Summary
Este protocolo utiliza un ensayo de inmunofluorescencia para detectar el daño en el ADN inducido por PM2.5en los corazones disecados de embriones de pez cebra.
Abstract
La exposición a partículas finas ambientales (PM2.5)puede conducir a toxicidad para el desarrollo cardíaco, pero los mecanismos moleculares subyacentes aún no están claros. La 8-hidroxi-2'desoxigenasa (8-OHdG) es un marcador de daño oxidativo del ADN y γH2AX es un marcador sensible para las roturas de doble cadena del ADN. En este estudio, nuestro objetivo fue detectar cambios en PM2.5-inducidos por 8-OHdG y γH2AX en el corazón de embriones de pez cebra utilizando un ensayo de inmunofluorescencia. Los embriones de pez cebra fueron tratados con materia orgánica extraíble (EOM) a partir de PM2.5 a 5 μg/mL en presencia o ausencia de antioxidante N-acetil-L-cisteína (NAC, 0.25 μM) a las 2 h después de la fertilización (hpf). DMSO se utilizó como control de vehículos. A 72 hpf, los corazones se diseccionaron de embriones usando una aguja de jeringa y se fijaron y permeabilizaron. Después de ser bloqueadas, las muestras fueron sondeada con anticuerpos primarios contra 8-OHdG y γH2AX. Las muestras se lavaron e incubaron con anticuerpos secundarios. Las imágenes resultantes se observaron bajo microscopía de fluorescencia y se cuantificaron utilizando ImageJ. Los resultados muestran que la OMA de PM2.5 mejoró significativamente las señales 8-OHdG y γH2AX en el corazón de los embriones de pez cebra. Sin embargo, NAC, actuando como un eliminador de especies reactivas de oxígeno (ROS), contrarrestó parcialmente el daño del ADN inducido por la OMA. Aquí, presentamos un protocolo de inmunofluorescencia para investigar el papel del daño en el ADN en los defectos cardíacos inducidos por PM2.5que se pueden aplicar a la detección de cambios en la expresión de proteínas inducidas por químicos ambientales en los corazones de embriones de pez cebra.
Introduction
La contaminación del aire es ahora un grave problema ambiental que enfrenta el mundo. Las partículas finas ambientales (PM2.5),que es uno de los indicadores más importantes de la calidad del aire, pueden transportar una gran cantidad de sustancias nocivas y entrar en el sistema circulatorio de la sangre, causando graves daños a la salud humana1. Los estudios epidemiológicos han demostrado que la exposición a PM2.5 puede conducir a un mayor riesgo de defectos cardíacos congénitos (CHD)2,3. La evidencia de experimentos con animales también mostró que PM2.5 puede causar un desarrollo cardíaco anormal en embriones de pez cebra y la descendencia de ratones, pero los mecanismos moleculares de la toxicidad del desarrollo cardíaco de PM2.5 aún se desconocen en gran medida4,5,6.
El daño en el ADN puede causar la detención del ciclo celular e inducir apoptosis, lo que puede destruir ampliamente el potencial de las células progenitoras y, en consecuencia, afectar el desarrollo del corazón7). Se ha documentado bien que los contaminantes ambientales, incluyendo PM2.5,tienen el potencial de atacar el ADN a través de mecanismos de estrés oxidativo8,9. Tanto el desarrollo cardíaco humano como el pez cebra son sensibles al estrés oxidativo10,11,12. 8-OHdG es un marcador de daño oxidativo del ADN, y la señal γH2AX es un marcador de roturas de doble cadena de ADN. La N-acetil-L-cisteína (NAC), un precursor sintético de la cisteína intracelular y el glutatión, es ampliamente utilizado como compuesto antioxidante. En este estudio, utilizamos NAC para investigar el papel del estrés oxidativo en PM2.5- daño inducido por el ADN13.
