Summary
في هذا البروتوكول، ونحن نصف كيفية توليد المورين الأولية أحادية القولون الظهارية مباشرة من سرداب الأمعاء. نحن نقدم النهج التجريبية لتوليد monolayers التقاء على مرشحات نفاذية، monolayers التقاء لتضميد الجروح الصفر والدراسات الكيميائية الحيوية، و أحادية الطبقات متناثرة والتقاء لتحليل immunofluorescence.
Abstract
تتكون ظهارة الأمعاء من طبقة واحدة من الخلايا التي تعمل كحاجز بين تجويف الأمعاء وداخل الجسم. اضطراب في استمرارية هذا الحاجز يمكن أن يؤدي إلى اضطرابات التهابية مثل مرض التهاب الأمعاء. كان أحد القيود في دراسة البيولوجيا الظهارية المعوية هو عدم وجود نماذج أولية زراعة الخلايا ، مما اضطر الباحثين إلى استخدام خطوط الخلايا النموذجية المستمدة من الأورام. وقد أعطى ظهور المعويات ثلاثية الأبعاد (3D) علماء الأحياء الظهارية أداة قوية لتوليد ثقافات الخلايا الأولية ، ومع ذلك ، فإن هذه الهياكل مضمنة في مصفوفة خارج الخلية وتفتقر إلى سمة النضج للخلايا الظهارية المعوية المتمايزة. وقد نشرت عدة تقنيات لتوليد monolayers الظهارية المعوية، ولكن معظمها مستمدة من enteroids 3D المنشأة مما يجعل العملية شاقة ومكلفة. هنا نحن نصف بروتوكول لتوليد أحاديات القولون الظهارية الأولية مباشرة من سرداب الأمعاء مورين. نحن أيضا تفاصيل النهج التجريبية التي يمكن استخدامها مع هذا النموذج مثل توليد الثقافات التقاء على مرشحات نفاذية، أحادية التقاء لدراسات التئام الجروح الصفر و أحادية متناثرة والتقاء لتحليل immunofluorescence.
Introduction
الخلايا الظهارية المعوية (IEC) خط الأمعاء تشكيل حاجز نفاذية انتقائية التي تسمح امتصاص المواد الغذائية والمياه في حين منع الكائنات الحية الدقيقة والسموم لدخول الجسم 1. تتكون الغشاء المخاطي المعوي من إسقاطات مضيئة تسمى الزغب (موجودة فقط في الأمعاء الدقيقة) والتشنجات المسماة سرداب. وتغطي سيلي وسطح سرداب القولون من قبل الخلايا الظهارية المتمايزة في حين أن قاعدة السراديب تتكون من الخلايا الجذعية التي تجعل التجديد السريع للظهارة المعوية، والتي لديها دوران من 3 إلى 7 أيام. الخلايا الجذعية المعوية (ISC) ليست مهمة فقط للحفاظ على التوازن الأمعاء ولكن لإصلاح كاف من الظهارة التالفة2.
كانت دراسة بيولوجيا الظهارة المعوية محدودة بسبب عدم وجود ثقافات الخلايا الأولية مع خطوط الخلايا المحولة كونها الأداة الوحيدة المتاحة. خطوط الخلايا الظهارية المعوية ليست قادرة على تكرار بدقة فسيولوجيا الظهارة المعوية العادية. تطوير الثقافات ثلاثية الأبعاد المستمدة من مركز خدمات التصلب العصبي الداخلي قدمت علماء الأحياء المخاطية المعوية مع نماذج في المختبر التي تشبه في ظروف المخاطية الأمعاء في الجسم الحي3. يمكن عزل السراديب بسهولة من عينات مورين ، جزءا لا يتجزأ من وسط مصفوفة غشاء الطابق السفلي (على سبيل المثال ، Matrigel) وتزرع في وسائط مكيفة تحتوي على Wnt3a ، R -spondin ، و Noggin ، مما يولد هياكل ثلاثية الأبعاد تعرف باسم enteroids (الأمعاء الدقيقة) أو colonoids (الأمعاء الغليظة)4. المعويات والقولونات هي هياكل كروية مستقطبة حيث يواجه المجال apical تجويف داخلي والمنطقة القاعدية على اتصال مباشر مع المصفوفة خارج الخلية. Enteroids و colonoids تحتوي على جميع الأنواع الفرعية الظهارية المعوية المتمايزة الرئيسية مثل Enterocytes / Colonocytes ، Paneth ، Enteroendocrine وخلايا Goblet وتظهر بنفس النسب نسبيا كما هي الحال في قسم القناة الهضمية حيث تم عزلها من5. على الرغم من أن المعويات 3D والقولون تمثل تقدما كبيرا في دراسة التطور المعوي وعلم وظائف الأعضاء، وهذه النماذج تمثل بعض العيوب مثل الوصول المحدود إلى السطح apical من الخلايا الظهارية (التجويف) والقدرة على توسيع نطاق الثقافات صعودا أو أسفل لتحقيق فحص الإنتاجية العالية من الجزيئات ذات الأهمية. للتغلب على هذه القيود، تم إنشاء بروتوكولات للحصول على الثقافات 2D الأولية من IEC المستمدة من enteroids 3D / colonoids. 