Summary
Este protocolo usa um ensaio de imunofluorescência para detectar danos de DNA induzidos por PM2.5nos corações dissecados de embriões de zebrafish.
Abstract
A exposição de partículas finas ambientes (PM2.5) pode levar à toxicidade do desenvolvimento cardíaco, mas os mecanismos moleculares subjacentes ainda não estão claros. 8-hidroxi-2'desoxygenase (8-OHdG) é um marcador de dano oxidativo de DNA e γH2AX é um marcador sensível para quebras de fios duplos de DNA. Neste estudo, tivemos como objetivo detectar alterações de PM2.5-Induzidas 8-OHdG e γH2AX no coração de embriões de zebrafish usando um ensaio de imunofluorescência. Os embriões de zebrafish foram tratados com questões orgânicas extrativáveis (EOM) a partir de PM2,5 a 5 μg/mL na presença ou ausência de antioxidante N-acetil-L-cisteína (NAC, 0,25 μM) a 2 h pós fertilização (hpf). O DMSO foi usado como controle de veículos. Com 72 cv, os corações foram dissecados a partir de embriões usando uma agulha de seringa e fixos e permeabilizados. Após serem bloqueadas, as amostras foram sondadas com anticorpos primários contra 8-OHdG e γH2AX. As amostras foram então lavadas e incubadas com anticorpos secundários. As imagens resultantes foram observadas sob microscopia de fluorescência e quantificadas por ImageJ. Os resultados mostram que os sinais de EOM de PM2.5 aumentaram significativamente os sinais 8-OHdG e γH2AX no coração dos embriões de zebrafish. No entanto, o NAC, agindo como um carniceiro reativa de oxigênio (ROS), contra-ativou parcialmente o dano de DNA induzido pelo EOM. Aqui, apresentamos um protocolo de imunofluorescência para investigar o papel dos danos de DNA em defeitos cardíacos induzidos por PM2,5que podem ser aplicados à detecção de mudanças de expressão de proteínas induzidas por químicos ambientais nos corações dos embriões de zebrafish.
Introduction
A poluição do ar é agora um sério problema ambiental enfrentado pelo mundo. Partículas finas ambientes (PM2.5),que é um dos indicadores mais importantes da qualidade do ar, podem transportar um grande número de substâncias nocivas e entrar no sistema circulatório sanguíneo, causando sérios danos à saúde humana1. Estudos epidemiológicos demonstraram que a exposição à PM2,5 pode levar a um risco aumentado de defeitos cardíacos congênitos (CHDs)2,3. Evidências de experimentos em animais também mostraram que a PM2.5 pode causar desenvolvimento cardíaco anormal em embriões de zebrafish e na prole de camundongos, mas os mecanismos moleculares da toxicidade do desenvolvimento cardíaco de PM2.5 ainda são amplamente desconhecidos4,5,6.
Danos no DNA podem causar apreensão do ciclo celular e induzir apoptose, que pode destruir extensivamente o potencial das células progenitoras e, consequentemente, prejudicar o desenvolvimento cardíaco7). Foi bem documentado que os poluentes ambientais, incluindo o PM2.5,têm potencial para atacar o DNA através de mecanismos de estresse oxidativo8,9. Tanto o desenvolvimento cardíaco humano quanto o zebrafish são sensíveis ao estresse oxidativo10,11,12. 8-OHdG é um marcador de dano de DNA oxidativo, e o sinal γH2AX é um marcador de quebras duplas de dna. N-acetil-L-cisteína (NAC), um precursor sintético de cisteína intracelular e glutationa, é amplamente utilizado como um composto antioxidante. Neste estudo, utilizamos o NAC para investigar o papel do estresse oxidativo na PM2.5- dano de DNA induzido13.
