Summary
Dit protocol maakt gebruik van een immunofluorescentietest om PM2,5-geïnduceerdeDNA-schade in de ontlede harten van zebravisembryo's te detecteren.
Abstract
Blootstelling aan fijnstof in de omgeving (PM2,5)kan leiden tot cardiale ontwikkelingstoxiciteit, maar de onderliggende moleculaire mechanismen zijn nog onduidelijk. 8-hydroxy-2'deoxygenase (8-OHdG) is een marker van oxidatieve DNA-schade en γH2AX is een gevoelige marker voor DNA-dubbelstrengsbreuken. In deze studie wilden we PM2,5-geïnduceerde8-OHdG- en γH2AX-veranderingen in het hart van zebravisembryo's detecteren met behulp van een immunofluorescentietest. Zebravisembryo's werden behandeld met extraheerbare organische stoffen (EOM) van PM2,5 bij 5 μg / ml in de aan- of afwezigheid van antioxidant N-acetyl-L-cysteïne (NAC, 0,25 μM) 2 uur na bevruchting (hpf). DMSO werd gebruikt als voertuigbesturing. Bij 72 hpf werden harten met behulp van een spuitnaald van embryo's ontleed en gefixeerd en gepermeabiliseerd. Na te zijn geblokkeerd, werden monsters onderzocht met primaire antilichamen tegen 8-OHdG en γH2AX. Monsters werden vervolgens gewassen en geïncubeerd met secundaire antilichamen. De resulterende beelden werden waargenomen onder fluorescentiemicroscopie en gekwantificeerd met behulp van ImageJ. De resultaten tonen aan dat EOM van PM2.5 8-OHdG- en γH2AX-signalen in het hart van zebravisembryo's aanzienlijk verbeterde. NAC, dat optrad als een reactieve zuurstofsoort (ROS) aaseter, ging de door EOM geïnduceerde DNA-schade echter gedeeltelijk tegen. Hier presenteren we een immunofluorescentieprotocol voor het onderzoeken van de rol van DNA-schade in PM2.5-geïnduceerdehartafwijkingen die kunnen worden toegepast op de detectie van door chemicaliën geïnduceerde eiwitexpressieveranderingen in de harten van zebravisembryo's.
Introduction
Luchtvervuiling is nu een ernstig milieuprobleem waarmee de wereld wordt geconfronteerd. Fijnstof in de omgeving (PM2,5), een van de belangrijkste indicatoren van de luchtkwaliteit, kan een groot aantal schadelijke stoffen vervoeren en de bloedsomloop binnendringen, waardoor de menselijke gezondheid ernstig wordt geschaad1. Epidemiologische studies hebben aangetoond dat blootstelling aan PM2,5 kan leiden tot een verhoogd risico op aangeboren hartafwijkingen (CHD's)2,3. Bewijs uit dierproeven toonde ook aan dat PM2,5 abnormale cardiale ontwikkeling kan veroorzaken bij zebravisembryo's en de nakomelingen van muizen, maar de moleculaire mechanismen van de cardiale ontwikkelingstoxiciteit van PM2,5 zijn nog grotendeels onbekend4,5,6.
DNA-schade kan celcyclusstilstand veroorzaken en apoptose veroorzaken, die het potentieel van voorlopercellen op grote schaal kan vernietigen en bijgevolg de hartontwikkeling kan schaden7). Het is goed gedocumenteerd dat milieuverontreinigende stoffen, waaronder PM2.5, het potentieel hebben om DNA aan te vallen via oxidatieve stressmechanismen8,9. Zowel de hartontwikkeling van mens als zebravis zijn gevoelig voor oxidatieve stress10,11,12. 8-OHdG is een oxidatieve DNA-schademarker en het γH2AX-signaal is een marker van DNA-dubbelstrengsbreuken. N-acetyl-L-cysteïne (NAC), een synthetische voorloper van intracellulaire cysteïne en glutathion, wordt veel gebruikt als een anti-oxidatieve verbinding. In deze studie gebruiken we NAC om de rol van oxidatieve stress in PM2.5- geïnduceerde DNA-schade13te onderzoeken.
