Summary
En este protocolo, describimos cómo generar monocapas epiteliales primarias murine de los dos puntos directamente de criptas intestinales. Proporcionamos enfoques experimentales para generar monocapas confluentes en filtros permeables, monocapas confluentes para la cicatrización de heridas de arañazos y estudios bioquímicos, y monocapas dispersas y confluentes para análisis de inmunofluorescencia.
Abstract
El epitelio intestinal se compone de una sola capa de células que actúan como una barrera entre la luz intestinal y el interior del cuerpo. La interrupción en la continuidad de esta barrera puede dar lugar a desordenes inflamatorios tales como enfermedad de intestino inflamatoria. Una de las limitaciones en el estudio de la biología epitelial intestinal ha sido la falta de modelos de cultivo celular primario, lo que ha obligado a los investigadores a utilizar líneas celulares modelo derivadas de carcinomas. El advenimiento de los enteroides tridimensionales (3D) ha dado a los biólogos epiteliales una poderosa herramienta para generar cultivos celulares primarios, sin embargo, estas estructuras están incrustadas en la matriz extracelular y carecen de la madurez característica de las células epiteliales intestinales diferenciadas. Se han publicado varias técnicas para generar monocapas epiteliales intestinales, pero la mayoría se derivan de enteroides 3D establecidos que hacen que el proceso sea laborioso y costoso. Aquí describimos un protocolo para generar monocapas epiteliales primarias de los dos puntos directamente de criptas intestinales murine. También detallamos enfoques experimentales que se pueden utilizar con este modelo, como la generación de cultivos confluentes en filtros permeables, monocapa confluente para estudios de cicatrización de heridas de arañazos y monocapas dispersas y confluentes para análisis de inmunofluorescencia.
Introduction
Las células epiteliales intestinales (IEC) recubren los intestinos formando una barrera selectivamente permeable que permite la absorción de nutrientes y agua a la vez que evitan que microorganismos y toxinas entren en el organismo 1. La mucosa intestinal se compone de proyecciones luminales llamadas vellosidades (sólo presentes en el intestino delgado) e invaginaciones llamadas criptas. Las vellosidades y la superficie de las criptas del colon están cubiertas por células epiteliales diferenciadas, mientras que la base de las criptas está compuesta por células madre que hacen la rápida renovación de los epitelios intestinales, que tiene un recambio de 3 a 7 días. Las células madre intestinales (ISC) no sólo son importantes para mantener la homeostasis intestinal, sino para la reparación adecuada de los epitelios dañados2.
El estudio de la biología intestinal del epithelia fue limitado por la carencia de cultivos celulares primarios con las variedades de células transformadas que eran la única herramienta disponible. Las variedades de células modelo epitelial intestinal no son capaces de replicar exactamente la fisiología del epitelio intestinal normal. El desarrollo de cultivos 3D derivados de isc proporcionó a los biólogos de la mucosa intestinal con modelos in vitro que se asemejan in vivo a las condiciones de la mucosa intestinal3. Las criptas pueden aislarse fácilmente de muestras murinas, incrustadas en un medio de matriz de membrana basal (por ejemplo, Matrigel) y cultivadas en medios acondicionados que contienen Wnt3a, R-espondina y Noggin, generando estructuras 3D conocidas como enteroides (intestino delgado) o colonoides (intestino grueso)4. Los enteroides y los colonoides son estructuras esferoidales polarizadas donde el dominio apical está frente a un lumen interno y la región basolateral está en contacto directo con la matriz extracelular. Los enteroides y colonoides contienen todos los principales sub-tipos epiteliales intestinales diferenciados, como enterocitos / colonocitos, paneth, enteroendocrinos y células caliciformes y aparecen en relativamente las mismas proporciones que en la sección del intestino donde se aislaron de5. A pesar de que los enteroides 3D y los colonoides representan un gran avance en el estudio del desarrollo intestinal y la fisiología, estos modelos presentan ciertos inconvenientes, como el acceso limitado a la superficie apical de las células epiteliales (lumen) y la capacidad de escalar cultivos hacia arriba o hacia abajo para lograr un cribado de alto rendimiento de moléculas de interés. Para superar estas limitaciones, se generaron protocolos para obtener cultivos 2D primarios de IEC derivados de enteroides/colonoides 3D. Los enteroides/colonoides 2D crecen como hoja de células al igual que las líneas celulares modelo y son ideales para estudiar la reparación de heridas intestinales, las interacciones huésped-patógeno y la medicina regenerativa, entre otros. Varios artículos publicados describen cómo generar monocapas 2D a partir de estructuras 3D o directamente de criptas intestinales, (ver6,7,8,9,10,11)pero estos métodos tienden a ser intensivos en mano de obra y difíciles de reproducir. Un método rápido, simple, y reproducible para obtener monocapas directamente de las criptas intestinales del ratón recientemente aisladas se contornea en este protocolo.
