR) familie af krydrende faktorer24,25 og sedimentering på cæsiumsulfatgradienter ved en tæthed (1,3-1,35 g / mL), der svarer til hnRNP og snRNP24 . Efterfølgende udtømning-rekonstitution eksperimenter, igen viste Gal3 (samt et andet medlem af galectin familien, galectin-1 (Gal1)) var påkrævet, men overflødige, faktorer i cellefri splejsning assays7,8.

Når NE er fraktioneret over en glycerol gradient, immunprecipitation af gradient fraktioner med anti-Gal3 gav forskellige komplekser med varierende nøgletal af forskellige snRNAs og tilhørende proteiner, hvilket tyder på, at Gal3 er forbundet med flere snRNPs i mangel af præ-mRNA splejsning substrat10. Især er Gal3 og U1 snRNP samlet i en monopartikler, der sedimenter til ~ 10S-regionen af gradienten (fraktioner 3-5 af en 12%-32% glycerol gradient). Da bindingen af U1 snRNP til 5'-splejsningsstedet for præ-mRNA repræsenterer det første skridt i splejset samling5,26, var det muligt, at Gal3 kan få adgang til splejsningsvejen via sin tilknytning til U1 snRNP. Dette begreb understøttes af den observation, at Gal3, som en del af 10S Gal3-U1 snRNP kompleks, kunne findes at forbinde med en pre-mRNA substrat, men ikke med kontrol RNA mangler splejsning steder, hvilket tyder på 5'splejse site anerkendelse af U1 snRNP var en vigtig forudsætning i sin samling i en splejsning. Desuden afskaffede forbehandling af fraktioner, der indeholder Gal3-U1 snRNP-partiklen med mikrokokkernekerne, lastningen af Gal3 på præ-mRNA10. Det centrale spørgsmål er derfor, om dette tidlige ternære kompleks, der består af Gal3, U1 snRNP og pre-mRNA, repræsenterer et funktionelt E-kompleks, der er forpligtet til splejsningsforløbet eller et blindde H-kompleks, der ikke kan komme ind på splejsningvejen5,26. Vi behandlede dette spørgsmål ved at teste, om Gal3 - U1 snRNP kan rekonstruere splejsning aktivitet i NE udtømt af U1 snRNP med samtidig tab af splejsning kapacitet (U1ΔNE). Resultaterne af vores eksperimenter, hvis protokol er beskrevet i denne artikel, indikerer, at Gal3 - U1 snRNP binder sig til præ-mRNA substrat til at danne et funktionelt E-kompleks, og at U1 snRNP er forpligtet til at indarbejde Gal3 i splejsning vej16.

To kritiske trin i den beskrevne eksperimentelle protokol skal bemærkes. For det første kræver trin 3.2.7 fjernelse af det supernatante ubundne materiale efter anti-Gal3-udfældning af glycerolfraktionerne. Fuldstændig fjernelse af væsken fra pelleted agarose perler kræver, at nålespidsen af Hamilton sprøjten indsættes til bunden af perlerne. Dette skal gøres omhyggeligt, så perlerne ikke tilstopper sprøjtenålen eller går tabt ved at klæbe til nålen, da sidstnævnte trækkes ud af røret. For det andet er det vigtigt, at de pelleterede perler bruges til samling af splejsning reaktionerne med så lidt forsinkelse som muligt. Koordineringen af disse to trin var afgørende for, at proceduren kunne blive en succes. I den forbindelse skal det også bemærkes, at vi for nylig har forbedret genopretningen af Gal3-U1 snRNP-komplekser i pelletfraktionen ved at erstatte Protein A-Sepharose CL-4B perler med Protein A-magnetiske nanopartikler i den kovalente kobling af anti-Gal3 antistof til perler.

