Summary
פרוטוקול זה משתמש ב בדיקת אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות נזק DNA המושרה PM2.5בלבם הניתח של עוברים דגי זברה.
Abstract
חשיפה חלקיקית עדינה סביבתית (PM2.5)עלולה להוביל לרעילות התפתחותית של הלב, אך המנגנונים המולקולריים הבסיסיים עדיין אינם ברורים. 8-הידרוקסי-2'deoxygenase (8-OHdG) הוא סמן של נזק DNA חמצוני ו γH2AX הוא סמן רגיש עבור שברי גדיל כפול DNA. במחקר זה, אנו שואפים לזהות PM2.5-המושרה 8-OHdG ו γH2AX שינויים בלב של עוברים דג זברה באמצעות בדיקת אימונופלואורסצנטיות. עוברים דגי זברה טופלו בעניינים אורגניים הניתנים לחילוץ (EOM) מ PM2.5 ב 5 מיקרוגרם / מ"ל בנוכחות או היעדר נוגד חמצון N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC, 0.25 מיקרומטר) ב 2 שעות לאחר ההפריה (hpf). DMSO שימש כפקד רכב. ב 72 כ"ס, לבבות נותחו מעוברים באמצעות מחט מזרק קבוע וחלחל. לאחר שנחסמו, דגימות נבדקו עם נוגדנים ראשוניים נגד 8-OHdG ו γH2AX. לאחר מכן נשטפו הדגימות ודגרו בנוגדנים משניים. התמונות שהתקבלו נצפו תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וכימותו באמצעות ImageJ. התוצאות מראות כי EOM מ PM2.5 משופר באופן משמעותי 8-OHdG ו γH2AX אותות בלב העוברים של דגי זברה. עם זאת, NAC, הפועל כנבלות חמצן תגובתי (ROS), נטרל חלקית את נזק ה- DNA שנגרם על ידי EOM. כאן, אנו מציגים פרוטוקול אימונופלואורסצנטיות לחקירת תפקידו של נזק לדנ"א ב- PM 2.5 - מומים בלב הנגרמים על ידי PM2.5שניתן להחיל על גילוי שינויים בביטוי חלבון סביבתי המושרה כימי בלבם של עוברים דגי זברה.
Introduction
זיהום אוויר הוא כיום בעיה סביבתית חמורה העומדת בפני העולם. חומר חלקיקי הסביבה בסדר (PM2.5), שהוא אחד האינדיקטורים החשובים ביותר של איכות האוויר, יכול לשאת מספר רב של חומרים מזיקים ולהיכנס למערכת הדם, גרימת נזק חמור לבריאותהאדם 1. מחקרים אפידמיולוגיים הראו כי חשיפה PM2.5 יכול להוביל לסיכון מוגבר של מומים מולדים בלב (CHDs)2,3. עדויות מניסויים בבעלי חיים הראו גם כי PM2.5 יכול לגרום להתפתחות לב חריגה בעוברי דגי זברה וצאצאים של עכברים, אבל המנגנונים המולקולריים של הרעילות ההתפתחותית הלבבית של PM2.5 עדיין לא ידוע במידה רבה4,5,6.
נזק לדנ"א יכול לגרום למעצר מחזור התא ולגרום לאפופטוזיס, אשר עלול להרוס בהרחבה את הפוטנציאל של תאים אבות, וכתוצאה מכך, לפגוע בהתפתחות הלב7). זה כבר מתועד היטב כי מזהמים סביבתיים, כולל PM2.5, יש פוטנציאל לתקוף DNA באמצעות מנגנוני עקה חמצונית8,9. הן התפתחות הלב האנושי והן של דג הזברה רגישים ללחץ חמצוני10,11,12. 8-OHdG הוא סמן נזק DNA חמצוני, ואות γH2AX הוא סמן של שברי גדיל כפול DNA. N-אצטיל-L-ציסטאין (NAC), מבשר סינתטי של ציסטאין תאי וגלוטתיון, נמצא בשימוש נרחב כתרכובת נוגד חמצון. במחקר זה, אנו משתמשים NAC כדי לחקור את התפקיד של עקה חמצונית PM2.5- נזק DNA המושרה13.
