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Biology

आंतों के क्रिप्ट्स से मुरीन प्राइमरी कोलन एपिथेलियल मोनोलेयर्स की पीढ़ी

Published: February 6, 2021 doi: 10.3791/62156
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, School of Medicine, University of Michigan

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम बताते हैं कि आंतों के क्रिप्ट्स से सीधे मुरीन प्राथमिक एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर कैसे उत्पन्न करें। हम पारमीय फिल्टर पर कॉन्फ्ल्यूरेंट मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं, खरोंच घाव भरने और जैव रासायनिक अध्ययनों के लिए कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए विरल और कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर।

Abstract

आंतों के एपिथेलियम में कोशिकाओं की एक परत शामिल होती है जो आंत ल्यूमेन और शरीर के इंटीरियर के बीच एक बाधा के रूप में कार्य करती है। इस बाधा की निरंतरता में व्यवधान के परिणामस्वरूप भड़काऊ आंत्र रोग जैसे भड़काऊ विकार हो सकते हैं। आंतों के एपिथेलियल जीव विज्ञान के अध्ययन में सीमाओं में से एक प्राथमिक सेल संस्कृति मॉडल की कमी रही है, जिसने शोधकर्ताओं को कार्सिनोमा से प्राप्त मॉडल सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए बाध्य किया है। तीन आयामी (3 डी) एंटरॉइड के आगमन ने एपिथेलियल जीवविज्ञानियों को प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण दिया है, फिर भी, ये संरचनाएं बाहकालीन मैट्रिक्स में एम्बेडेड हैं और विभेदित आंतों के एपिथेलियल कोशिकाओं की परिपक्वता विशेषता की कमी है। आंतों के एपिथेलियल मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए कई तकनीकें प्रकाशित की गई हैं, लेकिन अधिकांश प्रक्रिया को श्रमसाध्य और महंगा बनाने वाले 3 डी एंटरॉइड से प्राप्त होते हैं। यहां हम मुरीन आंतों के तहखानों से सीधे प्राथमिक एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों का भी विस्तार करते हैं जिनका उपयोग इस मॉडल के साथ किया जा सकता है जैसे कि पारमीय फिल्टर पर कॉन्फ्ल्यूंट संस्कृतियों की पीढ़ी, खरोंच घाव भरने के अध्ययन के लिए एकाठ मोनोलेयर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए विरल और कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर।

Introduction

आंतों की एपिथेलियल कोशिकाएं (आईईसी) आंतों को एक चुनिंदा पारमी बाधा बनाती हैं जो सूक्ष्मजीवों और विषाक्त पदार्थों को शरीर में प्रवेश करने से रोकते समय पोषक तत्व और पानी अवशोषण की अनुमति देती है 1। आंतों के म्यूकोसा चमकदार अनुमानों से बना है जिसे विली (केवल छोटी आंत में मौजूद) कहा जाता है और क्रिप्ट्स नाम के इनवेजिनेशन हैं। विली और कोलन क्रिप्ट्स की सतह विभेदित एपिथेलियल कोशिकाओं द्वारा कवर की जाती है जबकि क्रिप्ट्स के आधार में स्टेम सेल शामिल होते हैं जो आंतों के एपिथेलिया का तेजी से नवीकरण करते हैं, जिसका कारोबार 3 से 7 दिनों तक होता है। आंतों के स्टेम सेल (आईएससी) न केवल आंत होमोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं बल्कि क्षतिग्रस्त एपिथेलिया2की पर्याप्त मरम्मत के लिए हैं।