Zebravis als modelgewerveld dier is op grote schaal gebruikt om cardiale ontwikkeling en menselijke hart- en vaatziekten te bestuderen, omdat mechanismen van cardiale ontwikkeling zeer geconserveerd zijn bij gewervelde dieren14,15. De voordelen van het gebruik van zebravissen als model zijn hun kleine formaat, sterk voortplantingsvermogen en lage voedingskosten. Van bijzonder belang voor deze studies, zebravisembryo's zijn niet afhankelijk van de bloedsomloop tijdens de vroege ontwikkeling en kunnen ernstige hartmisvorming overleven14. Bovendien maakt hun transparantie het mogelijk om het hele lichaam direct onder een microscoop te observeren. Zebravisembryo's bieden dus een uitstekende gelegenheid voor het beoordelen van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de inductie van cardiale ontwikkelingstoxiciteit als gevolg van blootstelling aan verschillende milieuchemicaliën5,16,17. We hebben eerder gemeld dat PM2.5-geïnduceerde oxidatieve stress leidt tot DNA-schade en apoptose, wat resulteert in hartmisvormingen bij zebravissen18. In deze studie bieden we een gedetailleerd protocol voor het onderzoeken van PM2.5-geïnduceerdeDNA-schade in het hart van zebravisembryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Wild type zebravissen (AB) die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen van het National Zebrafish Resource Center in Wuhan, China. Alle dierprocedures die hier worden beschreven, zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care Institution van de ethische commissie van Soochow University.
1. PM2,5-bemonstering en extractie van organische verbindingen
OPMERKING: PM2.5 werd verzameld in een stedelijk gebied in Suzhou, China, 1-7 augustus 2015, zoals eerder beschreven5.
- Bak 47 mm kwartsmembraanfilters gedurende 2 uur in een 500 °C dempingsoven om de organische componenten te verwijderen.
- Plaats een filter in een PM2.5 sampler voor 24 uur ononderbroken bemonstering.
- Verwijder het filter en droog gedurende 24 uur bij kamertemperatuur.
- Kwantificeer het filter met een analytische balans.
- Extraheer organische componenten uit het filter door Soxhlet-extractie met dichloormethaan als oplosmiddel19.
- Droog de EOM door een roterende verdamping in een waterbad van 60 °C en stikstofstroom. Los EOM op in DMSO en bewaar bij -20 °C.
2. Embryoverzameling en behandeling van zebravissen
- Houd de zebravis op 28,5 ± 0,5 °C in een recircerend aquacultuursysteem met een 14 uur lichte en 10 uur donkere fotoperiodecyclus.
- Plaats gezonde volwassen zebravissen in een aquarium met een verhouding van 2: 1 tussen mannen en vrouwen.
- Verzamel de volgende dag de embryo's en was ze met systeemwater (d.w.z. zebravisbroedwater).
- Selecteer en verdeel willekeurig zebravisembryo's die een normale ontwikkeling vertonen (uniforme grootte, volle korrels en geen eiercoagulatie) in 4 groepen in individuele glazen petrischalen met een diameter van 7 cm (ongeveer 50 embryo's per schotel).
- Behandel de embryo's met PM2,5 (5 mg/L) in aanwezigheid of afwezigheid van NAC bij 0,25 μM van 2 hpf tot 72 hpf. Gebruik DMSO als voertuigbesturing tot een eindconcentratie van 0,1% (v/v).
3. Morfologische observatie van zebravisembryo's en hartdissectie
- Breng bij 72 hpf embryo's over in glazen dia's en observeer onder een stereomicroscoop. Registreer hartmisvormingen, zoals pericardoedeem, veranderde looping en verminderde grootte.
- Bereken misvormingspercentages (het percentage embryo's met hartafwijkingen van de totale levende embryo's) en analyseer verschillen tussen groepen met behulp van eenrichtings-ANOVA gevolgd door de Meervoudige Vergelijkingstest van Turkije (p < 0,05 = statistisch significant).
- Verdoof de embryo's met 0,6 mg / ml MS-222 om ze op glazen dia's te immobiliseren.