2D enteroids / colonoids تنمو ورقة من الخلايا تماما كما تفعل خطوط الخلايا النموذجية ومثالية لدراسة إصلاح الجروح المعوية ، والتفاعلات المضيفة الممرضة ، والطب التجديدي من بين أمور أخرى. تصف العديد من الأوراق المنشورة كيفية توليد أحاديات الأبعاد 2D من هياكل ثلاثية الأبعاد أو مباشرة من سرداب الأمعاء ، (انظر6،7،8،9،10،11)ولكن هذه الأساليب تميل إلى أن تكون كثيفة العمالة ويصعب إعادة إنتاجها. يتم تحديد طريقة سريعة وبسيطة وقابلة للاستنساخ للحصول على طبقات أحادية مباشرة من سرداب الأمعاء الماوس معزولة حديثا في هذا البروتوكول.
هنا نشرح بالتفصيل عملية استخراج سرداب مع الحد الأدنى من توليد الحطام، واختيار مصفوفة خارج الخلية والأسطح والتطبيقات المختلفة لهذه التقنية. تم تحسين هذا النهج التجريبي لأ وسرداب القولون ، ولكن يتم الحصول على نتائج مماثلة عند تطبيقها على الأمعاء الدقيقة.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات المذكورة أدناه وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعة ميشيغان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.
1. إعداد الكواشف لعزل سرداب والثقافة (إعداد في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة)
- 50 مللي متر إيثيلينديامين حمض رباعي الأسيتيك (EDTA): إضافة 50 مل 0.5 M المخزون إلى 450 مل من الفوسفات المالحة المخزنة، دون الكالسيوم (Ca2+) والمغنيسيوم (ملغ2 +) لإعداد 500 مل. في هذا البروتوكول سوف يشير برنامج تلفزيوني إلى برنامج تلفزيوني دون الكالسيوم والمغنيسيوم ما لم يذكر خلاف ذلك.
- هز العازلة: حل 7.4 غرام السكروز (43.3 mM) و 5 غرام سوربيتول (54.9 mM) في برنامج تلفزيوني لإعداد 500 مل.
- L-WRN (L-Wnt-3A، R-spondin و Noggin) وسائل الإعلام: تكملة متقدمة Dulbecco النسر المعدلة المتوسطة / هام F-12 (DMEM/F12) (780 مل) مع 20٪ مصل البقر الجنيني (FBS) (200 مل), 1x ملحق الجلوتامين المتاحة تجاريا (10 مل), 100 U/mL البنسلين و, 100 غرام / مل ستربتومايسين (10 مل) ، ومرشح تعقيم مع مرشح 0.22 ميكرومتر.
- الحصول على خلايا L-WRN من خلال ATCC، وتنمو في قوارير T175، واختيار باستخدام Geneticin وهيغروميسين. يتم تغيير الوسائط وجمعها لمدة 12 يوما.
ملاحظة: يتم اختبار كل دفعة من الوسائط لنشاط WNT باستخدام اختبار TOPflash Wnt Reporter. في هذه الحالة تم اتباع بروتوكولات مختبر نمذجة الأنسجة التحويلية للطب في ميشيغان (https://www.umichttml.org/protocols). ويزرع خط الخلية TOPflash HEK 293 إلى التقاء في قارورة T75، جرب ومطلي على لوحة 96 جيدا. في اليوم التالي يتم إضافة تخفيفات مختلفة من الوسائط التي تم جمعها إلى الخلايا واحتضانها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، يتم الانتزاع الخلايا ، ويتم إجراء فحص اليراعة لوسيفيراز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يتم تطبيع المقايسة باستخدام Wnt-3A المؤتلف. وينقسم إلى وسائل الإعلام 25 مل aliquots في أنابيب مخروطية 50 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- الحصول على خلايا L-WRN من خلال ATCC، وتنمو في قوارير T175، واختيار باستخدام Geneticin وهيغروميسين. يتم تغيير الوسائط وجمعها لمدة 12 يوما.
