Summary
Этот протокол использует иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в рассеченных сердцах эмбрионов рыбок данио.
Abstract
Воздействие тонкодисперсных частиц(ТЧ 2,5)может привести к токсичности для развития сердца, но основные молекулярные механизмы все еще неясны. 8-гидрокси-2'дезоксигеназа (8-OHdG) является маркером окислительного повреждения ДНК, а γH2AX является чувствительным маркером для разрывов двухцепочечных ДНК. В этом исследовании мы стремились обнаружить изменения PM2,5-индуцированных8-OHdG и γH2AX в сердце эмбрионов рыбок данио с использованием иммунофлуоресцентного анализа. Эмбрионы рыбок данио обрабатывали экстрагируемыми органическими веществами (EOM) изPM 2,5 при 5 мкг/мл в присутствии или отсутствии антиоксиданта N-ацетил-L-цистеина (NAC, 0,25 мкМ) через 2 ч после оплодотворения (hpf). DMSO использовался в качестве управления транспортным средством. При 72 л.с. сердца были рассечены от эмбрионов с помощью шприцевой иглы и зафиксированы и пронизывались. После блокировки образцы были исследованы первичными антителами против 8-OHdG и γH2AX. Затем образцы промывали и инкубировали с вторичными антителами. Полученные изображения наблюдались под флуоресцентной микроскопией и количественно оценивались с помощью ImageJ. Результаты показывают, что EOM от PM2.5 значительно усиливает сигналы 8-OHdG и γH2AX в сердце эмбрионов рыбок данио. Тем не менее, NAC, действуя как поглотитель активных форм кислорода (ROS), частично противодействовал повреждению ДНК, вызванному EOM. Здесь мы представляем протокол иммунофлуоресценции для исследования роли повреждения ДНК в пороках сердца, вызванныхPM 2,5,который может быть применен для обнаружения изменений экспрессии белка в окружающей среде, вызванных химическими веществами, в сердцах эмбрионов рыбок данио.
Introduction
Загрязнение воздуха в настоящее время является серьезной экологической проблемой, стоящей перед миром. Окружающие тонкодисперсные твердые частицы(ТЧ 2,5),которые являются одним из важнейших показателей качества воздуха, могут переносить большое количество вредных веществ и поступать в кровеносную систему, нанося серьезный вред здоровьючеловека1. Эпидемиологические исследования показали, что воздействиеТЧ 2,5 может привести к повышенному риску врожденных пороков сердца (ИБС)2,3. Данные экспериментов на животных также показали, чтоPM 2,5 может вызывать аномальное сердечное развитие у эмбрионов рыбок данио и потомства мышей, но молекулярные механизмы сердечной токсичности развития PM2,5 все еще в значительной степени неизвестны4,5,6.
Повреждение ДНК может вызвать остановку клеточного цикла и вызвать апоптоз, который может значительно разрушить потенциал клеток-прародителей и, следовательно, ухудшить развитие сердца7). Хорошо задокументировано, что загрязнители окружающей среды, включаяТЧ 2,5,могут атаковать ДНК через механизмы окислительного стресса8,9. Как у человека, так и у рыбок данио сердечное развитие чувствительно к окислительнойнагрузке10,11,12. 8-OHdG является маркером окислительного повреждения ДНК, а сигнал γH2AX является маркером двухцепочечных разрывов ДНК. N-ацетил-L-цистеин (NAC), синтетический предшественник внутриклеточного цистеина и глутатиона, широко используется в качестве антиоксидантного соединения. В этом исследовании мы используем NAC для изучения роли окислительного стресса вPM 2.5- индуцированном повреждении ДНК13.
Рыбки данио как модельные позвоночные широко использовались для изучения сердечного развития и сердечно-сосудистых заболеваний человека, поскольку механизмы развития сердца высоко сохраняются среди позвоночных14,15. Преимущества использования рыбок данио в качестве модели включают их небольшой размер, сильную репродуктивную способность и низкую стоимость кормления. Особый интерес для этих исследований представляет то, что эмбрионы рыбок данио не зависят от кровеносной системы в период раннего развития и могут пережить тяжелую пороки сердца14. Более того, их прозрачность позволяет непосредственно наблюдать под микроскопом все тело. Таким образом, эмбрионы рыбок данио предоставляют выдающуюся возможность для оценки молекулярных механизмов, участвующих в индукции токсичности сердечного развития в результате воздействия различных химических веществ окружающей среды5,16,17. Ранее мы сообщали, что окислительный стресс, вызванныйPM 2,5,приводит к повреждению ДНК и апоптозу, что приводит к порокам сердца у рыбок данио18. В этом исследовании мы предоставляем подробный протокол для изучения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в сердце эмбрионов рыбок данио.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Дикие рыбки данио (AB), используемые в этом исследовании, были получены из Национального ресурсного центра рыбок данио в Ухане, Китай. Все процедуры для животных, описанные здесь, были рассмотрены и одобрены Институтом по уходу за животными Комитета по этике Университета Сучхоу.