El pez cebra como vertebrado modelo ha sido ampliamente utilizado para estudiar el desarrollo cardíaco y las enfermedades cardiovasculares humanas porque los mecanismos del desarrollo cardíaco están altamente conservados entre los vertebrados14,15. Las ventajas de usar el pez cebra como modelo incluyen su pequeño tamaño, fuerte capacidad reproductiva y bajo costo de alimentación. De particular interés para estos estudios, los embriones de pez cebra no dependen del sistema circulatorio durante el desarrollo temprano y pueden sobrevivir a una malformación cardíaca grave14. Además, su transparencia permite observar directamente todo el cuerpo bajo un microscopio. Por lo tanto, los embriones de pez cebra brindan una excelente oportunidad para evaluar los mecanismos moleculares involucrados en la inducción de la toxicidad del desarrollo cardíaco como resultado de la exposición a diversos productos químicos ambientales5,16,17. Hemos informado previamente que el estrés oxidativo inducido por PM2.5conduce al daño del ADN y la apoptosis, lo que resulta en malformaciones cardíacas en el pez cebra18. En este estudio, proporcionamos un protocolo detallado para investigar el daño al ADN inducido por PM2.5en el corazón de embriones de pez cebra.
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Protocol
El pez cebra de tipo salvaje (AB) utilizado en este estudio se obtuvo del Centro Nacional de Recursos de Pez Cebra en Wuhan, China. Todos los procedimientos de animales descritos aquí han sido revisados y aprobados por la Institución de Cuidado Animal del Comité de Ética de la Universidad de Soochow.
1. Muestreo de PM2.5 y extracción de compuestos orgánicos
NOTA: PM2.5 se recolectó en un área urbana en Suzhou, China, del 1 al 7 de agosto de 2015, como se describió anteriormente5.
- Hornea filtros de membrana de cuarzo de 47 mm en un horno de silenciador de 500 °C durante 2 h para eliminar los componentes orgánicos.
- Coloque un filtro en un muestreador PM2.5 durante 24 h de muestreo ininterrumpido.
- Retire el filtro y séquelo durante 24 h a temperatura ambiente.
- Cuantificar el filtro con una balanza analítica.
- Extraer componentes orgánicos del filtro mediante extracción Soxhlet utilizando diclorometano como disolvente19.
- Secar la EJ mediante una evaporación rotativa en un baño de agua de 60 °C y un flujo de nitrógeno. Disolver la EOM en DMSO y conservar a -20 °C.
2. Recolección y tratamiento de embriones de pez cebra
- Mantener el pez cebra a 28,5 ± 0,5 °C en un sistema de acuicultura de recirculación con un ciclo de fotoperíodo de luz de 14 h y fotoperíodo oscuro de 10 h.
- Coloque el pez cebra adulto sano en un tanque en una proporción de 2: 1 macho a hembra.
- Al día siguiente, recoja los embriones y lávelos con agua del sistema (es decir, agua de cría de pez cebra).
- Seleccionar y dividir aleatoriamente embriones de pez cebra que demuestren un desarrollo normal (tamaño uniforme, granos completos y sin coagulación de huevos) en 4 grupos en placas de Petri de vidrio individuales con un diámetro de 7 cm (aproximadamente 50 embriones por plato).
- Tratar los embriones con PM2,5 (5 mg/L) en presencia o ausencia de NAC a 0,25 μM desde 2 hpf hasta 72 hpf. Utilice DMSO como control del vehículo hasta una concentración final al 0,1% (v/v).
3. Observación morfológica de embriones de pez cebra y disección cardíaca
- A 72 hpf, transfiera embriones a portaobjetos de vidrio y observe bajo un microscopio estereoscópico. Registre malformaciones cardíacas, como edema pericárdico, alteración del bucle y disminución del tamaño.
- Calcular las tasas de malformación (el porcentaje de embriones con defectos cardíacos del total de embriones vivos) y analizar las diferencias entre los grupos utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparación múltiple de Turquía (p < 0,05 = estadísticamente significativo).