आंतों एपिथेलिया जीव विज्ञान का अध्ययन प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों की कमी से सीमित था, जिसमें परिवर्तित सेल लाइनें एकमात्र उपकरण उपलब्ध थीं। आंतों के एपिथेलियल मॉडल सेल लाइनें सामान्य आंतों के एपिथेलियम के शरीर विज्ञान को सटीक रूप से दोहराने में सक्षम नहीं हैं। आईएससी से प्राप्त 3 डी संस्कृतियों के विकास ने आंतों के म्यूकोसल जीवविज्ञानियों को इन विट्रो मॉडल प्रदान किए जो वीवो आंत म्यूकोसलस्थितियोंमें समान हैं। क्रिप्ट्स को आसानी से मुरीन नमूनों से अलग किया जा सकता है, जो तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम (जैसे, मैट्रिक्स) में एम्बेडेड होता है और वातानुकूलित मीडिया में उगाया जाता है जिसमें Wnt3a, आर-स्पॉन्डिन और नोगिन होते हैं, जो एंटोॉइड (छोटी आंत) या कोलोनॉइड (बड़ी आंत)4के रूप में जाना जाता है। एंटरॉइड और कोलोनॉइड ध्रुवीकृत गोलाकार संरचनाएं हैं जहां एपिकल डोमेन आंतरिक ल्यूमेन का सामना कर रहा है और बेसोटेरल क्षेत्र बाह्य मैट्रिक्स के सीधे संपर्क में है। एंटोइड्स और कोलोनॉइड में एंटोसाइट्स/कोलोनोसाइट्स, पैनेथ, एंटोएंडोक्राइन और गोबलेट कोशिकाओं जैसे सभी प्रमुख विभेदित आंतों के एपिथेलियल उप-प्रकार होते हैं और वे अपेक्षाकृत उसी अनुपात में दिखाई देते हैं जैसा कि वे आंत के खंड में करते हैं जहां वे5से अलग थे। हालांकि 3 डी एंटोलोइड और कोलोनॉइड आंतों के विकास और शरीर विज्ञान के अध्ययन में एक प्रमुख अग्रिम का प्रतिनिधित्व करते हैं, ये मॉडल कुछ कमियां पेश करते हैं जैसे कि एपिथेलियल कोशिकाओं (ल्यूमेन) की एपिकल सतह तक सीमित पहुंच और रुचि के अणुओं की उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्राप्त करने के लिए संस्कृतियों को ऊपर या नीचे स्केल करने की क्षमता। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, 3 डी एंटोरॉयड/कोलोनॉइड से प्राप्त आईईसी की प्राथमिक 2डी संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल उत्पन्न किए गए थे । 2D एंटोरॉयड/कोलोनॉइड कोशिकाओं की शीट के रूप में बढ़ते हैं जैसे मॉडल सेल लाइनें करते हैं और आंतों के घाव की मरम्मत, मेजबान-रोगजनक बातचीत और अन्य लोगों के बीच पुनर्योजी दवा का अध्ययन करने के लिए आदर्श होते हैं। कई प्रकाशित पत्रों में बताया गया है कि 3डी संरचनाओं से या सीधे आंतों के क्रिप्ट्स से 2D मोनोलेयर कैसे उत्पन्न करें,(देखें 6,7,8,9,10,11)लेकिन ये विधियां श्रम गहन और पुन: पेश करने के लिए कठिन होती हैं। हौसले से अलग माउस आंतों के क्रिप्ट्स से सीधे मोनोलेयर्स प्राप्त करने के लिए एक तेज, सरल और प्रजनन योग्य विधि इस प्रोटोकॉल में रेखांकित की गई है।

यहां हम मलबे की न्यूनतम पीढ़ी, बाहुलीय मैट्रिक्स विकल्प और इस तकनीक के लिए विभिन्न सतहों और अनुप्रयोगों के साथ क्रिप्ट निष्कर्षण की प्रक्रिया को विस्तार से समझाते हैं। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण को कोलन क्रिप्ट्स के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन छोटी आंत के लिए लागू होने पर इसी तरह के परिणाम प्राप्त किए जाते हैं।

Protocol

नीचे वर्णित सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी गई है और मिशिगन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया है ।

1. तहखाना अलगाव और संस्कृति के लिए अभिकर् पना की तैयारी (ऊतक संस्कृति हुड में तैयार)