- الوسائط الأساسية: ل 500 مل, تكملة متقدمة DMEM/F12 (448 مل) مع 2x تكملة الجلوتامين المتاحة تجاريا (10 مل), 20 م م HEPES (10 مل), 100 U/mL البنسلين و, 100 غرام/مل ستربتومايسين (10 مل)، 2 م ن أسيتيل-L-السيستين (2 مل)، N2 الملحق (10 مل) و B27 الملحق (20 مل)، تصفية تعقيم مع مرشح 0.22 ميكرومتر. تقسيم وسائل الإعلام إلى 25 مل aliquots في أنبوب مخروطي 50 مل وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- وسائط كاملة LWRN: الجمع بين 25 مل LWRN وسائل الإعلام مع 25 مل من وسائل الإعلام الأساسية والملحق مع 200 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF) (20μL) و 2x المضادات الحيوية المضادة لليميكوتيك حل (1 مل). تخزين الوسائط كاملة عند 4 °C.
- الكولاجين واللامينين: حل 5 ملغ مسحوق في 5 مل من مرشح تعقيم 100 mM حمض الخليك (إضافة 60 ميكرولتر من مخزون حمض الخليك إلى 9.94 مل من الماء الصف الجزيئي) لإنتاج تركيز المخزون من 1 ملغم / مل. تدوير في 4 درجة مئوية لمدة 4 ساعة وجعل 100 μL aliquots في أنابيب 0.2 مل. تجميد عند -20 درجة مئوية. يتم شراء اللامينين بتركيز مخزون قدره 100 ميكروغرام /مل.
- وسائط كاملة بدون عوامل نمو (CMGF-): ملحق متقدم DMEM/F12 (500 مل) مع ملحق الجلوتامين 1x المتاح تجاريا (5 مل)، 10 mM HEPES (5 مل)، 100 U/mL البنسلين، و، 100 غرام / مل ستريبتوميسين (5 مل).
- وسائط التمايز: إلى 9.2 مل من وسائط CMGF، أضف 200 ميكرولتر من ملحق B27، و100 ميكرولتر من ملحق N2، و20 ميكرولتر من N-أسيتيل-L-cysteine، و500 ميكرولتر من وسائط Noggin12 (مصنوعة من الخلايا المنتجة ل Noggin) و2 ميكرولتر من EGF لصنع 10 مل من الوسائط المتمايزة.
2. إعداد لوحات، والشرائح غرفة وإدراج غشاء ثقافة الخلية
- طلاء لوحة 48 جيدا والشرائح غرفة للطلاء 2D monolayer: استخدام محلول الطلاء الذي يشكل صفمين (1:40 التخفيف، انظر جدول المواد) والكولاجين (1:30 التخفيف) في الفوسفات البارد دولبيكو المخزنة المالحة، مع Ca2 + و Mg2 + (DPBS). أضف 200 ميكرولتر من محلول الطلاء إلى كل بئر واحتضن الشريحة قبل اللوحة/الحجرة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.
- طلاء 0.4 ميكرومتر إدراج غشاء زراعة الخلية: جعل 1:30 تخفيف الكولاجين في الماء الصف الجزيئي وإضافة 200 ميكرولتر لكل إدراج. الحفاظ على لوحة تحتوي على إدراج الغشاء على الجليد في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة حضانة، والحفاظ على لوحة في حاضنة2 CO 5٪ في 37 درجة مئوية لمدة 1.5-2 ساعة. البوليستر والغشاء البولي كربونات إدراج تسفر عن نتائج مماثلة.
ملاحظة: يمكن أن تكون البذر أي لوحة زراعة الأنسجة (يمكن إجراء صعودا وهبوطا) باستخدام هذا البروتوكول عن طريق ضبط حجم الكولاجين / صفح للحصول على تغطية كاملة من سطح الطلاء.