1. Отбор пробТЧ 2,5 и экстракция органических соединений
ПРИМЕЧАНИЕ: PM2.5 был собран в городской местности в Сучжоу, Китай, 1-7 августа 2015 года, как описаноранее 5.
- Выпекайте 47-мм кварцевые мембранные фильтры в муфельной печи 500 °C в течение 2 ч для удаления органических компонентов.
- Поместите фильтр в пробоотборник ТЧ2,5 на 24 ч непрерывного отбора проб.
- Снимите фильтр и высушите в течение 24 ч при комнатной температуре.
- Количественно оцените фильтр с помощью аналитического баланса.
- Экстрагирование органических компонентов из фильтра экстракцией Soxhlet с использованием дихлорметана в качестве растворителя19.
- Высушите EOM путем ротационного испарения на водяной бане 60 °C и потока азота. Растворить ЭОМ в ДМСО и хранить при -20 °C.
2. Сбор и лечение эмбрионов рыбок данио
- Поддерживайте рыбку данио при 28,5 ± 0,5 °C в системе рециркуляторной аквакультуры с 14-ч светлым и 10-ч темным фотопериодным циклом.
- Поместите здоровых взрослых рыбок данио в аквариум в соотношении 2: 1 между самцами и самками.
- На следующий день соберите эмбрионы и промыйте их системной водой (т.е. водой для размножения рыбок данио).
- Отобрать и случайным образом разделить эмбрионы рыбок данио, демонстрирующие нормальное развитие (однородный размер, полные зерна и отсутствие коагуляции яиц) на 4 группы в отдельных стеклянных чашках Петри диаметром 7 см (около 50 эмбрионов на блюдо).
- Обрабатывайте эмбрионыТЧ 2,5 (5 мг/л) в присутствии или отсутствии NAC при 0,25 мкМ от 2 л.с.ф. до 72 л.с. Используйте ДМСО в качестве контроля транспортного средства до конечной концентрации при 0,1% (v/v).
3. Морфологическое наблюдение за эмбрионами рыбок данио и рассечение сердца
- При 72 л.с. переносите эмбрионы на стеклянные слайды и наблюдайте под стереомикроскопом. Регистрировать пороки развития сердца, такие как отек перикарда, измененная петля и уменьшенный размер.
- Рассчитайте частоту пороков развития (процент эмбрионов с пороками сердца от общего числа живых эмбрионов) и проанализируйте различия между группами с использованием односторонней ANOVA, за которой следует тест множественного сравнения Турции (p < 0,05 = статистически значимый).
- Обезболить эмбрионы 0,6 мг/мл MS-222, чтобы обездвижить их на стеклянных слайдах.
- Записывайте сердечные удары в течение 30 с и количественно оцените частоту сердечных ритмов с помощью программного обеспечения ImageJ5,20.
- Рассекните сердца от эмбрионов рыбок данио с помощью одноразовой шприцевой иглы под стереомикроскопом. Внимание: Избегайте разрушения формы сердца.
4. Иммунофлуоресцентный анализ
- Чтобы использовать иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5, в сердце эмбрионов рыбок данио, используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать круг на чистой стеклянной стороне.
- Добавьте 50 мкл 4% параформальдегида к 1,25 мл фосфатного буферного физиологического раствора (PBS), чтобы получить фиксаторный раствор.
- Поместите 3 рассеченных сердца в один гидрофобный барьерный круг и высиживая в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Декантировать раствор под микроскопом и сушить образцы при комнатной температуре не менее 5 мин, чтобы сердца полностью прикрепляли к стеклянным слайдам.
- Трижды мойте слайды в PBS с 0,1% Tween 20 (PBST) в течение 5 минут на одну стирку.
- Добавьте 50 мкл бычьего сывороточного альбумина (BSA) к 1000 мкл PBST для получения 5% раствора BSA и инкубируйте слайды во влажной камере в течение 1 ч, чтобы блокировать связывание неспецифических антител.
- Декантирует раствор и промывает образцы PBST три раза в течение 5 минут на одну промывку.
- Развести 2 мкл мышиного моноклонального антитела против 8-OHdG и 2 мкл поликлонального антитела кролика против γH2AX в 296 мкл PBST для получения рабочего первичного раствора коктейля антител.
- Инкубировать образцы сердца с 50 мкл раствора коктейля первичных антител против 8-OHdG и γH2AX в увлажненной камере в течение не менее одного часа при комнатной температуре или ночью при 4 °C (ночная инкубация может увеличить интенсивность сигнала).
- Декантирует раствор и промывает образцы PBST три раза в течение 5 минут на одну промывку.
- Развести 1 мкл меченого FITC вторичного антитела против мыши и 1 мкл вторичного антитела против кролика cy3 в 498 мкл PBST для получения рабочего раствора коктейля вторичных антител и инкубировать образцы с вторичными антителами (1:500 в PBST) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
- Декантирует раствор и промывает образцы PBS три раза в течение 5 минут за одну промывку, защищенную от света.