Aquí explicamos en detalle el proceso de extracción de criptas con una generación mínima de residuos, la elección de la matriz extracelular y diferentes superficies y aplicaciones para esta técnica. Este acercamiento experimental fue optimizado para las criptas de los dos puntos, pero los resultados similares se obtienen cuando están aplicados para el intestino delgado.
Protocol
Todos los procedimientos descritos a continuación han sido aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan.
1. Preparación de reactivos para el aislamiento y cultivo de criptas (preparar en la campana de cultivo de tejidos)
- 50 mM de ácido etilendiamina tetraacético (EDTA): Añadir 50 mL 0,5 M en stock a 450 mL de fosfato tamponado salino, sin calcio (Ca2+)y magnesio (Mg2+)para preparar 500 mL. En este protocolo PBS se referirá a PBS sin calcio y magnesio a menos que se indique lo contrario.
- Tampone de agitación: Disolver 7,4 g de sacarosa (43,3 mM) y 5 g de sorbitol (54,9 mM) en PBS para preparar 500 mL.
- Medios de L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondin y Noggin): Suplemento Avanzado de Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) (780 mL) con 20% de Suero Fetal Bovino (FBS) (200 mL), 1x suplemento de glutamina disponible en el mercado (10 mL), 100 U/mL de penicilina y, 100 g/mL de estreptomicina (10 mL), y filtro esterilizar con filtro de 0.22 μm.
- Obtenga células L-WRN a través de ATCC, crezca en frascos T175 y seleccione usando Geneticin e Hygromycin. Los medios se cambian y se recopilan durante 12 días.
NOTA: Cada lote de medios se prueba para la actividad Wnt utilizando un ensayo TOPflash Wnt Reporter. En este caso los protocolos traslacionales del laboratorio del modelado del tejido de la medicina de Michigan (https://www.umichttml.org/protocols) fueron seguidos. La línea celular TOPflash HEK 293 se cultiva hasta la confluencia en un matraz T75, tripsinizado y plateado en una placa de 96 pocillos. Al día siguiente se añaden diferentes diluciones de los medios recogidos a las células y se incuban en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante la noche. Al día siguiente, las células se lisan, y el ensayo firefly luciferasa se realiza de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ensayo se normaliza utilizando Wnt-3A recombinante. El medio se divide en alícuotas de 25 mL en tubos cónicos de 50 mL y se almacenan a -80 °C.
- Obtenga células L-WRN a través de ATCC, crezca en frascos T175 y seleccione usando Geneticin e Hygromycin. Los medios se cambian y se recopilan durante 12 días.
- Soporte base: Para 500 mL, suplemento Advanced DMEM/F12 (448 mL) con 2x suplemento de glutamina disponible en el comercio (10 mL), 20 mM HEPES (10 mL), 100 U/mL penicilina y, 100 g/mL de estreptomicina (10 mL), 2 mM N-acetil-L-cisteína (2 mL), suplemento N2 (10 mL) y suplemento B27 (20 mL), filtro esterilizar con filtro de 0,22 μm. Divida el medio en alícuotas de 25 mL en tubo cónico de 50 mL y guárdelo a -80 °C.
- Medio completo LWRN: Combinar 25 mL de medios LWRN con 25 mL de medio base y complementar con 200 ng/mL de factor de crecimiento epidérmico (EGF) (20μL) y 2x solución antibiótico-antimicótica (1 mL). Almacene el soporte completo a 4 °C.