  1. 50 m ethylenediamine टेट्राएसेटिक एसिड (EDTA): 500 मिलीएल तैयार करने के लिए कैल्शियम (सीए2+)और मैग्नीशियम (एमजी2+)के बिना, फॉस्फेट बफर खारा के 450 मिलील में 50 मिलियन एमएल 0.5 मीटर स्टॉक जोड़ें। इस प्रोटोकॉल में पीबीएस कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना पीबीएस का उल्लेख करेगा जब तक कि अन्यथा नहीं कहा जाता है।
  2. शेक बफर: 500 एमएल तैयार करने के लिए पीबीएस में 7.4 ग्राम सुक्रोज (43.3 mM) और 5 ग्राम सोर्बिटोल (54.9 mM) को भंग करें।
  3. एल-डब्ल्यूएन (एल-डब्ल्यूएनटी-3ए, आर-स्पॉन्डिन और नोगिन) मीडिया: पूरक उन्नत डल्बेको के संशोधित ईगल मीडियम/हैम के एफ-12 (डीएमईएम/एफ12) (780 एमएल) के साथ 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (200 एमएल), 1x व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ग्लूटामाइन सप्लीमेंट (10 एमएलएल), 100 यू/एमएल पेनिकिलिन, और 100 ग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (10 एमएल), और फिल्टर 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ स्टरलाइज करें।
    1. एटीसीसी के माध्यम से एल-डब्ल्यूआरएन कोशिकाएं प्राप्त करें, T175 फ्लास्क में बढ़ते हैं, और जेनेटिकिन और हाइग्रोमाइसिन का उपयोग करके चयन करें। मीडिया बदल जाता है और 12 दिनों के लिए एकत्र किया जाता है।
      नोट: मीडिया के हर बैच एक TOPflash Wnt रिपोर्टर परख का उपयोग कर WNT गतिविधि के लिए परीक्षण किया जाता है । इस मामले में मिशिगन मेडिसिन ट्रांसलेशनल टिश्यू मॉडलिंग लेबोरेटरी प्रोटोकॉल (https://www.umichttml.org/protocols) का पालन किया गया। TOPflash HEK २९३ सेल लाइन एक T75 फ्लास्क में संकुचन के लिए हो गया है, trypsinized और एक ९६ अच्छी तरह से थाली पर चढ़ाया । अगले दिन एकत्र किए गए मीडिया के विभिन्न कमजोर पड़ने को कोशिकाओं में जोड़ा जाता है और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटेड कियाजाता है। अगले दिन, कोशिकाओं को lysed कर रहे हैं, और जुगनू लूसिफ़ेरेस परख निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया जाता है । परख को पुनर्संयोजन WNT-3A का उपयोग करके सामान्यीकृत किया जाता है। मीडिया को 50 एमएल शंकु ट्यूबों में 25 एमएल एलिककोट्स में बांटा गया है और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया गया है।
  4. बेस मीडिया: 500 मिलीएल के लिए, 2x व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ग्लूटामीन पूरक (10 एमएल), 20 एमएम एचईपीई (10 एमएल), 100 यू/एमएल पेनिसिलिन और, के साथ उन्नत डीएमईएमईएम/एफ 12 (448 एमएल) पूरक 100 ग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन (10 एमएल), 2 एमएम एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन (2 एमएल), एन2 सप्लीमेंट (10 एमएल) और बी27 सप्लीमेंट (20 एमएल), फिल्टर स्टरलाइज के साथ 0.22 माइक्रोन फिल्टर। मीडिया को 50 एमएल शंकु नली में 25 एमएल एलिककोट्स में विभाजित करें और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. एलडब्ल्यूएलएन पूर्ण मीडिया: बेस मीडिया के 25 एमएल के साथ 25 एमएल एलडब्ल्यूएलएन मीडिया को मिलाएं और 200 एनजी/एमएल एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) (20μL) और 2x एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान (1 एमएल) के साथ पूरक करें। पूरा मीडिया 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. कोलेजन और लैमिनिन: 1 मिलीग्राम/एमएल के स्टॉक एकाग्रता का उत्पादन करने के लिए 100 mm एसिटिक एसिड (आणविक ग्रेड पानी के 9.94 एमएल में एसिटिक एसिड स्टॉक के 60 माइक्रोन जोड़ें) के 5 एमएल में 5 मिलीग्राम पाउडर घोलें। 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएं और 0.2 एमएल ट्यूब में 100 माइक्रोन एलिकोट बनाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। लैमिनिन 100 μg/mL के स्टॉक एकाग्रता पर खरीदा जाता है।
  7. विकास कारकों के बिना पूरा मीडिया (CMGF-): पूरक उन्नत DMEM/F12 (५०० मिलीएल) 1x वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध ग्लूटामीन पूरक (5 एमएल), 10 mM HEPES (5 mL), १०० यू/एमएल पेनिसिलिन और, १०० ग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमीसिन (5 mL) के साथ ।
  8. भेदभाव मीडिया: सीएमजीएफ-मीडिया के 9.2 एमसीएल तक, बी 27 पूरक के 200 माइक्रोन, N2 पूरक के 100 माइक्रोन, एन-एसिटिल-एल-सिस्टीन के 20 माइक्रोन, नोगिन मीडिया के 500 माइक्रोन12 (नोगिन-उत्पादक कोशिकाओं से बने) और 10 एमएसएल ईजीएफ को भेदभाव मीडिया के 10 मीटर बनाने के लिए जोड़ें।

2. प्लेटों, कक्ष स्लाइड और सेल संस्कृति झिल्ली आवेषण की तैयारी

  1. 2डी मोनोलेयर चढ़ाना के लिए 48-अच्छी प्लेट और चैंबर स्लाइड का उपयोग करें: कोटिंग समाधान का उपयोग करें जो लेमिनिन (1:40 कमजोर पड़ने, सामग्री की तालिकादेखें) और कोलेजन (1:30 कमजोर पड़ने) ठंड Dulbecco के फॉस्फेट बफर नमकीन में, Ca2 + और एमजी2 + (DPBS) के साथ। प्रत्येक कुएं में कोटिंग समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें और कम से कम2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में प्लेट/चैंबर स्लाइड को प्री-इन्क्यूबेट करें।
  2. कोटिंग 0.4 माइक्रोन सेल कल्चर झिल्ली आवेषण: आणविक ग्रेड पानी में कोलेजन के 1:30 कमजोर पड़ने और प्रत्येक डालने के लिए 200 माइक्रोन जोड़ें। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर झिल्ली डालें युक्त प्लेट रखें। 30 मिनट इनक्यूबेशन के बाद, प्लेट को 1.5-2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें। पॉलिएस्टर और पॉलीकार्बोनेट झिल्ली आवेषण तुलनीय परिणाम उत्पंन करते हैं।
    नोट: किसी भी ऊतक संस्कृति प्लेट वरीयता प्राप्त किया जा सकता है (ऊपर और डाउनस्केलिंग प्रदर्शन किया जा सकता है) कोलेजन का समायोजन करके इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर/

3. तहखाना अलगाव

नोट: विच्छेदन शुरू करने से पहले, कोलेजन और/या लेमिनिन कोटेड प्लेट/झिल्ली आवेषण/कक्ष स्लाइड तैयार करें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में छोड़ दें । सर्जरी के लिए उपयुक्त एक स्वच्छ कार्य पीठ और बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों, और 2D मोनोलेयर की खेती के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट तैयार करें। 2डी मोनोलेयर खेती के लिए अन्य सभी मानक उपकरणों की पुष्टि करें जैसे आर्द्रीकृत सीओ2 इनक्यूबेटर, टेबलटॉप सेंट्रलाइज (4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा गया), माइक्रोस्कोप और पिपेट (सीरोलॉजिकल पिपेट सहित) तैयार हैं।