דגי זברה כעליית חוליות מודל שימשו באופן נרחב לחקר התפתחות הלב ומחלות לב וכלי דם אנושיים מכיוון שמנגנונים של התפתחות הלב נשמרים מאוד בקרב בעלי חוליות14,15. היתרונות של שימוש בדגי זברה כמודל כוללים את גודלם הקטן, יכולת הרבייה החזקה ועלות האכלה נמוכה. עניין מיוחד במחקרים אלה, עוברים דג זברה אינם תלויים במערכת הדם במהלך ההתפתחות המוקדמת ויכולים לשרוד מום לב חמור14. יתר על כן, השקיפות שלהם מאפשרת את כל הגוף להיות נצפה ישירות תחת מיקרוסקופ. לכן, עוברים דגי זברה מספקים הזדמנות יוצאת דופן להערכת המנגנונים המולקולריים המעורבים בגיוס רעילות התפתחותית לבבית כתוצאה מחשיפה לכימיקלים סביבתיים שונים5,16,17. דיווחנו בעבר כי PM2.5- סטרס חמצוני המושרה מוביל לנזק DNA אפופטוזיס, וכתוצאה מכך מומים בלב דג זברה18. במחקר זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לחקירת נזק DNA המושרה PM2.5בלב העוברים של דגי זברה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגי זברה מסוג בר (AB) המשמשים במחקר זה התקבלו ממרכז המשאבים הלאומי לדגי זברה בווהאן, סין. כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן נבדקו ואושרו על ידי המכון לטיפול בבעלי חיים של ועדת האתיקה של אוניברסיטת סוכו.
1.2.5 דגימה ומיצוי תרכובות אורגניות
הערה: PM2.5 נאסף באזור עירוני בסוז'ואו, סין, 1-7 באוגוסט 2015, כפי שתואר קודם לכן5.
- אופים מסנני קרום קוורץ 47 מ"מ בכבשן עמעם של 500 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי להסיר את הרכיבים האורגניים.
- מקם מסנן בסמפלר PM2.5 למשך 24 שעות של דגימה ללא הפרעה.
- מוציאים את המסנן ומייבשים למשך 24 שעות בטמפרטורת החדר.
- כימת את המסנן עם איזון אנליטי.
- לחלץ רכיבים אורגניים מהמסנן על ידי מיצוי Soxhlet באמצעות dichloromethane כמו ממס19.
- יבש את EOM על ידי אידוי סיבובי באמבט מים 60 °C וזרימת חנקן. להמיס EOM ב- DMSO ולאחסן ב -20 °C (70 °F).
2. איסוף וטיפול בעוברי דגי זברה
- שמור על דג הזברה ב 28.5 ± 0.5 °C (5 °F) במערכת חקלאות ימית במחזור מחדש עם מחזור פוטופריוד 14 שעות ו 10 שעות כהה photoperiod.
- הניחו דגי זברה בוגרים בריאים במיכל ביחס של 2:1 בין זכר לנקבה.
- למחרת, לאסוף את העוברים ולשטוף אותם עם מי מערכת (כלומר, מי רבייה של דגי זברה).
- בחר וחלק באופן אקראי עוברי דגי זברה המדגים התפתחות נורמלית (גודל אחיד, דגנים מלאים וללא קרישת ביצים) ל-4 קבוצות בצלחות פטרי מזכוכית בודדות בקוטר של 7 ס"מ (כ-50 עוברים למנה).
- לטפל בעוברים עם PM2.5 (5 מ"ג / ליטר) בנוכחות או היעדר NAC ב 0.25 מיקרומטר מ 2 כ"ס עד 72 כ"ס. השתמש ב- DMSO כפקד רכב לריכוז סופי של 0.1% (v/v).
3. תצפית מורפולוגית של עוברים דגי זברה ניתור לב
- ב 72 כ"ס, להעביר עוברים שקופיות זכוכית להתבונן תחת מיקרוסקופ סטריאו. הקלט מומים בלב, כגון בצורת קרום הלב, לולאה שונה, וירידה בגודל.
- חשב שיעורי מום (אחוז העוברים עם מומים בלב מתוך סך העוברים החיים) ולנתח הבדלים בין קבוצות באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של טורקיה (p < 0.05 = מובהק סטטיסטית).
- למרדים את העוברים עם 0.6 מ"ג / מ"ל MS-222 כדי לשתק אותם על מגלשות זכוכית.
- הקלט פעימות לב עבור 30 s ולכומת את קצב הלב באמצעות תוכנת ImageJ5,20.