- Colágeno y Laminina: Disolver 5 mg de polvo en 5 mL de filtro esterilizado de ácido acético de 100 mM (añadir 60 μL de caldo de ácido acético a 9,94 mL de agua de grado molecular) para producir una concentración de stock de 1 mg/mL. Girar a 4 °C durante 4 h y hacer alícuotas de 100 μL en tubos de 0,2 mL. Congelar a -20 °C. Laminina se compra a una concentración de stock de 100 μg/mL.
- Medios completos sin factores de crecimiento (CMGF-): Suplemento Avanzado DMEM/F12 (500 mL) con 1x suplemento de glutamina disponible en el comercio (5 mL), 10 mM HEPES (5 mL), 100 U/mL de penicilina y, 100 g/mL de estreptomicina (5 mL).
- Medios de diferenciación: A 9,2 mL de cmgf- medios, añadir 200 μL de suplemento B27, 100 μL de suplemento de N2, 20 μL de N-acetil-L-cisteína, 500 μL de noggin medio12 (hecho de células productoras de Noggin) y 2 μL de EGF para hacer 10 mL de medios de diferenciación.
2. Preparación de placas, portaobjetos de cámara e insertos de membrana de cultivo celular
- Recubrimiento de portaobjetos de placa y cámara de 48 pocillos para chapado en monocapa 2D: Utilice la solución de recubrimiento que constituye laminina (dilución 1:40, ver Tabla de Materiales)y colágeno (dilución 1:30) en solución salina tamponada por fosfato de Dulbecco en frío, con Ca2+ y Mg2+ (DPBS). Añadir 200 μL de solución de recubrimiento a cada pozo y preincubar el portaobjetos de placa/cámara en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante al menos 2 h.
- Recubrimiento de 0.4 μm de inserciones de membrana de cultivo celular: Haga 1:30 la dilución de colágeno en agua de grado molecular y agregue 200 μL a cada inserto. Mantenga la placa que contiene el inserto de membrana sobre hielo a 4 °C durante 30 min. Después de 30 minutos de incubación, mantenga la placa en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 1,5-2 h. Los insertos de membrana de poliéster y policarbonato producen resultados comparables.
NOTA: Cualquier placa de cultivo de tejidos puede ser sembrada (se puede realizar escalado hacia arriba y hacia abajo) utilizando este protocolo ajustando el volumen de colágeno / laminina para obtener una cobertura completa de la superficie de revestimiento.
3. Aislamiento de la cripta
NOTA: Antes de comenzar la disección, prepare la placa recubierta de colágeno y/o laminina/insertos de membrana/portaobjetos de cámara y déjelos en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C. Prepare un banco de trabajo limpio e instrumentos quirúrgicos estériles apropiados para la cirugía, y un gabinete de seguridad biológica para cultivar monocapas 2D. Confirme que todos los demás equipos estándar para el cultivo de monocapas 2D, como la incubadora humidificada de CO2, las centrifugadoras de sobremesa (mantenidas a 4 °C), el microscopio y las pipetas (incluidas las pipetas serológicas) están listos.
- Utilice ratones C57Bl/6, de 8-12 semanas de edad. Eutanasia de ratones utilizando un método aprobado de eutanasia.
- Rocíe las carcasas de los ratones con una solución de etanol al 70% (EtOH) para limpiar el área de disección y eliminar el exceso de EtOH utilizando papel de papel.
NOTA: Asegúrese de que los reactivos de aislamiento de cripta (como PBS, EDTA de 50 mM, búfer de agitación) criptas se mantienen fríos. Estos reactivos se pueden preparar un día antes y son buenos para usar durante al menos 3 meses cuando se almacenan a 4 °C. Además, asegúrese de que el medio completo LWRN se mantenga en un baño de cuentas / agua mantenido a 37 ° C hasta su uso. - Usando tijeras de disección y descapotables limpios, diseccione el colon desde el recto hasta el ciego. Sostenga el extremo del colon usando fórceps y enjuague muy suavemente las heces usando PBS helado en una jeringa de 10 ml, equipada con una sonda de alimentación de 20 G (Figura 1A). Asegúrese de no romper el colon.
