Summary
בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד ליצור מונוליירים אפיתל ראשוניים של אפיתל ישירות מקריפטות מעיים. אנו מספקים גישות ניסיוניות כדי ליצור monolayers confluent על מסננים חדירים, monolayers confluent לריפוי פצעי גירוד ומחקרים ביוכימיים, ו monolayers דליל ונוח לניתוח כשל חיסוני.
Abstract
האפיתל במעיים מורכב משכבה אחת של תאים הפועלים כמחסום בין לומן המעיים לבין פנים הגוף. הפרעה בהמשכיות של מחסום זה יכולה לגרום להפרעות דלקתיות כגון מחלות מעי דלקתיות. אחת המגבלות בחקר הביולוגיה האפיתל במעיים הייתה היעדר מודלים ראשוניים של תרבית תאים, אשר חייבה את החוקרים להשתמש בקווי תאים מודל נגזר קרצינומות. הופעתם של אנטנואידים תלת מימדיים (3D) העניקה לביולוגים אפיתל כלי רב עוצמה ליצירת תרביות תאים ראשוניות, עם זאת, מבנים אלה מוטמעים במטריצה חוץ-תאית וחסרים את הבגרות האופיינית לתאי אפיתל מעיים מובחנים. מספר טכניקות ליצירת מונוטלרים אפיתל מעיים פורסמו, אבל רוב נגזרים enteroids 3D הוקמה מה שהופך את התהליך מייגע ויקר. כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מונוליירים ראשוניים של מעיים אפיתל ישירות מקריפטות מעיים מורין. אנו מפרטים גם גישות ניסיוניות שניתן להשתמש בהן עם מודל זה כגון יצירת תרבויות מבלבלות על מסננים חדירים, מונולייר מבלבל למחקרי ריפוי פצעי גירוד ומונוליירים דלילים ומבלבלים לניתוח כשל חיסוני.
Introduction
תאי אפיתל המעיים (IEC) מרפדים את המעיים ויוצרים מחסום חדיר סלקטיבי המאפשר ספיגת חומרים מזינים ומים תוך מניעת מיקרואורגניזמים ורעלים להיכנס לגוף 1. רירית המעי מורכבת מהקרנות זוהרות הנקראות וילי (רק במעי הדק) ופולשים הנקראים קריפטות. וילי ואת פני השטח של קריפטות המעי הגס מכוסים על ידי תאי אפיתל מובחנים בעוד הבסיס של הקריפטות מורכב תאי גזע שהופכים את ההתחדשות המהירה של אפיתליה מעיים, אשר יש מחזור מ 3 עד 7 ימים. תאי גזע מעיים (ISC) חשובים לא רק לשמירה על הומאוסטזיס במעיים אלא לתיקון נאות של אפיתליה פגומה2.
חקר הביולוגיה של אפיתליה במעיים היה מוגבל על ידי היעדר תרביות תאים ראשוניות עם קווי תאים שהשתנו להיות הכלי היחיד זמין. קווי תאים מודל אפיתל מעיים אינם מסוגלים לשכפל במדויק את הפיזיולוגיה של אפיתל המעי הנורמלי. הפיתוח של תרבויות 3D נגזר ISC סיפק ביולוגים הרירית במעיים עם מודלים במבחנה הדומים בתנאים ריר במעיים vivo3. קריפטות ניתן לבודד בקלות מדגימות מורין, מוטבע בינוני מטריצת קרום מרתף (למשל, Matrigel) וגדל במדיה מותנית המכילה Wnt3a, R-spondin, ו Noggin, יצירת מבנים 3D המכונה enteroids (המעי הדק) או קולונואידים (מעי גס)4. Enteroids ו קולונואידים הם מבנים כדוריים מקוטבים שבהם התחום האפור פונה לומן פנימי והאזור הבסיסי נמצא במגע ישיר עם המטריצה החוץ תאית. Enteroids ו colonoids מכילים את כל תת-סוגי אפיתל מעיים מובחנים העיקריים כגון Enterocytes / Colonocytes, Paneth, Enteroendocrine ותאי גביע והם מופיעים בפרופורציות זהות יחסית כפי שהם מופיעים בחלק של המעיים שבו הם היו מבודדים מ5. למרות 3D enteroids ו colonoids מייצגים התקדמות משמעותית בחקר התפתחות המעיים ופיזיולוגיה, מודלים אלה מציגים חסרונות מסוימים כגון גישה מוגבלת לפני השטח apical של תאי האפיתל (לומן) ואת היכולת לטפס על תרבויות למעלה או למטה כדי להשיג סינון תפוקה גבוהה של מולקולות של עניין. כדי להתגבר על מגבלות אלה, נוצרו פרוטוקולים להשגת תרבויות דו-ממדיות עיקריות של חברת החשמל הנגזרות מ- enteroids/colonoids תלת-ממדיים. 