Summary
このプロトコルは、免疫蛍光アッセイを使用して、ゼブラフィッシュ胚の解剖された心臓におけるPM2.5誘発DNA損傷を検出する。
Abstract
周囲の微小粒子状物質(PM2.5)曝露は心臓発達毒性を引き起こす可能性があるが、基礎となる分子メカニズムはまだ不明である。8-ヒドロキシ-2'デオキシゲナーゼ(8-OHdG)は、酸化的DNA損傷のマーカーであり、γH2AXはDNA二重鎖切断のための感受性マーカーである。本研究では、免疫蛍光アッセイを用いてゼブラフィッシュ胚の心臓部におけるPM2.5誘導8-OHdGおよびγH2AXの変化を検出することを目的とした。ゼブラフィッシュ胚は、受精後2時間(hpf)で抗酸化N-アセチルL-システイン(NAC,0.25 μM)の有無に関して、PM2.5 から5μg/mLで抽出可能な有機物質(EOM)で処理した。DMSOは車両制御として使用されました。72hpfでは、注射針を使用して胚から心臓を解剖し、固定して透過させた。ブロックされた後、サンプルを8-OHdGおよびγH2AXに対する一次抗体でプローブした。次いで、試料を洗浄し、二次抗体でインキュベートした。得られた画像を蛍光顕微鏡観察下で観察し、ImageJを用いて定量した。結果は、PM2.5 からのEOMがゼブラフィッシュ胚の心臓部で8-OHdGおよびγH2AX信号を有意に増強したことを示す。しかしながら、NACは、活性酸素種(ROS)スカベンジャーとして作用し、EOM誘導DNA損傷を部分的に打ち消した。ここでは、ゼブラフィッシュ胚の心臓における環境化学的誘導タンパク質発現変化の検出に適用できるPM2.5-誘発心臓欠陥におけるDNA損傷の役割を調べるための免疫蛍光プロトコルを提示する。
Introduction
大気汚染は今や世界が直面している深刻な環境問題です。大気質の最も重要な指標の一つである周囲微小粒子状物質(PM2.5)は、多数の有害物質を運び、血液循環系に入り、人間の健康に深刻な害を及ぼす可能性がある。疫学研究は、PM2.5曝露が先天性心不全(CHD)2、3のリスクの増加につながることを実証した。また、動物実験の証拠は、PM2.5がゼブラフィッシュの胚およびマウスの子孫に異常な心臓発達を引き起こす可能性があることを示したが、PM2.5の心臓発達毒性の分子機構は依然としてほとんど知られていない4、5、6である。
DNA損傷は、細胞周期停止を引き起こし、アポトーシスを誘発し、前駆細胞の可能性を広範囲に破壊し、その結果、心臓の発達を損なう可能性がある7)。PM2.5を含む環境汚染物質は、酸化ストレス機構8,9を通じてDNAを攻撃する可能性を有することが十分に文書化されている。ヒトとゼブラフィッシュの心臓の発達は、酸化ストレス10、11、12に敏感です。8-OHdGは酸化的DNA損傷マーカーであり、γH2AXシグナルはDNA二重鎖切断のマーカーである。細胞内システインとグルタチオンの合成前駆体であるN-アセチル-L-システイン(NAC)は、抗酸化化合物として広く使用されています。本研究では、NACを用い、PM2.5-誘導DNA損傷13における酸化ストレスの役割を調べる。
脊椎動物のモデルとしてのゼブラフィッシュは、脊椎動物14,15の間で心臓開発のメカニズムが高度に保存されているため、心臓の発達やヒト心血管疾患の研究に広く用いられている。ゼブラフィッシュをモデルとして使用する利点には、小型、強力な生殖能力、低給餌コストなどがあります。これらの研究に特に興味深いのは、ゼブラフィッシュ胚は初期の発達の間に循環系に依存せず、重度の心臓奇形14を生き残ることができる。さらに、その透明性により、全身を顕微鏡下で直接観察することができます。このように、ゼブラフィッシュ胚は、種々の環境化学物質への曝露の結果として心臓発達毒性の誘導に関与する分子機構を評価する優れた機会を提供する5、16、17。我々は以前にPM2.5誘導酸化ストレスがDNA損傷およびアポトーシスをもたらし、ゼブラフィッシュ18の心臓奇形をもたらすことを報告した。本研究では、ゼブラフィッシュ胚の心臓部におけるPM2.5誘導DNA損傷を調査するための詳細なプロトコルを提供する。
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Protocol
本研究で使用された野生型ゼブラフィッシュ(AB)は、中国武漢市の国立ゼブラフィッシュ資源センターから入手した。ここで概説されているすべての動物の手順は、スーチョウ大学の倫理委員会の動物ケア機関によって見直され、承認されています.