- Retire el colon proximal. Esta será la porción del colon más cercana a la unión ileocecal.
- Con fórceps, deslice el colon distal suavemente sobre la sonda de alimentación de 20 G, atando el colon en el extremo de la trompa por la punta con hilo de sutura de seda 4-0 (Figura 1B).
- Invierta los dos puntos de adentro hacia afuera usando los dedos de uno sobre el extremo atado y ate el otro extremo con hilo de sutura de seda 4-0. Usando tijeras quirúrgicas, corte el colon debajo de la punta de la sonda de alimentación (Figura 1C,D, E).
- Usando el émbolo de una jeringa de repetición de 1.25 ml, abra suavemente el extremo desatado del colon invertido en la punta de una jeringa de repetición de 1.25 mL. Deslice el colon invertido sobre el extremo de la jeringa y ate firmemente con hilo de sutura de seda 4-0 (Figura 1F, G).
- Inserte el émbolo en la jeringa e infle el colon para formar una salchicha. Inflar hasta que la salchicha de colon se vea turgent sin arrugas visibles (Figura 1H).
- Colocar la jeringa/colon en un tubo de 15 mL con 5 mL de solución de recuperación celular sobre hielo durante 20 min, inflar y desinflar el colon una vez cada 5 min(Figura 1I). El embutido debe permanecer inflado durante la incubación.
- Ate usando hilo de sutura de seda 4-0 debajo de la punta de la jeringa de repetición con el colon inflado. Cortar la salchicha de la jeringa de repetición y colocar en tubo de 15 mL que contenga 10 mL de EDTA de 50 mM (2mM para intestino delgado) durante 40 min y girar a 4 °C(Figura 1J,K).
- Decantar la solución de EDTA y reemplazar con 5 mL de tampón de agitación. Agitar la salchicha manualmente en posición vertical (vigorosamente) durante 2 min.
- Decantar la solución de agitación en un nuevo tubo de 15 mL y repetir el paso de agitación para un total de 10 mL de criptas en el tampón de agitación.
- Tome 20 μL de la suspensión de la cripta en una placa de Petri y cuente el número de criptas bajo un microscopio. Calcular la concentración de criptas en criptas/μL. Dependiendo de la concentración, diluir las muestras para obtener 5 criptas/μL en el momento del revestimiento (1000 criptas/cm2).
- Gire el tubo con criptas aisladas usando centrífuga de mesa a 400 x g durante 10 min a 4 °C.
- Mientras tanto, retire la placa/inserto/cámara de 48 pozos de la incubadora y colóquele en el gabinete de bioseguridad. Aspire la solución de recubrimiento usando P200 y deje la placa con la tapa ligeramente desplazada hasta que las células estén listas para ser plateadas.
4. Cultivo de monocapa 2D
NOTA: Para un protocolo detallado sobre cómo generar monocapas epiteliales intestinales a partir de colonoides 3D comprobar protocolos por Estes y laboratorios Kovbasnjuk (7,11).
- Retire el tampón de agitación con pipeta serológica de 10 mL. Asegúrese de que el pellet está intacto y puede usar P1000 para eliminar cualquier líquido que quede. Vuelva a suspender el pellet en 3 mL de medio completo LWRN y pipetete hacia arriba y hacia abajo con P1000. Añadir 200 μL de criptas a cada pozo de un portaobjetos de placa/cámara de 48 pozos pre-recubierto e incubar en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C.
- Al día siguiente, aspire los medios con P200 y agregue medios nuevos. Las células llegan a ser confluentes en 24-48 h.
- Para inserciones de membrana de cultivo celular, agregue 200 criptas de μL (5 criptas /μL) a la parte superior de las inserciones y 600 μL de medios L-WRN completos a la parte inferior. Al día siguiente, aspire los medios usando P200 y agregue medios frescos solo a la cámara superior. Incubar la placa en una incubadora al 5% deCO2 a 37 °C. La resistencia eléctrica transepitelial (TEER) se mide todos los días utilizando el medidor epitelial voltio /ohmio (EVOM).
