Summary
이 프로토콜은 면역 형광 분석기를 사용하여 제브라피시 배아의 해부 된 심장에서 PM2.5-유도 된 DNA 손상을 감지합니다.
Abstract
주변 의 미세 미립자 물질 (PM2.5)노출은 심장 발달 독성으로 이어질 수 있지만 기본 분자 메커니즘은 여전히 불분명합니다. 8-하이드록시-2'탈산소제(8-OHdG)는 산화 DNA 손상의 마커이며 γH2AX는 DNA 이중 가닥 파손에 대한 민감한 마커이다. 이 연구에서는 면역형광 분석기를 사용하여 제브라피시 배아의 심장에서 PM2.5-유도8-OHdG 및 γH2AX 의 변화를 검출하는 것을 목표로 했습니다. Zebrafish 배아는 2h 후 수정(hpf)에서 항산화 N-아세틸-L-시스테인(NAC, 0.25 μM)의 존재 또는 부재 시 PM2.5에서 추출 가능한 유기 물질(EOM)으로 치료되었다. DMSO는 차량 제어로 사용되었습니다. 72 hpf에서, 심혼은 주사기 바늘을 사용하여 배아에서 해부되고 고정되고 permeabilized되었습니다. 차단 된 후, 샘플은 8-OHdG 및 γH2AX에 대한 1 차 적인 항체로 조사되었다. 시료는 그 때 세척하고 이차 항체로 배양하였다. 결과 심상은 형광 현미경 검사의 밑에 관찰되고 ImageJ를 사용하여 정량화되었습니다. 결과는 PM2.5에서 EOM이 제브라피시 배아의 심장에 있는 8-OHdG 및 γH2AX 신호를 현저하게 향상했다는 것을 보여줍니다. 그러나, NAC는 반응성 산소 종(ROS) 폐포제로 작용하여 EOM 유도 DNA 손상을 부분적으로 중화하였다. 여기서, 우리는 제브라피시 배아의 심장에서 환경 화학 유발 단백질 발현 변화의 검출에 적용될 수 있는 PM2.5-유도된심장 결함에서 DNA 손상의 역할을 조사하기 위한 면역형성 프로토콜을 제시한다.
Introduction
대기 오염은 이제 세계가 직면한 심각한 환경 문제입니다. 대기질의 가장 중요한 지표 중 하나인 주변 미세미립자 물질(PM2.5)은많은 유해 물질을 운반하고 혈액 순환 시스템에 들어갈 수 있어 인체 건강에 심각한 해를 끼칠 수있다 1. 역학 연구는 PM2.5 노출이 선천성 심장 결함 (CHDs)2,3의증가한 리스크로 이끌어 낼 수 있다는 것을 보여주었습니다. 동물 실험에서 증거는 또한 PM2.5가 제브라피시 배아와 마우스의 자손에서 비정상적인 심장 발달을 일으킬 수 있지만 PM2.5의 심장 발달 독성의 분자 메커니즘은 여전히 크게 알려지지 않은4,5,6을보여주었다.
DNA 손상은 세포 주기 체포를 유발하고 세포 세포의 잠재력을 광범위하게 파괴할 수 있는 세포 세포 멸망을 유발할 수 있으며, 결과적으로 심장발달7을손상시킬 수 있다. PM2.5를포함한 환경 오염 물질이 산화 스트레스 메커니즘8,9를통해 DNA를 공격할 가능성이 있다는 것이 잘 문서화되어 있다. 인간과 제브라피쉬 심장 발달은 산화 스트레스10,11,12에민감하다. 8-OHdG는 산화 DNA 손상 마커이며, γH2AX 신호는 DNA 이중 가닥 파손의 마커이다. N-아세틸-L-시스테인 (NAC), 세포 내 시스테인과 글루타티온의 합성 선구자, 널리 산화 화합물로 사용 된다. 이 연구에서는 NAC를 사용하여 PM2.5에서산화 스트레스의 역할을 조사합니다 - 유도된 DNA손상(13).