3. عزل سرداب
ملاحظة: قبل البدء في تشريح، وإعداد الكولاجين و / أو صفيحة مغلفة لوحة / إدراج غشاء / الشريحة غرفة وتركها في حاضنة2 CO 5٪ في 37 درجة مئوية. إعداد مقعد عمل نظيف وأدوات جراحية معقمة مناسبة للجراحة ، وخزانة سلامة بيولوجية لزراعة أحاديات الأبعاد. تأكد من أن جميع المعدات القياسية الأخرى لزراعة أحادية الطبقة 2D مثل حاضنة CO2 الرطبة ، وأجهزة الطرد المركزي على سطح الطاولة (التي يتم الحفاظ عليها عند 4 درجات مئوية) والمجهر والمواسير (بما في ذلك المواسير المصلية) جاهزة.
- استخدام C57Bl/6 الفئران، 8-12 أسابيع من العمر. قتل الفئران باستخدام طريقة معتمدة للقتل الرحيم.
- رش جثث الفئران بمحلول الإيثانول بنسبة 70٪ (EtOH) لتنظيف منطقة التشريح وإزالة EtOH الزائد باستخدام الأنسجة الورقية.
ملاحظة: تأكد من أن تظل سراديب العزل سرداب (مثل PBS، 50 mM EDTA، المخزن المؤقت اهتزاز) الباردة. يمكن تحضير هذه الكواشف قبل يوم واحد وهي جيدة للاستخدام لمدة 3 أشهر على الأقل عند تخزينها عند 4 °C. أيضا، تأكد من أن يتم الاحتفاظ وسائط كاملة LWRN في حمام حبة / الماء الحفاظ على 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. - باستخدام مقص تشريح نظيفة والملقط، تشريح القولون من المستقيم إلى الكوم. عقد نهاية القولون باستخدام ملقط وتدفق بلطف جدا قبالة البراز باستخدام الجليد البارد PBS في حقنة 10 مل، مزودة أنبوب التغذية 20 G (الشكل 1A). تأكد من عدم تمزق القولون.
- إزالة القولون القريبة. سيكون هذا الجزء من القولون الأقرب إلى تقاطع اليوسكال.
- مع ملقط، الشريحة القولون البعيدة بلطف على أنبوب التغذية 20 G، ربط قبالة القولون في نهاية الأنبوب من طرف مع 4-0 خيوط الحرير(الشكل 1B).
- عكس القولون من الداخل الى الخارج باستخدام أصابع المرء على نهاية تعادل قبالة وربط الطرف الآخر مع 4-0 خيوط الحرير خياطة. باستخدام مقص الجراحية، وقطع القولون تحت غيض من أنبوب التغذية (الشكل 1C،D، E).
- باستخدام المكبس من حقنة تكرار 1.25 مل، افتح بلطف الطرف غير المربوط من القولون المقلوب على طرف حقنة مكررة سعة 1.25 مل. الشريحة القولون مقلوب على نهاية الحقنة وربطة عنق بإحكام مع خيط خياطة الحرير 4-0 (الشكل 1F، G).
- أدخل المكبس في الحقنة ونفخ القولون لتشكيل النقانق. تضخيم حتى النقانق القولون تبدو عكر مع عدم وجود التجاعيد مرئية (الشكل 1H).
- وضع حقنة / القولون في أنبوب 15 مل مع 5 مل من حل استعادة الخلية على الجليد لمدة 20 دقيقة، تضخيم وتفريغ القولون مرة واحدة كل 5 دقائق (الشكل 1I). يجب أن يبقى السجق مضخمة أثناء الحضانة.
- التعادل قبالة باستخدام 4-0 خيوط الحرير تحت غيض من حقنة تكرار مع تضخم القولون. قطع النقانق من الحقنة المتكررة ومكان في أنبوب 15 مل تحتوي على 10 مل من 50 م م (2mM للأمعاء الدقيقة) EDTA لمدة 40 دقيقة وتدوير في 4 °C (الشكل 1J, K).
- Decant قبالة حل EDTA واستبدالها مع 5 مل من اهتزاز العازلة. يهز النقانق يدويا في وضع عمودي (بقوة) لمدة 2 دقيقة.
- decant حل اهتزاز في أنبوب جديد 15 مل وتكرار خطوة اهتزاز لما مجموعه 10 مل من سرداب في هز العازلة.