  1. C57Bl/6 चूहों, 8-12 सप्ताह पुराने का प्रयोग करें । इच्छामृत्यु की एक अनुमोदित विधि का उपयोग करके चूहों को इच्छामृत्यु दें।
  2. विच्छेदन क्षेत्र को साफ करने और पेपर ऊतक का उपयोग करके अतिरिक्त एटोह को हटाने के लिए चूहों के शवों को 70% इथेनॉल (ईटीओएच) समाधान के साथ स्प्रे करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि तहखाना आइसोलेशन रिएजेंट (जैसे पीबीएस, 50 एमएम ईडीए, शेक बफर) क्रिप्ट्स को ठंडा रखा जाता है। इन अभिकर् ते को एक दिन पहले तैयार किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत होने पर कम से कम 3 महीने तक उपयोग करना अच्छा होता है। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि LWRN पूरा मीडिया एक मनका में रखा जाता है/पानी का उपयोग करने तक ३७ डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा स्नान ।
  3. साफ विच्छेदन कैंची और संदंश का उपयोग करके, मलाशय से सीकम तक पेट को काटना। संदंश का उपयोग कर कोलन के अंत पकड़ो और बहुत धीरे से एक 10 मिलीएल सिरिंज में बर्फ ठंड PBS का उपयोग कर मल फ्लश, एक 20 जी खिला ट्यूब(चित्रा 1A)के साथ फिट । सुनिश्चित करें कि पेट टूटना नहीं है।
    1. समीपस्थ पेट निकालें। यह इलियोसेकल जंक्शन के निकटतम कोलन का हिस्सा होगा।
  4. संदंश के साथ, डिस्टल कोलन को धीरे-धीरे 20 जी फीडिंग ट्यूब पर स्लाइड करें, ट्यूब के अंत में कोलन को 4-0 रेशम सीवन धागे(चित्रा 1B)के साथ टिप द्वारा बांधने के लिए।
  5. अंत पर एक उंगलियों का उपयोग कर बाहर के अंदर पेट उलटा बांधा और 4-0 रेशम सीवन धागे के साथ दूसरे छोर टाई । सर्जिकल कैंची का उपयोग करना, खिला ट्यूब की नोक के नीचे पेट काट(चित्रा 1C,डी, ई)।
  6. एक 1.25 एमएल दोहराने सिरिंज के प्लंजर का उपयोग करना, धीरे से एक 1.25 मिलीएल दोहराने सिरिंज की नोक पर उल्टे पेट के अनट्लेड अंत खुला। उलटे कोलन को सिरिंज के अंत पर स्लाइड करें और 4-0 रेशम सीवन धागे(चित्रा 1F,जी) के साथ कसकर टाईकरें।
  7. सिरिंज में प्लंजर डालें और एक सॉसेज बनाने के लिए पेट को फुलाएं। जब तक पेट सॉसेज कोई दिखाई झुर्रियों(चित्रा 1H)के साथ टर्जेंट लग रहा है फुलाने ।
  8. 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेल रिकवरी सॉल्यूशन के 5 एमएल के साथ 15 एमएल ट्यूब में सिरिंज/कोलन रखें, हर 5 मिनट(चित्रा 1I)के लिए एक बार कोलन को फुलाएं और डिफ्लेट करें । सॉसेज को इनक्यूबेशन के दौरान फुलाया जाना चाहिए।
  9. पेट फुलाया के साथ दोहराने सिरिंज की नोक के नीचे 4-0 रेशम सीवन धागे का उपयोग कर बंद टाई । सॉसेज को रिपीट सिरिंज से काटें और 15 एमएल ट्यूब में रखें जिसमें 50 mm (छोटी आंत के लिए 2mM) EDTA के 10 एमएल होते हैं और 4 डिग्री सेल्सियस(चित्रा 1J,K)पर घुमाएं ।
  10. EDTA समाधान से दूर डेसेंट और शेक बफर के 5 एमएल के साथ बदलें। सॉसेज को 2 मिनट के लिए ऊर्ध्वाधर स्थिति (सख्ती से) में मैन्युअल रूप से हिलाएं।
  11. एक नई 15 एमएल ट्यूब में मिलाते हुए समाधान को डिकेंट करें और बफर मिलाते हुए क्रिप्टो के कुल 10 एमएल के लिए मिलाते हुए कदम दोहराएं।
  12. पेट्री डिश में क्रिप्ट सस्पेंशन का 20 माइक्रोन लें और माइक्रोस्कोप के नीचे क्रिप्ट्स की संख्या गिनें । क्रिप्ट्स/माइक्रोन में क्रिप्ट एकाग्रता की गणना करें। एकाग्रता के आधार पर, चढ़ाना (1000 क्रिप्टो/सेमी2)के समय 5 क्रिप्ट/μL प्राप्त करने के लिए नमूनों को पतला करें।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर टेबलटॉप अपकेंद्रित्र का उपयोग करके अलग-थलग क्रिप्ट के साथ ट्यूब स्पिन करें।
  14. इस दौरान इनक्यूबेटर से 48-वेल प्लेट/डालने/चैंबर स्लाइड निकालकर बायोसेफ्टी कैबिनेट में रखें। P200 का उपयोग करके कोटिंग समाधान को एस्पिरेट करें और प्लेट को ढक्कन के साथ थोड़ा ऑफसेट छोड़ दें जब तक कि कोशिकाएं चढ़ाए जाने के लिए तैयार न हों।