모델 척추동물로서 제브라피쉬는 심장 발달 및 인간 심혈관 질환을 연구하는 데 널리 사용되고 있으며, 이는 심장 발달의 메커니즘이 척추동물14,15사이에서 높게 보존되기 때문이다. 모델로 제브라피쉬를 사용하는 장점은 작은 크기, 강한 생식 능력 및 낮은 수유 비용을 포함합니다. 이러한 연구에 특히 관심이 있는 제브라피시 배아는 초기 발달 중 순환 시스템에 의존하지 않으며 심한 심장기형(14)에서살아남을 수 있다. 더욱이, 그들의 투명성은 현미경의 밑에 바디 전체가 직접 관찰될 수 있습니다. 따라서, 제브라피쉬 배아는 다양한 환경화학물질5,16,17에노출됨에 따라 심장 발달 독성유도에 관여하는 분자기전기를 평가할 수 있는 뛰어난 기회를 제공한다. 우리는 이전에 PM2.5유도 된 산화 스트레스가 DNA 손상및 석멸증으로 이어지며, 제브라피시 18에서 심장 기형이 발생한다고보고했습니다. 이 연구에서는, 우리는 제브라피시 배아의 심혼에 있는 PM2.5유도한 DNA 손상을 조사하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구에 사용된 야생형 제브라피쉬(AB)는 중국 우한에 있는 국립 제브라피시 자원 센터에서 입수되었다. 여기에 설명된 모든 동물 절차는 소오하우 대학 윤리위원회의 동물 관리 기관에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. PM2.5 샘플링 및 유기 화합물 추출
참고: PM2.5는 2015년 8월 1일부터 7일까지 중국 쑤저우의 한 도시 지역에서 수집되었으며, 이전에 설명한 대로5.
- 유기 성분을 제거하기 위해 2 시간 동안 500 °C 머플 로에 47mm 석영 멤브레인 필터를 굽습니다.
- 중단 없는 샘플링을 위해 PM2.5 샘플러에 필터를 놓습니다.
- 필터를 제거하고 실온에서 24 시간 동안 건조하십시오.
- 분석 균형으로 필터를 정량화합니다.
- 용매(19)로서디클로로메탄을 이용한 소슬렛 추출에 의해 필터로부터 유기 성분을 추출한다.
- 60°C 수조 및 질소 흐름에서 회전 증발에 의해 EOM을 건조시. DMSO에서 EOM을 용해하고 -20 °C에 저장합니다.
2. 제브라피시 배아 수집 및 치료
- 14h 광및 10h 암흑 광기간 주기로 재순환 양식 시스템에서 28.5 ± 0.5°C에서 제브라피쉬를 유지한다.
- 건강한 성인 얼룩말 물고기를 2:1 남성 대 여성 비율로 탱크에 넣습니다.
- 다음 날, 배아를 수집하고 시스템 물 (즉, 제브라피시 사육 물)로 씻어.
- 지름 7cm(접시당 약 50배) 개별 유리 페트리 접시에 있는 4개의 그룹으로 정상적인 발달(균일한 크기, 전체 곡물 및 계란 응고 없음)을 보여주는 제브라피쉬 배아를 선택하고 무작위로 나눕니다.
- 2hpf에서 72hpf까지 0.25 μM에서 NAC의 존재 또는 부재시 PM2.5 (5 mg/L)로 배아를 치료한다. DMSO를 차량 제어로 사용하여 최종 농도가 0.1%(v/v)입니다.
3. 제브라피시 배아및 심장 해부의 형태학적 관찰
- 72 hpf에서, 유리 슬라이드로 배아를 전송하고 스테레오 현미경에서 관찰. 심근 부종, 변경 된 루핑 및 감소 된 크기와 같은 심장 기형을 기록하십시오.
- 기형 비율(총 살아있는 배아 중 심장 결함을 가진 배아의 백분율)을 계산하고 터키의 다중 비교 테스트 (p < 0.05 = 통계적으로 유의한)를 사용하여 단방향 ANOVA를 사용하여 그룹 간의 차이를 분석합니다.
- 0.6 mg/mL MS-222로 배아를 마취하여 유리 슬라이드에 고정시합니다.
- ImageJ 소프트웨어5,20을사용하여 심장 박동을 30s로 기록하고 심박수를 정량화합니다.
- 스테레오 현미경의 밑에 일회용 주사기 바늘로 제브라피시 배아에서 심혼을 해부합니다. 주의: 하트 모양을 파괴하지 마십시오.