2D enteroids / colonoids לגדול כמו גיליון של תאים בדיוק כמו קווי תאים מודל לעשות והם אידיאליים ללמוד תיקון פצעי מעיים, אינטראקציות מארח-פתוגן, ורפואה רגנרטיבית בין היתר. מספר מאמרים שפורסמו מתארים כיצד ליצור מונוליירים דו-ממדיים ממבנים תלת-ממדיים או ישירות מקריפטות מעיים, (ראה6,7,8,9,10,11) אך שיטות אלה נוטות להיות עבודה אינטנסיבית וקשה להתרבות. שיטה מהירה, פשוטה וניתן לשחזור להשגת מונוליירים ישירות מקריפטות מעיים של עכברים מבודדים טריים מתוארת בפרוטוקול זה.
כאן אנו מסבירים בפירוט את תהליך מיצוי הקריפטה עם דור מינימלי של פסולת, בחירת מטריצה חוץ-תאית ומשטחים ויישומים שונים לטכניקה זו. גישה ניסיונית זו הייתה אופטימיזציה עבור קריפטות המעי הגס, אבל תוצאות דומות מתקבלות כאשר מוחל על המעי הדק.
Protocol
כל ההליכים המתוארים להלן אושרו ובוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן.
1. הכנת ריאגנטים לבידוד ותרבות הקריפטה (היכונו למכסה המנוע של תרבות הרקמות)
- 50 מ"מ אתילנדיאמין חומצה טטראאצטית (EDTA): להוסיף 50 מ"ל 0.5 M מלאי ל 450 מ"ל של מלוחים מאגר פוספט, ללא סידן (Ca2+) ומגנזיום (מ"ג2 +) כדי להכין 500 מ"ל. בפרוטוקול זה PBS יתייחס PBS ללא סידן ומגנזיום אלא אם כן צוין אחרת.
- חיץ לנער: להמיס 7.4 גרם סוכרוז (43.3 מ"מ) ו 5 סורביטול גרם (54.9 מ"מ) ב PBS להכין 500 מ"ל.
- L-WRN (ל-וונט-3A, R-spondin ו Noggin) מדיה: תוספת מתקדמת של Dulbecco של הנשר שונה בינוני / Ham של F-12 (DMEM / F12) (780 מ"ל) עם 20% סרום שור עוברי (FBS) (200 מ"ל), 1x מסחרי זמין תוספת גלוטמין (10 מ"ל), 100 U/mL פניצילין ו, 100 גרם / מ"ל סטרפטומיצין (10 מ"ל), ומסנן לעקר עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
- קבל תאי L-WRN דרך ATCC, לגדול צלושי T175, ובחר באמצעות גנטיקה והיגרומיצין. המדיה משתנה ונאספת במשך 12 יום.
הערה: כל אצווה של מדיה נבדקת עבור פעילות Wnt באמצעות בדיקה של TOPflash Wnt Reporter. במקרה זה פרוטוקולי המעבדה למידול רקמות תרגום של הרפואה במישיגן (https://www.umichttml.org/protocols) בוצעו. קו התא TOPflash HEK 293 גדל למפגש בבקבוק T75, טריפסיני ומוצף על צלחת של 96 באר. למחרת דילולים שונים של המדיה שנאספה מתווספים לתאים ומדגירים באינקובטור CO2 5% ב 37 °C (69 °F) לילה. למחרת, התאים הם lysed, ו Firefly לוציפראז assay מבוצע על פי הוראות היצרן. ההסתעפות מנורמלת באמצעות Wnt-3A רקומביננטי. המדיה מחולקת 25 מ"ל aliquots בצינורות חרוט 50 מ"ל ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
- קבל תאי L-WRN דרך ATCC, לגדול צלושי T175, ובחר באמצעות גנטיקה והיגרומיצין. המדיה משתנה ונאספת במשך 12 יום.