- Neem hartslagen op gedurende 30 s en kwantificeer hartslagen met behulp van ImageJ-software5,20.
- Ontleed harten van zebravisembryo's met een wegwerpspuitnaald onder een stereomicroscoop. Let op: Vermijd het vernietigen van de hartvorm.
4. Immunofluorescentietest
- Om een immunofluorescentietest te gebruiken om PM2.5 geïnduceerde DNA-schade in het hart van zebravisembryo's te detecteren, gebruikt u een hydrofobe barrièrepen om een cirkel aan een schone glazen kant te tekenen.
- Voeg 50 μL 4% paraformaldehyde toe aan 1,25 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) om een fixatieve oplossing te maken.
- Plaats 3 ontleedde harten in een hydrofobe barrièrepencirkel en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Decanteer de oplossing onder de microscoop en droog de monsters bij kamertemperatuur gedurende ten minste 5 minuten, zodat de harten volledig aan de glasdia's hechten.
- Was de dia's driemaal in PBS met 0,1% Tween 20 (PBST) gedurende 5 minuten per wasbeurt.
- Voeg 50 μL runderserumalbumine (BSA) toe aan 1000 μL PBST om een 5% BSA-oplossing te verkrijgen en incubeer de dia's gedurende 1 uur in een vochtige kamer om niet-specifieke antilichaambinding te blokkeren.
- Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBST gedurende 5 minuten per wasbeurt.
- Verdun 2 μL monoklonaal antilichaam van muizen tegen 8-OHdG en 2 μL konijnpolyklonaal antilichaam tegen γH2AX in 296 μL PBST om een werkende primaire antilichaamcocktailoplossing te verkrijgen.
- Incubeer de hartmonsters met 50 μL van de primaire antilichaamcocktailoplossing tegen 8-OHdG en γH2AX in een bevochtigde kamer gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C (nachtelijke incubatie kan de signaalintensiteit verhogen).
- Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBST gedurende 5 minuten per wasbeurt.
- Verdun 1 μL FITC-gelabeld geitenantimuisantilichaam en 1 μL cy3 geitenantia-antikonijn in 498 μL PBST om een werkende secundaire antilichaamcocktailoplossing te verkrijgen en incubateer de monsters met de secundaire antilichamen (1:500 in PBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
- Decanteer de oplossing en was de monsters driemaal met PBS gedurende 5 minuten per wasbeurt beschermd tegen licht.
- Voeg 20 μL DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool) toe aan de monsters voor nucleaire kleuring gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Breng een coverslip aan om te schuiven en af te sluiten met nagellak om uitdroging en beweging te voorkomen. Stel vervolgens de monsters in beeld onder een fluorescentiemicroscoop en kwantificeer het fluorescentiesignaal van het hartgebied met behulp van ImageJ-software. Bereken de relatieve veranderingen met het gemiddelde van dmso-controlemonsters. Bepaal de statistische significantie van de gegevens zoals in stap 3.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze immunofluorescentietest is een gevoelige en specifieke methode voor het meten van eiwitexpressieveranderingen in de harten van zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan milieuchemicaliën.
In deze representatieve analyse werden embryo's blootgesteld aan PM2,5 in afwezigheid of aanwezigheid van de antioxidant NAC geëvalueerd op de aanwezigheid van hartmisvormingen(figuur 1). Zoals waargenomen, veroorzaakte EOM van PM2.5 een significante toename van cardiale teratogenese, zoals pericardoedeem, veranderde looping en verminderde grootte, vergeleken met dmso-controlebehandelde harten. De hartslag was ook significant verlaagd bij embryo's die werden blootgesteld aan EOM(figuur 1B). De toevoeging van NAC verzwakte significant door EOM geïnduceerde hartafwijkingen(figuur 1).
Hier werd de immunofluorescentietest gebruikt om 8-OHdG- en γH2AX-expressie in zebravisembryo te meten om de mate van DNA-schade in met EOM behandelde weefsels te evalueren. Zoals te zien is in figuur 2,waren de niveaus van 8-OHdG- en γH2AX-expressie significant verhoogd in de harten van zebravisembryo's die werden behandeld met de EOM-groep in vergelijking met de controle, dmso-behandelde harten, wat duidt op een toename van oxidatieve DNA-schade en DNA-dubbelstrengsbreuken. Bovendien werd de door EOM geïnduceerde DNA-schade gedeeltelijk tegengegaan door NAC-suppletie(figuur 2).