NOTA: Si el cultivo tiene una lectura teer mayor que 300 Ω.cm2,están destinados a ser confluentes. La confluencia se logra en 3-4 días. Cambiar de medio cada 2 días.
Representative Results
Para ilustrar la confiabilidad de las culturas epiteliales primarias de la monocapa de los dos puntos, un resumen del aislamiento de la cripta y de las imágenes representativas derivadas del protocolo se demuestra. El usuario debe tener en cuenta que las criptas aisladas se cultivan en condiciones estériles, por lo que una correcta disección y limpieza del colon es una prioridad. La figura 1 presenta los pasos clave durante el aislamiento de cripta. Las criptas aisladas (Figura 2A) ahora se cuentan y concentran (Figura 2B) para obtener una concentración de 5 criptas/μL. Después de una preparación concentrada de criptas, las células se platearán en el formato deseado (plato de cultivo, insertos de membrana o portaobjetos de cámara) y se incubarán con los medios apropiados dependiendo de las necesidades experimentales. La Figura 3 muestra la progresión del cultivo después de 24 y 48 h de cultivo en placas de 48 pozos. Las células se incuban hasta que se alcanza la confluencia deseada. Para ejemplificar las posibles aplicaciones de este método, permitimos que los pozos de placa de 48 pozos alcanzaran la confluencia y procedimos a hacer un ensayo de herida de arañazo. La Figura 4 representa un rasguño recién creado (Figura 4A) en una monocapa colonoide 2D y la misma herida 24 h después (Figura 4B). Está claro que el cultivo sigue siendo saludable y viable y hay reparación de heridas. Para generar monocapas diferenciadas, los medios se cambian de LWRN a medios de diferenciación. La diferenciación se consigue mostrando altos valores de TEER(Figura 5A),disminución de marcadores ISC ((Receptor acoplado a proteína G rica en leucina rica en repetición 5 (Lgr5) y Achaete-scute como 2 (Ascl2)) y aumento de los marcadores de diferenciación ((Alanil aminopeptidasa (Anpep), Mucina 2 (Muc2), lisizima 1 (Lyz1), Sacarosa iso-maltasa (Sis) y Chrmogranina A (Chga))(Figura 5B,C)por PCR. Otros marcadores como CDX2 y KRT20 también se pueden incluir en este panel. Además de los niveles de expresión de ARNm, la aparición de sub-tipos de células epiteliales diferenciadas en colonoides 2D cultivados en condiciones de diferenciación también se muestra por inmunofluorescencia (Muc2 y Chga; Figura 5D).
Figura 1:Preparación de muestras para la generación de monocapas saludables. La preparación de la muestra es crucial para la generación de monocapas saludables. Los pasos clave del proceso de aislamiento se describen en esta figura para que sea más fácil para el lector. El colon se extirpa del ratón, asegurándose de que no haya restos de piel. Retire cuidadosamente las heces asegurándose de no perforar el colon; esto es de vital importancia ya que el colon necesita ser capaz de contener aire y ser inflado y desinflado. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 2: Recuento y concentración de aislamiento de cripta. (A) Criptas colónicas después de agitar las salchichas de colon. La imagen representa un campo de una caída de 20 μL. (B) Concentración de cripta para obtener 5 criptas/μL. Barra de escala: 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:Crecimiento primario de monocapa IEC. (A)Monocapas IEC 2D después de 24 h de revestimiento y eliminación de desechos celulares. (B) Monocapas IEC 2D confluentes 48 h después del revestimiento. Barra de escala: 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:Ensayos de heridas por arañazos utilizando IEC primario murino. Imágenes que muestran la herida que cura después de que un rasguño fuera hecho en monocapa epitelial de los dos puntos. Barra de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5:Diferenciación de monocapas epiteliales de colon. (A) Los medios de diferenciación crean barreras epiteliales estrechas como lo demuestra el TEER. Los medios de diferenciación causan una caída en la expresión de ARNm de(B)marcadores de células madre y regulación al alza de(C)marcadores de diferenciación. (D)Los marcadores de células epiteliales diferenciadas especializadas tales como Muc2 y Chromogranin-A se pueden también detectar vía la inmunofluorescencia de colonoids 2D directos. Barra de escala: 5 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Nuestro protocolo proporciona un método rápido, reproducible y confiable para generar monocapas