- מדיה בסיסית: עבור 500 מ"ל, תוספת מתקדם DMEM/F12 (448 מ"ל) עם תוסף גלוטמין 2x זמין מסחרית (10 מ"ל), 20 מ"מ HEPES (10 מ"ל), 100 U/mL פניצילין ו, 100 גרם / מ"ל סטרפטומיצין (10 מ"ל), 2 מ"מ N-אצטיל-L-ציסטאין (2 מ"ל), תוספת N2 (10 מ"ל) ותוסף B27 (20 מ"ל), מסנן לעקר עם מסנן 0.22 מיקרומטר. לחלק את המדיה ל 25 aliquots מ"ל בצינור חרוט 50 מ"ל ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
- LWRN מדיה מלאה: לשלב 25 mL LWRN מדיה עם 25 מ"ל של מדיה בסיסית תוספת עם 200 ng/mL אפידרמיס גורם גדילה (EGF) (20μL) ו 2x פתרון אנטיביוטי אנטיביוטי (1 מ"ל). אחסן את המדיה המלאה ב- 4 °C (69 °F).
- קולגן ולמינין: להמיס 5 אבקת מ"ג ב 5 מ"ל של מסנן מעוקר 100 מ"מ חומצה אצטית (להוסיף 60 μL של מלאי חומצה אצטית ל 9.94 מ"ל של מים מולקולריים) כדי לייצר ריכוז מלאי של 1 מ"ג / מ"ל. לסובב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות ולעשות 100 μL aliquots בצינורות 0.2 מ"ל. להקפיא ב -20 מעלות צלזיוס. למין נרכש בריכוז מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל.
- מדיה מלאה ללא גורמי גדילה (CMGF-): תוספת DMEM/F12 מתקדם (500 מ"ל) עם תוסף גלוטמין זמין מסחרית 1x (5 מ"ל), 10 מ"מ HEPES (5 מ"ל), 100 U/mL פניצילין, ו, 100 גרם / mL סטרפטומיצין (5 מ"ל).
- מדיה בידול: כדי 9.2 מ"ל של CMGF- מדיה, להוסיף 200 μL של תוספת B27, 100 μL של תוסף N2, 20 μL של N-אצטיל-L-ציסטאין, 500 μL של מדיה Noggin12 (עשוי תאים המייצרים Noggin) ו 2 μL של EGF כדי להפוך 10 מ"ל של מדיה בידול.
2. הכנת צלחות, שקופיות קאמריות ותוספות קרום תרבות התא
- ציפוי 48-באר צלחת שקופיות תא לציפוי מונולאייר 2D: השתמש בתמיסת הציפוי המהווה למין (1:40 דילול, ראה טבלה של חומרים)וקולגן (1:30 דילול) מלוחים אגירה פוספט של Dulbecco קר, עם Ca2 + ו Mg2 + (DPBS). הוסף 200 μL של פתרון ציפוי לכל באר מראש דגירה צלחת / שקופית תא ב 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (69 °F) לפחות 2 שעות.
- ציפוי 0.4 מיקרומטר תרבית תאים מוסיף: להפוך 1:30 דילול של קולגן במים כיתה מולקולרית ולהוסיף 200 μL לכל הכנס. שמור את הצלחת המכילה את הממברנה להוסיף על קרח ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות דגירה, לשמור את הצלחת ב 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (69 °F) עבור 1.5-2 שעות. פוליאסטר וקרום פוליקרבונט מוסיף להניב תוצאות דומות.
הערה: כל צלחת תרבית רקמה ניתן לזרוע (למעלה וצמצומים ניתן לבצע) באמצעות פרוטוקול זה על ידי התאמת נפח קולגן / למין כדי לקבל כיסוי מלא של משטח הציפוי.