1. PM2.5 サンプリングと有機化合物抽出
注:PM2.5 は、前に説明したように、2015年8月1-7日、中国蘇州の都市部で収集されました。
- 500°Cのマフレ炉で47mmの石英膜フィルターを2時間焼き、有機成分を除去します。
- 24 時間のサンプリングを行う PM2.5 サンプラーにフィルターを配置します。
- フィルターを取り外し、室温で24時間乾燥します。
- 分析バランスでフィルターを定量化します。
- 溶媒19としてジクロロメタンを用いたソックスレー抽出によりフィルターから有機成分を抽出する。
- 60°Cの水浴と窒素流でロータリーエバポレーションによりEOMを乾燥させます。DMSOでEOMを溶解し、-20 °Cで保存してください。
2. ゼブラフィッシュ胚の採取と治療
- 14時間光と10時間の暗い光周期サイクルを持つ再循環養殖システムで28.5±0.5°Cでゼブラフィッシュを維持します。
- 健康な成虫ゼブラフィッシュを2:1の雄対雌比でタンクに入れます。
- 翌日、胚を採取し、システム水(すなわちゼブラフィッシュ繁殖水)で洗浄する。
- 通常の発達(均一な大きさ、全粒、卵凝固なし)を示すゼブラフィッシュ胚を、直径7cm(1皿あたり約50胚)の個々のガラスペトリ皿の4つのグループに無作為に分けます。
- 2 hpfから72 hpfまで0.25 μMでNACの存在下または不在のPM 2.5(5 mg/L)で胚を処置する。DMSO を車両制御として、最終濃度を 0.1% (v/v) に設定します。
3. ゼブラフィッシュ胚の形態観察と心臓解剖
- 72 hpfで、胚をガラススライドに移し、立体顕微鏡で観察する。心膜浮腫、変化したループ、サイズの減少などの心臓奇形を記録します。
- 奇形率(生きている胚全体のうち心臓欠損を有する胚の割合)を計算し、一方行ANOVAを使用してグループ間の差異を分析し、続いてトルコの多重比較試験(p<0.05 =統計的に有意)
- 0.6 mg/mL MS-222で胚を麻酔し、ガラススライドに固定化します。
- 30 sの心拍数を記録し、ImageJソフトウェア5、20を使用して心拍数を定量化します。
- ゼブラフィッシュ胚の心臓を、使い捨て注射針でステレオ顕微鏡で解剖する。注意: 心臓の形状を破壊しないようにしてください。
4. 免疫蛍光アッセイ
- 免疫蛍光アッセイを使用してゼブラフィッシュ胚の心臓部でPM2.5 誘導DNA損傷を検出するには、疎水性バリアペンを使用してクリーンガラス側に円を描きます。
- 4%パラホルムアルデヒド50 μLをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の1.25 mLに加え、固定溶液を作ります。
- 解剖した心臓を1つの疎水性バリアペンサークルに3個入れ、室温で20分間インキュベートします。
- 顕微鏡下で溶液をデカントし、少なくとも5分間室温でサンプルを乾燥させて、心臓がガラススライドに完全に付着するようにします。
- スライドをPBSで3回洗浄し、0.1%のトゥイーン20(PBST)を1回5分間洗浄します。
- 50 μLのウシ血清アルブミン(BSA)を1000 μLのPBSTに加えて5%BSA溶液を得て、湿度の高いチャンバーで1時間、非特異的抗体結合を遮断するためにインキュベートします。
- 溶液をデカントし、PBSTで3回、洗浄1回5分間洗浄します。
- PBSTの296 μLにおいてγH2AXに対して8-OHdGおよび2μLのウサギポリクローナル抗体に対して2μLのマウスモノクローナル抗体を希釈し、働く一次抗体カクテル溶液を得た。
- 加湿チャンバー内の8-OHdGおよびγH2AXに対する一次抗体カクテル溶液の50 μLを用いて心臓サンプルを室温で、または4°Cで一晩インキュベートしてインキュベートします(一晩インキュベーションは信号強度を増加させることができます)。
- 溶液をデカントし、PBSTで3回、洗浄1回5分間洗浄します。
- 498 μLのPBSTで1μLのFITC標識ヤギ抗マウス二次抗体と1μLのcy3ヤギ抗ウサギ二次抗体を希釈して、働く二次抗体カクテル溶液を得て、二次抗体(PBSTで1:500)の二次抗体でサンプルをインキュベートし、暗い室内温度で1時間培養した。
- 溶液をデカントし、PBSで3回、光から保護された洗浄1回5分間洗浄してサンプルを洗浄します。
- DAPI(4',6-ジミジノ-2-フェニリンドール)を20 μLのサンプルに加え、室温で30分間の核染色を行います。
- カバースリップを塗布して、マニキュアでスライドおよびシールし、乾燥や動きを防ぎます。次に、蛍光顕微鏡でサンプルを画像化し、ImageJソフトウェアを使用して心臓領域の蛍光シグナルを定量化します。DMSO 制御サンプルの平均で相対変化を計算します。ステップ 3.2 のデータの統計的有意性を決定します。
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Representative Results