- خذ 20 ميكرولتر من تعليق سرداب في طبق بيتري وعدد من سرداب تحت المجهر. حساب تركيز سرداب في سرداب / μL. اعتمادا على التركيز، وتمييع العينات للحصول على 5 سرداب / ميكرولتر في لحظة الطلاء (1000 سرداب / سم2).
- قم بتدفير الأنبوب باستخدام سرداب معزولة باستخدام جهاز الطرد المركزي على الطاولة عند 400 × ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- في غضون ذلك، قم بإزالة شريحة لوحة/إدراج/غرفة ذات 48 بئرا من الحاضنة ووضعها في خزانة السلامة البيولوجية. يستنشق محلول الطلاء باستخدام P200 وترك لوحة مع غطاء تعويض قليلا حتى الخلايا على استعداد لتكون مطلية.
4. زراعة أحادية الطبقة 2D
ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصل حول كيفية توليد أحاديات الظهارية المعوية من colonoids 3D التحقق من بروتوكولات من قبل مختبرات إستيس وKovbasnjuk (7،11).
- إزالة المخزن المؤقت اهتزاز باستخدام ماصة المصلية 10 مل. تأكد من أن بيليه سليمة، وربما باستخدام P1000 لإزالة أي السائل اليسار. إعادة تعليق بيليه في 3 مل من وسائل الإعلام LWRN كاملة وماصة صعودا وهبوطا مع P1000. أضف 200 ميكرولتر من سرداب إلى كل بئر من شريحة لوحة/حجرة مغلفة مسبقا 48 بئرا واحتضنها فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ عند 37 درجة مئوية.
- في اليوم التالي يستنشق وسائل الإعلام باستخدام P200 وإضافة وسائط جديدة. تصبح الخلايا التقاء في 24-48 ساعة.
- لإدراج غشاء زراعة الخلية، أضف 200 ميكرولتر من سردابات (5 سرداب/ميكرولتر) إلى أعلى الإدراجات و600 ميكرولتر من وسائط L-WRN الكاملة إلى الجزء السفلي. في اليوم التالي يستنشق وسائل الإعلام باستخدام P200 وإضافة وسائط جديدة فقط إلى الغرفة العليا. احتضان اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ في 37 درجة مئوية. يتم قياس المقاومة الكهربائية عبر الإبط (TEER) كل يوم باستخدام مقياس فولت/أوم الظهاري (EVOM).
ملاحظة: إذا كان للثقافة قراءة TEER أكبر من 300 Ω.cm2، فهي من المفترض أن تكون التقاء. يتحقق الالتقاء في 3-4 أيام. تغيير الوسائط كل يومين.
Representative Results
لتوضيح موثوقية ثقافات أحادية القولون الظهارية الأولية ، يتم عرض ملخص لعزل سرداب والصور التمثيلية المستمدة من البروتوكول. يجب أن يكون لدى المستخدم في الاعتبار أن سرداب معزولة يتم استزراعها في ظروف معقمة ، لذلك فإن تشريح القولون وتنظيفه بشكل صحيح هو أولوية. الشكل 1 ملامح الخطوات الرئيسية أثناء عزل سرداب. يتم الآن عد سرداب معزولة(الشكل 2A)وتتركز (الشكل 2B) للحصول على تركيز 5 سرداب / ميكرولتر. بعد إعداد مركزة من سرداب، سيتم مطلي الخلايا في الشكل المطلوب (طبق الثقافة، إدراج الغشاء أو الشرائح غرفة) واحتضان مع وسائل الإعلام المناسبة اعتمادا على الاحتياجات التجريبية. ويبين الشكل 3 تطور الثقافة بعد 24 و 48 ساعة من الثقافة في لوحات 48 بئرا. يتم احتضان الخلايا حتى يتم الوصول إلى التقاء المطلوب. ولتجسيد التطبيقات الممكنة لهذه الطريقة، سمحنا لآبار صفائح 48 بئرا بالوصول إلى الالتقاء وشرعنا في إجراء فحص للجرح الصفري. يصور الشكل 4 خدشا تم إنشاؤه حديثا (الشكل 4A) في طبقة أحادية القولون 2D ونفس الجرح بعد 24 ساعة (الشكل 4B). ومن الواضح أن الثقافة لا تزال صحية وقابلة للحياة وهناك إصلاح الجرح. لإنشاء طبقات أحادية مختلفة، يتم تغيير الوسائط من LWRN إلى وسائط التمايز. ويتحقق التمايز من خلال إظهار قيم TEER عالية (الشكل 5A)، وانخفاض علامات مركز خدمات المشاريع ((Leucine الغنية تكرار التي تحتوي على البروتين G إلى جانب مستقبلات 5 (Lgr5) وAchaete-scute مثل 2 (Ascl2)) وزيادة علامات التمايز ((ألانيل) أمينوببتيداز (أنبيب)، موسين 2 (Muc2)، ليسوزيم 1 (Lyz1)، السكروز ايزو مالطا (سيس) وChrmogranin A (Chga)) (الشكل 5B، C) بواسطة PCR. علامات أخرى كما CDX2 و KRT20 ويمكن أيضا أن تدرج في هذه اللوحة. بالإضافة إلى مستويات التعبير مرنا, يظهر أيضا ظهور أنواع فرعية من الخلايا الظهارية المتمايزة في colonoids 2D نمت في ظروف التمايز من قبل immunofluorescence (Muc2 وتشغا; الشكل 5D).