3. בידוד קריפטה
הערה: לפני תחילת הניתוח, להכין קולגן ו / או למין מצופה צלחת / ממברנה מוסיף / שקופית תא ולהשאיר אותם 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (69 °F). הכינו ספסל עבודה נקי ומכשירים כירורגיים סטריליים המתאימים לניתוח, וארון בטיחות ביולוגי לפולחן מונוליירים דו-מימדיים. אשרו את כל הציוד הסטנדרטי האחר עבור קולטי מונולייר דו-מימדיים כגון חממת CO2 לחה, צנטריפוגות שולחן (מתוחזקות ב-4 מעלות צלזיוס), מיקרוסקופ ופיפטות (כולל פיפטות סרולוגיות) מוכנות.
- השתמש C57Bl/6 עכברים, 8-12 שבועות. המתת חסד לעכברים בשיטה מאושרת של המתת חסד.
- לרסס את פגרים עכברים עם 70% אתנול (EtOH) פתרון לנקות את אזור הניתוח ולהסיר עודף EtOH באמצעות רקמת נייר.
הערה: ודא כי ריאגנטים בידוד הקריפטה (כגון PBS, 50 mM EDTA, לחיץ לנער) קריפטות נשמרים קרים. ריאגנטים אלה יכולים להיות מוכנים יום אחד לפני והם טובים לשימוש לפחות 3 חודשים כאשר מאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס. כמו כן, ודא כי המדיה המלאה LWRN נשמר באמבט חרוזים / מים מתוחזק ב 37 מעלות צלזיוס עד השימוש. - באמצעות מספריים ומלקחיים נקיים, לנתח את המעי הגס מפי הטבעת אל cecum. החזיקו את קצה המעי הגס בעזרת מלקחיים ושטפו בעדינות רבה את הצואה באמצעות PBS קר כקרח במזרק של 10 מ"ל, המצויד בצינור האכלה של 20 גרם(איור 1A). הקפד לא לקרוע את המעי הגס.
- הסר את המעי הגס הפרוקסימלי. זה יהיה החלק של המעי הגס הקרוב ביותר לצומת ileocecal.
- בעזרת מלקחיים, החליקו בעדינות את המעי הגס הדיסטלי אל צינור ההזנה של 20 G, וקשרו את המעי הגס בקצה הצינור בקצה חוט תפר משי 4-0(איור 1B).
- הפוך את המעי הגס מבפנים החוצה באמצעות אצבעותיו של אחד מעל הקצה קשור ולקשור את הקצה השני עם חוט תפר משי 4-0. בעזרת מספריים כירורגיות, חותכים את המעי הגס מתחת לקצה צינור ההזנה(איור 1C, D,E).
- באמצעות הכוען של מזרק חוזר 1.25 מ"ל, בעדינות לפתוח את הקצה הלא מאוית של המעי הגס הפוך על קצה של מזרק חוזר 1.25 מ"ל. החליקו את המעי הגס ההפוך לקצה המזרק וקשורו בחוזקה חוט תפר משי 4-0(איור 1F, G).
- הכנס את הוכנה לתוך המזרק ולנפח את המעי הגס כדי ליצור נקניק. לנפח עד נקניק המעי הגס נראה טורגנט ללא קמטים גלויים (איור 1H).
- מניחים מזרק /המעי הגס בצינור 15 מ"ל עם 5 מ"ל של פתרון שחזור תאים על קרח במשך 20 דקות, מנפחים ומנפחים את המעי הגס אחת ל-5 דקות(איור 1I). הנקניק חייב להישאר מנופח במהלך הדגירה.
- לקשור באמצעות חוט תפר משי 4-0 מתחת לקצה המזרק לחזור עם המעי הגס מנופח. חותכים את הנקניק את המזרק חוזר ומניחים בצינור 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של 50 מ"מ (2mM עבור המעי הדק) EDTA במשך 40 דקות ולסובב ב 4 מעלות צלזיוס(איור 1J,K).
- כבה את פתרון EDTA ולהחליף עם 5 מ"ל של חוצץ לנער. לנער את הנקניק באופן ידני במצב אנכי (במרץ) במשך 2 דקות.