この免疫蛍光アッセイは、環境化学物質にさらされたゼブラフィッシュ胚の心臓におけるタンパク質発現変化を測定するための敏感かつ特異的な方法である。
この代表的な分析では、抗酸化物質NACの存在の有無または存在下でPM2.5にさらされた胚は、心臓奇形の存在について評価した(図1)。観察されたように、PM2.5からのEOMは、DMSO制御治療心臓と比較して、心膜浮腫、変化したループ、およびサイズの減少などの心臓奇形発生の有意な増加を引き起こした。また、EOMに曝露された胚においても心拍速度が有意に低下した(図1B)。NACの添加はEOM誘発性心不全を著しく減衰させた(図1)。
ここで免疫蛍光アッセイは、ゼブラフィッシュ胚における8-OHdGおよびγH2AX発現を測定し、EOM処理組織におけるDNA損傷の程度を評価するために使用した。図2に示すように、8-OHdGおよびγH2AX発現のレベルは、コントロールと比較してEOM群で処理されたゼブラフィッシュ胚の心臓において有意に増加した、DMSO処理心臓、酸化DNA損傷およびDNA二重鎖切断の増加を示す。さらに、EOM誘発DNA損傷を、NAC補充によって部分的に打ち消した(図2)。
図 1.ゼブラフィッシュ胚の心臓奇形は72hpfである。 (A) 72 hpfのゼブラフィッシュ胚の画像。点線は、心房(赤)または心室(青)を示します。スケールバー、200 μm。(B) 心臓奇形と心拍の割合。結果は SEM ±平均として表示されます。各群の少なくとも50個の胚を調べた。EOM: 5 mg/L で EOM;NAC: 0.25 μM で NAC.**,P < 0.01;、p<0.001 この図の大きいバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.72 hpfでゼブラフィッシュ胚の心臓部におけるDNA損傷。 A) 免疫蛍光染色。スケールバー、100 μm。B) 定量的な結果。結果はSEM±平均として提示された。各グループから少なくとも15人の心臓が調べられた。EOM: 5 mg/L で EOM;NAC: 0.25 μM の NAC。**;P < 0.01;***;p<0.001.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ゼブラフィッシュは、環境化学物質の心臓発達毒性を研究するための優れた脊椎動物モデルであるが、胚心臓の小さいサイズに起因して、ウェスタンブロット分析のための十分なタンパク質を得ることは困難である。そこで、PM2.5に曝露したゼブラフィッシュ胚の心臓におけるDNA損傷バイオマーカーのタンパク質発現レベルを定量化するための高感度免疫蛍光法を提示する。
解剖中、心臓の完全性をそのまま保つことが重要です。我々の経験では、72 hpfで分離を実行することは比較的容易である。さらに、心臓は収集後できるだけ早く固定液に入れる必要があります。もう一つの重要なステップは、解剖された心臓がガラススライドに完全に取り付けられていることを確認するためにサンプルを乾燥させることです。それ以外の場合、サンプルは、標識中にスライドから洗い流され得る。
二重免疫蛍光染色は、分離された心臓における8-OHdGおよびγH2AX信号の両方を検出するために行われる。この方法は、労力を節約し、サンプルサイズを削減するだけでなく、2つの信号の共局在化を容易にします。この抗体ベースの方法では、生きている胚の蛍光シグナルを検出することはできませんが、この迅速なプロトコルは、単離されたゼブラフィッシュ胚の心臓におけるタンパク質発現を検出するために使用することができます。
酸化ストレスがPM2.5誘導DNA損傷8,9を媒介することがしばしば報告されている。過剰なROS産生は、ゼブラフィッシュ胚発生21、22、23の間にDNA損傷およびアポトーシスを引き起こす可能性がある。我々は以前に報告した18のように、EOMに曝露されたゼブラフィッシュ胚の心臓に8-OHdGおよびγH2AXシグナル発現の増加が認められ、その発現はROSスカベンジャーNACによる治療によって有意に打ち消される。NACがPM2.5誘導DNA損傷シグナル発現を完全に逆転させるわけではないことは注目に値し、酸化ストレスがPM2.5に曝露されたゼブラフィッシュ胚の心臓に認められるDNA損傷に部分的にしか寄与し得ないことを示している。
結論として、この方法は、ゼブラフィッシュ胚の無傷の心臓におけるPM2.5 誘発DNA損傷を検出するための敏感な技術を使用する。さらに、この方法は、他の環境化学物質にさらされたゼブラフィッシュ胚の心臓におけるタンパク質発現変化を検出するために適用することができる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(助成金番号:81870239、81741005、81972999)と江蘇高等教育機関の優先学術プログラム開発によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
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