الشكل 1:إعداد عينة لتوليد monolayers صحية. إعداد العينة أمر بالغ الأهمية لتوليد monolayers صحية. يتم تصوير الخطوات الرئيسية لعملية العزل في هذا الشكل لتسهيل الأمر على القارئ. يتم استئصال القولون من الماوس، والتأكد من عدم وجود بقايا الفراء. إزالة البراز بعناية التأكد من أنك لا ثقب القولون; هذا أمر بالغ الأهمية حيث أن القولون يحتاج إلى أن يكون قادرا على الاحتفاظ بالهواء وتضخيمه وانكماشه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سرداب العزل العد والتركيز. (أ) سرداب القولون بعد هز النقانق القولون. تصور الصورة حقلا قطرة 20 ميكرولتر. (ب) تركيز سرداب من أجل الحصول على 5 سرداب / μL. شريط مقياس: 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الأولية IEC نمو Monolayer. (A) 2D IEC monolayers بعد 24 ساعة من الطلاء وإزالة حطام الخلية. (ب) التقاء 2D IEC monolayers 48 ساعة بعد الطلاء. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:اختبار الجرح الصفر باستخدام المورين الأولية IEC. صور تظهر التئام الجروح بعد خدش تم إجراؤه في أحادي القولون الظهاري. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:التمييز بين طبقات القولون الظهارية الأحادية. (A) وسائل الإعلام التمايز يخلق حواجز ظهارية ضيقة كما يتضح من TEER. وسائل الإعلام التمايز يسبب انخفاض في التعبير مرنا من (ب) علامات الخلايا الجذعية و upregulation من (C) علامات التمايز. (د)علامات الخلايا الظهارية المتميزة المتخصصة مثل Muc2 وChromogranin-A يمكن أيضا الكشف عن طريق الفلورة المناعية للقولونات 2D المباشرة. شريط المقياس: 5 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يوفر بروتوكولنا طريقة سريعة وقابلة للاستنساخ وموثوقة لتوليد طبقات أحادية أولية مباشرة 2D IEC. واحدة من الاختلافات الرئيسية في بروتوكولنا مقارنة مع البروتوكولات المنشورة سابقا لتوليد monolayers الظهارية القولون هو أننا لا قطع القولون في قطع صغيرة لتحرير السراديب. بدلا من ذلك، قمنا بتكييف بروتوكول لفصل ظهارة الأمعاء من mesenchyme13 بواسطة مزيج من القوى الكيميائية والميكايكية لإطلاق سرداب في إعداد نظيف للغاية،(الشكل 2)،وتوفير الباحث مع المواد المثالية لتوليد الثقافات الأولية. يمكن استخدام طريقة العزل لدينا أيضا لتوليد enteroids 3D والقولون. من المهم القيام بعدد سرداب في كل مرة يتم فيها إجراء تجربة لتطبيع عدد سرداب التي يتم صفيحها. المتغيرات مثل تورغور نقانق القولون، وسرعة العزلة، وخبرة المستخدم يمكن أن تؤثر على عدد من سرداب معزولة. إن تركيز سرداب الطلاء المقترح المذكور في البروتوكول هو نقطة انطلاق ، ولكن يجب على كل مستخدم لحساب المتغيرات التي يحركها المستخدم تحسينه. لقد استخدمنا هذه التقنية مع الفئران WT الذكور والإناث تتراوح بين 8 إلى 20 أسبوعا، ونحن لم نر اختلافات كبيرة في بقاء الخلية، من الناحية النظرية سرداب معزولة عن الفئران الأصغر سنا لديها فرص أفضل للبقاء على قيد الحياة. يتم صفيح سرداب في الزائدة كما نسبة صغيرة فقط منهم نعلق على السطح والبقاء على قيد الحياة. التوازن حيث هناك ما يكفي من السراديب أن يكون لها التقاء 50٪ بعد يوم واحد من الطلاء ولكن ليس الكثير من سرداب حيث السرداب الموت سيكون لها تأثير السامة للخلايا هو الهدف. يجب إزالة وسائط LWRN بعناية بعد 24 ساعة من الطلاء للقضاء على سرداب وحطام ميت ، ويجب أن يتم ذلك بعناية لتجنب فصل الخلايا التي تنمو بالفعل كقاتل أحادي.