4. 2डी मोनोलेयर को कल्विट करना

नोट: 3 डी कोलोनॉइड से आंतों के एपिथेलियल मोनोलेयर उत्पन्न करने के बारे में एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए एस्टेस और कोवबास्नजुक प्रयोगशालाओं(7,11)द्वारा प्रोटोकॉल की जांच करें।

  1. 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके झटकों वाले बफर को हटा दें। सुनिश्चित करें कि गोली बरकरार है और किसी भी तरल छोड़ दिया हटाने के लिए P1000 का उपयोग कर सकते हैं। एलडब्ल्यूएलएन पूर्ण मीडिया के 3 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और P1000 के साथ ऊपर और नीचे पिपेट करें। एक पूर्व लेपित ४८-अच्छी तरह से थाली/कक्ष स्लाइड के प्रत्येक कुएं में तहखाने के २०० μL जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट ।
  2. अगले दिन P200 का उपयोग कर मीडिया आकांक्षी और ताजा मीडिया जोड़ें । कोशिकाएं 24-48 घंटे में ढुलमुल हो जाती हैं ।
  3. सेल कल्चर झिल्ली आवेषण के लिए, आवेषण के शीर्ष पर 200 माइक्रोन क्रिप्ट (5 क्रिप्ट/μL) जोड़ें और नीचे के हिस्से में पूर्ण एल-डब्ल्यूएन मीडिया के 600 माइक्रोन जोड़ें। अगले दिन P200 का उपयोग कर मीडिया आकांक्षी और केवल शीर्ष कक्ष के लिए ताजा मीडिया जोड़ें । प्लेट को 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ट्रांसेपिथेलियल इलेक्ट्रिकल रेजिस्टेंस (टीईईआर) को हर दिन एपिथेलियल वोल्ट/ओम मीटर (EVOM) का उपयोग करके मापा जाता है ।
    नोट: यदि संस्कृति एक TEER ३०० Ω.सेमी2से अधिक पढ़ने है, वे के लिए शांत होने का मतलब है । 3-4 दिनों में कन्फ्यूशियस हासिल किया जाता है। हर 2 दिन में मीडिया बदलें।

Representative Results

प्राथमिक एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर संस्कृतियों की विश्वसनीयता को समझाने के लिए, प्रोटोकॉल से प्राप्त तहखाना अलगाव और प्रतिनिधि छवियों का सारांश दिखाया गया है। उपयोगकर्ता के मन में होना चाहिए कि अलग तहखाने बाँझ स्थितियों में सुसंस्कृत हैं, तो एक सही विच्छेदन और पेट की सफाई एक प्राथमिकता है । चित्रा 1 में तहखाना अलगाव के दौरान महत्वपूर्ण चरण हैं। अलगतहखाने (चित्रा 2A)अब गिना जाता है और केंद्रित(चित्रा 2B)5 तहखाने/μL की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए । क्रिप्ट्स की एक केंद्रित तैयारी के बाद, कोशिकाओं को वांछित प्रारूप (संस्कृति पकवान, झिल्ली आवेषण या कक्ष स्लाइड) में चढ़ाया जाएगा और प्रयोगात्मक जरूरतों के आधार पर उपयुक्त मीडिया के साथ इनक्यूबेटेड किया जाएगा। चित्रा 3 ४८-अच्छी तरह से प्लेटों में संस्कृति के 24 और ४८ घंटे के बाद संस्कृति प्रगति से पता चलता है । जब तक वांछित पूर्णता तक नहीं पहुंच जाती तब तक कोशिकाओं को इनक्यूबेटेड किया जाता है। इस विधि के संभावित अनुप्रयोगों का उदाहरण देने के लिए, हमने 48-अच्छी प्लेट कुओं को नरमी तक पहुंचने की अनुमति दी और खरोंच-घाव परख करने के लिए आगे बढ़े। चित्रा 4 एक ताजा बनाया खरोंच(चित्रा 4A)एक 2D कोलोनॉयड मोनोलेयर में और एक ही घाव 24 घंटे के बाद(चित्रा 4B)दर्शाया गया है । यह स्पष्ट है कि संस्कृति अभी भी स्वस्थ और व्यवहार्य है और घाव की मरम्मत है । विभेदित मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए, मीडिया को एलडब्ल्यूएलएन से भेदभाव मीडिया में बदल दिया जाता है। उच्च टीईईआर मूल्यों(चित्रा 5A),आईएससी मार्कर की कमी ((ल्यूसिन-रिच रिपीट-युक्त जी-प्रोटीन युक्त रिसेप्टर 5 (एलजीआर5) और अचेते-स्कूट जैसे 2 (Ascl2)) और भेदभाव मार्कर की वृद्धि (()) दिखाकर भेदभाव हासिल किया जाता है पीसी द्वारा एलनिल एमिओपेप्टिडेस (Anpep), म्यूसिन 2 (Muc2), लाइसोजाइम 1 (Lyz1), सुक्रोज आइसो-माल्टासे (Sis) और Chrmogranin A (Chga))(चित्रा 5B,सी)। CDX2 और KRT20 के रूप में अन्य मार्कर भी इस पैनल में शामिल किया जा सकता है। एमआरएनए अभिव्यक्ति के स्तर के अलावा, भेदभाव की स्थिति में उगाए गए 2डी कोलोनॉइड में विभेदित एपिथेलियल कोशिकाओं के उप-प्रकार की उपस्थिति भी इम्यूनोफ्लोरेसेंस (Muc2 और Chga) द्वारा दिखाई जाती है; चित्रा 5D)।