4. 면역 형광 분석
- 면역형 광도 분석기를 사용하여 제브라피시 배아의 심장에서 PM2.5 유도 된 DNA 손상을 감지하려면 소수성 장벽 펜을 사용하여 깨끗한 유리 측에 원을 그립니다.
- 포산염 완충식(PBS)의 1.25mL에 4% 파라포름알데히드의 50 μL을 추가하여 고정 용액을 만듭니다.
- 해부된 하트 3개를 하나의 소수성 장벽 펜 원에 넣고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
- 현미경의 밑에 용액을 데크로 하고 적어도 5 분 동안 실온에서 견본을 건조하, 그래서 심혼이 유리 슬라이드에 완전히 붙어 있습니다.
- PBS에서 슬라이드를 0.1% Tween 20(PBST)으로 세척당 5분 동안 세 번 세척합니다.
- 50 μL의 소 세럼 알부민(BSA)을 PBST1000 μL에 추가하여 5% BSA 용액을 얻고 비특이적 항체 결합을 차단하기 위해 습한 챔버에서 슬라이드를 배양합니다.
- 용액을 데수제하고 세척 당 5 분 동안 PBST로 샘플을 세 번 세척하십시오.
- 8-OHdG에 대한 마우스 단일 클론 항체2 μL및 2 μL의 래시즈폴리오날 항체를 위한 2μL을 PBST의 296μL에서 γH2AX에 대하여 희석하여 일차 항체 칵테일 용액을 얻습니다.
- 심장 샘플을 8-OHdG 및 γH2AX에 대한 1차 항체 칵테일 용액의 50 μL로 실내 온도에서 또는 4°C에서 1시간 이상 가습챔버에서 배양한다(야간 배큐어는 신호 강도를 증가시킬 수 있음).
- 용액을 데수제하고 세척 당 5 분 동안 PBST로 샘플을 세 번 세척하십시오.
- FITC 표지염소 이차 항체1μL과 Cy3 염소 항토끼 이차 항체의 1μL을 PBST의 498μL에서 희석하여 이차 항체 칵테일 용액을 확보하고 어두운 실내 온도에서 1시간 동안 이차 항체(PBST1:500)로 샘플을 배양한다.
- 용액을 데수제하고 PBS로 샘플을 3회 세척하여 빛으로부터 보호한 세척당 5분 동안 세척합니다.
- 실온에서 30분 동안 핵 염색을 위한 샘플에 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)의 20μL을 추가합니다.
- 커버슬립을 사용하여 매니큐어로 미끄러지거나 밀봉하여 건조와 움직임을 방지합니다. 그런 다음 형광 현미경으로 샘플을 이미지화하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 심장 영역의 형광 신호를 정량화합니다. DMSO 제어 샘플의 평균으로 상대적 변화를 계산합니다. 3.2 단계에서와 같이 데이터의 통계적 유의를 결정합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이러한 면역형분석법은 환경 화학물질에 노출된 제브라피시 배아의 심장에서 단백질 발현 변화를 측정하는 민감하고 구체적인 방법입니다.
본 대표적인 분석에서, 항산화 NAC의 부재 또는 존재시 PM2.5에 노출된 배아는 심장 기형의 존재에 대해 평가하였다(도1). 관찰된 바와 같이, PM2.5로부터EOM은 DMSO 대조군 처리심장에 비해 심근 부종, 변경된 루핑 및 감소된 크기와 같은 심장 성각발생에 상당한 증가를 일으켰습니다. 심장 박동 속도는 또한 EOM(도 1B)에노출된 배아에서 현저하게 감소되었습니다. NAC의 첨가는 EOM 유발 심장 결함을 현저히 감쇠시켰다(도1).
여기서 면역형광 분석체는 EOM 처리 조직에서 DNA 손상의 정도를 평가하기 위해 제브라피시 배아에서 8-OHdG 및 γH2AX 발현을 측정하는 데 사용되었다. 도 2에도시된 바와 같이, 8-OHdG 및 γH2AX 발현의 수준은 대조군에 비해 EOM 그룹으로 처리된 제브라피시 배아의 심장에서 현저히 증가하였으며, DMSO 처리된 심혼은 각각 산화 DNA 손상 및 DNA 이중 가닥 파손의 증가를 나타낸다. 더욱이, EOM 유도 DNA 손상은 NAC보충(도 2)에의해 부분적으로 중화되었다.