- Decant את הפתרון רועד לתוך צינור חדש 15 מ"ל ולחזור על שלב רועד עבור סך של 10 מ"ל של קריפטות חיץ רועד.
- קח 20 μL של השעיית הקריפטה בצלחת פטרי ולספור את מספר הקריפטות תחת מיקרוסקופ. לחשב את ריכוז הקריפטה בקריפטות /μL. בהתאם לריכוז, לדלל את הדגימות כדי לקבל 5 קריפטות / μL ברגע של ציפוי (1000 קריפטות / ס"מ2).
- לסובב את הצינור עם קריפטות מבודדות באמצעות צנטריפוגה שולחן ב 400 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- בינתיים, להסיר צלחת 48-באר / הכנס / שקופית תא מן האינקובטור ומניחים אותו בארון biosafety. לשאוף את פתרון הציפוי באמצעות P200 ולהשאיר את הצלחת עם המכסה מעט לקזז עד התאים מוכנים להיות מצופה.
4. קולטני 2D מונולייר
הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט על איך ליצור monolayers אפיתל מעיים מן המעי הגס 3D לבדוק פרוטוקולים על ידי אסטס מעבדות Kovbasnjuk (7,11).
- הסר את מאגר הרעידות באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. ודא כי גלולה הוא שלם, ייתכן באמצעות P1000 כדי להסיר כל נוזל עזב. להשעות מחדש את גלולה ב 3 מ"ל של LWRN מדיה מלאה פיפטה למעלה ולמטה עם P1000. הוסף 200 μL של קריפטות לכל באר של צלחת מצופה מראש 48-טוב / שקופית קאמרית דגירה ב 5% CO2 חממה ב 37 °C (69 °F).
- למחרת לשאוף את המדיה באמצעות P200 ולהוסיף מדיה חדשה. התאים הופכים להיות משולבים ב 24-48 שעות.
- עבור מוסיף קרום תרבות התא, להוסיף 200 μL crypts (5 קריפטות / μL) לראש מוסיף ו 600 μL של מדיה מלאה L-WRN לחלק התחתון. למחרת לשאוף את התקשורת באמצעות P200 ולהוסיף מדיה טרייה רק לתא העליון. דגירה את הצלחת ב 5% CO2 אינקובטור ב 37 °C (69 °F). התנגדות חשמלית Transepithelial (TEER) נמדדת מדי יום באמצעות מד וולט אפיתל / אוהם (EVOM).
הערה: אם לתרבות יש קריאת TEER הגדולה מ- 300 Ω.cm2, הם אמורים להיות משולבים. קונפלונציה מושגת ב 3-4 ימים. שנה מדיה כל יומיים.
Representative Results
כדי להמחיש את האמינות של תרבויות המונולאייה הראשיות של המעי הגס האפיתל, מוצג סיכום של בידוד הקריפטה ותמונות מייצגות הנגזרות מהפרוטוקול. המשתמש חייב לזכור כי הקריפטות המבודדות מתורבתות בתנאים סטריליים, ולכן ניתוח נכון וניקוי המעי הגס הוא בראש סדר העדיפויות. איור 1 כולל שלבים מרכזיים במהלך בידוד קריפטה. קריפטות מבודדות (איור 2A) נספרות ומרוכזות כעת (איור 2B) כדי לקבל ריכוז של 5 קריפטות/μL. לאחר הכנה מרוכזת של קריפטות, התאים יהיו מצופים בפורמט הרצוי (צלחת תרבות, מוסיף ממברנה או שקופיות תא) ודגירה עם המדיה המתאימה בהתאם לצרכים ניסיוניים. איור 3 מראה התקדמות תרבותית אחרי 24 ו-48 שעות של תרבות בצלחות של 48 בארות. התאים הם דגירה עד המפגש הרצוי הוא הגיע. כדי להדגים יישומים אפשריים של שיטה זו, אפשרנו בארות צלחת 48 בארות להגיע confluency והמשכנו לעשות בדיקת פצע שריטה. איור 4 מתאר שריטה שנוצרה זה עתה (איור 4A)במושב דו-מושבי ואותו פצע 24 שעות לאחר מכן (איור 4B). ברור שהתרבות עדיין בריאה ובת קיימא ויש תיקון פצעים. כדי ליצור מונולייטרים מובחנים, המדיה משתנה מ- LWRN למדיית בידול. הבידול מושג על ידי הצגת ערכי TEER גבוהים (איור 5A), ירידה של סמני ISC ((קולטן מצמד חלבון G המכיל לאוצין 5 (Lgr5) ו- Achaete-scute כמו 2 (Ascl2)) והגדלת סמני הבידול (()אלניל אמינופטידאז (אנפפ), מוצ'ין 2 (Muc2), ליזוזים 1 (Lyz1), סוכרוז איסו-מלטאז (סיס) וקרמוגרנין A (צ'אגה))(איור 5B,C)מאת PCR. סמנים אחרים כמו CDX2 ו- KRT20 ניתן לכלול גם בלוח זה. בנוסף לרמות ביטוי mRNA, המראה של תת-סוגים של תאי אפיתל מובחנים במעי הגס דו-מימדיים הגדלים בתנאי בידול מוצג גם על ידי שפעת המערכת החיסונית (Muc2 ו- Chga; איור 5D).