Den centrale konklusion er afledt af eksperimenter, hvor U1ΔNE, blottet for splejsning aktivitet, suppleres af 10S Gal3 - U1 snRNP partikel immunprecipitated af perler kovalent afledt med anti-Gal3 antistoffer. Selv om der var klare beviser for fjernelse af intron, var effektiviteten af exon-sammenføjning mindre end den, der blev observeret i den reaktion, der blev udført i mangel af perler (sammenlign bane 6 versus vognbane 1 i figur 2C). I vores cellefri splejsning assays, ca 30% af radioaktivitet i pre-mRNA substrat er typisk omdannet til ligated exons. Denne mangel i ekson ligation kan skyldes: a) en mindre end optimal mængde af en kritisk komponent, enten i U1ΔNE (figur 1A) eller i Gal3 - U1 snRNP-komplekset (figur 1B); eller b) nogle strukturelle begrænsninger (f.eks. vanskeligheder med at gennemgå en kropsbygningsændring) af Gal3 - U1 snRNP immobiliseret på anti-Gal3 perler under splejsning reaktion (Figur 1C).

Andre forskere har rapporteret brugen af solid fase immun-udvælgelse til fælde specifikke komplekser og dokumentere katalytisk aktivitet eller nogle bestilt progression af splejsning strukturer. For eksempel viste Chiu et al. tilsætning af gærsplejsning faktor Cwc25 kan jage pre-mRNA substrat på et antistof-fanget samlet spleviom i den første katalytiske reaktion, hvilket giver mellemprodukter, exon 1 og lariat-exon227. I samme gærsystem brugte Krishnan et al. et Protein A-tag til at immobilisere via biotinyleret-IgG renset Bact splejsekompleks til strøptavidin-coatede magnetiske perler i en biofysisk undersøgelse af præ-mRNA-remodeling (afstand mellem 5'splejsningsstedet og grenpunktet) før det første splejsningstrin28. Vores nuværende artikel udvider disse tidligere undersøgelser med hensyn til at fuldføre begge trin i splejsningsreaktionen og kan derfor have betydning af teknisk karakter: Det samme sæt procedurer kan anvendes på en række andre splejsningsfaktorer, der forbinder med snRNPs for at undersøge, hvornår og hvordan disse faktorer indlæses på splejsede komplekser. Evnen til at overvåge mRNA-produktdannelsen fra splejsningreaktionen udgør et stærkt bevis på, at disse samlede spleknoomer faktisk er funktionelle. Dette kan fremme vores forståelse af, hvordan spleviomer form, som tidligere rapporter ved hjælp af proteomiske tilgange17 kun katalog tilstedeværelsen af nogle faktorer i et givet kompleks snarere end hvordan faktorerne kan have været indlæst på komplekset.

En klar begrænsning af disse procedurers generelle anvendelighed på andre proteiner eller snRNPs for at vurdere deres rolle i splejsning er tilgængeligheden af et specifikt antistof rettet mod den særlige faktor, der effektivt vil fremskynde det tilknyttede kompleks. For eksempel immunpolerede polyklonale anti-Gal3 antisera fra en række kaniner (f.eks. #24, #49) Gal3-U1 snRNP-komplekset fra atomekstrakt eller glycerolfraktioner 3-5 (U1 snRNA og U1 70K protein, der er udfældet med det cognate antigen, Gal3). I modsætning hertil gav to kommercielt tilgængelige monoklonale antistoffer rettet mod Gal3, Mac-2 og NCL-GAL3, ikke de samme resultater. Epitoperne af Mac-2 og NCL-GAL3 er blevet kortlagt til aminoterminalen domæne Gal3 polypeptid29, og det er muligt, at deres respektive epitoper ikke er tilgængelige i Gal3-U1 snRNP kompleks. Desuden kan en antistofbundet faktor (f.eks. Gal3) og det tilhørende kompleks (f.eks. U1 snRNP) muligvis ikke længere danne yderligere interaktioner med præ-mRNA eller andre splejsede komponenter. Dette kan skyldes fysisk interferens fra antistoffet eller af den matrix, som antistoffet er kovalent koblet til. Derfor skal hvert interessesystem vurderes fra sag til sag. På trods af disse begrænsninger ser det imidlertid ud til, at ordningen med at anvende komplekser affinitet- eller immun-udvalgt på perler til rekonstrueret splejsning aktivitet i ekstrakter udtømt af en bestemt splejsning faktor kan være generelt gældende for andre systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde er blevet støttet af National Science Foundation Grant MCB-0092919 og Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (til RJP) og af National Institutes of Health Grant GM-38740 og Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (til JLW).