O zebrafish como vertebrado modelo tem sido amplamente utilizado para estudar o desenvolvimento cardíaco e doenças cardiovasculares humanas porque os mecanismos de desenvolvimento cardíaco são altamente conservados entre vertebrados14,15. As vantagens de usar o zebrafish como modelo incluem seu pequeno tamanho, forte capacidade reprodutiva e baixo custo de alimentação. De particular interesse para esses estudos, os embriões de zebrafish não dependem do sistema circulatório durante o desenvolvimento precoce e podem sobreviver à malformação cardíaca grave14. Além disso, sua transparência permite que todo o corpo seja diretamente observado sob um microscópio. Assim, os embriões de zebrafish proporcionam uma excelente oportunidade para avaliar os mecanismos moleculares envolvidos na indução da toxicidade do desenvolvimento cardíaco como resultado da exposição a diversos produtos químicos ambientais5,16,17. Informamos anteriormente que o estresse oxidativo induzido por PM2.5leva a danos no DNA e à apoptose, resultando em malformações cardíacas em zebrafish18. Neste estudo, fornecemos um protocolo detalhado para investigar danos de DNA induzidos por PM2.5no coração de embriões de zebrafish.
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Protocol
Os zebrafish do tipo selvagem (AB) utilizados neste estudo foram obtidos no Centro Nacional de Recursos de Zebrafish em Wuhan, China. Todos os procedimentos de animais aqui descritos foram revisados e aprovados pela Instituição de Cuidados Com Animais do Comitê de Ética da Universidade de Soochow.
1. PM2.5 amostragem e extração de compostos orgânicos
NOTA: PM2.5 foi coletado em uma área urbana em Suzhou, China, 1-7 de agosto de 2015, como descrito anteriormente5.
- Asse filtros de membrana de quartzo de 47 mm em um forno de muffle de 500 °C por 2 h para remover os componentes orgânicos.
- Coloque um filtro em um amostrador PM2.5 para 24 horas de amostragem ininterrupta.
- Retire o filtro e seque por 24 horas em temperatura ambiente.
- Quantifique o filtro com um equilíbrio analítico.
- Extrair componentes orgânicos do filtro por extração soxhlet usando diclorometano como solvente19.
- Seque o EOM por uma evaporação rotativa em um banho de água de 60 °C e fluxo de nitrogênio. Dissolver eOM no DMSO e armazenar a -20 °C.
2. Coleta e tratamento de embriões de zebrafish
- Mantenha o zebrafish a 28,5 ± 0,5 °C em um sistema de aquicultura re-circulante com luz de 14 h e ciclo fotoperodo escuro de 10h.
- Coloque zebrafish adulto saudável em um tanque a uma proporção de 2:1 masculino e feminino.
- No dia seguinte, recolham os embriões e lave-os com água do sistema (ou seja, água de reprodução de zebrafish).
- Selecione e divida aleatoriamente embriões de zebrafish demonstrando um desenvolvimento normal (tamanho uniforme, grãos completos e sem coagulação de ovos) em 4 grupos em pratos petri de vidro individuais com um diâmetro de 7 cm (cerca de 50 embriões por prato).
- Trate os embriões com PM2.5 (5 mg/L) na presença ou ausência de NAC a 0,25 μM de 2 cvf até 72 cvf. Use o DMSO como controle de veículo para uma concentração final de 0,1% (v/v).
3. Observação morfológica de embriões de zebrafish e dissecção cardíaca
- A 72 cvf, transfira embriões para lâminas de vidro e observe sob um microscópio estéreo. Registra malformações cardíacas, como edema pericárdico, looping alterado e diminuição do tamanho.
- Calcular taxas de malformação (a porcentagem de embriões com defeitos cardíacos fora do total de embriões vivos) e analisar diferenças entre grupos que utilizam ANOVA unidirecional seguido do Teste de Comparação Múltipla da Turquia (p < 0,05 = estatisticamente significante).
- Anestesiar os embriões com 0,6 mg/mL MS-222 para imobilizá-los em lâminas de vidro.
- Grave batimentos cardíacos para 30 s e quantifique as frequências cardíacas usando o software ImageJ5,20.