איור 1: הכנה לדוגמה ליצירת מונוליירים בריאים. הכנת מדגם חיונית ליצירת מונוליירים בריאים. שלבים מרכזיים בתהליך הבידוד מתוארים באיור זה כדי להקל על הקורא. המעי הגס הוא מגורש מן העכבר, לוודא שאין שאריות פרווה. בזהירות להסיר את הצואה לוודא שאתה לא לנקב את המעי הגס; זה הוא בעל חשיבות חיונית כמו המעי הגס צריך להיות מסוגל להחזיק אוויר להיות מנופח ומנוטרל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ספירת בידוד בקריפטה וריכוז. (A)קריפטות קולוניאליות לאחר טלטול נקניקיות המעי הגס. התמונה מתארת שדה של ירידה של 20 μL. (B)ריכוז קריפטה על מנת לקבל 5 קריפטות / μL. סרגל סולם: 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: צמיחה ראשית שלמונולאייר של חברת החשמל. (A) מונוליירים דו-ממדיים של חברת החשמל לאחר 24 שעות של ציפוי והסרה של פסולת תאים. (B)קופלואנט 2D IEC monolayers 48 שעות לאחר הציפוי. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מבחני פצעי גירוד באמצעות חברת החשמל הראשית. תמונות המראות ריפוי פצעים לאחר שריטה נעשתה במושבת אפיתל. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: בידול של מונוליירים של מעי גס אפיתל. (A) מדיה בידול יוצרת מחסומי אפיתל הדוקים כפי שהוכח על ידי TEER. מדיה בידול גורמת לירידה בביטוי mRNA של (B) סמני תאי גזע ו upregulation של (C) סמני בידול. (D)סמנים של תאי אפיתל מובחנים מיוחדים כגון Muc2 ו Chromogranin-A ניתן לזהות גם באמצעות immunofluorescence של קולונואידים דו-ממדיים ישירים. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
הפרוטוקול שלנו מספק שיטה מהירה, הניתנת לשחזור ואמינה ליצירת מונוליירים ראשוניים ישירים של חברת החשמל. אחד ההבדלים העיקריים בפרוטוקול שלנו בהשוואה לפרוטוקולים שפורסמו בעבר כדי ליצור מונוליירים אפיתל המעי הגס הוא שאנחנו לא חותכים את המעי הגס בחתיכות קטנות כדי לשחרר את הקריפטות. במקום זאת, התאמנו פרוטוקול להפרדת אפיתל מעיים ממזנצ'ים13 על ידי שילוב של כוחות כימיים ומכאניים לשחרור קריפטות בהכנה נקייה ביותר, המספקת לחוקר חומר אידיאלי ליצירתתרבויותראשוניות. שיטת הבידוד שלנו יכולה לשמש גם ליצירת enteroids 3D ו colonoids. חשוב לעשות ספירת קריפטה בכל פעם שמתבצע ניסוי כדי לנרמל את מספר הקריפטות המצופה. משתנים כגון טורגור נקניקיות המעי הגס, מהירות הבידוד, מומחיות המשתמש יכולה להשפיע על מספר הקריפטות המבודדות. ריכוז קריפטת הציפוי המוצע המוזכר בפרוטוקול הוא נקודת התחלה, אך כל משתמש שיש לקחת בחשבון משתנים מונחי משתמש חייב למטב אותו. השתמשנו בטכניקה זו עם עכברי WT זכר ונקבה הנעים בין 8 ל -20 שבועות ולא ראינו הבדלים גדולים בהישרדות התאים, בתיאוריה קריפטות מבודדות מעכברים צעירים יש סיכוי טוב יותר לשרוד. קריפטות מצופות עודף כמו רק אחוז קטן מהם לצרף את פני השטח ולשרוד. איזון שבו יש מספיק קריפטות יש 50% מפגש יום אחד לאחר ציפוי אבל לא יותר מדי קריפטות שבו הקריפטות הגוססות תהיה השפעה ציטוטוקסית היא המטרה. מדיה LWRN יש להסיר בזהירות 24 שעות לאחר הציפוי כדי לחסל קריפטות מתות ופסולת, זה חייב להיעשות בזהירות, כדי למנוע ניתוק תאים שכבר גדלים כמו monolayer.