MINX pre-mRNA substrat, der anvendes i splejsning assays var en venlig gave fra Dr. Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-U1 snRNP The Binding Site Hu ENA-RNP #33471 human autoimmune serum specific for U1 snRNP
bottle top vacuum filter Fisher Scientific Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) for filtering solutions containing Tris
centrifuge International Equipment Company IEC Model PR-6 for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation
diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 159220-5G for treatment of water used in preparation of all solutions
dimethylpimelimidate (DMP) Sigma-Aldrich 80490-5G for cross-linking antibody to Sepharose beads
electrophoresis cell BioRad Laboratories, Inc Mini-Protean II for SDS-PAGE separation of proteins
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000-100ml for blocking after the cross-linking reaction
gel electrophoresis system Hoefer, Inc HSI SE 500 Series for separating snRNAs by gel electrophoresis
gel slab dryer BioRad Model 224 for drying gel slabs for autoradiography
Hybond ECL membrane GE Healthcare RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) for immunoblotting of proteins on membrane
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) Pierce Microdialyzer System 100 for exchanging the buffer of nuclear extract  
microdialyzer membranes (8K cutoff) Pierce 66310 for exchanging the buffer of nuclear extract 
non-fat dry milk Spartan Stores Spartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4B Millipore-Sigma GE 17-0780-01 for coupling antibody to beads
Proteinase K Millipore-Sigma P2308-5mg for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs
RNasin Promega N2111 for inhibiting ribonuclease activity
rocker/rotator Lab Industries, Inc  Labquake Shaker 400-110 for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation
Safety-Solve Research Products International Corp. No. 111177 scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate
scintillation counter Beckman Instruments LS6000SC scintillation counter for determination of radioactivity 
speed vaccum concentrator Savant SVC 100H for drying ethanol-precipitated RNA pellets
Transphor electrophoresis unit Hoefer, Inc Hoefer TE Series Transphor for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoskins, A. A., Moore, M. J. The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine. Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).
  2. Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing. Science. 231, 1534-1539 (1986).
  3. Lerner, M., Steitz, J. A. Snurps and scyrps. Cell. 25, 298-300 (1981).
  4. Maniatis, T., Reed, R. The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing. Nature. 325, 673-678 (1987).
  5. Hoskins, A. A., et al. Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes. Science. 331, 1289-1295 (2011).
  6. Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins. International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).
  7. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).
  8. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).
  9. Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3. Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).
  10. Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP. Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).
  11. Fritsch, K., et al. Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex. BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).
  12. Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).
  13. Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA. Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).
  14. Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes. Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).
  15. Malca, H., Shomron, N., Ast, G. The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex. Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).
  16. Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes. Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).
  17. Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome. Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).
  18. Jurica, M. S., Moore, M. J. Capturing splicing complexes to study structure and mechanism. Methods. 28, 336-345 (2002).
  19. Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing. Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).
  20. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).
  21. Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains. Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).
  22. Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles. Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).
  23. Barondes, S. H., et al. Galectins: a family of animal β-galactoside-binding proteins. Cell. 76, 597-598 (1994).
  24. Laing, J. G., Wang, J. L. Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex. Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).
  25. Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components. Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).
  26. Michaud, S., Reed, R. An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway. Genes & Development. 5, 2534-2546 (1991).
  27. Chiu, Y. -F., et al. Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction. Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).
  28. Krishnan, R., et al. Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).
  29. Gray, R. M., et al. Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3. Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).

Tags

Biokemi Udgave 166 præ-mRNA splejsning splejsning cellefri splejsning assay glycerol gradient fraktionering U1 snRNP kompleks galectiner
Komplementering af splejsning aktivitet af en Galectin-3 - U1 snRNP Kompleks på perler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voss, P. G., Haudek, K. C.,… More

Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads. J. Vis. Exp. (166), e61990, doi:10.3791/61990 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter