Summary
该协议使用免疫荧光检测检测斑马鱼胚胎解剖心脏中PM2.5诱发的DNA损伤。
Abstract
环境细颗粒物（PM2.5）暴露可导致心脏发育毒性，但潜在的分子机制尚不清楚。8-羟基-2'脱氧酶（8-OHdG）是氧化DNA损伤的标记，+H2AX是DNA双链断裂的敏感标记。在这项研究中，我们旨在通过免疫荧光检测斑马鱼胚胎心脏的PM2.5诱导8-OHDG和+H2AX变化。斑马鱼胚胎在受精后2小时（hpf）2小时时，以5微克/mL的PM2.5 处理可提取的有机物质（EOM）。DMSO 被用作车辆控制。在72马力，心脏被解剖从胚胎使用注射器针和固定和渗透。被阻塞后，用原样抗体对8-OHdG和+H2AX进行探测。然后用二次抗体清洗和孵育样品。由此产生的图像在荧光显微镜下观察，并使用 ImageJ 进行量化。结果表明，EOM从下午2.5 显著增强8-OHDG和+H2AX信号在斑马鱼胚胎的心脏。然而，NAC作为活性氧物种（ROS）的清除剂，部分抵消了EOM引起的DNA损伤。在这里，我们提出了一个免疫荧光方案，用于研究DNA损伤在PM2.5诱发的心脏缺陷中的作用，可用于检测斑马鱼胚胎心脏中环境化学诱发的蛋白质表达变化。
Introduction
空气污染是目前世界面临的一个严重的环境问题。环境细颗粒物（PM2.5）是空气质量最重要的指标之一，可携带大量有害物质进入血液循环系统，对人体健康造成严重危害。流行病学研究表明，PM2.5暴露可导致先天性心脏缺陷（CHDs）2，3的风险增加。动物实验的证据表明，PM2.5可导致斑马鱼胚胎和小鼠后代心脏发育异常，但PM2.5心脏发育毒性的分子机制仍鲜为人知。
DNA损伤可引起细胞周期骤停并诱发凋亡，从而可能广泛破坏祖细胞的潜力，进而损害心脏发育。有充分证据表明，环境污染物，包括PM2.5，有可能通过氧化应激机制8，9攻击DNA。人类和斑马鱼心脏发育都对氧化应激10、11、12敏感。8-OHdG 是一种氧化性 DNA 损伤标记，+H2AX 信号是 DNA 双链断裂的标志。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）是细胞内半胱氨酸和谷胱甘肽的合成前体，被广泛用作抗氧化化合物。在这项研究中，我们使用NAC来研究氧化应激在下午2.5诱发DNA损伤13中的作用。
斑马鱼作为脊椎动物的模型，已被广泛用于研究心脏发育和人类心血管疾病，因为心脏发育机制在脊椎动物中保存高度。使用斑马鱼作为模型的优势包括它们体积小、繁殖能力强和饲养成本低。这些研究特别感兴趣的是，斑马鱼胚胎在早期发育过程中不依赖于循环系统，并且能够存活下来，严重心脏畸形14。此外，它们的透明度允许在显微镜下直接观察整个身体。因此，斑马鱼胚胎提供了一个绝佳的机会，以评估参与诱导心脏发育毒性的分子机制，由于接触各种环境化学品5，16，17。我们之前曾报道，PM2.5引起的氧化应激导致DNA损伤和凋亡，导致斑马鱼18的心脏畸形。在这项研究中，我们提供了一个详细的协议，用于调查PM2.5引起的斑马鱼胚胎心脏DNA损伤。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究中使用的野生斑马鱼（AB）是从中国武汉国家斑马鱼资源中心获得的。这里概述的所有动物程序都经过了苏乔大学伦理委员会动物护理研究所的审查和批准。
1. 下午2.5 采样和有机化合物提取
注：下午2.5 收集于中国苏州市区，2015年8月1-7日，如前5日所述。
- 在 500 °C 消声炉中烘烤 47 mm 石英膜过滤器 2 小时，以去除有机成分。
- 将过滤器放到 PM2.5 取样器中，进行 24 小时的不间断取样。
- 取出过滤器，在室温下干燥 24 小时。
- 使用分析平衡对过滤器进行量化。
- 使用二氯甲烷作为溶剂19从过滤器中提取有机成分。
- 在 60 °C 的水浴和氮流中旋转蒸发，干燥 EOM。在 DMSO 中溶解 EOM，并在 -20 °C 下存储。
2. 斑马鱼胚胎收集和治疗
- 将斑马鱼保持在 28.5 ± 0.5 °C 的循环水产养殖系统中，具有 14 h 光和 10 h 深色光周期。
- 以2：1的雄性与雌性比例将健康的成年斑马鱼放入水箱中。
- 第二天，收集胚胎，用系统水（即斑马鱼繁殖水）清洗它们。
- 选择并随机将表现出正常发育（均匀大小、全粒和无卵子凝结）的斑马鱼胚胎分成4组，分别在直径为7厘米（每盘约50个胚胎）的玻璃培养皿中。
- 在 NAC 存在或不存在时，用 PM2.5 （5 毫克/升） 治疗胚胎，从 2 马力到 72 hpf 的 0.25 μM。使用 DMSO 作为车辆控制，最终浓度为 0.1% （v/v）。
3. 斑马鱼胚胎和心脏解剖的形态观察
- 在72马力，将胚胎转移到玻璃滑梯和立体显微镜下观察。记录心脏畸形，如腹膜水肿、循环改变和尺寸缩小。
- 计算畸形率（心脏缺陷的胚胎在总活胚胎中的百分比），并使用单向 ANOVA 分析组之间的差异，然后是土耳其的多重比较测试（p < 0.05 = 统计学意义）。
- 用0.6毫克/毫升MS-222麻醉胚胎，使其在玻璃滑梯上固定。
- 记录心跳30s和量化心率使用图像J软件5，20。
- 在立体显微镜下用一次性注射器针从斑马鱼胚胎中解剖心脏。注意：避免破坏心脏形状。
4. 免疫荧光检测
- 要使用免疫荧光检测检测斑马鱼胚胎心脏的PM2.5 诱导DNA损伤，请使用疏水屏障笔在干净的玻璃侧画一个圆圈。
- 将 50 μL 的 4% 副甲醛添加到 1.25 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，以形成固定解决方案。
