Summary
Denne protokol bruger en immunofluorescence assay til at opdage PM2,5-induceretDNA-skader i dissekeret hjerter zebrafisk embryoner.
Abstract
Omgivende fine partikler (PM2.5)eksponering kan føre til hjerteudviklingstoksicitet, men de underliggende molekylære mekanismer er stadig uklare. 8-hydroxy-2'deoxygenase (8-OHdG) er en markør for oxidativ DNA-skade og γH2AX er en følsom markør for DNA dobbelt streng pauser. I denne undersøgelse, vi havde til formål at opdage PM2,5-induceret 8-OHdG og γH2AX ændringer i hjertet af zebrafisk embryoner ved hjælp af en immunofluorescence assay. Zebrafiskembryoner blev behandlet med ekstraherbare organiske forhold (EOM) fra PM2,5 ved 5 μg/ml i nærvær eller fravær af antioxidant N-acetyl-L-Cystein (NAC, 0,25 μM) ved 2 timer efter befrugtning (hpf). DMSO blev brugt som en køretøjskontrol. Ved 72 hk blev hjerter dissekeret fra embryoner ved hjælp af en sprøjtenål og fastgjort og permeabiliseret. Efter at være blevet blokeret blev prøverne undersøgt med primære antistoffer mod 8-OHdG og γH2AX. Prøverne blev derefter vasket og inkuberet med sekundære antistoffer. De resulterende billeder blev observeret under fluorescensmikroskopi og kvantificeret ved hjælp af ImageJ. Resultaterne viser, at EOM fra PM2,5 signifikant forbedrede 8-OHdG- og γH2AX-signaler i hjertet af zebrafiskembryoner. Nac, der fungerede som en reaktiv iltart (ROS) ådselæder, modvirkede imidlertid delvist den EOM-inducerede DNA-skade. Her præsenterer vi en immunfluorescence protokol til undersøgelse af dna-skadernes rolle i PM2,5-inducerede hjertefejl, der kan anvendes til påvisning af miljømæssige kemisk inducerede proteinudtryksændringer i zebrafiskembryoners hjerter.
Introduction
Luftforurening er nu et alvorligt miljøproblem, som verden står over for. Omgivende fine partikler (PM2.5), som er en af de vigtigste indikatorer for luftkvaliteten, kan bære et stort antal skadelige stoffer og komme ind i blodcirkulationssystemet, hvilket forårsager alvorlig skade på menneskers sundhed1. Epidemiologiske undersøgelser har vist , at PM2,5-eksponering kan føre til en øget risiko for medfødte hjertefejl (CHD'er)2,3. Beviser fra dyreforsøg viste også, at PM2,5 kan forårsage unormal hjerteudvikling i zebrafisk embryoner og afkom afmus,men de molekylære mekanismer i hjerteudviklingsmæssige toksicitet PM2,5 er stadig stort set ukendt4,5,6.
DNA-skader kan forårsage cellecyklus anholdelse og fremkalde apoptose, som i vid udstrækning kan ødelægge potentialet i stamcelleceller og dermed forringe hjerteudviklingen7). Det er veldokumenteret, at miljøforurenende stoffer, herunder PM2,5, har potentiale til at angribe DNA gennem oxidative stressmekanismer8,9. Både human og zebrafisk hjerte udvikling er følsomme over for oxidativ stress10,11,12. 8-OHdG er en oxidativ DNA-skadesmarkør, og γH2AX-signal er en markør for DNA-dobbeltstrengsbrud. N-acetyl-L-Cystein (NAC), en syntetisk forløber for intracellulær cystein og glutathion, er meget udbredt som en anti-oxidativ forbindelse. I denne undersøgelse bruger vi NAC til at undersøge den rolle, oxidativ stress i PM2.5- induceret DNA-skade13.