Figure 1
चित्रा 1:स्वस्थ मोनोलेयर्स जनरेशन के लिए नमूना तैयारी। स्वस्थ मोनोलेयर्स की पीढ़ी के लिए नमूना तैयारी महत्वपूर्ण है। अलगाव की प्रक्रिया के प्रमुख चरणों को इस आंकड़े में चित्रित किया गया है ताकि पाठक को आसान बनाया जा सके। कोलन माउस से उत्पादित है, यह सुनिश्चित करता है कि कोई फर बचा नहीं है। ध्यान से मल को हटा दें सुनिश्चित करें कि आप पेट को छिद्रित नहीं करते हैं; यह महत्वपूर्ण महत्व का है क्योंकि पेट को हवा पकड़ने और फुलाने और हवा निकालने में सक्षम होने की आवश्यकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:तहखाना अलगाव गिनती और एकाग्रता। (A)कोलन सॉसेज मिलाने के बाद कोलोनिक क्रिप्ट्स । छवि एक 20 μL ड्रॉप के एक क्षेत्र को दर्शाया गया है । (ख)5 तहखाने/μL प्राप्त करने के लिए क्रिप्ट एकाग्रता। स्केल बार: 1 मिमी . कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:प्राथमिक आईईसी मोनोलेयर वृद्धि। (ए)2डी आईईसी मोनोलेयर 24 घंटे के बाद चढ़ाना और सेल मलबे को हटाने के बाद। (ख)कॉन्फ्लूंट 2डी आईईसी मोनोलेयर्स 48 घंटे चढ़ाना के बाद। स्केल बार: 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:स्क्रैच घाव परख murine प्राथमिक आईईसी का उपयोग कर। एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर में एक खरोंच के बाद घाव भरने वाली छवियां। स्केल बार: 5 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5:एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर्स का भेदभाव। (A)विभेदन मीडिया टीईईआर द्वारा प्रदर्शित तंग एपिथेलियल बाधाओं को बनाता है। विभेदन मीडिया(बी)स्टेम सेल मार्कर और(सी)भेदभाव मार्कर के अपरेजेशन की mRNA अभिव्यक्ति में एक बूंद का कारण बनता है । (घ)विशेष विभेदित एपिथेलियल कोशिकाओं जैसे Muc2 और क्रोमोग्रानिन-ए के मार्कर भी प्रत्यक्ष 2डी कोलोनॉइड के इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से पता लगाया जा सकता है । स्केल बार: 5 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हमारा प्रोटोकॉल प्रत्यक्ष प्राथमिक 2D आईईसी मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए एक तेज़, प्रजनन योग्य और विश्वसनीय विधि प्रदान करता है। पेट एपिथेलियल मोनोलेयर उत्पन्न करने के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल की तुलना में हमारे प्रोटोकॉल में मुख्य अंतर में से एक यह है कि हम क्रिप्ट्स को मुक्त करने के लिए पेट को छोटे टुकड़ों में नहीं काटते हैं। इसके बजाय, हमने एक बेहद साफ तैयारी में क्रिप्ट्स को रिलीज करने के लिए रासायनिक और यांत्रिक बलों के संयोजन द्वारा मेसेंचिम13 से आंतों के एपिथेलियम को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित किया,(चित्र 2),शोधकर्ता को प्राथमिक संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए आदर्श सामग्री प्रदान करता है। हमारे अलगाव विधि का उपयोग 3डी एंटरनोइड और कोलोनॉइड उत्पन्न करने के लिए भी किया जा सकता है। हर बार क्रिप्टो किए जा रहे क्रिप्ट्स की संख्या को सामान्य बनाने के लिए एक प्रयोग किया जाता है तो क्रिप्ट काउंट करना महत्वपूर्ण है। कोलन सॉसेज टर्गर, अलगाव की गति, उपयोगकर्ता विशेषज्ञता जैसे चर अलग-थलग क्रिप्टो की संख्या को प्रभावित कर सकते हैं। प्रोटोकॉल में उल्लिखित सुझाए गए प्लेटिंग क्रिप्ट एकाग्रता एक प्रारंभिक बिंदु है, लेकिन उपयोगकर्ता संचालित चरों के लिए खाते में प्रत्येक उपयोगकर्ता को इसे अनुकूलित करना चाहिए। हम पुरुष और महिला WT 8 से 20 सप्ताह से लेकर चूहों के साथ इस तकनीक का इस्तेमाल किया है और हम सेल अस्तित्व में प्रमुख अंतर नहीं देखा है, सिद्धांत में युवा चूहों से अलग तहखाने में जीवित रहने के लिए बेहतर संभावना है । क्रिप्ट्स को अतिरिक्त रूप से चढ़ाया जाता है क्योंकि उनमें से केवल एक छोटा प्रतिशत सतह से जुड़ता है और जीवित रहता है। एक संतुलन जहां चढ़ाना के बाद एक दिन 50% संकुचन के लिए पर्याप्त क्रिप्ट हैं, लेकिन बहुत सारे क्रिप्ट नहीं हैं जहां मरने वाले क्रिप्ट्स का साइटोटॉक्सिक प्रभाव होगा लक्ष्य है। LWRN मीडिया ध्यान से मृत तहखाने और मलबे को खत्म करने के लिए चढ़ाना के बाद 24 घंटे हटा दिया जाना चाहिए, यह ध्यान से किया जाना चाहिए कोशिकाओं है कि पहले से ही एक मोनोलेयर के रूप में बढ़ रहे है अलग से बचने के लिए ।