לאחר הסרה ראשונית של מדיית LWRN, על המשתמש להחליט אם התנאים הניסיוניים דורשים מונוליירים ראשוניים של חברת החשמל שנשארים קרובים יותר לתאי גזע ומוסיפים מדיית LWRN טרייה או אם הבידול של המונולאייר רצוי, להחליף במדיית בידול. הגורם החשוב ביותר בפרוטוקול זה הוא להבטיח את שלמות המעי הגס במהלך תהליך הבידוד. אם מתרחש קרע, ניתן לקצר את הנקניק כדי לחסל את האזור הפגוע. לפני לשים את הנקניק ב EDTA להיות בטוח כי הקשרים הם הדוקים ככל האפשר. אם הנקניקייה מנוטרלת לאחר הדגירה EDTA הפרוטוקול יכול להימשך עם השפעה מועטה עד ללא השפעה בתפוקת הקריפטה הכוללת. אם המזרק החוזר אינו זמין, קצה מיקרופיפט רגיל המחובר למזרק רגיל יכול לשמש גם לתהליך של אינפלציה ודפלציה. כמו כן, אם אין פתרון התאוששות התא זמין, צעדי האינפלציה הדפלציה ניתן לעשות EDTA (2mM המעי הדק, 50 מ"מ המעי הגס), אבל החלפה זו אינה מומלצת. אם אין צורך במפגש, קריפטות יכולות לגדול בצלחות מצופות רק בקולגן ואפילו בצלחות לא מצופות. השתמש רק במקרים צלחות לא מצופות אין אפשרות אחרת, אבל התאים לא יגדלו בריאים כפי שהם היו בצלחות מצופות קולגן. כשמדובר תרבות בריאות ויציבות, monolayers מצופה פלסטיק הם בריאים במשך 4 עד 5 ימים בעוד monolayers מצופה transwells ניתן לשאת עד 8 ימים.
אחת המגבלות העיקריות של שיטה זו היא המדיה הסלולרית הנדרשת כדי לגדל את מונוליירים המעי הגס אפיתל. תאי LWRN זמינים ב- ATCC, אך יצירת מדיה מותנית LWRN היא עבודה אינטנסיבית ודורשת גישה לספקטרומטר פלואורסצנטי כדי לקבוע את פעילות Wnt. מדיית בידול דורשת מספר ריאגנטים המתווסף טריים לפני השימוש, מה שהופך אותו לתהליך מייגע. לבסוף, רוב ריאגנטים אלה הם יקרים וקל לשרוף את ריאגנטים בקצב מהיר. אם מעבדה מעוניינת להקים טכניקה זו ללא תרבות תאים ראשונית במעיים קודמים, מומלץ מאוד למצוא משתף פעולה / מכללה עם ניסיון ולאמן את אחד מחבריהם.