- Добавьте 20 мкл DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндола) в образцы для ядерного окрашивания в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Нанесите накладку на скольжение и запечатайте лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание и движение. Затем визуйте образцы под флуоресцентным микроскопом и количественно оцените флуоресцентный сигнал области сердца с помощью программного обеспечения ImageJ. Рассчитайте относительные изменения со средним значением контрольных образцов DMSO. Определите статистическую значимость данных, как по состоянию на шаге 3.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот иммунофлуоресцентный анализ является чувствительным и специфическим методом измерения изменений экспрессии белка в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию химических веществ окружающей среды.
В этом репрезентативном анализе эмбрионы, подвергшиеся воздействиюPM 2,5 в отсутствие или присутствие антиоксиданта NAC, оценивались на наличие наличия пороков развития сердца(рисунок 1). Как наблюдалось, EOM от PM2,5 вызывал значительное увеличение сердечного тератогенеза, такого как отек перикарда, измененная петля и уменьшение размера, по сравнению с сердцами, обработанными контролем DMSO. Частота сердечных сокращений также была значительно снижена у эмбрионов, подвергшихся воздействию EOM(рисунок 1B). Добавление NAC значительно ожимело ЭОМ-индуцированные пороки сердца(рисунок 1).
Здесь иммунофлуоресцентный анализ использовался для измерения экспрессии 8-OHdG и γH2AX у эмбриона рыбки данио для оценки степени повреждения ДНК в тканях, обработанных EOM. Как показано на рисунке 2,уровни экспрессии 8-OHdG и γH2AX были значительно увеличены в сердцах эмбрионов рыбок данио, получавших группу EOM, по сравнению с контрольными, обработанными DMSO сердцами, что указывает на увеличение окислительного повреждения ДНК и разрывов двухцепей ДНК, соответственно. Кроме того, вызванное EOM повреждение ДНК было частично противодействовано добавками NAC(рисунок 2).
Рисунок 1. Пороки сердца эмбрионов рыбок данио при 72 л.с. (A) Изображения эмбрионов рыбок данио при 72 л.с.ф. Пунктирные линии обозначают предсердия (красный) или желудочки (синий). Шкала, 200 мкм. (B) Пороки сердца и частота сердцебиения. Результаты представлены в виде среднего ± SEM. Было исследовано не менее 50 эмбрионов в каждой группе. EOM: EOM в 5 мг/л; NAC: NAC при 0,25 мкМ.. **,P < 0,01; , p<0.001 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Повреждение ДНК в сердце эмбрионов рыбок данио на 72 л.с. А) Иммунофлуоресцентное окрашивание. Шкала, 100 мкм. Б) Количественные результаты. Результаты были представлены как средние ± SEM. Было обследовано не менее 15 сердец из каждой группы. EOM: EOM в 5 мг/л; NAC: NAC при 0,25 мкМ. **; P < 0,01; ***; с<0.001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя рыбки данио является отличной моделью позвоночных для изучения токсичности химических веществ окружающей среды для развития сердца, из-за небольшого размера сердца эмбриона трудно получить достаточное количество белка для анализа вестерн-блэт. Поэтому мы представляем чувствительный метод иммунофлуоресценции для количественной оценки уровней экспрессии белка биомаркеров повреждения ДНК в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействиюPM 2,5.
Во время рассечения важно сохранить целостность сердца в целости и сохранности. По нашему опыту, относительно легко выполнить изоляцию при 72 л.с. Кроме того, сердце нужно как можно скорее после сбора поместить в фиксационный раствор. Другим важным шагом является сушка образцов, чтобы убедиться, что рассеченные сердца полностью прикреплены к стеклянной горке. В противном случае образцы могут быть смыты со слайда во время маркировки.
Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание выполняется для обнаружения сигналов 8-OHdG и γH2AX в изолированных сердцах. Этот метод не только экономит трудозатраты и позволяет использовать уменьшенный размер выборки, но и облегчает солокализацию двух сигналов. Хотя этот метод на основе антител не может обнаружить флуоресцентные сигналы у живых эмбрионов, этот быстрый протокол может быть использован для обнаружения экспрессии белка в изолированных сердцах эмбрионов рыбок данио.
Часто сообщалось, что окислительный стресс опосредует ТЧ2,5-индуцированноеповреждение ДНК8,9. Чрезмерная выработка АФК может привести к повреждению ДНК и апоптозу во время эмбрионального развития рыбок данио21,22,23. Как мы ранее сообщали18,повышенная экспрессия сигналов 8-OHdG и γH2AX наблюдается в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию EOM, экспрессия которых значительно противодействовает лечению NAC-мусорщика АФК. Примечательно, что NAC не полностью обращает вспять экспрессию сигнала повреждения ДНК, вызваннуюPM 2,5,что указывает на то, что окислительный стресс может лишь частично способствовать повреждению ДНК, наблюдаемым в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию PM2,5.
В заключение, этот метод использует чувствительный метод для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5, в неповрежденных сердцах эмбрионов рыбок данио. Кроме того, метод может быть применен для обнаружения изменений экспрессии белка в сердцах эмбрионов рыбок данио, подвергшихся воздействию других химических веществ окружающей среды.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом наук о природе Китая (номер гранта: 81870239, 81741005, 81972999) и Приоритетным академическим программным развитием высших учебных заведений Цзянсу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M.
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