- Disseque corações de embriões de zebrafish com uma agulha de seringa descartável sob um microscópio estéreo. Atenção: Evite destruir a forma do coração.
4. Ensaio de imunofluorescência
- Para usar um ensaio de imunofluorescência para detectar danos de DNA induzidos por PM2.5 no coração de embriões de zebrafish, use uma caneta de barreira hidrofóbica para desenhar um círculo em um lado de vidro limpo.
- Adicione 50 μL de 4% de paraformaldeído a 1,25 mL de Salina Tamponada fosfato (PBS) para fazer uma solução fixa.
- Coloque 3 corações dissecados em um círculo de caneta de barreira hidrofóbica e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente.
- Decante a solução sob o microscópio e seque as amostras à temperatura ambiente por pelo menos 5 minutos, de modo que os corações se apeguem completamente aos slides de vidro.
- Lave os slides três vezes em PBS com 0,1% Tween 20 (PBST) por 5 min por lavagem.
- Adicione 50 μL de albumina de soro bovino (BSA) a 1000 μL de PBST para obter uma solução BSA de 5% e incubar os slides em uma câmara úmida por 1h para bloquear a ligação de anticorpos não específicos.
- Decante a solução e lave as amostras três vezes com PBST por 5 minutos por lavagem.
- Diluir 2 μL de anticorpo monoclonal do rato contra 8-OHdG e 2 μL de anticorpo policlonal de coelho contra γH2AX em 296 μL de PBST para obter uma solução de coquetel de anticorpos primários em funcionamento.
- Incubar as amostras cardíacas com 50 μL da solução primária de coquetel de anticorpos contra 8-OHdG e γH2AX em uma câmara umidificada por pelo menos uma hora em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C (a incubação noturna pode aumentar a intensidade do sinal).
- Decante a solução e lave as amostras três vezes com PBST por 5 minutos por lavagem.
- Diluir 1 μL de anticorpo secundário anti-rato de cabra com rótulo FITC e 1 μL de anticorpo secundário anti-coelho de cabra cy3 em 498 μL de PBST para obter uma solução de coquetel de anticorpos secundários funcionando e incubar as amostras com os anticorpos secundários (1:500 em PBST) por 1 h à temperatura ambiente no escuro.
- Decante a solução e lave as amostras três vezes com PBS por 5 minutos por lavagem protegida da luz.
- Adicione 20 μL de DAPI (4',6-diamidino-2-fenildole) às amostras para coloração nuclear por 30 minutos à temperatura ambiente.
- Aplique uma mancha de cobertura para deslizar e selar com esmalte para evitar secagem e movimento. Em seguida, imagem as amostras sob um microscópio de fluorescência e quantificar o sinal de fluorescência da área cardíaca usando o software ImageJ. Calcule as alterações relativas com a média das amostras de controle DMSO. Determinar a significância estatística dos dados como na etapa 3.2.
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Representative Results
Este ensaio de imunofluorescência é um método sensível e específico para medir mudanças de expressão proteica nos corações dos embriões de zebrafish expostos a produtos químicos ambientais.
Nesta análise representativa, foram avaliados embriões expostos à PM2,5 na ausência ou presença do NAC antioxidante para a presença de malformações cardíacas(Figura 1). Como observado, o EOM da PM2.5 causou um aumento significativo na teratogênese cardíaca, como edema pericárdico, looping alterado e diminuição do tamanho, em comparação com corações tratados com controle DMSO. A taxa de batimentos cardíacos também foi significativamente diminuída em embriões expostos ao EOM (Figura 1B). A adição de NAC atenuou significativamente defeitos cardíacos induzidos pelo EOM(Figura 1).