LWRN मीडिया के प्रारंभिक हटाने के बाद, उपयोगकर्ता को यह तय करना होगा कि प्रायोगिक स्थितियों को प्राथमिक आईईसी मोनोलेयर की आवश्यकता होती है जो स्टेम सेल के करीब रहते हैं और ताजा एलडब्ल्यूआरएन मीडिया जोड़ते हैं या यदि मोनोलेयर का भेदभाव वांछित है, तो भेदभाव मीडिया के साथ बदलें। इस प्रोटोकॉल में एक सबसे महत्वपूर्ण कारक अलगाव प्रक्रिया के दौरान पेट की अखंडता को आश्वस्त करना है। यदि टूटना होता है, तो क्षतिग्रस्त क्षेत्र को खत्म करने के लिए सॉसेज को छोटा किया जा सकता है। EDTA में सॉसेज डालने से पहले सुनिश्चित करें कि समुद्री मील जितना संभव हो उतना तंग कर रहे हैं। यदि EDTA इनक्यूबेशन के बाद सॉसेज को हवा निकाल दिया जाता है तो समग्र तहखाना उपज में कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। यदि रिपीट सिरिंज उपलब्ध नहीं है, तो नियमित सिरिंज से जुड़ी एक नियमित माइक्रोपिपेट टिप का उपयोग मुद्रास्फीति और अपस्फीति की प्रक्रिया के लिए भी किया जा सकता है। इसके अलावा, यदि कोई सेल रिकवरी समाधान उपलब्ध नहीं है, तो ईडीटीए (2mM छोटी आंत, 50 mm कोलन) में मुद्रास्फीति और अपस्फीति कदम किए जा सकते हैं, लेकिन इस प्रतिस्थापन की सिफारिश नहीं की जाती है। यदि कन्फ्लेमनी की आवश्यकता नहीं है, तो क्रिप्ट केवल कोलेजन के साथ और यहां तक कि अनकोटेड प्लेटों में लेपित प्लेटों में विकसित हो सकते हैं। केवल अनकोटेड प्लेटों के मामलों का उपयोग करें कोई अन्य विकल्प नहीं है, लेकिन कोशिकाएं स्वस्थ नहीं होंगी क्योंकि वे कोलेजन-लेपित प्लेटों में होंगी। जब संस्कृति स्वास्थ्य और स्थिरता की बात आती है, तो प्लास्टिक में चढ़ाए गए मोनोलेयर 4 से 5 दिनों तक स्वस्थ होते हैं जबकि ट्रांसवेल में चढ़ाए गए मोनोलेयर को 8 दिनों तक ले जाया जा सकता है।

इस विधि की मुख्य सीमाओं में से एक एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर विकसित करने के लिए आवश्यक सेल मीडिया है। LWRN कोशिकाओं एटीसीसी में उपलब्ध हैं, लेकिन LWRN वातानुकूलित मीडिया पीढ़ी श्रम गहन है और Wnt गतिविधि निर्धारित करने के लिए एक फ्लोरोसेंट स्पेक्ट्रोमीटर के लिए उपयोग की आवश्यकता है । विभेदन मीडिया को कई अभिकर्त्रों की आवश्यकता होती है जिन्हें उपयोग से पहले ताजा जोड़ा जाता है, जो इसे एक थकाऊ प्रक्रिया बनाता है। अंत में इनमें से ज्यादातर रिएजेंट्स महंगे होते हैं और रिएजेंट्स को तेज रफ्तार में जलाने में आसानी होती है। यदि एक प्रयोगशाला पिछले आंतों प्राथमिक सेल संस्कृति के बिना इस तकनीक को स्थापित करने की इच्छा है, यह अत्यधिक अनुभव के साथ एक सहयोगी/कॉलेज खोजने के लिए और उनके सदस्यों में से एक को प्रशिक्षित करने की सिफारिश की है ।