IEC 2D primarias directas. Una de las principales diferencias en nuestro protocolo en comparación con los protocolos publicados anteriormente para generar monocapas epiteliales de colon es que no cortamos el colon en pequeños trozos para liberar las criptas. En su lugar, adaptamos un protocolo para separar el epitelio intestinal del punto de equilibrio13 mediante una combinación de fuerzas químicas y mecánicas para liberar criptas en una preparación extremadamente limpia,(Figura 2),proporcionando al investigador material ideal para generar cultivos primarios. Nuestro método de aislamiento también se puede utilizar para generar enteroides 3D y colonoides. Es importante hacer un recuento de criptas cada vez que se realiza un experimento para normalizar el número de criptas que se están plateando. Variables como la turgencia de la salchicha de colon, la velocidad de aislamiento, la experiencia del usuario pueden afectar el número de criptas aisladas. La concentración de cripta de chapado sugerida mencionada en el protocolo es un punto de partida, pero cada usuario para tener en cuenta las variables impulsadas por el usuario debe optimizarla. Hemos utilizado esta técnica con ratones WT machos y hembras que van desde las 8 a las 20 semanas y no hemos visto grandes diferencias en la supervivencia celular, en teoría las criptas aisladas de ratones más jóvenes tienen mejores posibilidades de sobrevivir. Las criptas están plateadas en exceso, ya que solo un pequeño porcentaje de ellas se adhieren a la superficie y sobreviven. Un equilibrio donde hay suficientes criptas para tener una confluencia del 50% un día después del chapado, pero no demasiadas criptas donde las criptas moribundas tendrán un efecto citotóxico es el objetivo. Los medios LWRN deben eliminarse cuidadosamente 24 horas después del revestimiento para eliminar las criptas muertas y los desechos, esto debe hacerse con cuidado para evitar la separación de células que ya están creciendo como una monocapa.
Después de la eliminación inicial de los medios LWRN, el usuario debe decidir si las condiciones experimentales requieren monocapas IEC primarias que permanezcan más cerca de las células madre y agreguen medios LWRN frescos o si se desea diferenciar la monocapa, reemplazarlas por medios de diferenciación. El factor más importante en este protocolo es asegurar la integridad del colon durante el proceso de aislamiento. Si se produce una ruptura, la salchicha se puede acortar para eliminar el área dañada. Antes de poner la salchicha en EDTA asegúrese de que los nudos estén lo más apretados posible. Si la salchicha se desinfla después de la incubación de EDTA, el protocolo se puede continuar con poco o ningún efecto en el rendimiento general de la cripta. Si la jeringa de repetición no está disponible, una punta de micropipeta regular unida a una jeringa regular también se puede utilizar para el proceso de inflación y deflación. Además, si no hay una solución de recuperación celular disponible, los pasos de inflación y deflación se pueden realizar en EDTA (intestino delgado de 2mM, 50 mM de colon), pero no se recomienda esta sustitución. Si no se requiere confluencia, las criptas pueden crecer en placas recubiertas solo con colágeno e incluso en placas no recubiertas. Sólo el uso de placas sin recubrimiento casos no hay otra opción, pero las células no crecerán saludables como lo harían en las placas recubiertas de colágeno. Cuando se trata de la salud y la estabilidad del cultivo, las monocapas chapadas en plástico son saludables durante 4 a 5 días, mientras que las monocapas plateadas en transwells se pueden transportar hasta por 8 días.
Una de las principales limitaciones de este método es el medio celular necesario para cultivar las monocapas epiteliales del colon. Las células LWRN están disponibles en ATCC, pero la generación de medios acondicionados LWRN requiere mucha mano de obra y requiere acceso a un espectrómetro fluorescente para determinar la actividad Wnt. Los medios de diferenciación requieren una serie de reactivos que se añaden frescos antes de su uso, lo que lo convierte en un proceso tedioso. Finalmente, la mayoría de estos reactivos son costosos y es fácil quemar los reactivos a un ritmo rápido. Si un laboratorio desea establecer esta técnica sin cultivo celular primario intestinal previo, es muy recomendable encontrar un colaborador/colegio con experiencia y formar a uno de sus miembros.