- Anestesiar los embriones con 0,6 mg/ml MS-222 para inmovilizarlos en portaobjetos de vidrio.
- Registre los latidos del corazón durante 30 s y cuantifique las frecuencias cardíacas utilizando el software ImageJ5,20.
- Diseccionar corazones de embriones de pez cebra con una aguja de jeringa desechable bajo un microscopio estereoscópico. Precaución: Evite destruir la forma del corazón.
4. Ensayo de inmunofluorescencia
- Para usar un ensayo de inmunofluorescencia para detectar el daño del ADN inducido por PM2.5 en el corazón de embriones de pez cebra, use una pluma de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo en un lado de vidrio limpio.
- Agregue 50 μL de paraformaldehído al 4% a 1,25 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para hacer una solución fijadora.
- Coloque 3 corazones diseccionados en un círculo de pluma de barrera hidrofóbica e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente.
- Decantar la solución bajo el microscopio y secar las muestras a temperatura ambiente durante al menos 5 minutos, de modo que los corazones se adhieran completamente a los portaobjetos de vidrio.
- Lave las diapositivas tres veces en PBS con 0.1% Tween 20 (PBST) durante 5 minutos por lavado.
- Añadir 50 μL de albúmina sérica bovina (BSA) a 1000 μL de PBST para obtener una solución de BSA al 5% e incubar los portaobjetos en una cámara húmeda durante 1 h para bloquear la unión de anticuerpos no específicos.
- Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBST durante 5 min por lavado.
- Diluir 2 μL de anticuerpo monoclonal de ratón contra 8-OHdG y 2 μL de anticuerpo policlonal de conejo contra γH2AX en 296 μL de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos primarios en funcionamiento.
- Incubar las muestras de corazón con 50 μL de la solución de cóctel de anticuerpos primarios contra 8-OHdG y γH2AX en una cámara humidificada durante al menos una hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 °C (la incubación nocturna puede aumentar la intensidad de la señal).
- Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBST durante 5 min por lavado.
- Diluir 1 μL de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con FITC y 1 μL de anticuerpo secundario anti-conejo de cabra cy3 en 498 μL de PBST para obtener una solución cóctel de anticuerpos secundarios en funcionamiento e incubar las muestras con los anticuerpos secundarios (1:500 en PBST) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante 5 min por lavado protegido de la luz.
- Añadir 20 μL de DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) a las muestras para la tinción nuclear durante 30 min a temperatura ambiente.
- Aplique un cubrebocas para deslizar y selle con esmalte de uñas para evitar el secado y el movimiento. A continuación, imagine las muestras bajo un microscopio de fluorescencia y cuantifique la señal de fluorescencia del área del corazón utilizando el software ImageJ. Calcule los cambios relativos con el promedio de muestras de control DMSO. Determine la significación estadística de los datos como en el paso 3.2.
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Representative Results
Este ensayo de inmunofluorescencia es un método sensible y específico para medir los cambios en la expresión de proteínas en los corazones de embriones de pez cebra expuestos a productos químicos ambientales.
En este análisis representativo, se evaluaron embriones expuestos a PM2.5 en ausencia o presencia del antioxidante NAC para la presencia de malformaciones cardíacas (Figura 1). Como se observó, la OMA de PM2.5 causó un aumento significativo en la teratogénesis cardíaca, como edema pericárdico, asa alterada y disminución del tamaño, en comparación con los corazones tratados con control DMSO. La frecuencia cardíaca también disminuyó significativamente en embriones expuestos a la OMA(Figura 1B). La adición de NAC atenuó significativamente los defectos cardíacos inducidos por la OMA (Figura 1).