Zebrafisk som model hvirveldyr har været meget udbredt til at studere hjerteudvikling og menneskelige hjerte-kar-sygdomme, fordi mekanismerne i hjerteudvikling er meget bevaret blandt hvirveldyr14,15. Fordelene ved at bruge zebrafisk som model omfatter deres lille størrelse, stærke reproduktive evne og lave fodringsomkostninger. Af særlig interesse for disse undersøgelser er zebrafiskembryoner ikke afhængige af kredsløbssystemet under tidlig udvikling og kan overleve alvorlig hjertemisdannelse14. Desuden gør deres gennemsigtighed det muligt for hele kroppen at blive observeret direkte under et mikroskop. Zebrafiskembryoner giver således en enestående mulighed for at vurdere de molekylære mekanismer, der er involveret i induktion af hjerteudviklingsmæssig toksicitet som følge af eksponering for forskellige miljøkemikalier5,16,17. Vi har tidligere rapporteret, at PM2,5-induceret oxidativ stress fører til DNA-skader og apoptose, hvilket resulterer i hjertemisdannelser hos zebrafisk18. I denne undersøgelse giver vi en detaljeret protokol til undersøgelse af PM2,5-induceret DNA-skade i hjertet af zebrafisk embryoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vilde type zebrafisk (AB), der anvendes i denne undersøgelse blev opnået fra National Zebrafish Resource Center i Wuhan, Kina. Alle dyreprocedurer, der er skitseret her, er blevet gennemgået og godkendt af Animal Care Institution of The Ethics Committee of Soochow University.
1. PM2,5 prøveudtagning og organisk forbindelsesudvinding
BEMÆRK: PM2.5 blev indsamlet i et byområde i Suzhou, Kina, August 1-7, 2015, som beskrevet tidligere5.
- Bages 47 mm kvartsmembranfiltre i en 500 °C muffe ovn i 2 timer for at fjerne de organiske komponenter.
- Anbring et filter i en PM2,5-prøveudtagning i 24 timer uafbrudt prøveudtagning.
- Fjern filteret og tør i 24 timer ved stuetemperatur.
- Kvantificer filteret med en analytisk balance.
- Ekstrakt organiske komponenter fra filteret ved hjælp af dichlormethan som opløsningsmiddel19.
- Tør EOM ved en roterende fordampning i et 60 °C vandbad og kvælstofstrøm. EOM opløses i DMSO og opbevares ved -20 °C.
2. Indsamling og behandling af zebrafiskembryoer
- Zebrafisken tilbageholdes ved 28,5 ± 0,5 °C i et recirkulationsopdræt med en 14 timers lys og 10 timers mørk fotoperiodecyklus.
- Placer sunde voksne zebrafisk i en tank på en 2:1 mandlige til kvindelige forhold.
- Den næste dag skal du samle embryonerne og vaske dem med systemvand (dvs. zebrafisk avlsvand).
- Vælg og tilfældigt opdele zebrafisk embryoner demonstrerer en normal udvikling (ensartet størrelse, fuldkorn, og ingen æg koagulation) i 4 grupper i individuelle glas Petri retter med en diameter på 7 cm (ca. 50 embryoner pr skål).
- Embryonerne behandles med PM2,5 (5 mg/L) i nærværelse eller fravær af NAC ved 0,25 μM fra 2 hkf til 72 hkf. Brug DMSO som køretøjskontrol til en endelig koncentration ved 0,1% (v/v).
3. Morfologisk observation af zebrafisk embryoner og hjerte dissektion
- Ved 72 hk, overføre embryoner til glas dias og observere under et stereomikroskop. Optag hjertemisdannelser, f.eks. perikardieødem, ændret looping og nedsat størrelse.
- Beregn misdannelser (procentdelen af embryoner med hjertefejl ud af det samlede levende embryoner) og analysere forskelle mellem grupper ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Tyrkiets Multiple Comparison Test (p < 0,05 = statistisk signifikant).
- Bedøve embryonerne med 0,6 mg/mL MS-222 for at immobilisere dem på glasrutschebaner.
- Optag hjerteslag i 30 s og kvantificer hjertefrekvenser ved hjælp af ImageJ software5,20.