El mantenimiento del cultivo 3D podría ser costoso debido al costo de la matriz de membrana basal de volúmenes medios acondicionados medios y altos necesarios para los cultivos organoides, pero tiene la ventaja de utilizar un número reducido de ratones y las estructuras generadas se pueden pasar muchas veces. Los enteroides (derivados del intestino delgado) son relativamente fáciles de aislar y mantener, mientras que los colonoides son más delicados, crecen a un ritmo más lento y tienen una capacidad de paso más limitada. La generación de monocapas a partir de colonoides 3D requiere una cantidad desproporcionada de estructuras 3D, que hacen que este tipo de experimentos consuman mucho tiempo y sean costosos. Por el contrario, la preparación epitelial directa de la monocapa del colon es rápida y es una forma rápida de obtener los resultados. Una preparación de colon puede generar un área confluente de 75cm2 (10 a 15 mL de medios acondicionados, reemplaza una vez) de 2 a 3 días después del revestimiento (esta área requeriría 144 pozos de colonoides 3D, lo que significa casi 6mL de Matrigel y más de 250 mL de medios acondicionados). El menor consumo de medios, el bajo costo de mantenimiento del cultivo celular y la capacidad de realizar pruebas funcionales y el rápido procesamiento aguas abajo son grandes ventajas de las monocapas epiteliales de colon.
Este protocolo es una herramienta valiosa en el estudio de la biología de célula epitelial intestinal en áreas tales como célula-adherencia, polaridad, y diferenciación. Da la ventaja de generar cultivos celulares primarios a partir de ratones genéticamente modificados (knock-out, sobreexpresación, reporteros). Las monocapas epiteliales intestinales primarias permiten un fácil acceso a las superficies apical y basolateral (cuando se platean en transwells) permitiendo el estudio de la permeabilidad, barrera y migración transepitelial de diferentes tipos de células. Finalmente, este modelo puede ser útil en diferentes campos como las interacciones huésped-patógenos, el daño epitelial y la reparación y el descubrimiento de fármacos.
Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por un Premio de Desarrollo Profesional de la Fundación de Crohn y Colitis (544599, a MQ) y las subvenciones de los NIH (DK055679, DK089763, DK059888, a AN). Nos gustaría agradecer al Laboratorio de Modelado de Tejido Traslacional de Medicina de Michigan por su continua ayuda y acceso a sus reactivos y protocolos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Antibiotic Antimycotic solution | Corning | 30-004CI | |
| B27 supplement (50X) | Gibco | 12587-010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen from human placenta (type IV) | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| D-Sorbitol | Sigma | 85529-250G | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Epithelial Volt/Ohm meter | World Precision Instruments | 0-10KΩ with STX2 (EVOM2) | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Lonza | 51201 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-016-CV | |
| Firefly Luciferase assay | Biotium | 30085-2 | |
| Geneticin | Gibco | 10131-035 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES (1M) | Corning | 25060CI | |
| Human recombinant EGF | R&D systems | 236-EG | Stock Concentration: 500µg/mL |
| Human recombinant Wnt-3A | R&D systems | W3a-H-005 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| LWRN cells | ATCC | CRL-3276 | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CV | |
| N2 supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock Concentration: 500mM |
| Noggin | Conditioned media | - | |
| Nunc Lab-Tek Chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182-1PAK | |
| Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL) | Corning | 30002CI | |
| Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic 20G feeding tube | Fisher Scientific | 50-810-46 | |
| rh-laminin-521 | Gibco | A29248 | Stock concentration: 100µg/mL |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD | Fisher Scientific | NC9452680 | |
| TOPflash HEK293 cells | ATCC | CRL-3249 | |
| Transwell Permeable supports (0.4µm) | Corning | 3470 |
References
- Quiros, M., Nusrat, A. Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair. Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).
- Blutt, S. E., et al. Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).
- Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications. Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Cardenas, D., et al. Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium. Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Zou, W. Y., et al. Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections. Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Nik, A. M., Carlsson, P. Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme. Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).