Aquí se utilizó el ensayo de inmunofluorescencia para medir la expresión de 8-OHdG y γH2AX en embriones de pez cebra para evaluar el alcance del daño al ADN en los tejidos tratados con OMA. Como se muestra en la Figura 2,los niveles de expresión de 8-OHdG y γH2AX aumentaron significativamente en los corazones de los embriones de pez cebra tratados con el grupo EOM en comparación con los corazones controlados tratados con DMSO, lo que indica un aumento en el daño oxidativo del ADN y las roturas de doble cadena de ADN, respectivamente. Además, el daño del ADN inducido por la OMA fue parcialmente contrarrestado por la suplementación con NAC(Figura 2).
Figura 1. Defectos cardíacos de embriones de pez cebra a 72 hpf. (A) Imágenes de embriones de pez cebra a 72 hpf. Las líneas punteadas indican aurículas (rojo) o ventrículos (azul). Barra de escala, 200 μm. (B) Malformación cardíaca y frecuencia cardíaca. Los resultados se presentan como media ± SEM. Se examinaron al menos 50 embriones en cada grupo. EOM: EOM a 5 mg/L; NAC: NAC a 0,25 μM.. **,P < 0,01; , p<0.001 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Daño en el ADN en el corazón de embriones de pez cebra a 72 hpf. A) Tinción por inmunofluorescencia. Barra de escala, 100 μm. B) Resultados cuantitativos. Los resultados se presentaron como media ± SEM. Se examinaron al menos 15 corazones de cada grupo. EOM: EOM a 5 mg/L; NAC: NAC a 0,25 μM. **; P < 0,01; ***; p<0,001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque el pez cebra es un excelente modelo de vertebrados para estudiar la toxicidad del desarrollo cardíaco de los productos químicos ambientales, debido al pequeño tamaño del corazón embrionario, es difícil obtener suficiente proteína para el análisis de western blot. Por lo tanto, presentamos un método de inmunofluorescencia sensible para cuantificar los niveles de expresión de proteínas de los biomarcadores de daño al ADN en los corazones de embriones de pez cebra expuestos a PM2.5.
Durante la disección, es importante mantener intacta la integridad del corazón. En nuestra experiencia, es relativamente fácil realizar el aislamiento a 72 hpf. Además, el corazón debe colocarse en solución de fijación tan pronto como sea posible después de la recolección. Otro paso crítico es secar las muestras para asegurarse de que los corazones diseccionados estén completamente unidos al portaobjetos de vidrio. De lo contrario, las muestras pueden lavarse de la diapositiva durante el etiquetado.
La tinción de inmunofluorescencia dual se realiza para detectar señales 8-OHdG y γH2AX en los corazones aislados. Este método no solo ahorra mano de obra y permite el uso de un tamaño de muestra reducido, sino que también facilita la colocalización de las dos señales. Aunque este método basado en anticuerpos no puede detectar señales de fluorescencia en embriones vivos, este protocolo rápido se puede utilizar para detectar la expresión de proteínas en corazones de embriones aislados de pez cebra.
Se ha informado con frecuencia que el estrés oxidativo media el daño al ADN inducido por PM2.58,9. La producción excesiva de ROS puede provocar daños en el ADN y apoptosis durante el desarrollo embrionario del pez cebra21,22,23. Como hemos informado anteriormente18,se observa un aumento de la expresión de la señal 8-OHdG y γH2AX en los corazones de los embriones de pez cebra expuestos a la OMA, cuyos expresiones se contrarrestan significativamente mediante el tratamiento con el recolector de ROS NAC. Cabe destacar que NAC no revierte completamente la expresión de señales de daño al ADN inducida por PM2.5,lo que indica que el estrés oxidativo solo puede contribuir parcialmente al daño al ADN observado en los corazones de los embriones de pez cebra expuestos a PM2.5.
En conclusión, este método utiliza una técnica sensible para detectar el daño del ADN inducido por PM2.5 en los corazones intactos de los embriones de pez cebra. Además, el método se puede aplicar para detectar cambios en la expresión de proteínas en los corazones de embriones de pez cebra expuestos a otros productos químicos ambientales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (número de subvención: 81870239, 81741005, 81972999) y el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
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