بعد الإزالة الأولية لوسائط LWRN ، يجب على المستخدم أن يقرر ما إذا كانت الظروف التجريبية تتطلب طبقات أحادية أساسية في IEC تبقى أقرب إلى الخلايا الجذعية وإضافة وسائط LWRN جديدة أو إذا كان التمايز بين الطبقة الأحادية مرغوبا فيه ، واستبدالها بوسائط تمايز. العامل الوحيد الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو ضمان سلامة القولون أثناء عملية العزل. إذا حدث تمزق، يمكن تقصير النقانق للقضاء على المنطقة المتضررة. قبل وضع النقانق في EDTA تأكد من أن العقد ضيقة قدر الإمكان. إذا تم تفريغ النقانق بعد حضانة EDTA يمكن الاستمرار في البروتوكول مع تأثير ضئيل أو معدوم في العائد العام سرداب. إذا لم تكن الحقنة المتكررة متوفرة ، يمكن أيضا استخدام طرف ميكروبايت منتظم متصل بحقنة منتظمة لعملية التضخم والانكماش. أيضا، إذا لم يكن هناك حل استعادة الخلية المتاحة، يمكن القيام به التضخم والانكماش الخطوات في EDTA (2mM الأمعاء الدقيقة، 50 mM القولون)، ولكن لا ينصح هذا الاستبدال. إذا لم يكن هناك حاجة إلى التقاء، يمكن أن تنمو سرداب في لوحات المغلفة فقط مع الكولاجين وحتى في لوحات غير المصقول. فقط استخدام الحالات لوحات غير المصقول لا يوجد خيار آخر، ولكن الخلايا لن تنمو صحية كما هو الحال في لوحات المغلفة بالكولاجين. عندما يتعلق الأمر بالصحة الثقافية والاستقرار، فإن الطبقات الأحادية المطلية بالبلاستيك صحية لمدة 4 إلى 5 أيام في حين يمكن حمل الطبقات الأحادية المطلية في transwells لمدة تصل إلى 8 أيام.
واحدة من القيود الرئيسية لهذه الطريقة هي وسائط الخلية المطلوبة لزراعة أحاديات القولون الظهارية. تتوفر خلايا LWRN في ATCC ، ولكن توليد الوسائط المكيفة LWRN كثيف العمالة ويتطلب الوصول إلى مطياف فلوري لتحديد نشاط Wnt. تتطلب وسائط التمايز عددا من الكواشف التي يتم إضافتها طازجة قبل الاستخدام ، مما يجعلها عملية مملة. وأخيرا، فإن معظم هذه الكواشف مكلفة وسهلة لحرق الكواشف بوتيرة سريعة. إذا كان المختبر يرغب في إنشاء هذه التقنية دون ثقافة الخلايا الأولية المعوية السابقة ، فمن المستحسن للغاية العثور على متعاون / كلية لديه خبرة وتدريب أحد أعضائه.