- Dissekere hjerter fra zebrafisk embryoner med en engangs sprøjte nål under et stereomikroskop. Forsigtig: Undgå at ødelægge hjerteformen.
4. Immunofluorescence Assay
- For at bruge en immunofluorescence assay til at opdage PM2,5 induceret DNA-skader i hjertet af zebrafisk embryoner, skal du bruge en hydrofobisk barriere pen til at tegne en cirkel på en ren glas side.
- Der tilsættes 50 μL 4% paraformaldehyd til 1,25 mL fosfat buffered saltvand (PBS) for at lave en fiksativ opløsning.
- Placer 3 dissekerede hjerter i en hydrofobisk barrierepencirkel, og inkuber i 20 min ved stuetemperatur.
- Dekanter opløsningen under mikroskopet og tør prøverne ved stuetemperatur i mindst 5 min, så hjerterne helt fastgøres til glasrutschebanerne.
- Vask rutsjebanerne tre gange i PBS med 0,1% Tween 20 (PBST) i 5 min pr. vask.
- Der tilsættes 50 μL kvægserum (BSA) til 1000 μL PBST for at opnå en 5 % BSA-opløsning og inkuberes diasene i et fugtigt kammer i 1 time for at blokere ikke-specifik antistofbinding.
- Dekanter opløsningen og vask prøverne tre gange med PBST i 5 min pr. vask.
- Fortynd 2 μL mus monoklonale antistoffer mod 8-OHdG og 2 μL kanin polyklonale antistof mod γH2AX i 296 μL pbst for at opnå en fungerende primær antistof cocktail løsning.
- Inkuberes hjerteprøverne med 50 μL af den primære antistofcocktailopløsning mod 8-OHdG og γH2AX i et befugtet kammer i mindst en time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C (Inkubation fra den ene dag til den anden kan øge signalintensiteten).
- Dekanter opløsningen og vask prøverne tre gange med PBST i 5 min pr. vask.
- Fortynd 1 μL AF FITC-mærket ged anti-mus sekundært antistof og 1 μL cy3 ged anti-kanin sekundært antistof i 498 μL pbst for at opnå en fungerende sekundær antistofcocktailopløsning og inkubere prøverne med de sekundære antistoffer (1:500 i PBST) i 1 time ved stuetemperatur i mørke.
- Dekanter opløsningen og vask prøverne tre gange med PBS i 5 min pr. vask beskyttet mod lys.
- Der tilsættes 20 μL DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) til prøverne til nuklear farvning i 30 min ved stuetemperatur.
- Påfør en coverlip til at glide og forsegle med neglelak for at forhindre tørring og bevægelse. Derefter billede prøverne under en fluorescens mikroskop og kvantificere fluorescens signal af hjerte område ved hjælp af ImageJ software. Beregn de relative ændringer med gennemsnittet af DMSO-kontrolprøver. Bestem dataenes statistiske betydning som i trin 3.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne immunofluorescence assay er en følsom og specifik metode til måling af protein udtryk ændringer i hjerter zebrafisk embryoner udsat for miljømæssige kemikalier.
I denne repræsentative analyse blev embryoner, der blev udsat for PM2,5 i antioxidantens fravær eller tilstedeværelse, evalueret for tilstedeværelsen af hjertemisdannelser (Figur 1). Som observeret forårsagede EOM fra PM2.5 en betydelig stigning i hjerte teratogenese, såsom perikardieødem, ændret looping og nedsat størrelse sammenlignet med DMSO-kontrolbehandlede hjerter. Hjerteslagsraten blev også signifikant nedsat hos embryoner, der blev eksponeret for EOM (figur 1B). Tilsætning af NAC svækkede hjertefejl i EOM betydeligt (figur 1).