3 डी संस्कृति का रखरखाव बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स माध्यम की लागत और ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों के लिए आवश्यक वातानुकूलित मीडिया की उच्च मात्रा के कारण महंगा हो सकता है, लेकिन इसमें चूहों की कम संख्या का उपयोग करने का लाभ है और उत्पन्न संरचनाओं को कई बार पारित किया जा सकता है। एंटरॉइड (छोटी आंत से प्राप्त) को अलग करना और बनाए रखना अपेक्षाकृत आसान है जबकि कोलोनोइड अधिक नाजुक होते हैं, धीमी गति से बढ़ते हैं और अधिक सीमित मार्ग क्षमता रखते हैं। 3 डी कोलोनॉइड से मोनोलेयर पीढ़ी को 3 डी संरचनाओं की आय से अधिक राशि की आवश्यकता होती है, जो इस प्रकार के प्रयोगों को समय लेने और महंगा बनाती है। इसके विपरीत, प्रत्यक्ष एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर प्रेप तेज है और परिणाम प्राप्त करने का एक त्वरित तरीका है। एक कोलन प्रेप 75 सेमी2 (वातानुकूलित मीडिया के 10 से 15 एमएल) का एक ढुलमुल क्षेत्र उत्पन्न कर सकता है, एक बार बदलता है) चढ़ाना के बाद 2 से 3 दिन (इस क्षेत्र को 3 डी कोलोनॉइड के 144 कुओं की आवश्यकता होगी, जिसका अर्थ है लगभग 6mL Matrigel और 250 एमएल से अधिक वातानुकूलित मीडिया)। मीडिया की कम खपत, सेल संस्कृति का कम लागत रखरखाव और कार्यात्मक परीक्षण ों और तेजी से डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण करने की क्षमता एपिथेलियल कोलन मोनोलेयर के बड़े फायदे हैं।

यह प्रोटोकॉल सेल-आसंजन, ध्रुवता और भेदभाव जैसे क्षेत्रों में आंतों के एपिथेलियल सेल जीव विज्ञान के अध्ययन में एक मूल्यवान उपकरण है। यह आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों (नॉक-आउट, ओवरएक्सप्रेसिंग, रिपोर्टर्स) से प्राथमिक सेल संस्कृतियों को उत्पन्न करने का लाभ देता है। प्राथमिक आंतों के एपिथेलियल मोनोलेयर विभिन्न कोशिकाओं प्रकारों के पारगम्यता, बाधा और ट्रांसेपिथेलियल माइग्रेशन के अध्ययन की अनुमति देते हैं। अंत में, यह मॉडल मेजबान-रोगजनकों की बातचीत, एपिथेलियल क्षति और मरम्मत और दवा की खोज जैसे विभिन्न क्षेत्रों में उपयोगी हो सकता है।

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को क्रोन और कोलाइटिस फाउंडेशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड (544599, एमक्यू को) और एनआईएच ग्रांट (DK055679, DK089763, DK0598888, AN) द्वारा समर्थित किया गया था। हम उनकी निरंतर मदद और उनके अभिकर् में और प्रोटोकॉल के लिए उपयोग के लिए मिशिगन मेडिसिन ट्रांसलेशनल ऊतक मॉडलिंग प्रयोगशाला का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
Antibiotic Antimycotic solution Corning 30-004CI
B27 supplement (50X) Gibco 12587-010
Cell Recovery Solution Corning 354253
Collagen from human placenta (type IV) Sigma-Aldrich C5533
D-Sorbitol Sigma 85529-250G
D-Sucrose Fisher Scientific BP220-1
Dulbecco’s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) Corning 21-030-CV
Epithelial Volt/Ohm meter World Precision Instruments 0-10KΩ with STX2 (EVOM2)
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) Lonza 51201
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-016-CV
Firefly Luciferase assay Biotium 30085-2
Geneticin Gibco 10131-035
GlutaMAX (100X) Gibco 35050-061
HEPES (1M) Corning 25060CI
Human recombinant EGF R&D systems 236-EG Stock Concentration: 500µg/mL
Human recombinant Wnt-3A R&D systems W3a-H-005
Hygromycin B Invitrogen 10687010
LWRN cells ATCC CRL-3276
Molecular grade water Corning 46-000-CV
N2 supplement (100X) Gibco 17502-048
N-acetyl-L-cysteine Sigma-Aldrich A9165-5G Stock Concentration: 500mM
Noggin Conditioned media -
Nunc Lab-Tek Chamber slide system Sigma-Aldrich C7182-1PAK
Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL) Corning 30002CI
Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS) Corning 21-040-CV
Plastic 20G feeding tube Fisher Scientific 50-810-46
rh-laminin-521 Gibco A29248 Stock concentration: 100µg/mL
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD Fisher Scientific NC9452680
TOPflash HEK293 cells ATCC CRL-3249
Transwell Permeable supports (0.4µm) Corning 3470

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References

  1. Quiros, M., Nusrat, A. Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair. Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).
  2. Blutt, S. E., et al. Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).
  3. Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications. Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).
  4. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  5. Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
  6. Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).
  7. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
  8. Cardenas, D., et al. Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium. Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).
  9. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  10. VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
  11. Zou, W. Y., et al. Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections. Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).
  12. Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
  13. Nik, A. M., Carlsson, P. Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme. Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).

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Muraleedharan, C. K., Mierzwiak, J., Feier, D., Nusrat, A., Quiros, M. Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts. J. Vis. Exp. (168), e62156, doi:10.3791/62156 (2021).

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