يمكن أن تكون صيانة الثقافة ثلاثية الأبعاد مكلفة بسبب تكلفة مصفوفة غشاء الطابق السفلي المتوسطة والأحجام العالية من الوسائط المكيفة اللازمة للثقافات العضوية ، ولكن لديها ميزة استخدام عدد أقل من الفئران ويمكن تمرير الهياكل المولدة عدة مرات. المعويات (المستمدة من الأمعاء الدقيقة) من السهل نسبيا لعزل والحفاظ على حين القولون هي أكثر حساسية، وتنمو بوتيرة أبطأ ولها قدرة مرور أكثر محدودية. جيل أحادي الطبقة من colonoids 3D تتطلب كمية غير متناسبة من الهياكل 3D، التي تجعل هذه الأنواع من التجارب تستغرق وقتا طويلا ومكلفة. على العكس من ذلك، الإعدادية القولون الظهارية مباشرة أحادية الطبقة سريع وطريقة سريعة للحصول على النتائج. يمكن أن تولد الإعدادية القولون واحد منطقة التقاء من 75 سم2 (10 إلى 15 مل من وسائل الإعلام مشروطة، يستبدل مرة واحدة) 2 إلى 3 أيام بعد الطلاء (هذه المنطقة تتطلب 144 بئرا من colonoids 3D، وهو ما يعني ما يقرب من 6mL من Matrigel وأكثر من 250 مل من وسائل الإعلام مشروطة). انخفاض استهلاك وسائل الإعلام، وانخفاض تكلفة الحفاظ على ثقافة الخلية والقدرة على إجراء اختبارات وظيفية ومعالجة المصب السريع هي مزايا كبيرة من monolayers القولون الظهارية.
هذا البروتوكول هو أداة قيمة في دراسة بيولوجيا الخلايا الظهارية المعوية في مجالات مثل التصاق الخلايا، والقطبية، والتمايز. فهو يعطي ميزة لتوليد ثقافات الخلايا الأولية من الفئران المعدلة وراثيا (خروج المغلوب، التعبير المفرط، المراسلين). تسمح الطبقات الأحادية الظهارية المعوية الأولية بسهولة الوصول إلى الأسطح القاعدية والبازلية (عندما تكون مطلية على transwells) مما يسمح بدراسة النفاذية والحاجز والهجرة عبر الظهارية لأنواع مختلفة من الخلايا. وأخيرا، يمكن أن يكون هذا النموذج مفيدا في مجالات مختلفة مثل تفاعلات مسببات الأمراض المضيفة، والضرر الظهاري، والإصلاح واكتشاف الأدوية.
Disclosures
ولا يوجد لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال جائزة التطوير الوظيفي لمؤسسة كرون والتهاب القولون (544599 ، إلى MQ) ومنح المعاهد القومية للصحة (DK055679 ، DK089763 ، DK059888 ، إلى AN). نود أن نشكر مختبر ميشيغان لنمذجة الأنسجة المترجمة للطب على مساعدتهم المستمرة والوصول إلى الكواشف والبروتوكولات الخاصة بهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Antibiotic Antimycotic solution | Corning | 30-004CI | |
| B27 supplement (50X) | Gibco | 12587-010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen from human placenta (type IV) | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| D-Sorbitol | Sigma | 85529-250G | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Epithelial Volt/Ohm meter | World Precision Instruments | 0-10KΩ with STX2 (EVOM2) | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Lonza | 51201 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-016-CV | |
| Firefly Luciferase assay | Biotium | 30085-2 | |
| Geneticin | Gibco | 10131-035 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES (1M) | Corning | 25060CI | |
| Human recombinant EGF | R&D systems | 236-EG | Stock Concentration: 500µg/mL |
| Human recombinant Wnt-3A | R&D systems | W3a-H-005 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| LWRN cells | ATCC | CRL-3276 | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CV | |
| N2 supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock Concentration: 500mM |
| Noggin | Conditioned media | - | |
| Nunc Lab-Tek Chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182-1PAK | |
| Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL) | Corning | 30002CI | |
| Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic 20G feeding tube | Fisher Scientific | 50-810-46 | |
| rh-laminin-521 | Gibco | A29248 | Stock concentration: 100µg/mL |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD | Fisher Scientific | NC9452680 | |
| TOPflash HEK293 cells | ATCC | CRL-3249 | |
| Transwell Permeable supports (0.4µm) | Corning | 3470 |
References
- Quiros, M., Nusrat, A. Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair. Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).
- Blutt, S. E., et al. Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).
- Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications. Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Cardenas, D., et al. Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium. Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Zou, W. Y., et al. Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections. Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Nik, A. M., Carlsson, P. Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme. Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).