Aqui, o ensaio de imunofluorescência foi utilizado para medir a expressão 8-OHdG e γH2AX em embrião de zebrafish para avaliar a extensão dos danos de DNA nos tecidos tratados com EOM. Como mostrado na Figura 2, os níveis de 8-OHdG e expressão γH2AX foram significativamente aumentados nos corações dos embriões de zebrafish tratados com o grupo EOM em comparação com o controle, corações tratados com DMSO, indicando um aumento nos danos oxidativos do DNA e quebras duplas de DNA, respectivamente. Além disso, o dano de DNA induzido pelo EOM foi parcialmente neutralizado pela suplementação do NAC(Figura 2).
Figura 1. Defeitos cardíacos de embriões de zebrafish a 72 hpf. (A) Imagens de embriões de zebrafish a 72 hpf. Linhas pontilhadas indicam atria (vermelho) ou ventrículos (azul). Barra de escala, 200 μm. (B) Malformação cardíaca e batimentos cardíacos. Os resultados são apresentados como média ± SEM. Pelo menos 50 embriões em cada grupo foram examinados. EOM: EOM a 5 mg/L; NAC: NAC a 0,25 μM.. **,P < 0,01; , p<0.001 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Dano de DNA no coração de embriões de zebrafish a 72 hpf. A) Coloração de imunofluorescência. Barra de escala, 100 μm. B) Resultados quantitativos. Os resultados foram apresentados como média ± SEM. Pelo menos 15 corações de cada grupo foram examinados. EOM: EOM a 5 mg/L; NAC: NAC a 0,25 μM. **; P < 0,01; ***; p<0.001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Embora o zebrafish seja um excelente modelo vertebrado para estudar a toxicidade do desenvolvimento cardíaco de produtos químicos ambientais, devido ao pequeno tamanho do coração embrião, é difícil obter proteína suficiente para análise de manchas ocidentais. Por isso, apresentamos um método sensível de imunofluorescência para quantificar os níveis de expressão proteica dos biomarcadores de dano de DNA nos corações dos embriões de zebrafish expostos à PM2.5.
Durante a dissecação, é importante manter intacta a integridade do coração. Em nossa experiência, é relativamente fácil realizar o isolamento a 72 hpf. Além disso, o coração precisa ser colocado em solução de fixação o mais rápido possível após a coleta. Outro passo crítico é secar as amostras para garantir que os corações dissecados estejam completamente presos ao escorregador de vidro. Caso contrário, as amostras podem ser lavadas do slide durante a rotulagem.
A coloração dupla de imunofluorescência é realizada para detectar sinais 8-OHdG e γH2AX nos corações isolados. Este método não só economiza mão-de-obra e permite o uso de um tamanho amostral reduzido, mas também facilita a co-localização dos dois sinais. Embora este método baseado em anticorpos não possa detectar sinais de fluorescência em embriões vivos, este protocolo rápido pode ser usado para detectar expressão proteica em corações isolados de embriões de zebrafish.
Tem sido frequentemente relatado que o estresse oxidativo media danos de DNA induzidos por PM2.58,9. A produção excessiva de ROS pode levar a danos no DNA e à apoptose durante o desenvolvimento embrionário de zebrafish21,22,23. Como já relatamos anteriormente18, uma expressão de sinal 8-OHdG e γH2AX é observada nos corações dos embriões de zebrafish expostos ao EOM, as expressões das quais são significativamente neutralizadas pelo tratamento com o NAC de catadores ROS. Vale ressaltar que o NAC não reverte completamente a expressão do sinal de dano de DNA induzido por PM2,5,indicando que o estresse oxidativo só pode contribuir parcialmente para o dano de DNA observado nos corações dos embriões de zebrafish expostos à PM2.5.
Em conclusão, este método utiliza uma técnica sensível para detectar danos de DNA induzidos por PM2.5 nos corações intactos de embriões de zebrafish. Além disso, o método pode ser aplicado para detectar mudanças de expressão proteica nos corações dos embriões de zebrafish expostos a outros produtos químicos ambientais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências da Natureza da China (número de subvenção: 81870239, 81741005, 81972999) e pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento de Instituições de Ensino Superior de Jiangsu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M.
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