- 将3颗解剖的心放入一个疏水屏障笔圈中，在室温下孵育20分钟。
- 在显微镜下将溶液除以在室温下干燥样品至少5分钟，使心脏完全附着在玻璃滑梯上。
- 在 PBS 中用 0.1% Tween 20 （PBST） 清洗幻灯片三次，每次洗 5 分钟。
- 将 50 μL 的牛血清白蛋白 （BSA） 添加到 1000 μL 的 PBST 中，以获得 5% 的 BSA 溶液，并在潮湿的腔室中孵育幻灯片 1 小时，以阻止非特定抗体结合。
- 将溶液除以每洗 5 分钟，然后用 PBST 清洗样品三次。
- 稀释 2 μL 的鼠标单克隆抗体对 8-OHdG 和 2 μL 的兔子多克隆抗体对 +H2AX 在 296 μL 的 PBST 获得一个工作的主要抗体鸡尾酒解决方案.
- 在室温下或在 4 °C 下过夜时，用 50 μL 的原发抗体鸡尾酒溶液在潮湿的腔室中孵育心脏样本，至少一小时（隔夜孵化可增加信号强度）。
- 将溶液除以每洗 5 分钟，然后用 PBST 清洗样品三次。
- 在 498 μL 的 PBST 中稀释 1 μL 的 FITC 标记山羊抗鼠二级抗体和 1 μL 的 cy3 山羊抗兔二级抗体，以获得有效的二级抗体鸡尾酒溶液，并在黑暗中用二级抗体（PBST 中的 1：500）孵育样品 1 小时。
- 将溶液除以，用 PBS 清洗样品三次，每次洗涤 5 分钟，不受光线照射。
- 在室温下将 20 μL 的 DAPI （4'，6-二恶英-2-苯林多）添加到样品中，用于核染色 30 分钟。
- 应用盖唇滑动，用指甲油密封，以防止干燥和移动。然后在荧光显微镜下对样品进行成像，然后使用 ImageJ 软件量化心脏区域的荧光信号。计算与 DMSO 控制样本的平均值的相对变化。确定数据在步骤 3.2 中的统计意义。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这种免疫荧光检测是测量暴露于环境化学物质的斑马鱼胚胎心脏蛋白质表达变化的一种敏感而具体的方法。
在这个具有代表性的分析中，在没有抗氧化剂NAC的情况下暴露于PM2.5的胚胎被评估为存在心脏畸形（图1）。观察到，与 DMSO 控制治疗的心脏相比，PM2.5导致心脏畸形发生显著增加，如心周水肿、循环改变和尺寸缩小。暴露于 EOM 的胚胎的心跳率也显著下降（图 1B）。NAC的加入显著减轻了EOM引起的心脏缺陷（图1）。
在这里，免疫荧光检测用于测量斑马鱼胚胎中的8-OHdG和+H2AX表达，以评估EOM处理组织DNA损伤的程度。如图2所示，与控制、DMSO治疗的心脏相比，用EOM组治疗的斑马鱼胚胎的8-OHdG和+H2AX表达水平显著增加，表明氧化DNA损伤和DNA双链断裂分别增加。此外，EOM引起的DNA损伤部分抵消了NAC补充（图2）。
图1。斑马鱼胚胎的心脏缺陷在72马力。 （A） 斑马鱼胚胎在72马力的图像。点线表示阿塔里亚（红色）或心室（蓝色）。秤吧，200μm。（B） 心脏畸形和心跳率。结果以平均± SEM 的形式呈现。每组至少检查了50个胚胎。EOM： EOM 在 5 毫克/升：NAC： NAC 在 0.25 μM.**，P < 0.01：， p<0.001 请点击这里查看这个数字的较大版本。
图2。72 hpf 的斑马鱼胚胎心脏的 DNA 损伤。 A） 免疫荧光染色。秤吧，100μm。B） 定量结果。结果以平均±SEM的形式提出。对每组至少15颗心脏进行了检查。EOM： EOM 在 5 毫克/升：NAC： NAC 在 0.25 μM。**;P < 0.01：***;p<0.001。请单击此处查看此图的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
虽然斑马鱼是研究环境化学物质心脏发育毒性的极好的脊椎动物模型，但由于胚胎心脏体积小，很难获得足够的蛋白质进行西方污点分析。因此，我们提出了一种敏感的免疫荧光方法，用于量化暴露在PM2.5下的斑马鱼胚胎心脏中DNA损伤生物标志物的蛋白质表达水平。
在解剖过程中，保持心脏的完整性是很重要的。根据我们的经验，在 72 hpf 下执行隔离相对容易。此外，心脏需要在收集后尽快投入固定解决方案。另一个关键步骤是干燥样品，以确保解剖的心完全附着在玻璃滑梯上。否则，样品可能会在标记过程中从幻灯片中冲走。
进行双免疫荧光染色，以检测孤立心脏中的 8-OHdG 和 +H2AX 信号。这种方法不仅节省了劳动力，允许使用减少的样本量，而且还有助于两个信号的共同定位。虽然这种基于抗体的方法不能检测活体胚胎中的荧光信号，但这种快速协议可用于检测孤立斑马鱼胚胎心脏中的蛋白质表达。
据经常报道，氧化应激调解PM2.5诱发DNA损伤8，9。过量的ROS生产可导致斑马鱼胚胎发育过程中的DNA损伤和凋亡21，22，23。正如我们之前在18日报道的那样，在接触EOM的斑马鱼胚胎的心脏中观察到增加的8-OHdG和+H2AX信号表达，这些胚胎的表情通过使用ROS清除剂NAC的治疗而显著抵消。值得注意的是，NAC并没有完全逆转PM2.5诱发的DNA损伤信号表达，表明氧化应激可能只部分导致接触PM2.5的斑马鱼胚胎心脏的DNA损伤。
最后，该方法使用一种灵敏的技术检测斑马鱼胚胎完整心脏中PM2.5 诱导DNA损伤。此外，该方法可用于检测暴露于其他环境化学物质的斑马鱼胚胎心脏的蛋白质表达变化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国自然科学基金会（资助编号：81870239、81741005、81972999）和江苏省高等学校优先学术项目发展的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520 (2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan. The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).
- Mesquita, S. R., et al. Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain). Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).
- Zhang, H., et al. Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).
- Duan, J., et al. Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model. Chemosphere. 180, 24-32 (2017).
- Lorda-Diez, C. I., et al. Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis. Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).
- Kouassi, K. S., et al. Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire. Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).
- Gualtieri, M., et al. Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5. Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).
- Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes. Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).
- Yamashita, M.
- Moazzen, H., et al. N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes. Cardiovascular Diabetology. 13, 46 (2014).
- Sun, S. Y. N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond. Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Asnani, A., Peterson, R. T. The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease. Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).
- Li, M., et al. Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish. Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).
- Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio). Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).
- Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. The Science of the Total Environment. 719, 135097 (2020).
- van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. An emerging consensus on cardiac regeneration. Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).
- Yue, C., et al. Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways. Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).
- Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).
- Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish. Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).
- Zhu, L., et al. DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio). Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).