תחזוקה של תרבות 3D יכול להיות יקר בשל העלות של מטריצת קרום מרתף בינוני כמויות גבוהות של מדיה מותנית הדרושים תרבויות אורגנואידים, אבל יש לו את היתרון של שימוש במספר מופחת של עכברים ואת המבנים שנוצרו ניתן לעבור פעמים רבות. Enteroids (נגזר המעי הדק) קל יחסית לבודד ולתחזק בעוד המעי הגס הם עדינים יותר, לגדול בקצב איטי יותר יש יכולת מעבר מוגבלת יותר. דור מונולאייר מן המעי הגס 3D דורשים כמות לא פרופורציונלית של מבנים 3D, שהופכים סוגים אלה של ניסויים זמן רב ויקר. להיפך, הכנה ישירה של מונולאייר מעי גס אפיתל היא מהירה והיא דרך מהירה להשיג את התוצאות. הכנת המעי הגס אחד יכול ליצור אזור confluent של 75 ס"מ2 (10 עד 15 מ"ל של מדיה מותנית, מחליף פעם אחת) 2 עד 3 ימים לאחר ציפוי (אזור זה ידרוש 144 בארות של קולונואידים 3D, כלומר כמעט 6mL של Matrigel ויותר מ 250 מ"ל של מדיה מותנית). הצריכה הנמוכה יותר של מדיה, תחזוקה בעלות נמוכה של תרבות התא ואת היכולת לבצע בדיקות פונקציונליות ועיבוד מהיר במורד הזרם הם יתרונות גדולים של monolayers המעי הגס אפיתל.
פרוטוקול זה הוא כלי רב ערך בחקר ביולוגיה של תאי אפיתל במעיים בתחומים כגון הידבקות בתאים, קוטביות ובידול. זה נותן את היתרון כדי ליצור תרביות תאים ראשוניות מעכברים מהונדסים גנטית (נוקאאוט, overexpressing, כתבים). המונוליירים הראשיים של אפיתל המעי מאפשרים גישה קלה למשטחים האפיקליים והבסולטריאליים (כאשר הם מצופים על טרנסוולים) ומאפשרים חקר חדירות, מחסום והגירה טרנספיתלאלית של סוגי תאים שונים. לבסוף, מודל זה יכול להיות שימושי בתחומים שונים כמו אינטראקציות מארח-פתוגנים, נזק אפיתל ותיקון וגילוי סמים.
Disclosures
למחברים אין ניגודי אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי פרס פיתוח קריירה של קרן קרוהן וקוליטיס (544599, ל- MQ) ומענקי NIH (DK055679, DK089763, DK059888, ל- AN). ברצוננו להודות למעבדה למישיגן רפואה תרגום מידול רקמות על העזרה המתמשכת שלהם וגישה ריאגנטים שלהם ופרוטוקולים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Antibiotic Antimycotic solution | Corning | 30-004CI | |
| B27 supplement (50X) | Gibco | 12587-010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen from human placenta (type IV) | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| D-Sorbitol | Sigma | 85529-250G | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Epithelial Volt/Ohm meter | World Precision Instruments | 0-10KΩ with STX2 (EVOM2) | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Lonza | 51201 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-016-CV | |
| Firefly Luciferase assay | Biotium | 30085-2 | |
| Geneticin | Gibco | 10131-035 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES (1M) | Corning | 25060CI | |
| Human recombinant EGF | R&D systems | 236-EG | Stock Concentration: 500µg/mL |
| Human recombinant Wnt-3A | R&D systems | W3a-H-005 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| LWRN cells | ATCC | CRL-3276 | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CV | |
| N2 supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock Concentration: 500mM |
| Noggin | Conditioned media | - | |
| Nunc Lab-Tek Chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182-1PAK | |
| Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL) | Corning | 30002CI | |
| Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic 20G feeding tube | Fisher Scientific | 50-810-46 | |
| rh-laminin-521 | Gibco | A29248 | Stock concentration: 100µg/mL |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD | Fisher Scientific | NC9452680 | |
| TOPflash HEK293 cells | ATCC | CRL-3249 | |
| Transwell Permeable supports (0.4µm) | Corning | 3470 |
References
- Quiros, M., Nusrat, A. Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair. Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).
- Blutt, S. E., et al. Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).
- Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications. Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Cardenas, D., et al. Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium. Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Zou, W. Y., et al. Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections. Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Nik, A. M., Carlsson, P. Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme. Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).