- לנתח לבבות מעוברי דגי זברה עם מחט מזרק חד פעמית תחת מיקרוסקופ סטריאו. אזהרה: הימנעו מהריסת צורת הלב.
4. אימונופלואורסצנטיות
- כדי להשתמש בבדיקת אימונופלואורסצנטיות כדי לזהות נזק DNA המושרה PM2.5 בלב העוברים של דגי זברה, השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר עיגול בצד זכוכית נקי.
- הוסף 50 μL של 4% paraformaldehyde כדי 1.25 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי להפוך פתרון קבוע.
- מניחים 3 לבבות ניתחו לתוך מעגל עט מחסום הידרופובי אחד ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- דקת הפתרון מתחת למיקרוסקופ ולייבש את הדגימות בטמפרטורת החדר לפחות 5 דקות, כך הלבבות מחוברים לחלוטין שקופיות זכוכית.
- לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBS עם 0.1% Tween 20 (PBST) במשך 5 דקות לכביסה.
- הוסף 50 μL של אלבומין סרום בקר (BSA) כדי 1000 μL של PBST כדי להשיג פתרון 5% BSA ודגורת השקופיות בתא לח עבור 1 שעה כדי לחסום כריכת נוגדנים ספציפית.
- Decant הפתרון לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות לכל לשטוף.
- לדלל 2 μL של נוגדן חד שבטי עכבר נגד 8-OHdG ו 2 μL של נוגדן פוליקלונלי ארנב נגד γH2AX ב 296 μL של PBST כדי להשיג פתרון קוקטייל נוגדנים ראשוני עובד.
- לדגור את דגימות הלב עם 50 μL של פתרון קוקטייל הנוגדנים העיקרי נגד 8-OHdG ו γH2AX בתא לח לפחות שעה אחת בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 °C (דגירה לילה יכול להגביר את עוצמת האות).
- Decant הפתרון לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות לכל לשטוף.
- לדלל 1 μL של נוגדן משני נגד עכבר עיזים תווית FITC ו 1 μL של נוגדן משני נגד ארנב עז cy3 ב 498 μL של PBST כדי להשיג פתרון קוקטייל נוגדנים משני עובד ודגורת הדגימות עם הנוגדנים המשניים (1:500 ב PBST) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
- פירוק הפתרון ולשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך 5 דקות לכל לשטוף מוגן מפני אור.
- הוסף 20 μL של DAPI (4',6-diamidino-2-פנילינדול) לדגימות עבור כתמים גרעיניים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- יש למרוח כיסוי על החלקה ולאטום עם לק כדי למנוע ייבוש ותנועה. לאחר מכן צלם את הדגימות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכמת את אות הפלואורסצנטיות של אזור הלב באמצעות תוכנת ImageJ. חשב את השינויים היחסיים עם הממוצע של דגימות פקד DMSO. קבע את המשמעות הסטטיסטית של הנתונים כמו בשלב 3.2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בדיקה חיסונית זו היא שיטה רגישה וספציפית למדידת שינויים בביטוי חלבונים בליבם של עוברים דגי זברה החשופים לכימיקלים סביבתיים.
בניתוח מייצג זה, עוברים שנחשפו PM2.5 בהיעדר או נוכחות של NAC נוגד חמצון הוערכו לנוכחות של מומים בלב (איור 1). כפי שנצפו, EOM מ PM2.5 גרם לעלייה משמעותית טרטוגנזה לב, כגון בצקת קרום הלב, לולאה שונה, וירידה בגודל, לעומת לבבות שטופלו בקרה DMSO. קצב פעימות הלב ירד משמעותית גם בעוברים שנחשפו ל- EOM (איור 1B). התוספת של NAC היפחתה באופן משמעותי מומים בלב הנגרמים על ידי EOM(איור 1).
כאן נעשה שימוש בבדיקת האימונופלואורסצנטיות למדידת ביטוי 8-OHdG ו- γH2AX בעובר דגי זברה כדי להעריך את היקף הנזק לדנ"א ברקמות שטופלו ב- EOM. כפי שניתן לראות באיור 2, רמות הביטוי 8-OHdG ו-γH2AX גדלו באופן משמעותי בליבם של עוברים דגי זברה שטופלו בקבוצת EOM בהשוואה לשליטה, לבבות שטופלו ב-DMSO, מה שמצביע על עלייה בנזק לדנ"א חמצוני ושברים כפולים של DNA, בהתאמה. יתר על כן, נזק הדנ"א שנגרם על ידי EOM נוטרל חלקית על ידי תוספי NAC(איור 2).