그림 1. 72 hpf에서 제브라피시 배아의 심장 결함. (A) 72hpf에서 제브라피시 배아의 이미지. 점선은 아리아(빨간색) 또는 심실(파란색)을 나타냅니다. 스케일 바, 200 μm. (B) 심장 기형 및 심장 박동 속도. 결과는 평균 ± SEM으로 표시됩니다. 각 그룹에서 적어도 50개의 배아가 검사되었습니다. EOM: EOM 에서 5 mg/L; NAC: 0.25 μM에서 NAC. **,P < 0.01; , p<0.001 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 72 hpf에서 제브라피시 배아의 심장에 있는 DNA 손상. A) 면역 형광 염색. 스케일 바, 100 μm. B) 정량적 결과. 결과는 SEM에 ± 의미로 제시되었습니다. 각 그룹에서 적어도 15 개의 하트가 검사되었습니다. EOM: EOM 에서 5 mg/L; NAC: 0.25 μM에서 NAC. **; P < 0.01; ***; p<0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
제브라피쉬는 환경 화학물질의 심장 발달 독성을 연구하기 위한 우수한 척추동물 모델이지만, 배아 심장의 크기가 작기 때문에 서양 얼룩 분석을 위한 충분한 단백질을 얻기가 어렵다. 따라서, PM2.5에노출된 제브라피쉬 배아의 심장에 DNA 손상 바이오마커의 단백질 발현 수준을 정량화하기 위한 민감한 면역형광방법을 제시한다.
해부 동안, 마음의 무결성을 온전하게 유지하는 것이 중요합니다. 우리의 경험에서, 그것은 상대적으로 쉽게 72 hpf에서 격리를 수행. 또한 수집 후 가능한 한 빨리 고정 솔루션에 심장을 넣어야합니다. 또 다른 중요한 단계는 해부된 하트가 유리 슬라이드에 완전히 부착되어 있는지 확인하기 위해 샘플을 건조시키는 것입니다. 그렇지 않으면 라벨링 중에 샘플이 슬라이드에서 세척될 수 있습니다.
이중 면역형광 염색은 고립된 심혼에서 8-OHdG 및 γH2AX 신호를 모두 검출하기 위해 수행됩니다. 이 방법은 노동을 절약할 뿐만 아니라 샘플 크기를 줄일 수 있게 해 주며 두 신호의 공동 지역화를 용이하게 합니다. 이 항체 기지를 둔 방법은 살아있는 태아에 있는 형광 신호를 검출할 수 없습니다, 이 급속한 프로토콜은 고립된 제브라피시 태아 심혼에 있는 단백질 발현을 검출하기 위하여 이용될 수 있습니다.
산화 스트레스가 PM2.5-유도된 DNA 손상8,9를중재한다는 것이 자주 보고되었습니다. 과도한 ROS 생산은 제브라피시 배아 발달 시 DNA 손상 및 자멸을 유발할 수있다(21,22,23). 앞서18회보고한바와 같이, 8-OHdG 및 γH2AX 신호 발현이 EOM에 노출된 제브라피시 배아의 심장에서 관찰되며, 그 발현은 ROS 스캐빈거 NAC로 의한 치료에 의해 현저히 중화된다. NAC가 PM2.5-유도된 DNA 손상 신호 발현을 완전히 반전시키지 않는다는 점은 점만하며, 산화 스트레스는 PM2.5에노출된 제브라피시 배아의 심장에서 관찰된 DNA 손상에 부분적으로만 기여할 수 있음을 나타낸다.
결론적으로, 이 방법은 제브라피시 배아의 온전한 심혼에 있는 PM2.5 유도한 DNA 손상을 검출하기 위한 민감한 기술을 이용합니다. 또한, 다른 환경 화학물질에 노출된 제브라피시 배아의 심장에서 단백질 발현 변화를 검출하는 방법을 적용할 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 : 81870239, 81741005, 81972999)과 장쑤 고등 교육 기관의 우선 교육 프로그램 개발에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M.
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