Figuur 1. Hartafwijkingen van zebravisembryo's bij 72 hpf. (A) Afbeeldingen van zebravisembryo's bij 72 hpf. Stippellijnen geven atria (rood) of ventrikels (blauw) aan. Schaalbalk, 200 μm. (B) Hartmisvorming en hartslag. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. In elke groep werden minstens 50 embryo's onderzocht. EOM: EOM bij 5 mg/L; NAC: NAC op 0,25 μM.. **,P < 0,01; , p<0.001 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. DNA-schade in het hart van zebravisembryo's bij 72 hpf. A) Immunofluorescentiekleuring. Schaalbalk, 100 μm. B) Kwantitatieve resultaten. De resultaten werden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Minstens 15 harten van elke groep werden onderzocht. EOM: EOM bij 5 mg/L; NAC: NAC op 0,25 μM. **; P < 0,01; ***; p<0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel zebravis een uitstekend gewerveld model is voor het bestuderen van de cardiale ontwikkelingstoxiciteit van milieuchemicaliën, is het vanwege de kleine omvang van het embryohart moeilijk om voldoende eiwit te verkrijgen voor western blot-analyse. Daarom presenteren we een gevoelige immunofluorescentiemethode voor het kwantificeren van de eiwitexpressieniveaus van DNA-schadebiomarkers in de harten van zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan PM2.5.
Tijdens dissectie is het belangrijk om de integriteit van het hart intact te houden. Onze ervaring is dat het relatief eenvoudig is om de isolatie uit te voeren bij 72 pkf. Bovendien moet het hart zo snel mogelijk na het verzamelen in een fixatieoplossing worden geplaatst. Een andere cruciale stap is het drogen van de monsters om ervoor te zorgen dat de ontlede harten volledig aan de glasplaat zijn bevestigd. Anders kunnen de monsters tijdens het etiketteren van de dia worden afgewassen.
Dubbele immunofluorescentiekleuring wordt uitgevoerd om zowel 8-OHdG- als γH2AX-signalen in de geïsoleerde harten te detecteren. Deze methode bespaart niet alleen arbeid en maakt het gebruik van een kleinere steekproefgrootte mogelijk, maar vergemakkelijkt ook co-lokalisatie van de twee signalen. Hoewel deze op antilichamen gebaseerde methode geen fluorescentiesignalen in levende embryo's kan detecteren, kan dit snelle protocol worden gebruikt om eiwitexpressie in geïsoleerde zebravisembryoharten te detecteren.
Het is vaak gemeld dat oxidatieve stress PM2,5-geïnduceerde DNA-schadebemiddelt 8,9. Overmatige ROS-productie kan leiden tot DNA-schade en apoptose tijdens de embryonale ontwikkeling van zebravissen21,22,23. Zoals we eerder hebben gemeld18, wordt een verhoogde 8-OHdG en γH2AX signaalexpressie waargenomen in de harten van zebravisembryo's blootgesteld aan EOM, waarvan de expressies aanzienlijk worden tegengegaan door behandeling met de ROS-aaseter NAC. Het is opmerkelijk dat NAC de expressie van PM2.5-geïnduceerdeDNA-schadesignalen niet volledig omkeert, wat aangeeft dat oxidatieve stress slechts gedeeltelijk kan bijdragen aan de DNA-schade die wordt waargenomen in de harten van zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan PM2.5.
Kortom, deze methode maakt gebruik van een gevoelige techniek voor het detecteren van PM2.5 geïnduceerde DNA-schade in de intacte harten van zebravisembryo's. Bovendien kan de methode worden toegepast om veranderingen in eiwitexpressie te detecteren in de harten van zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan andere milieuchemicaliën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Nature Sciences Foundation of China (subsidienummer: 81870239, 81741005, 81972999) en The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M.
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