איור 1. מומים לבביים של עוברים דגי זברה ב 72 כ"ס. (A) תמונות של עוברים דגי זברה ב 72 כ"ס. קווים מנוקדים מציינים אטריה (אדום) או חדרים (כחול). מוט קנה מידה, 200 מיקרומטר. (B) מום בלב וקצב פעימות לב. התוצאות מוצגות כממוצע ± SEM. לפחות 50 עוברים בכל קבוצה נבדקו. EOM: EOM ב 5 מ"ג / ליטר; NAC: NAC ב 0.25 מיקרומטר. **, P < 0.01; עמ<0.001 נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.,
איור 2. נזק לדנ"א בלב עוברים של דגי זברה ב-72 כ"ס. א) כתמי אימונופלואורסצנטיות. מוט קנה מידה, 100 מיקרומטר. ב) תוצאות כמותיות. התוצאות הוצגו כממוצע ± SEM. לפחות 15 לבבות מכל קבוצה נבדקו. EOM: EOM ב 5 מ"ג / ליטר; NAC: NAC ב 0.25 מיקרומטר. **; P < 0.01; ***; עמ<0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות דג זברה הוא מודל בעל חוליות מצוין לחקר הרעילות ההתפתחותית הלבבית של כימיקלים סביבתיים, בשל הגודל הקטן של הלב העובר, קשה להשיג מספיק חלבון לניתוח כתם מערבי. לכן, אנו מציגים שיטה חיסונית רגישה לכימות רמות ביטוי החלבון של סמנים ביולוגיים נזק DNA בלבם של עוברים דג זברה חשוף PM2.5.
במהלך הניתוח, חשוב לשמור על שלמות הלב ללא פגע. מניסיוננו, קל יחסית לבצע את הבידוד ב 72 כ"ס. בנוסף, יש להכניס את הלב לפתרון הקיבעון בהקדם האפשרי לאחר האיסוף. צעד קריטי נוסף הוא ייבוש הדגימות כדי לוודא שהלבבות שניתחו מחוברים לחלוטין למגלשת הזכוכית. אחרת, הדגימות עשויות להישטף מהשקופית במהלך התיוג.
מכתמים אימונופלואורסצנטיים כפולים מבוצעים כדי לזהות הן אותות 8-OHdG והן γH2AX בלבבות המבודדים. שיטה זו לא רק חוסכת עבודה ומאפשרת שימוש בגודל מדגם מופחת, אלא גם מאפשרת לוקליזציה משותפת של שני האותות. למרות ששיטה מבוססת נוגדנים זו אינה יכולה לזהות אותות פלואורסצנטיים בעוברים חיים, פרוטוקול מהיר זה יכול לשמש לזיהוי ביטוי חלבון בלבבות עוברי זברה מבודדים.
דווח לעתים קרובות כי עקה חמצונית מתווכת PM2.5- נזק DNA המושרה8,9. ייצור ROS מוגזם יכול להוביל נזק DNA אפופטוזיס במהלך התפתחות עוברית דג זברה21,22,23. כפי שדיווחנו בעבר18, מוגבר 8-OHdG ו γH2AX ביטוי אות נצפה בלבם של עוברים דג זברה חשוף EOM, הביטויים של אשר מנוגדים באופן משמעותי על ידי טיפול עם NAC נבלות ROS. ראוי לציין כי NAC אינו הופך לחלוטין PM2.5- ביטוי אות נזק DNA המושרה, המציין כי מתח חמצוני עשוי לתרום רק באופן חלקי לנזק ה- DNA שנצפו בלבם של עוברים דגי זברה שנחשפו PM2.5.
לסיכום, שיטה זו משתמשת בטכניקה רגישה לאיתור נזקי DNA הנגרמים על ידי PM2.5 בלבם השלם של עוברים דגי זברה. בנוסף, ניתן ליישם את השיטה כדי לזהות שינויים בביטוי חלבון בלבם של עוברים דגי זברה החשופים לכימיקלים סביבתיים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספר מענק: 81870239, 81741005, 81972999) ופיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות ההשכלה הגבוהה בג'יאנגסו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M.
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