Her blev immunofluorescence-analysen brugt til at måle 8-OHdG- og γH2AX-ekspression i zebrafiskembrybryo for at vurdere omfanget af DNA-skader i EOM-behandlede væv. Som vist i figur 2blev niveauet af 8-OHdG- og γH2AX-udtryk signifikant forøget i hjerterne på zebrafiskembryoner, der blev behandlet med EOM-gruppen sammenlignet med kontrol, DMSO-behandlede hjerter, hvilket indikerer en stigning i henholdsvis oxidativ DNA-skade og DNA-dobbeltstrengspauser. Desuden blev den EOM-inducerede DNA-skade delvist modvirket af NAC-tilskud (figur 2).
Figur 1. Hjertefejl hos zebrafisk embryoner på 72 hk. (A) Billeder af zebrafisk embryoner på 72 hkf. Stiplede linjer angiver forkamre (rød) eller hjertekamre (blå). Skalastang, 200 μm. (B) Hjertemisdannelser og hjerteslag. Resultaterne præsenteres som gennemsnitlige ± SEM. Mindst 50 embryoner i hver gruppe blev undersøgt. EOM: EOM ved 5 mg/L; NAC: NAC ved 0,25 μM.. **,P < 0,01; , s<0.001 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. DNA-skader i hjertet af zebrafisk embryoner på 72 hk. A) Immunofluorescence farvning. Skalastang, 100 μm. B) Kvantitative resultater. Resultaterne blev præsenteret som gennemsnitlige ± SEM. Mindst 15 hjerter fra hver gruppe blev undersøgt. EOM: EOM ved 5 mg/L; NAC: NAC ved 0,25 μM. **; P < 0.01; ***; s<0.001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom zebrafisk er en fremragende hvirveldyrmodel til undersøgelse af hjerteudviklingsmæssig toksicitet af miljøkemikalier på grund af embryohjertets lille størrelse, er det svært at opnå nok protein til vestlig blotanalyse. Derfor præsenterer vi en følsom immunfluorescencemetode til kvantificering af proteinudtryksniveauerne af DNA-skader biomarkører i hjerterne på zebrafiskembryoner, der udsættes for PM2,5.
Under dissektion er det vigtigt at holde hjertets integritet intakt. Det er vores erfaring, at det er relativt nemt at udføre isolationen ved 72 hkf. Derudover skal hjertet sættes i fikseringsløsning så hurtigt som muligt efter indsamling. Et andet kritisk skridt er at tørre prøverne for at sikre, at de dissekerede hjerter er helt fastgjort til glasrutschebanen. Ellers kan prøverne vaskes af diaset under mærkningen.
Dobbelt immunofluorescence farvning udføres for at detektere både 8-OHdG- og γH2AX-signaler i de isolerede hjerter. Denne metode sparer ikke kun arbejdskraft og tillader brug af en reduceret prøvestørrelse, men letter også co-lokalisering af de to signaler. Selv om denne antistofbaserede metode ikke kan detektere fluorescenssignaler i levende embryoner, kan denne hurtige protokol bruges til at detektere proteinudtryk i isolerede zebrafisk embryo hjerter.
Det er ofte blevet rapporteret, at oxidativ stress medierer PM2,5-induceret DNA-skade8,9. Overdreven ROS-produktion kan føre til DNA-skader og apoptose under zebrafisk embryonale udvikling21,22,23. Som vi tidligere har rapporteret18, observeres et øget 8-OHdG- og γH2AX-signaludtryk i hjerterne på zebrafiskembryoner, der udsættes for EOM, hvis udtryk i væsentlig grad modvirkes ved behandling med ROS-scavenger NAC. Det er bemærkelsesværdigt, at NAC ikke helt vender PM2,5-induceret DNA-skade signal udtryk, hvilket indikerer, at oxidativ stress kun kan bidrage delvist til DNA-skader observeret i hjerter zebrafisk embryoner udsat for PM2,5.
Afslutningsvis bruger denne metode en følsom teknik til påvisning af PM2,5 induceret DNA-skade i zebrafiskembryoners intakte hjerter. Derudover kan metoden anvendes til at opdage proteinudtryksændringer i hjerterne hos zebrafiskembryoner, der udsættes for andre miljøkemikalier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Nature Sciences Foundation of China (Grant nummer: 81870239, 81741005, 81972999) og The Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M.
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
